COLORATION DE ZIEHL NEELSEN A CHAUD ET COLORATION A L’AURAMINE POUR LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE

(1)

RAPPORT DE FIN DE STAGE POUR L'OBTENTION DU DIPLÔME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

Présenté et soutenu par:

PRESENTE ET SOUTENU PAR :

Réalisé et présenté par :

Gustave AHOGNI

Sous la direction de:

Tutrice : Superviseur : Mme Tania TESSY Pr Honoré S. BANKOLE

Master en Analyses bio Médicales Microbiologiste CDT-Abomey Professeur Titulaire des Universités

EPAC-UAC

COLORATION DE ZIEHL NEELSEN A CHAUD ET COLORATION A L’AURAMINE POUR LE DIAGNOSTIC

DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE

’ECBU

THEME

(2)

REPUBLIQUE DU BENIN

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI

ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI

CENTRE AUTONOME DE PERFECTIONNEMENT

DIRECTEUR : Pr SOUMANOU Mohamed

DIRECTEUR ADJOINT : Pr AHOUANNOU Clément

CHEF DE CAP : Pr AWANTO Christophe

Année Académique : 2016 -2017 1^ere promotion

(3)

COLORATION DE ZIEHL NEELSEN A CHAUD ET LA COLORATION A L’AURAMINE POUR LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE

i

DEDICACE

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ii

A tous ces scientifiques qui œuvrent sans cesse pour le bien-être de la population mondiale !

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iii

REMERCIEMENTS

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iv

 Ama feue mère

Toi qui n’as vécu que pour le bien être de tes enfants, toi qui ne s’est, jamais lassée de te battre pour ma réussite, voici le fruit de tes efforts. Mais hélas tu ne pourras y goutter puis que Dieu t’as trop tôt rappelé à lui. Ou que tu sois maman, sois contente et fière de moi car j’y suis arrivé.

 A mon père

Toi qui n’as jamais cessé de te battre pour mon avenir Puisse ce travail être à tes yeux le réconfort de tes peines et la fierté de me voir réussir .Que DIEU te comble davantage de ses grâces et t’accorde la longévité.

 A ma sœur Isabelle

Toi qui n’ascessé de me soutenir et de m’encourager, trouve ici le fruit de mes efforts .Que Dieu nous unisse davantage chaque jour qu’il fait.

 A mes frères et sœurs Marius, Mariano, Didier, Ghislain,Yasmine Recevez ceci comme le fruit de la confiance placée en moi et l’exemple à suivre.

 A Antoine SIANOU

Reçois ici le témoignage de ma profonde gratitude.

 A mes enfants Farwell, Howell, Ariane,et Divine Que Dieu vous bénisse et vous aide à mieux réussir que moi

 A Professeur Honoré S. BANKOLE

Vous avez suscité en moi l’esprit de recherche et du travail bien fait, grâce à votre rigueur scientifique. Malgré vos multiples occupations, vous avez été toujours présent et disponible durant ce travail. Puisse l’Eternel vous accorder longévité et prospérité afin que les jeunes générations bénéficient aussi de vos connaissances.

(7)

v

 Mme Tania TESSY

Vous avez su me faire bénéficier de vos expériences et savoir-faire indispensableà ce travail.Que Dieu vous bénisse.

 Tout le personnel de laboratoire du Centre de Dépistage et de traitement Abomey

Pour votre soutien, vos multiples conseils, et votre participation.

 A tous mes camarades de promotion

Pour la solidarité, l’amitié et en souvenir des moments de joies et peines vécus ensemble. Courage et persévérance.

 Aux autorités et enseignants du Centre Autonome de Perfectionnement.

Recevez ici le témoignage de ma profonde gratitude.

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vi

HOMMAGES

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vii

 A son excellence le Président du jury

C’est un honneur que vous nous faites en acceptant de présider notre jury de soutenance. Veuillez recevoir l’expression de nos respectueux hommages.

 Aux Honorables Membres du jury

Nous vous sommes reconnaissants de l’honneur que vous nous faites en acceptant de siéger dans notre jury et de juger notre travail. Espérant que vous apprécierez ce rapport de stage tout en apportant vos critiques et suggestions, nous vous prions de recevoir l’expression de nos sincères considérations.

(10)

viii

LISTE DESABREVIATIONS

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ix

BAAR : Bacilles Acido-Alcoolo- Résistant CDT : Centre de Dépistage et de traitement

PNT : Programme National contre la Tuberculose

% : Pourcentage

°C : Degrés Celsius Cm : Centimètre g : gramme ml:Millilitre

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x

LISTE DES TABLEAUX

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xi

Tableau I:Echelle de lecture pour la microscopie ordinaire………..16 Tableau II: Echelle de lecture pour la microscopie à fluorescence……….17 Tableau III : Répartition des échantillons de crachats selon le sexe……….19 Tableau IV: Répartition des échantillons de crachats en fonction de l’âge……...20 Tableau V: Résultats des échantillons au Ziehl Neelsen………..21

Tableau VI: Résultats des échantillons à l’auramine………21 Tableau VII : Résultat à l’auramine versus Ziehl Neelsen………22

Tableau VIII : Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration de Ziehl Neelsen……….23

Tableau IX: Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration à l’auramine………24

Tableau X : Répartition des échantillons en fonction de l’aspect des crachats et des résultats à la coloration de Ziehl Neelsen………25

Tableau XI : Répartition des échantillons selon l’aspect des crachats en fonction des résultats obtenus à l’auramine ………..26

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xii

LISTE DES FIGURES

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xiii

Figure 1 : Classification des mycobactéries……….5 Figure2 : Paroi des mycobactéries………6 Figure3 : Bacilles tuberculeux observés au microscope à la lumière directe après coloration par la méthode de Ziehl-Neelsen………10 Figure4: Bacilles tuberculeux observés au microscope à fluorescence après coloration à l’auramine………10

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xiv

SOMMAIRE

(17)

xv

INTRODUCTION...1

I.1. DEFINITION……….….4

I.2. HISTORIQUE ……….…...4

I.3. AGENT PATHOGENE ………..…...4

I.4. CARACTERISTIQUES ………..……..5

I.5. HABITAT………..……….7

I.6. MODE DE TRANSMISSION………..………..7

I.7. POUVOIR PATHOGENE ………..………...7

I.8. EPIDEMIOLOGIE………...………...8

I.9. TUBERCULOSE AU BENIN………..…………..8

I.10. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE………..……….9

II.1.CADRE………13

II.2.MATERIEL……….13

II.3. METHODES………14

III.1. RESULTATS ………19

III.2. COMMENTAIRE………..27

CONCLUSION ET SUGGESTIONS...29

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...31

ANNEXE ... 34

(18)

xvi

RESUME/ ABSTRAT

(19)

xvii

RESUME

La bacilloscopie après une technique de coloration, demeure l’outil le plus disponible pour poser le diagnostic de la tuberculose pulmonaire. Le présent travail a eu pour but, de comparer les résultats de deux techniques de coloration que sont le Ziehl Neelsen et l’auramine.

Pour ce faire, des frottis de 198 échantillons de crachats de malades suspectés de tuberculose pulmonaire, ont été soumis à ces deux types de coloration.

Au terme de cette étude, il ressort que la technique à l’auramine est plus sensible que la technique au Ziehl Neelsen.

Mots clés : Ziehl Neelsen – Auramine - Sensibilité

ABSTRAT

The bacilloscopy after a staining technique remains the most available tool for diagnosing pulmonary tuberculosis. The purpose of this study was to compare the results of two staining techniques, Ziehl Neelsen and Auramine.

To do this, smears of 198 sputum samples of patients suspected of pulmonary tuberculosis, were subjected to these two types of staining. At the end of this study, it appears that the auramine technique is more sensitive than the Ziehl Neelsen technique.

Key words: Ziehl Neelsen - Auramine - Sensibility

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COLORATION DE ZIEHL NEELSEN A CHAUD ET COLORATION A L’AURAMINE POUR LE DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE PULMONAIRE

1

INTRODUCTION

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2

La tuberculose pulmonaire est une maladie infectieuse causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis. Elle représente un véritable problème de santé publique, surtout dans les pays en voie de développement [8,11]. Malgré le développement récent de nouvelles techniques notamment moléculaires, l’examen microscopique des frottis de crachats à la recherche des Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants reste l’outil le plus disponible pour le diagnostic de la tuberculose dans les pays en développement [6]. Pour réaliser l’examen microscopique on utilise plusieurs types de coloration dont la coloration de Ziehl-Neelsen à chaud et la coloration à l’auramine.

La présente étude a eu pour objectif de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique de la tuberculose pulmonaire.

Spécifiquement, il s’est agi de :

1. Poser le diagnostic biologique de la tuberculose au moyen de la coloration de Ziehl Neelsen ;

2. Réaliser le diagnostic biologique de la tuberculose au moyen de la coloration à l’auramine.

En dehors de l’introduction et de la conclusion, le présent document comporte dans sa première partie quelques généralités sur la tuberculose, la deuxième partie aborde le matériel et la méthodologie suivie et la troisième partie expose les résultats et le commentaire.

(22)

3

CHAPITRE I

TUBERCULOSE PULMONAIRE

(23)

4

I.1. DEFINITION

C'est une maladie due au Mycobacterium tuberculosis communément dénommé « bacille de koch» dont la variété la plus rependue est représenté par le bacille du type humain.

I.2. HISTORIQUE

La tuberculose existe depuis 2000 à 4000 ans avant J.C. En 1819, René Laennec décrit la maladie. Dès 1865, Jean-Antoine Villemin montre que la maladie est transmissible et contagieuse. Ensuite, en 1882 Robert Koch identifia le Bacille de Koch et décrit l’immunité antituberculeuse en 1890. En 1908 Albert Calmette propose la pasteurisation du lait et réalise la première vaccination. Les recherches ont abouti à un médicament, la Streptomycine qui guérit les premiers malades en 1947.

I.3. AGENT PATHOGENE

Les mycobactéries appartiennent à l’ordre des Actinomycetales, à la famille des Mycobacteriaceae qui comporte un seul genre, le genre Mycobacterium[17] (figure1).

L’agent causal de la tuberculose humaine est une mycobactérie du complexe tuberculosis,constitué principalement de M. tuberculosis, M.

africanumet M. bovis[1].

Les autres mycobactéries sont appelées mycobactéries atypiques ou non-tuberculeuses. Ces mycobactéries sont omniprésentes dans l’environnement. Dans des circonstances données, comme l’immunodépression certaines d’entre elles peuvent devenir pathogènes pour l’homme.

(24)

5

Figure 1 : Classification des mycobactéries [17]

I.4. CARACTERISTIQUES

M. tuberculosis se présente sous la forme d’un fin bâtonnet, mesurant 2 à 5µm de long sur 0,2 à 0,3µm de large. Les espèces bactériennes qui forment le complexe tuberculosis sont rectilignes ou légèrement incurvées, aérobies strictes parfois micro aérophiles, non sporulées et dépourvues de capsule.

Bacteria

Actinobacteria

Actinomycetales

Mycobacteriaceae

Mycobacterium

Complexe tuberculosis Mycobactéries atypiques Mycobactéries non cultivables

Mycobactéries tuberculeuses M. tuberculosis, M.

africanum

M. bovis, M. microti M. caprae, M. pinnipedii M. canetti

Mycobactéries non tuberculeuses. Exemples :

M. avium-intracellulare M. marinum, M. kansasii M. xenopi, ...

M. leprae

M. lepraemurium Domaine

Classe Ordre

Famille

Genre

Espèce

(25)

6

La température optimale de croissance est de 35 à 37°C. Sa croissanceest particulièrement lente avec un temps de réplication de 12 à 24h [2].

En culture, les colonies de M. tuberculosis prennent une forme irrégulière verruqueuse ou en couronne, d’aspect sec, à surface plissée ou mamelonnée, elles sont opaques, de couleur crème, puis deviennent beige- foncée-chamois. Si les colonies sont bien séparées elles révèlent une forme de choux en fleur et sont difficilement dissociables dans l’eau [16]

Une des caractéristiques majeures des mycobactéries est la richesse de leur paroi en lipides (60%) et, en particulier, en acides mycoliques (acides gras à longue chaîne) (Figure 2) qui rendent imperméables la paroi aux colorants basiques comme la fuchsine ou l’auramine. Pour obtenir une visualisation des mycobactéries au microscope, il est donc nécessaire de réaliser la coloration de Ziehl-Neelsen ou de l’auramine dont le principe repose sur l’acido-alcoolo-résistance de la mycobactérie, c’est-à-dire sa capacité à résister à la décoloration par les acides et les alcools après une coloration à la fuchsine ou à l’auramine [2].

Figure 2 : Paroi des mycobactéries [2]

(26)

7

I.5. HABITAT

Les mycobactéries du complexe tuberculosis ont pour hôtes l’homme et certains animaux. Leur présence dans l’environnement est due à une contamination accidentelle par l’homme ou par des produits animaux tels que le lait et le beurre [16]. Tous les organes du corps humain peuvent être affectés par la tuberculose; mais les poumons sont les organes affectés dans la plupart des cas [10].

I.6. MODE DE TRANSMISSION

La transmission est principalement directe par voie aérienne. C'est en toussant, en éternuant, en parlant, ou en crachant que le malade émet des gouttelettes de flügge dans l’air ambiant [5,12]. Ces particules inhalées par un individu sain, s’attacheront à la paroi alvéolaire entraînant le début de l’infection [13]. Elle peut se faire aussi par voie digestive, lors de l’ingestion de lait non pasteurisé c’est le cas de M. bovis.

Le passage de l’infection à la maladie est favorisé par certains facteurs dont le principal est l’infection par le VIH [4].

I.7. POUVOIR PATHOGENE

Il existe deux formes de tuberculose : la tuberculose pulmonaire et la tuberculose extra-pulmonaire. La forme la plus répandue est la tuberculose pulmonaire. Initialement localisée dans le poumon, le bacille de Koch se multiplie et peut gagner d’autres parties du corps via le système sanguin et le système lymphatique [16].

(27)

8

Les personnes atteintes de la tuberculose pulmonaire présentent les symptômes respiratoires dont une toux grasse, productive, chronique, une hémoptysie et une douleur thoracique.

I.8. EPIDEMIOLOGIE

L’OMS estime que chaque année, 1,7 à 2 milliards d’individus sont infectés par M. tuberculosis, 7 à 9 millions développent la tuberculose- maladie et 1,7 millions en meurent [16]. La grande majorité des cas et des décès surviennent dans les pays à faibles ressources [10 ,5] en dépit des progrès notables dans la lutte contre la tuberculose : diminution de l’incidence mondiale d’environ 1%, taux de succès thérapeutique de 86% en 2008 [12].

En Afrique, la partie sub-saharienne paie le plus lourd tribut à la tuberculose. En effet, en 2009, l’incidence de la tuberculose était de 345 pour 100.000 habitants contre 29 et 47 respectivement en Amérique et en Europe.

Parmi les cinq premiers pays à forte prévalence de tuberculose en 2009, il y avait deux pays africains : l’Afrique du Sud et le Nigéria avec respectivement 0,50 million et 0,46 million de cas [18].

I.9. TUBERCULOSE AU BENIN

Au Bénin, le nombre de cas notifiés de tuberculose continue d’augmenter d’environ 2 à 4% par an [13].

Toutefois, le nombre de nouveaux cas en 2011 par rapport à 2010 a connu une augmentation plus importante.

En effet, 3878 cas de tuberculose toutes formes confondues ont été dépistés en 2010 contre 4320 cas en 2011 et 4075 en 2012 [15].

(28)

9

I.10.DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE I.10.1. Prélèvement

Lorsque la tuberculose pulmonaire est suspectée, au moins deux échantillons de crachats sont prélevés en deux jours de la manière suivante :

- une première entrevue avec le malade : un échantillon est prélevé immédiatement sur place après un effort de toux et un raclement de la gorge, sous la surveillance d’un agent de santé ;

- un crachoir est remis au malade pour recueillir un échantillon le lendemain matin au réveil [14].

I.10.2. Examen microscopique

L’examen microscopique d’un produit pathologique est la première étape du diagnostic bactériologique de la tuberculose et parfois la seule dans les pays en voie de développement. Il est effectué directement sur le frottis d’une parcelle purulente du produit pathologique ou sur le culot du produit homogénéisé et centrifugé après un traitement fluidifiant décontaminant.

Pour mettre en évidence les mycobactéries, on utilise leur propriété d’acido-alcoolo-résistance [3].

Il existe plusieurs techniques de coloration des mycobactéries, les principaux types de coloration utilisés sont:

- la classique coloration de Ziehl-Neelsen, où les bacilles sont colorés en rouge par la fuchsine sur fond bleu (figure3). La lecture s’effectue à l’aide d’un microscope à lumière transmise à l’objectif X100 ;

- la coloration à l’auramine qui nécessite en 1^ère intention, un microscope à fluorescence à l’objectif X20 ou 25 : les bacilles apparaissent jaune- vert fluorescent sur fond sombre (figure4).

(29)

10

Figure3 : Bacilles tuberculeux observés au microscope à la lumière directe après coloration par la méthode de Ziehl-Neelsen.

Figure4:Bacilles tuberculeux observés au microscope à fluorescence après Coloration à l’auramine

L’examen direct, peu coûteux, permet un dépistage rapide en quelques heures. Mais il présente deux inconvénients [9] :

- le manque de sensibilité : il faut en effet plus de 10⁴ bacilles/mL de produit pathologique pour que l’examen soit positif.

(30)

11

- le manque de spécificité : cet examen ne permet pas de différencier les mycobactéries du complexe tuberculosis des autres mycobactéries.

Cependant, dans les zones d’endémie tuberculeuse, les mycobactéries du complexe tuberculosis sont largement prédominantes dans les échantillons cliniques des patients atteints de tuberculose et en général, l’examen microscopique seul suffit pour le diagnostic.

(31)

12

CHAPITRE II

CADRE, MATERIEL ET METHODES

(32)

13

II.1.CADRE

Notre étude s’est déroulée au laboratoire de centre de diagnostic et de traitement de la tuberculose, situé dans le centre de santé de Vidolé Abomey.

Le personnel du centre de diagnostic et de traitement de la tuberculose est constitué de six personnes :

 deux infirmiers ;

 deux techniciens de laboratoire ;

 deux aides-soignants.

Le laboratoire effectue les activités suivantes :

 examen direct à la recherche des BAAR ;

 dépistage de HIV ;

 dépistage de la tuberculose et le test de sensibilité à l’aide du Genexpert.

II.2.MATERIEL II.2.1. Type d’étude

Il s’est agi d’une étude comparative qui s’est déroulée du 23 Mars 2017 au 28 avril 2017.

II.2.2. Echantillon

L’échantillond’étude est constitué de 198 prélèvements de crachats recueillis chez les patients suspects de tuberculose.

II.2.3. Matériel et réactifs

Nous avons utilisé le matériel suivant :

 microscope à fluorescence ;

 microscope ordinaire ;

 bec Bunsen ;

(33)

14

 lames ;

 baguettes pour étalement.

Les réactifs suivants ont été utilisés pour effectuer la coloration des frottis :

 solution de fuchsine phéniquée à1%

 solution d’acide sulfurique diluée 25% ;

 solution de bleu de méthylène 0,1% ;

 solution d’auramine phéniquée 0,1% ;

 solution d’alcool-acide 0,5% ;

 solution de permanganate de potassium 0,5% ;

II.3. METHODES

II.3.1. Confection des frottis

A partir de chaque échantillon de crachat, deux frottis ont été confectionnés.

 Technique

 Inscrire le numéro de l’échantillon sur la lame ;

 Dégraisser la lame ;

 Choisir la parcelle à étaler : idéalement la partie purulente de l’échantillon à l’aide du bâtonnet ;

 Réaliser le frottis de façon ovale et homogène avec 1 cm de large et 2 cm de long. Il ne doit pas être trop épais ni trop mince ;

 Laisser sécher le frottis ;

 Fixer le frottis en passant le dos de la lame 3 fois à la flamme.

(34)

15

II.3.2. Préparation des colorants

II.3.2.1. Préparation des colorants pour la microscopie à fluorescence

La solution d’auramine phénique à 0,1% ; la solution d’alcool-acide à 0,5% et la solution de permanganate de potassium à 0,5% ont été préparées selon la procédure de préparation (annexe1) [7].Seule la solution d’auramine phéniqué à 0,1% est conservée au réfrigérateur à 4°C.

II.3.2.2. Préparation des colorants pour la microscopie ordinaire

Pour la coloration au Ziehl Neelsen à chaud, trois colorants ont été utilisés à savoir fuchsine phéniquée à 1%, l’acide sulfurique à 25%, le bleu de méthylène 0,1%. Ces colorants ont été préparés (annexe2) [7].

II.3.3. Technique de coloration et de lecture II.3.3.1. Coloration au Ziehl-Neelsen

Les lames sont colorées selon la procédure suivante :

 Couvrir les lames de la solution de fuchsine phéniquée à 1% ;

 Chauffer les lames jusqu’à émission de vapeur ;

 Laisser agir pendant 15 minutes ;

 Rincer à l’eau du robinet ;

 Couvrir les lames d’acide sulfurique à 25% pendant 5 minutes ;

 Rincer à l’eau du robinet ;

 Couvrir les lames de la solution de bleu de méthylène à 0 ,1% pendant une minute ;

 Rincer à l’eau du robinet, égoutter et sécher.

(35)

16

Ces lames sont lues au microscope ordinaire à l’objectif X100 avec l’huile à immersion. La lecture des frottis a été faite selon l’échelle comme indiquée par le tableau I.

Tableau I: Echelle de lecture [13]

Expression quantitative Résultats

Pas de BAAR sur au moins une longueur Négatif

1 – 9 BAAR/ 100 champs ±

1 – 9 BAAR/ 10 champs 1+

1 – 10 BAAR/ champ 2+

≥10 BAAR/ champ 3+

II.3.3.2.Technique de coloration à l’auramine

La procédure de coloration à l’auramine a été réalisée de la manière suivante :

 Recouvrir les lames de la solution d’auramine phéniquée 1% pendant 20 minutes, et rincer à l’eau ;

 Recouvrir les lames de la solution d’alcool-acide à 0,5% pendant 2 minutes et rincer à l’eau ;

 Contre colorer avec la solution de permanganate 0,5% de potassium durant une minute ;

 Rincer à l’eau et laisser sécher à l’air ;

 La lecture a été faite à l’objectif X20 au microscope à fluorescence selon l’échelle indiquée par le tableau II lecture suivante :

(36)

17

Tableau II: Echelle de lecture [13]

Expression quantitative Résultats

Pas de BAAR sur au moins une longueur Négatif

1 – 29 BAAR/ longueur ±

30 – 299 BAAR/ longueur 1+

10 – 99 BAAR/ champ 2+

>100 BAAR/ champ 3+

(37)

18

CHAPITRE III

RESULTATS ET COMMENTAIRE

(38)

19

III.1. RESULTATS

Tableau III : Répartition des échantillons de crachats selon le sexe

Plus de la moitié des échantillons de crachats étaient d’origine masculine Sexe Effectif

Féminin 48 (40%) Masculin 73 (60%) Total 121 (100%)

(39)

20

Tableau IV: Répartition des échantillons de crachats en fonction de l’âge Age en année Effectif

[0 ; 10[ 10

(8%)

[10 ; 20[ 17

(14%)

[20 ; 30[ 22

(18%)

[30; 40[ 29

(24%)

[40 ; 50[ 15

(12%)

[50 ; 60[ 7

(6%)

≥ 60 21

(17%)

Total 121

(100%)

Les échantillons de crachats sont provenus beaucoup plus (24 %) des patients âgés de 30 à 40 ans.

(40)

21

Tableau V: Résultats des échantillons au Ziehl Neelsen

Effectif Pourcentage

Positif 21 11%

Négatif 177 89%

Total 198 100%

Sur les 198 échantillons de crachat, 21(11%) ont montré la présence de BAAR après coloration au Ziehl Neelsen.

Tableau VI: Résultats des échantillons à l’auramine

Effectif Pourcentage

Positif 23 12%

Négatif 175 88%

Total 198 100%

La positivité des 198 échantillons de crachat après coloration à l’auramine, est de 12% (23/ 198).

(41)

22

Tableau VII : Résultat à l’auramine versus Ziehl Neelsen Ziehl Neelsen

Auramine

Total Positif Négatif

Positif 21

(11%)

0 (0%)

21 (11%)

Négatif 2

(1,01%)

175 (88%)

177 (89%)

Total 23

(12%)

175 (88%)

198 (100%)

Tous les échantillons de crachat positifs au Ziehl Neelsen (11%) l’ont été également à l’auramine. Par contre, 1% (2/198) positif à l’auramine ne l’ont pas été au Ziehl Neelsen.

(42)

23

Tableau VIII : Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration de Ziehl Neelsen

Charge bacillaire Effectif Pourcentage

 Négatifs

 Positifs

+/-

177 21 13

100%

61,9%

1+ 1 4,8%

2+

3+

0 7

0%

33,3%

A la coloration de Ziehl Neelsen, les échantillons de crachat positifs ont montré à 61,9% (13/21), une rareté en BAAR.

(43)

24

Tableau IX: Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration à l’auramine

Charge bacillaire Effectif Pourcentage

 Négatifs

 Positifs

+/-

175 23

8

100%

34,8%

1+ 5 21,7%

2+

3+

5 5

21,7%

La rareté des BAAR à la coloration à l’auramine, a été observée dans 34,8%

(8/23)

(44)

25

TableauX : Répartition des échantillons en fonction de l’aspect des crachats et des résultats à la coloration de Ziehl Neelsen

Résultat

Aspect des crachats

Total Salivaire Muco-purulent Sang

Positifs

Négatifs

Total

3 (4,3%)

67 (95,7%)

70 (100%)

18 (14,2%) 109 (85,8%)

127 (100%)

0 (0%)

1 (1%)

1 (100%)

21 (10,6%)

177 (89,4%)

198 (100%) A la coloration de Ziehl Neelsen, les échantillons de crachats muco-purulents ont fournis plus de résultats positifs au BAAR.

(45)

26

Tableau XI : Répartition des échantillons selon l’aspect des crachats en fonction des résultats obtenus à l’auramine

Résultat Aspect des crachats

Total Salivaire Muco-purulent Sang

Positifs

Négatifs

4 (17,4%)

66 (37,7%)

19 (82,6%) 108 (61,7%)

0 (0%)

1 (0,7%)

0 23

(100%) 175 (100%)

A l’instar de la coloration au Ziehl Neelsen, les échantillons de crachats muco-purulents ont fournis plus de résultats positifs au BAAR à la coloration à l’auramine.

(46)

27

III.2. COMMENTAIRE

Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique de la tuberculose pulmonaire.La majorité (60%) des échantillons de crachats a été recueillie chez les hommes.

Ce qui sous-entend que les femmes sont moins suspectées de la tuberculose pulmonaire. Toutefois, aucune différence statistiquement significative n’a été notée (p>0,05). La tranche d’âge de 30 à 40 ans vient en tête suivie de celle de 20 à 30 ans. La jeunesse est alors beaucoup concernée par cette maladie.

Le taux de tuberculose dans la population d’étude, a été évalué à 11%

par la technique de Ziehl Neelsen. Ce taux a connu une augmentation (12%) par la technique à l’auramine. Tous les échantillons de crachat positifs au Ziehl Neelsen ont été également positifs à l’auramine. Cela signifie que l’augmentation observée au niveau du taux de positivité observé avec l’auramine, vient du fait que, l’auramine ait fait positifs, certains échantillons qui ont été négatifs au Ziehl Neelsen. On pourrait alors déduire que la coloration à l’auramine, est plus efficace que la coloration au Ziehl Neelsen à chaud.

En ce qui concerne la charge bacillaire en rapport avec l’aspect macroscopique des échantillons de crachat, nous avons remarqué que les crachats muco-purulents ont fourni plus de résultats positifs aussi bien à la coloration de Ziehl Neelsen qu’à la colorationà l’auramine. Dans le cadre d’un bon diagnostic biologique de la tuberculose pulmonaire, il est recommandé de réaliser les frottis de la bacilloscopie, à partir du mucus de l’échantillon des crachats. Si la qualité de la bacilloscopie dépend du caractère muco-purulent des échantillons de crachat, il n’en demeure pas moins que ce caractère n’a créé aucune différence entre les deux types de coloration.

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28

Au regard de ces résultats, la microscopie à fluorescence utilisant l’auramine est plus sensible car elle révèle plus d’échantillons positifs et de frottis dont la charge bacillaire est élevée. Elle est plus rapide en ce qui concerne le temps de coloration, le temps de lecture. La lecture des frottis colorés à l’auramine est plus facile.

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29

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

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30

Au terme de ce travail, il ressort que l’examen microscopique pour le diagnostic de la tuberculose utilisant la coloration à l’auramine est plus sensible, plus rapide, moins fastidieux que la coloration au Ziehl-Neelsen.

La coloration à l’auramine pour l’examen microscopique peut être alors recommandée afin d’obtenir un bon diagnostic de la tuberculose pulmonaire.

Nous ne pouvons terminer ce travail sans formuler les suggestions ci - après :

 former tous les techniciens de laboratoire sur la microscopie à fluorescence utilisant la coloration de l’auramine.

 doter tous les laboratoires des CDT du matériel pouvant permettre la réalisation de la microscopie à fluorescence.

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31

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

(51)

32

1- Bonard D, Msellati P, Rigouts L, Combe P, Coulibaly D, Coulibaly M et al. What is the meaning of repeated isolation of Mycobacterium africanum? IntJTuberc Lung Dis 2000; 4: 1176-1.

2- Boulahbal F, Tazir M, Khaled S, Zerrar M. Bactériologie de la tuberculose: Aspects diagnostiques, Thérapeutiques et organisationnels.

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3- Carbonelle B, Dailloux M, Lebrun L, Maugen J, Pernot C. Cahier de formation n°29 Bioforma 2003.146p.

4- Carbonelle B, Rousselet M. Diagnostic biologique de la tuberculose.

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5- Corbett E, Marston B, Churchyard G, De Cock K. Tuberculosis in sub- Saharan Africa: opportunities, challenges, and change in the era of antiretroviral

6- Guyentnl Wells C, Binkin N, Pham D, Nguyen V. The importance of quality control of sputum smear microscopy: the effect of reating errors on treatment

7- Hans L R, Van Deun A, Kam K M, Kim S J, Chonde T M, Trebucq A, et al. Priorités pour les services de bactériologie de la tuberculose dans les pays à faibles revenues. Union Internationale Contre la Tuberculose et les Maladies Respiratoires. 2^e édition, 2007.

8- Harries A D, Boxshall M, Phiri S, Van Gorkom J, Zachariah R, Quire S,et al. Assurer les soins VIH aux patients tuberculeux en Afrique sub- saharienne. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 1306-11.

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10- Médecins Sans Frontière. Tuberculose: Guide à l’usage des médecins, infirmiers, techniciens de laboratoire et auxiliaires de santé. 3^èmeédition.

Paris, 2001; 164 p.

(52)

33

11- Nunn P, De Cock K. Evaluation des progrès vers des services intégrés de traitement et de soins TB-VIH: les pays font ils ce qui doit être fait? Int J Tuberc Lung Dis 2008; 12 : S_1.

12- Organisation Mondiale de la Santé. Rapport sur la lutte contre la tuberculose dans le monde. Genève, 2009; 5p.

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18- WHO. Global tuberculosis control: WHO report 2010, Geneva, 2010;

204p.

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34

ANNEXES

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Annexe1 : Préparation des réactifs pour la microscopie à fluorescence Solution d’auramine phéniquée à 0,1%

Ethanol 95%………..…………...100 ml Phénol acqueux ……….………35 ml Auramine ……….…………1g Eau distillée qsp………...…………..…...865ml

 Dissoudre le phénol dans l’éthanol ;

 Ajouter l’auramine ;

 Ajouter 875 ml d’eau distillée ;

 Laisser séjourner pendant 24 heures à l’abri de la lumière ;

 Filtrer le mélange dans le flacon en verre teinté soigneusement bouché.

Solution d’alcool acide à 0,5%

Acide chlorhydrique.………..………...………….. 5 ml Ethanol à 95%……… ……….... 995ml

 Ajouter lentement l’acide chlorhydrique à l’alcool.

Solution de permanganate à 0,5%

Permanganate de potassium…………..……….5 g Eau distillée………1000 ml Ajouter le permanganate de potassium à l’eau puis mélanger.

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36

Annexe 2 : Préparation des réactifs pour la coloration de ziehl-Neelsen à chaud

Solution de fuchsine phéniquée à 1%

Ethanol………..…100ml Phénol acqueux………...55ml Fuchsine basique………...10g Eau distillée QSP……….…1000ml

- Dissoudre le phénol cristallisé dans l’alcool ;

- Ajouter la fuschine au mélange et mélanger jusqu’à l’obtention d’une solution homogène ;

- Ajouter l’eau distillée jusqu’à atteindre un volume de 1000 ml et mélanger de nouveau ;

- Transférer la solution dans un flacon.

Solution d’H2SO4 (acide sulfurique) à 25%

Eau distillée………...750ml Acide Sulfurique………..…….250ml

- Prendre 750ml d’eau distillée ;

- Plonger le flacon dans un bain de glace pour refroidir ;

- Ajouter lentement l’acide sulfurique en mélangeant régulièrement.

Solution de bleu de méthylène 0,1%

Bleu de méthylène………1g Eau distillée……….1000ml

Ajouter le bleu de méthylène à l’eau puis mélanger

(56)

37

TABLE DES MATIERES

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Titres Pages

DEDICACE...i

REMERCIEMENTS...iii

HOMMAGES ………iv

LISTE DES ABREVIATIONS ...vii

LISTE DES TABLEAUX...x

LISTE DES FIGURES……...xii

SOMMAIRE...xiv

RESUME……….xvi

INTRODUCTION...1

I.1. DEFINITION……….………..4

I.2. HISTORIQUE ………..………...4

I.3. AGENT PATHOGENE ………..………....4

I.4. CARACTERISTIQUES ………..5

I.5. HABITAT……….7

I.6. MODE DE TRANSMISSION………..7

I.7. POUVOIR PATHOGENE ………...7

I.8. EPIDEMIOLOGIE………...8

I.9. TUBERCULOSE AU BENIN………..8

I.10. DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE……….9

II.1.CADRE………13

II.2.MATERIEL……….13

II.2.1. Type d’étude………...13

II.2.2. Echantillon ……….13

(58)

39

II.2.3. Matériel et réactifs……….13

II.3. METHODES………14

II.3.1. Confection des frottis……….14

II.3.2. Préparation des colorants………..14

II.3.3. Technique de coloration et de lecture………...15

III.1. RESULTATS ………19

III.2. COMMENTAIRE………..27

CONCLUSION ET SUGGESTIONS...29

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...31

ANNEXE ... 34