III.2. COMMENTAIRE
II.3.3. Technique de coloration et de lecture
Les lames sont colorées selon la procédure suivante :
Couvrir les lames de la solution de fuchsine phéniquée à 1% ;
Chauffer les lames jusqu’à émission de vapeur ;
Laisser agir pendant 15 minutes ;
Rincer à l’eau du robinet ;
Couvrir les lames d’acide sulfurique à 25% pendant 5 minutes ;
Rincer à l’eau du robinet ;
Couvrir les lames de la solution de bleu de méthylène à 0 ,1% pendant une minute ;
Rincer à l’eau du robinet, égoutter et sécher.
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Ces lames sont lues au microscope ordinaire à l’objectif X100 avec l’huile à immersion. La lecture des frottis a été faite selon l’échelle comme indiquée par le tableau I.
Tableau I: Echelle de lecture [13]
Expression quantitative Résultats
Pas de BAAR sur au moins une longueur Négatif
1 – 9 BAAR/ 100 champs ±
1 – 9 BAAR/ 10 champs 1+
1 – 10 BAAR/ champ 2+
≥10 BAAR/ champ 3+
II.3.3.2.Technique de coloration à l’auramine
La procédure de coloration à l’auramine a été réalisée de la manière suivante :
Recouvrir les lames de la solution d’auramine phéniquée 1% pendant selon l’échelle indiquée par le tableau II lecture suivante :
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Tableau II: Echelle de lecture [13]
Expression quantitative Résultats
Pas de BAAR sur au moins une longueur Négatif
1 – 29 BAAR/ longueur ±
30 – 299 BAAR/ longueur 1+
10 – 99 BAAR/ champ 2+
>100 BAAR/ champ 3+
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CHAPITRE III
RESULTATS ET COMMENTAIRE
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III.1. RESULTATS
Tableau III : Répartition des échantillons de crachats selon le sexe
Plus de la moitié des échantillons de crachats étaient d’origine masculine Sexe Effectif
Féminin 48 (40%) Masculin 73 (60%) Total 121 (100%)
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Tableau IV: Répartition des échantillons de crachats en fonction de l’âge Age en année Effectif
Les échantillons de crachats sont provenus beaucoup plus (24 %) des patients âgés de 30 à 40 ans.
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Tableau V: Résultats des échantillons au Ziehl Neelsen
Effectif Pourcentage
Positif 21 11%
Négatif 177 89%
Total 198 100%
Sur les 198 échantillons de crachat, 21(11%) ont montré la présence de BAAR après coloration au Ziehl Neelsen.
Tableau VI: Résultats des échantillons à l’auramine
Effectif Pourcentage
Positif 23 12%
Négatif 175 88%
Total 198 100%
La positivité des 198 échantillons de crachat après coloration à l’auramine, est de 12% (23/ 198).
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Tableau VII : Résultat à l’auramine versus Ziehl Neelsen Ziehl Neelsen également à l’auramine. Par contre, 1% (2/198) positif à l’auramine ne l’ont pas été au Ziehl Neelsen.
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Tableau VIII : Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration de Ziehl Neelsen
Charge bacillaire Effectif Pourcentage
Négatifs
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Tableau IX: Répartition des résultats obtenus en fonction de la charge bacillaire pour la coloration à l’auramine
Charge bacillaire Effectif Pourcentage
Négatifs
La rareté des BAAR à la coloration à l’auramine, a été observée dans 34,8%
(8/23)
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TableauX : Répartition des échantillons en fonction de l’aspect des crachats et des résultats à la coloration de Ziehl Neelsen
Résultat A la coloration de Ziehl Neelsen, les échantillons de crachats muco-purulents ont fournis plus de résultats positifs au BAAR.
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Tableau XI : Répartition des échantillons selon l’aspect des crachats en fonction des résultats obtenus à l’auramine
Résultat Aspect des crachats muco-purulents ont fournis plus de résultats positifs au BAAR à la coloration à l’auramine.
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III.2. COMMENTAIRE
Le présent travail a eu pour objectif général de contribuer à l’amélioration du diagnostic biologique de la tuberculose pulmonaire.La majorité (60%) des échantillons de crachats a été recueillie chez les hommes.
Ce qui sous-entend que les femmes sont moins suspectées de la tuberculose pulmonaire. Toutefois, aucune différence statistiquement significative n’a été notée (p>0,05). La tranche d’âge de 30 à 40 ans vient en tête suivie de celle de 20 à 30 ans. La jeunesse est alors beaucoup concernée par cette maladie.
Le taux de tuberculose dans la population d’étude, a été évalué à 11%
par la technique de Ziehl Neelsen. Ce taux a connu une augmentation (12%) par la technique à l’auramine. Tous les échantillons de crachat positifs au Ziehl Neelsen ont été également positifs à l’auramine. Cela signifie que l’augmentation observée au niveau du taux de positivité observé avec l’auramine, vient du fait que, l’auramine ait fait positifs, certains échantillons qui ont été négatifs au Ziehl Neelsen. On pourrait alors déduire que la coloration à l’auramine, est plus efficace que la coloration au Ziehl Neelsen à chaud. l’échantillon des crachats. Si la qualité de la bacilloscopie dépend du caractère muco-purulent des échantillons de crachat, il n’en demeure pas moins que ce caractère n’a créé aucune différence entre les deux types de coloration.
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Au regard de ces résultats, la microscopie à fluorescence utilisant l’auramine est plus sensible car elle révèle plus d’échantillons positifs et de frottis dont la charge bacillaire est élevée. Elle est plus rapide en ce qui concerne le temps de coloration, le temps de lecture. La lecture des frottis colorés à l’auramine est plus facile.
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CONCLUSION ET SUGGESTIONS
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Au terme de ce travail, il ressort que l’examen microscopique pour le diagnostic de la tuberculose utilisant la coloration à l’auramine est plus sensible, plus rapide, moins fastidieux que la coloration au Ziehl-Neelsen.
La coloration à l’auramine pour l’examen microscopique peut être alors recommandée afin d’obtenir un bon diagnostic de la tuberculose pulmonaire.
Nous ne pouvons terminer ce travail sans formuler les suggestions ci -après :
former tous les techniciens de laboratoire sur la microscopie à fluorescence utilisant la coloration de l’auramine.
doter tous les laboratoires des CDT du matériel pouvant permettre la réalisation de la microscopie à fluorescence.
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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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2- Boulahbal F, Tazir M, Khaled S, Zerrar M. Bactériologie de la tuberculose: Aspects diagnostiques, Thérapeutiques et organisationnels.
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3- Carbonelle B, Dailloux M, Lebrun L, Maugen J, Pernot C. Cahier de formation n°29 Bioforma 2003.146p.
4- Carbonelle B, Rousselet M. Diagnostic biologique de la tuberculose.
Revue du praticien 2002; 52: 2115-20.
5- Corbett E, Marston B, Churchyard G, De Cock K. Tuberculosis in sub-Saharan Africa: opportunities, challenges, and change in the era of antiretroviral
6- Guyentnl Wells C, Binkin N, Pham D, Nguyen V. The importance of quality control of sputum smear microscopy: the effect of reating errors on treatment
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8- Harries A D, Boxshall M, Phiri S, Van Gorkom J, Zachariah R, Quire S,et al. Assurer les soins VIH aux patients tuberculeux en Afrique sub-saharienne. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10: 1306-11.
9- Maugein J, Bebear C. Diagnostic microbiologique de la tuberculose et intérêt de la Polymérase Chain Reaction. Med Mal Infect 2003; 33: 153-8.
10- Médecins Sans Frontière. Tuberculose: Guide à l’usage des médecins, infirmiers, techniciens de laboratoire et auxiliaires de santé. 3èmeédition.
Paris, 2001; 164 p.
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11- Nunn P, De Cock K. Evaluation des progrès vers des services intégrés de traitement et de soins TB-VIH: les pays font ils ce qui doit être fait? Int J Tuberc Lung Dis 2008; 12 : S1.
12- Organisation Mondiale de la Santé. Rapport sur la lutte contre la tuberculose dans le monde. Genève, 2009; 5p.
13- Programme National contre la Tuberculose du Bénin. Guide du PNT Bénin. 3ème éd. Cotonou, 2006 ; 50p.
14- Programme National contre la Tuberculose du Bénin. Guide du Réseau de laboratoires.1 ère éd. Cotonou, 2011; 66p.
15- Programme National contre la Tuberculose du Bénin. Rapport annuel du PNT 2012. Cotonou, 2013; 44p.
16- Sangare L, Diande S, Kouanda S . Mycobacterium tuberculosis drug - resistance in previously treated patients in Ouagadougou (Burkina Faso).
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18- WHO. Global tuberculosis control: WHO report 2010, Geneva, 2010;
204p.
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ANNEXES
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Annexe1 : Préparation des réactifs pour la microscopie à fluorescence Solution d’auramine phéniquée à 0,1%
Ethanol 95%………..…………...100 ml Phénol acqueux ……….………35 ml Auramine ……….…………1g Eau distillée qsp………...…………..…...865ml
Dissoudre le phénol dans l’éthanol ;
Ajouter l’auramine ;
Ajouter 875 ml d’eau distillée ;
Laisser séjourner pendant 24 heures à l’abri de la lumière ;
Filtrer le mélange dans le flacon en verre teinté soigneusement bouché.
Solution d’alcool acide à 0,5%
Acide chlorhydrique.………..………...………….. 5 ml Ethanol à 95%……… ……….... 995ml
Ajouter lentement l’acide chlorhydrique à l’alcool.
Solution de permanganate à 0,5%
Permanganate de potassium…………..……….5 g Eau distillée………1000 ml Ajouter le permanganate de potassium à l’eau puis mélanger.
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Annexe 2 : Préparation des réactifs pour la coloration de ziehl-Neelsen à chaud
Solution de fuchsine phéniquée à 1%
Ethanol………..…100ml Phénol acqueux………...55ml Fuchsine basique………...10g Eau distillée QSP……….…1000ml
- Dissoudre le phénol cristallisé dans l’alcool ;
- Ajouter la fuschine au mélange et mélanger jusqu’à l’obtention d’une solution homogène ;
- Ajouter l’eau distillée jusqu’à atteindre un volume de 1000 ml et mélanger de nouveau ;
- Transférer la solution dans un flacon.
Solution d’H2SO4 (acide sulfurique) à 25%
Eau distillée………...750ml Acide Sulfurique………..…….250ml
- Prendre 750ml d’eau distillée ;
- Plonger le flacon dans un bain de glace pour refroidir ;
- Ajouter lentement l’acide sulfurique en mélangeant régulièrement.
Solution de bleu de méthylène 0,1%
Bleu de méthylène………1g Eau distillée……….1000ml
Ajouter le bleu de méthylène à l’eau puis mélanger
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TABLE DES MATIERES
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II.2.3. Matériel et réactifs……….13
II.3. METHODES………14
II.3.1. Confection des frottis……….14
II.3.2. Préparation des colorants………..14
II.3.3. Technique de coloration et de lecture………...15
III.1. RESULTATS ………19
III.2. COMMENTAIRE………..27
CONCLUSION ET SUGGESTIONS...29
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...31
ANNEXE ... 34