REPUBLIQUE DU BENIN
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
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UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI ---
ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI
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DEPARTEMENT DE PRODUCTION ET SANTE ANIMALES (PSA)
Rapport de fin de formation
Pour l’obtention du Diplôme de Licence Professionnelle en Production et Santé Animales
THEME
Président du jury
Dr T. Jacques DOUGNON Examinateur
Dr Philippe SESSOU
Maître-Assistant des universités(CAMES) Enseignant-Chercheur à l’EPAC/UAC
Evaluation de la qualité microbiologique du crabe fumé vendu dans le marché Dantokpa
Superviseur :
Dr. Cyrille Kadoéito BOKO
Maître-Assistant des universités (CAMES) Enseignant-Chercheur à l’EPAC/UAC
9ème promotion
Année académique : 2015-2016 Présenté et soutenu par : Aujuvette B. P. HOUMENOU
Dédicaces
Nous dédions ce travail
A notre père Maxime HOUMENOU pour son soutien permanent, ses conseils et ses sacrifices ; trouve en ce travail l’amour du travail bien fait que tu nous as toujours appris. Longue vie à toi papa je t’aime
A notre mère Elise MEGNIHO pour ses conseils, encouragements et sacrifices, nous venons te montrer toute notre profonde reconnaissance à travers ce travail ; je t’aime.
Hommages
A notre Superviseur, Docteur Cyrille BOKO, Maître-Assistant des Universités (CAMES), Enseignant-Chercheur et Chef du Département de Production et Santé Animales (PSA) de l’École Polytechnique d’Abomey - Calavi (EPAC), pour avoir accepté de superviser ce travail. Ses précieux conseils, son appui scientifique et sa disponibilité malgré ses multiples occupations tout au long de ce temps de recherche nous ont permis de mener à bien ce travail. nous gardons de lui le souvenir d’un maître dévoué, rigoureux, soucieux du travail bien fait. Qu’il reçoive mes sincères hommages.
A notre président du jury, pour le grand sacrifice qu‘il nous a fait en acceptant de présider notre jury malgré ses nombreuses occupations. Hommage respectueux.
A tous nos membres du jury, pour le grand honneur qu’ils nous ont fait en acceptant de juger ce travail et d’y apporter leurs critiques constructives malgré leurs multiples occupations. Toutes nos profondes reconnaissances et considérations.
Remerciements
Nous tenons à remercier du fond du cœur :
Dieu Tout Puissant, Père éternel qui ne cesse de se révéler dans notre vie ;
Le Professeur Souaïbou FAROUGOU, Vice-Recteur Chargé de la Coopération Interuniversitaire, des Relations Extérieures et de l’Insertion Professionnelle, Responsable de l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales pour nous avoir accueillis dans son unité de recherche ;
Le Professeur Sahidou SALIFOU, Directeur du Laboratoire National de Parasitologie Vétérinaire ; Professeur agrégé de Parasitologie Vétérinaire au Bénin Enseignant-Chercheur en Production et Santé Animales pour ses enseignements et conseils.
Le Professeur Issaka YOUSSAO, Directeur du Laboratoire de Biotechnologie Animale et de Technologie des Viandes à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi, Enseignant-Chercheur en Production et Santé Animales pour ses enseignements et conseils ;
Le Professeur Benoît KOUTINHOUIN, Directeur-Adjoint du Centre de Pédagogie Universitaire et d’Assurance Qualité (CPUAQ) de l’Université d’Abomey-Calavi, Enseignant-Chercheur en Production et Santé Animales pour ses enseignements et conseils
Le Professeur Jacques DOUGNON, Maitre-Conférences des Universités du CAMES, Docteur Vétérinaire et Enseignant-Chercheur en Production et Santé Animales pour ses enseignements et ses conseils
Le Docteur Philippe SESSOU, Maître-Assistant des Universités (CAMES), Enseignant-Chercheur à l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC), pour l’intérêt particulier que vous avez accordé à notre travail.
Le Docteur Ulbad P. TOUGAN, Enseignant-Chercheur à l’Université de Parakou pour son aide, ses enseignements et ses conseils. Qu’il reçoive ici toute notre reconnaissance ;
Tous les enseignants de l’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) en particulier ceux du Département de Production et Santé Animales (DPSA) pour n’avoir ménagé aucun effort pour nous transmettre leurs savoirs. Qu’ils reçoivent ici nos sincères hommages mérités.
Le Docteur Régina Ekoua KRABI pour ses enseignements, sa sympathie et ses conseils.
Le Docteur Camus ADOLIGBE, Enseignant-Chercheur au Département de Production et Santé Animales pour ses conseils ;
Monsieur François DOSSA pour l’aide dont nous avions bénéficié durant ce travail ;
Monsieur Oscar Nestor AGUIDISSOU et Madame Alida YAMBODE pour leur précieuse collaboration
Monsieur Eric YESSINOU, Doctorant à l’Université d’Abomey-Calavi pour son aide, sa disponibilité et ses conseils ;
Toute l’équipe de l’Unité de Recherche en Biotechnologie de Production et Santé Animales à l’EPAC pour leur collaboration dans la réalisation de ce travail. Puisse le Seigneur les bénir
A Tous nos frères et sœurs en particulier Anicia et Anicette HOUMENOU qui nous ont toujours soutenus financièrement et moralement. Qu’ils reçoivent ici toutes nos reconnaissances.
Tous les étudiants de la 9ème promotion de licence en Production et Santé Animales
A tous ceux que nous n’avons pas nommés et qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce travail.
Table des matières
Dédicaces ... 1
Hommages ... 2
Remerciements ... 3
Table des matières ... 5
Liste des sigles et abréviations ... 8
Liste des tableaux ... 10
Liste des figures ... 11
Résumé ... 12
Abstract... 13
Introduction ... 14
PREMIERE PARTIE : Généralités ... 16
1. Généralités ... 17
1.1. Contexte du stage ... 17
1.2. Présentation de l’URBPSA ... 18
1.2.1. Historique et objectifs de l’URBPSA ... 18
1.2.2. Forces et Faiblesses ... 18
DEUXIEME PARTIE : ... 20
Activités menées et difficultés rencontrées ... 20
2. Activités menées et difficultés rencontrées ... 21
2.1. Activités menées ... 21
2.1.1. Préparation des milieux de culture ... 21
2.1.2. Technique de mise en culture des souches de Bacillus spp et des Lactobacilles ... 22
2.1.3 La lyophilisation ... 23
2.1.4. La coloration Gram ... 23
2.1.5. Dénombrement et recherche de microorganismes dans quelques denrées alimentaires ... 24
2.2. Difficultés rencontrées ... 25
2.3. Approches de solution ... 25
2.4. Problème identifié ... 25
TROISIEME PARTIE : ... 27
3.1 Généralités sur le crabe Callinectes amnicola ... 28
3.1.1. Morphologie du crabe Callinectes amnicola ... 28
3.1.2. Valeur nutritionnelle des crabes ... 28
3.1.3. Sources de contamination du crabe ... 29
3.1.4. Contaminations liées à l’air et aux poussières ... 29
3.1.5. Contaminations par les unités de production et de transformation .... 30
3.1.6. Généralités sur les différents germes rencontrés dans le crabe fumé . 30 3.2. Matériel et Méthodes... 35
3.2.1. Zone d’étude ... 35
3.2.2. Matériel biologique ... 35
3.2.3. Matériels de laboratoire ... 36
3.2.4 Méthodologie ... 37
3.2.5. Analyse statistique ... 40
3.3 Résultats et discussion ... 42
3.3.1. Résultats ... 42
3.3.2. Discussion ... 44
Conclusion et suggestions ... 46
Conclusion ... 46
Suggestions ... 46
Références bibliographiques ... 47
Annexes ... 52
Liste des sigles et abréviations
AFNOR : Association Française de Normalisation
AFSSA : Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments ASR : Anaérobie Sulfito-Réducteurs
Aw : Activité de l’eau BP : Baird Parker
CAMES : Conseil Africain Malgache de l’Enseignement Supérieur CE : Commission Européenne
DE : Direction de l’Elevage
DPSA : Département de Production et Santé Animales EPAC : Ecole Polytechnique d’Abomey Calavi
FMAT : Flore Aérobie Mésophile Totale.
FAO : Food and Agriculture Organization (Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture) GBH : Génie de Biologie Humaine
GC : Génie Civil
GEn : Génie de l’Environnement
GIMR : Génie d’Imagerie Médicale et de Radiologie GIT : Génie Informatique et Télécommunication GME : Génie Mécanique et Energétique
GTA : Génie de la Technologie Alimentaire ISO : International Standard Organization
LARBA Laboratoire de Recherche et d’Etude en Biologie Appliquée LMD : Licence Master Doctorat
MBH : Maintenance Biomédicale et Hospitalière MRS : Man Rogosa Sharp
PCA : Plate Acount Agar PIB : Produit Intérieur Brut
PSA : Production et Santé Animales
REESAO : Réseau pour l’Excellence de l’Enseignement Supérieur en Afrique de l’Ouest
SD : Sabouraud Dextrose Agar TSN : Trypticase Sulfite Néomycine UAC : Université d’Abomey Calavi
URBPSA : Unité de Recherche en Biotechnologies de la Production et Santé Animales
VRBG : Violet Red Bile Agar
Liste des tableaux
Tableau 1:Composition chimique et valeur nutritionnelle des crustacés ... 29 Tableau 2 : Charge microbienne des crabes fumés vendus à Dantokpa ... 43 Tableau 3:Corrélation entre les charges microbiennes ... 43
Liste des figures
Figure 1 : Crabe du genre Callinectes amnicola ... 28 Figure 2 : Crabes fumés achetés au marché Dantokpa ... 36 Figure 3 : Crabes fumés à broyer dans un mortier ... 38
Résumé
Le présent stage de fin de formation en Licence Professionnelle a été effectué du 20 Juin au 20 septembre 2016, à l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et de la Santé Animales (URBPSA) du département de Production et Santé Animales (PSA). Durant cette période, plusieurs activités ont été menées telles que la préparation des milieux de culture, la mise en culture des Bacillus spp et lactobacilles et leur lyophilisation, le dénombrement et la recherche des microorganismes d’intérêt en microbiologie alimentaire dans quelques denrées alimentaires, l’examen bactériologique des œufs non éclos et enfin la stérilisation et récupération du matériel de laboratoire. Durant ce stage, l’analyse microbiologique de 25 échantillons de crabes fumés vendus au marché Dantokpa a été entreprise. Les résultats de cette analyse révèlent que 100% des échantillons analysés ont des charges microbiennes supérieures à celle normative (5.104 ufc/g) exigée par la Direction Générale de l’Alimentation (France) pour les crabes et crustacées cuits. La charge microbienne moyenne des échantillons en flore totale est de 33.05.104 ufc/g. 32% et 20% respectivement des échantillons investigués ne sont pas satisfaisants en ce qui concerne les coliformes fécaux et Escherichia coli au regard des critères fixés par ce même guide. Les charges microbiennes en coliformes fécaux et Escherichia coli des échantillons sont respectivement de 28.69 ufc/g et 11.47 ufc/g. 44% des échantillons investigués ont des quanta microbiens en ASR (Anaérobies Sulfito-Réducteurs) supérieurs (4.8 ufc/g) à celui exigé (2 ufc/g). Par ailleurs, tous les échantillons sont exempts de Salmonella sp et présentent des charges microbiennes en S. aureus inférieures à celle exigée par la norme. Il faut signaler que les échantillons véhiculent des levures et moisissures avec des charges microbiennes respectives de 9.4.102 ufc/g pour les levures et 9.2.102 ufc/g pour les moisissures. En somme, l’étude révèle que les crabes analysés sont de qualité microbiologique non satisfaisante au regard des prescriptions normatives de Direction Générale de l’Alimentation (France). Les microorganismes responsables de cette mauvaise qualité sont les germes aérobies mésophiles totaux, les coliformes fécaux et les anaérobies sulfito-réducteurs. Les crabes fumés analysés présentent donc des risques pour la santé des consommateurs.
Mots clés : Qualité, microbiologie, crabe, fumé, Bénin
Abstract
In order to complete our professional Bachelor’s degree, we carried out from June 20 to September 20, 2016 a training at Biotechnology Research Unit of the Animal Health and Production (URBPSA) of the department of Animal Health and Production (PSA). During this period, several capacity building activities in Animal health and production were performed, especially in bacteriological analysis of food products. These included: Bacillus and lactobacilles culture and lyophilization, pathogenic bacteria research and counting in food products, bacteriological test of unhatched eggs, sterilization and recovery of the laboratory material. Furthermore, the microbiological analysis of 25 smoked crab samples sold from Dantokpa market were performed. The results of this analysis showed that 100% of samples analyzed have a microbial loads higher than normative (5.104 ufc/g) required by the French Legislative Guide (2000) for the crabs and crustacean cooked. The average microbial load of samples in Mesophilic Aerobic flora is 33, 05 104 ufc/g, 32% and 20%
respectively of investigated samples are unsatisfactory to the fecal coliforms and Escherichia coli according to the quality requirements this same guide. The microbial loads in coliforms fecal and Escherichia coli of samples are respectively 28.69 ufc/g and 11.47 ufc/g. 44% of investigated samples have microbial quanta in (Anaerobic Sulfito-Reducers) ASR higher (4,8 ufc/g) than required (2 ufc/g). In addition, all the samples are free from Salmonella sp and present microbial loads in S. aureus lower than that required by the standard. It should be announced that the samples present yeasts and moulds with microbial loads 9.4.102 ufc/g for yeasts and 9.2.102 ufc/g for the moulds. The study showed that the crabs analyzed are unsatisfactory microbiological quality according to the normative regulations of the French Legislative document. The micro-organisms responsible of this bad quality are Mesophilic Aerobic flora, the fecal coliforms and the anaerobic sulfito-reducers. The smoked crabs analyzed represent a risks to the consumers health.
Key words: Quality, microbiology, smoked crab, Dantokpa, Salmonella.
Introduction
Dans de nombreuses régions du monde, la pêche constitue l’une des principales activités menées par l’homme pour satisfaire ses besoins et contribuer à la lutte contre l’insécurité alimentaire. Au Bénin, la pêche tient une place relativement importante dans l’équilibre socio-économique national car elle fait vivre environ 500.000 personnes et contribue pour 3 % au PIB (Tossou, 2010). Parmi les produits de pêche, le crabe constitue l’un des aliments les plus appréciés au Bénin. L’espèce de crabe la plus consommée dans ce pays est Callinectes amnicola (Gnimadi et al., 2008 ). Elle a une grande importance socio- économique et nutritionnelle tant par sa valeur nutritionnelle que marchande et fait l’objet de commercialisation tant à l’échelle nationale qu’internationale (Kouton, 2004). Le crabe constitue une importante source de protéines animales pour les populations. Cependant, il est pêché dans des milieux aquatiques exposés à la pollution chimique, organique et surtout microbiologique (Dovonou, 2011). Ainsi, selon le lieu de pêche, des germes pathogènes ou des micropolluants le contaminent. Après la pêche, pour empêcher sa détérioration sous l’effet des microorganismes d’altération surtout, le crabe subit plusieurs traitements de préservation dont la congélation, la réfrigération, le grillage, le fumage et la cuisson (Degnon et al., 2012). Au Bénin, le fumage constitue l’une des méthodes les plus utilisées de conservation du crabe et se fait de façon traditionnelle. Au cours du processus de fumage qui est à chaud, la fumée constitue un facteur essentiel dont les constituants exercent des actions sur le crabe, notamment sur ses qualités organoleptiques et sur sa flore d’altération.
L’action bactérienne de la fumée est cependant sélective pour les flores microbiennes rencontrées sur le crabe (Degnon et al., 2013). Il peut donc y subsister après fumage des microorganismes susceptibles de provoquer chez les consommateurs des toxi-infections alimentaires dont certaines sont de véritables
problèmes de santé publique. De plus, après fumage, cette denrée est exposée dans des conditions peu hygiéniques pouvant induire une recontamination. La littérature consultée révèle un manque d’informations sur la qualité sanitaire du crabe fumé vendu au Bénin. Il s’avère donc important d’apprécier la qualité microbiologique de ce produit en vue d’évaluer le risque que représente sa consommation. C’est dans cette optique qu’au cours de notre stage à l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales (URBPSA), nous avons choisi d’évaluer la qualité microbiologique des crabes fumés vendus dans le marché Dantokpa.
L’objectif général de ce stage est de renforcer nos capacités techniques en Production et Santé Animales notamment en microbiologie ;
L’objectif spécifique est d'évaluer la qualité microbiologique des crabes fumés vendus dans le marché Dantokpa.
Le présent document est subdivisé en trois parties :
la première porte sur les généralités;
la deuxième fait le point des activités menées et des difficultés rencontrées au cours de notre stage et ;
la troisième a été consacrée à l’évaluation de la qualité microbiologique des crabes fumés vendus dans le marché Dantokpa.
PREMIERE PARTIE : Généralités
1. Généralités
1.1. Contexte du stage
L’Ecole Polytechnique d’Abomey-Calavi (EPAC) de l’Université d’Abomey- Calavi a été créée par le décret N° 2002-551 du 16 décembre 2002, modifié par le décret N° 2005-078 du 25 février 2005 portant création, attribution, organisation et fonctionnement de L’EPAC. C’est un établissement public d’Enseignement Supérieur, de Formation Technique et Professionnelle à caractère de grande école dotée d’une autonomie financière et d’un règlement pédagogique. Les domaines de compétences de l’EPAC couvrent deux secteurs - clés organisés en deux grands blocs, le secteur industriel et le secteur biologique comprenant dix départements:
le secteur industriel comprend cinq départements: Génie Civil, Génie Electrique, Génie Informatique et Télécommunication, Génie Mécanique et Energétique, Génie Biomédicale et Maintenance Hospitalière ;
le secteur Biologique est composé de cinq Départements: Analyse Biomédicale, Imagerie Médicale, Génie de l'Environnement, Production et Santé Animales et Génie de la Technologie Alimentaire.
Dans le cadre de la professionnalisation de l'enseignement supérieur, la formation en licence Professionnelle a été instaurée dans le secteur biologique depuis l'année académique 2005-2006. Cette formation se renforce aujourd’hui avec les réformes LMD (Licence, Master, Doctorat) en cours dans l’espace REESAO où l'EPAC joue un rôle primordial. La formation en Licence Professionnelle à l'EPAC dure trois ans répartis en six semestres dont cinq sont destinés aux cours théoriques, aux travaux pratiques et aux stages en entreprise.
Les stages en entreprise visent à mettre les apprenants en contact avec les réalités du milieu professionnel, et durent un mois par an. En fin de formation, la dernière session du cursus est réservée à un stage pratique à l’issue duquel un rapport est rédigé et soutenu par l’apprenant. C’est dans ce contexte que nous avons choisi de faire nos stages à l’Unité de Recherche en Biotechnologie de la Production et Santé Animales : URBPSA de l’EPAC, afin de renforcer nos
connaissances acquises au cours des trois années de formation. Ce stage a été réalisé du 20 juin au 20 septembre 2016.
1.2. Présentation de l’URBPSA
1.2.1. Historique et objectifs de l’URBPSA
L’URBPSA est une unité de recherche créée et intégrée au LARBA le 03 avril 2009. Elle est dirigée par le Professeur Souaïbou FAROUGOU, Professeur Titulaire des Universités (CAMES). Ce dernier est assisté d’une équipe constituée de Maîtres de Conférences (CAMES), de Maîtres Assistants (CAMES) et des Assistants. Cette unité accueille des mémorants et des doctorants pour leur stage de fin de formation. Le laboratoire réunit des spécialistes en pathologies animales, en parasitologie, en microbiologie, en zootechnie, en normes et contrôle de qualité et génétique animale. Le domaine de compétences de base de cette unité est le contrôle de la qualité des aliments, la microbiologie, les pathologies infectieuses et la parasitologie. Le programme de recherche de l’URBPSA est centré autour des thématiques ci-dessous :
- amélioration génétique des animaux domestiques
- tiques du bétail et pathologies transmises
- qualité microbiologique des aliments
- conservation des aliments
- pathologies infectieuses des animaux domestiques.
Cette unité possède un laboratoire d’acarologie mis en service en mai 2015. Ce laboratoire est spécialisé dans la recherche des méthodes de lutte endogène contre des tiques résistantes sur le terrain contre les acaricides de synthèse.
1.2.2. Forces et Faiblesses
Forces
L’URBPSA est conduit par un personnel dynamique et qualifié qui assure sa bonne marche. Cette unité de recherche, à travers son responsable, s’est dotée de deux bâtiments. Le premier, destiné à la microbiologie, à l’immunologie et aux
pathologies infectieuses, est équipée de matériels et de consommables dont les principaux sont : trois étuves, deux spectrophotomètres, un bain marie, deux centrifugeuses, un four à microondes, un microscope photonique (Olympus), deux microscope stéréoscopiques, une hotte à flux Laminaire, une balance électronique, trois réfrigérateurs, un congélateur, deux ordinateurs de bureau, un thermocycleur, un dispositif pour électrophorèse en gel d’agarose, des milieux de culture et autres réactifs pour la mycologie et la bactériologie, des consommables pour la parasitologie et des ouvrages didactiques et de recherche (collections d’articles). Le deuxième bâtiment mis en service en mai 2015, dispose d’une étable, d’un laboratoire d’acarologie, d’une salle polyvalente et d’un bureau pour les assistants. En plus de ces matériels, l’URBPSA dispose d’une connexion internet qui permet aux étudiants et aux différents chercheurs de faire leurs travaux dans de très bonnes conditions. Les recherches dans cette unité de recherche se font en collaboration avec d’autres laboratoires avec lesquels l’URBPSA partage des intérêts communs.
Faiblesses
L’URBPSA est un laboratoire très bien équipé et très organisé mais il présente également des insuffisances telles que :
- l’inexistence d’un lyophilisateur pour le séchage à froid
- l’inexistence de groupe électrogène pour l’alimentation du laboratoire en cas de coupure d’électricité
DEUXIEME PARTIE : Activités menées et difficultés
rencontrées
2. Activités menées et difficultés rencontrées
Au cours de notre stage à l’URBPSA, plusieurs activités ont été menées. Il s’agit entre autres de la préparation des milieux de culture, de la mise en culture des Bacillus spp et lactobacilles et de leur lyophilisation, du dénombrement et de la recherche des microorganismes d’intérêt en microbiologie alimentaire dans quelques denrées alimentaires, de l’examen bactériologique des œufs non éclos et enfin de la stérilisation et récupération du matériel de laboratoire. Toutefois, nous avions eu à faire face à quelques difficultés auxquelles nous avions proposés des approches solutions durant notre stage.
2.1. Activités menées
2.1.1. Préparation des milieux de culture
Le milieu de culture est l’ensemble de substances contenant des éléments nutritifs quantitatifs et qualitatifs pour la croissance des microorganismes mais aussi pour leur entretien. Il existe des milieux solides (gélose) et des milieux liquides (bouillon).Les milieux de cultures qui ont été utilisés sont des milieux commercialisés sous forme de milieux complets déshydratés. Ainsi, pour la préparation, les milieux déshydratés ont été pesés et dissous dans de l’eau distillée suivant les indications du fabriquant. Les milieux ont été mis au bain marie à vapeur fluente et certains ont été stérilisés en plus à l’autoclave à une température de 121°C pendant 15 mn selon l’indication du fabriquant. Après refroidissement ces milieux ont été coulés dans des boîtes de Pétri (gélose) ou distribués dans les tubes à vis (bouillon). Les milieux préparés ont été conservés au réfrigérateur à une température de 3 à 5°C pour être utilisés ultérieurement.
Les milieux qui ont été préparés sont :
Mac-Conkey sur lequel poussent les bactéries à gram- ;
XLD : Xylose Lysine Désoxycholate pour l’isolement des entérobactéries pathogènes et notamment des Shigella et des Salmonella ;
Rappaport Vassiliadis (RV) pour l’enrichissement et la multiplication des salmonelles;
L’EPT : Eau Peptonnée Tamponnée qui est un bouillon et un milieu de revivification ;
Le diluent pour faire les dilutions décimales ;
Le PCA : Plate Count Agar utilisé pour la recherche de la flore totale ;
le milieu VRBG (violet cristal, rouge neutre, bile, glucose) utilisé pour la recherche des coliformes fécaux ;
Le SD : Sabouraud Dextrose Agar utilisé pour la culture des levures et moisissures ;
Le BP : Baird Parker utilisé pour la recherche des staphylocoques ;
Le TSN : Trypticase - sulfite - néomycine (TSN) pour la recherche des anaérobies sulfito-réducteurs;
Bouillon nutritif qui constitue un milieu d’utilisation générale pour un grand nombre de microorganismes ne présentant pas d’exigences ;
la gélose nutrient pour la culture de différentes bactéries (Gram+ ou Gram-);
Le Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant : BLBVB pour l’identification des coliformes totaux et fécaux ;
L’Eau Peptonnée Exempt d’Indole pour la mise en évidence de l’indole qui caractérise la présence d’Escherichia coli.
EMB : Eosine Blue Methylen pour la confirmation de la présence des E. coli 2.1.2. Technique de mise en culture des souches de Bacillus spp et des Lactobacilles
Les cultures de Bacillus spp et des Lactobacilles ont été faites respectivement sur des géloses Nutrient et Man Rogosa Sharp (MRS) préalablement préparées et coulées dans des boites de Pétri stériles. Les boîtes de Pétri ensemencées ont été incubées à 37°C pendant 24h pour les Bacillus et 48h pour les lactobacilles.
Après incubation et dénombrement des différentes bactéries, celles-ci ont été ensuite récoltées pour la lyophilisation.
2.1.3 La lyophilisation
La lyophilisation est un procédé industriel qui permet la sublimation de l’eau contenu dans un produit. C’est une technique de séchage à froid qui permet de retirer l’eau d’un produit et de l’obtenir sous forme de poudre. Ici, on procède à la récolte des colonies de chaque bactérie dans un tube contenant 9 ml d’eau peptonnée tamponnée ; on y ajoute du lait et du glycérol pour protéger la paroi des bactéries contre le froid puisque le mélange sera conservé au congélateur.
Après 24h de congélation, les flacons sont déposés dans le lyophilisateur pendant 30heures pour l’obtention des souches lyophilisées.
2.1.4. La coloration Gram
La coloration de Gram est une méthode d’identification des bactéries G- et des bactéries G+.
2.1.4.1. Confection du frottis
Une goutte d’eau stérile a été déposée sur une lame porte objet puis une colonie isolée de bactérie a été ajoutée à l’aide d’une anse de platine flambée. Le mélange a été étalé puis fixé à la chaleur de la flamme du bec Bunsen. La lame séchée a été posée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.
2.1.4.2. La coloration proprement dite
L’étalement fixé a été coloré au violet de gentiane. Une minute après, nous l’avons rincé à l’eau distillée. Ensuite l’étalement a été mordancé au Lugol pendant 30 secondes puis rincé à l’eau distillée. Ensuite, l’alcool a été versé goutte à goutte sur la lame inclinée pour la décoloration. L’alcool a été rincé après 5 à 10 secondes à l’eau distillée. L’étalement a été recoloré par la fuschine.
Une minute après, cette solution a été lavée à l’eau distillée. La lame a été séchée entre deux feuilles de papier absorbant avant son observation au microscope à l’objectif x 100 avec une goutte d’huile à immersion.
2.1.5. Dénombrement et recherche de microorganismes dans quelques denrées alimentaires
A l’URBPSA, plusieurs travaux de recherche ont été menés sur la qualité microbiologique de différentes denrées alimentaires. Il s’agit de la viande de porcs abattus à l’Abattoir de Cotonou et sur les aires d’abattages, de la viande ovine prête à consommer vendue sur les parcs Routiers de Bohicon et d’Hilla- Codji, des crabes crus pêchés dans les lacs et lagunes du sud-Bénin, la chair d’escargot vendue à Allada et à Comè, le poulet braisé vendu au bord des rues, le riz vendu à l’hôpital de zone de Calavi, le poisson chinchard congelé vendu dans les poissonneries dans la commune de Toffo et le jus d’ananas produit dans la commune d’Allada. Plusieurs catégories de germes ont été dénombrées et/ou recherchées par différentes techniques telles que : la flore totale par la technique d’ensemencement en masse avec la gélose PCA (Plate Count Agar), les coliformes totaux et fécaux par la technique de NPP (Nombre Plus Probable) avec le BLBVB (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant) ou par la technique d’ensemencement en masse en double couche avec la gélose VRBG (Violet Red Bile Glucose), les Anaérobies sulfito-réducteurs par la technique d’ensemencement en masse en double couche dans des tubes avec la gélose TSN (Trypticase Sulfite Néomycine), les staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus) par la technique d’ensemencement en surface (étalement) avec la gélose BP (Baird Parker), les levures et moisissures par la technique d’ensemencement en surface avec la gélose SD (Sabouraud Dextrose) au chloramphénicol. Les souches de Salmonella ont été recherchées dans ces produits analysés suivant la norme NF EN ISO 6579 :2002.
2.2. Difficultés rencontrées
Durant notre stage à l’URBPSA, nous avons été confrontés à quelques difficultés. Il s’agit :
- des coupures périodiques et régulières d’eau et du courant électrique qui ont entravé le bon déroulement de nos activités au laboratoire ;
- du dysfonctionnement de certains appareils de stérilisation.
- de l’insuffisance des matériels de laboratoire 2.3. Approches de solution
Les difficultés que nous avions eues à rencontrer ne sont pas restés inertes aux approches de solutions. Ainsi pour palier à ces difficultés nous pouvons :
- mettre en place un forage pour l’approvisionnement en eau
- mettre à la disposition de l’URBPSA un groupe électrogène pour palier au problème de délestage
- écrire des projets de recherches pour bénéficier de fonds pour les recherches
- équiper le laboratoire des matériels et d’appareils de stérilisation - mettre en place une équipe dynamique de réparation des appareils
2.4. Problème identifié
Le crabe fumé obtenu par procédé traditionnel de fumage au Bénin est une source non négligeable de protéines animales pour les populations.
Malheureusement, ce produit de pêche est transformé et vendu dans des conditions peu hygiéniques pouvant entraîner sa contamination par des microorganismes pathogènes et par voie de conséquence affecter la santé du consommateur. La littérature consultée révèle un manque de données sur la qualité microbiologique du crabe fumé et vendu au Bénin. Il s’avère donc
important d’évaluer la qualité microbiologique de cette denrée en vue d’évaluer les risques que courent les consommateurs.
TROISIEME PARTIE :
Evaluation de la qualité microbiologique des
crabes fumés vendus dans le marché Dantokpa
3.1 Généralités sur le crabe Callinectes amnicola 3.1.1. Morphologie du crabe Callinectes amnicola
Le crabe est un invertébré crustacé décapode brachyoure (courte queue) de l’embranchement des Arthropodes. Les crustacés sont des animaux invertébrés au corps formé de segments articulés. Ils sont fondamentalement constitués de trois parties : la tête, le thorax et l’abdomen (Miserey, 2005). Le corps du crabe est formé de la fusion de la tête et du thorax (céphalothorax) qui sont recouverts par une carapace et portent latéralement cinq paires de pattes ambulatoires.
Callinectes amnicola a une carapace quadrangulaire épaisse, grossièrement granulée de couleur brun verdâtre et portant des épines antérolatérales généralement longues. La première paire de pattes est transformée en pinces dissymétriques qui servent à la nutrition et à la défense. Les quatre autres paires servent à la locomotion et/ou à la natation. Les individus possèdent une paire d’yeux et une pièce buccale (Miserey, 2005). Cette espèce atteint des tailles beaucoup plus importantes (12,2 cm de long chez le mâle et 14,9 cm de long chez la femelle).
Figure 1 : Crabe du genre Callinectes amnicola
3.1.2. Valeur nutritionnelle des crabes
La chair des crustacés est riche en eau, en azote non protéique, en histidine, en tryptophane, en phosphore, en vitamines et contient peu de glucides (Guiraud et Galzy, 1980). Le tableau ci-dessous donne la composition chimique et la valeur nutritionnelle moyenne de 100 grammes de partie comestible (FAO, 1979).
Tableau 1:Composition chimique et valeur nutritionnelle des crustacés
Constituants Valeurs
Eau (ml) 77,00
Energie (calories) 94,00
Protéines (g) 18,00
Lipides (g) 1,50
Glucides (g) 1,50
Cellulose (g) 2,00
Calcium (mg) 100
Fer (mg) 5,00
Thiamine (mg) 0,05
Riboflavine (mg) 0,10
Niacine (mg) 2,50
Source : FAO, 1979
3.1.3. Sources de contamination du crabe
La contamination primaire de matières premières alimentaires se fait par l’eau, le sol, l’air et les poussières. Lorsqu’elles sont transformées, les matières premières subissent de nouvelles contaminations propres au contexte de l’unité de transformation (ambiances, surfaces, eau, matériels, personnels etc.) et aux processus technologiques qui conduisent au produit fini.
3.1.4. Contaminations liées à l’air et aux poussières
L’atmosphère environnant les produits alimentaires contient de nombreuses particules dont le nombre peut varier de quelques centaines de milliers à plusieurs millions de germes par m3. Parmi ces particules 103 à 104 sont des unités formant des colonies (Bourgeois et al., 1996). La contamination microbienne atmosphérique est surtout constituée par des bactéries, des moisissures (Aspergillus, Penicillium etc.) et plus rarement des levures
(Torulopsis). Parmi les bactéries, prédominent les sporulées et les Micrococcus (Zimmer-mann et Nikodermusz, 1981). Les produits alimentaires sont exposés à cette contamination lorsqu’ils ne sont pas protégés par un emballage.
3.1.5. Contaminations par les unités de production et de transformation L’unité de transformation et son environnement sont la source de nouvelles contaminations qui s’ajoutent à la contamination antérieure. Les responsables de ces nouvelles contaminations sont encore l’air, le sol et l’eau. Mais il faut signaler également l’importance des équipements et le vendeur. Le vendeur est sans doute la principale source de contamination surtout quand il est en contact prolongé avec les produits. L’homme produit des particules en grande quantité, et proportionnellement à son activité (de 100.000 à 10.000.000 par minute) (Bourgeois et al., 1996). Parmi elles, nombreuses sont des germes pathogènes ou non, ou en sont porteuses (Lucas, 1980). Les principales sources sont la sphère oro-nasale, le système pileux, les mains et les vêtements. Le risque de contamination à partir des surfaces en contact avec les produits est très élevé. Il s’agit notamment des cuves, outils, emballages etc. La nature des matériaux est déterminante (Ehedg, 1993). Les matériaux naturels sont les plus contaminants (bois, papiers etc.) et on leur préfèrera les plastiques et les métaux inoxydables.
La présence de zones difficilement nettoyables sur les outils est aussi cause des contaminations (Lelieveld et al., 1992). La contamination par les surfaces a été maintes fois démontrée (Sinigaglia, 1992) dans toutes les branches de l’industrie alimentaire. Les biofilms qui se développent suite à l’adhésion, puis à la croissance des microorganismes sont en grande partie source de contamination par les surfaces (Tijhuis et al., 1994).
3.1.6. Généralités sur les différents germes rencontrés dans le crabe fumé Les différents germes susceptibles de contaminer le crabe fumé sont les germes aérobies mésophiles, les staphylocoques, les anaérobies sulfito-réducteurs, les coliformes fécaux et E. coli ainsi que les salmonelles. La probabilité pour que la
plupart des bactéries responsables d’infections digestives chez l’homme provoquent de graves maladies est faible en cas de cuisson adéquate du crabe avant consommation. Toutefois, il existe un risque indirect car ces bactéries peuvent s’avérer être des germes de toxi- infection alimentaire (Huss, 1995) et des pathogènes opportunistes.
3.1.6.1. Les germes aérobies mésophiles : la flore totale
Les germes aérobies mésophiles sont les différents microorganismes pathogènes ou non susceptibles de se retrouver dans un aliment. Il s’agit des germes aérobies pouvant se multiplier dans des conditions ambiantes à 30°C (Bonnefoy et al., 2002) et ne constituant pas une famille bactérienne particulière. Cette flore regroupe les Enterobacteriaceae, les Bacillus, les staphylocoques, Pseudomonas, les bactéries lactiques ou autres agents éventuellement pathogènes. La flore totale renseigne sur l’hygiène globale de l’aliment. La présence en grand nombre de microorganismes aérobies mésophiles sur un aliment montre qu’il y a eu une contamination lors de la préparation ou lors du stockage associée à un développement microbien à un moment donné au cours de la préparation, du stockage ou tout au long de la période de stockage.
3.1.6.2. Les salmonelles
Les bactéries du genre Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Ce genre regroupe de petits bacilles, Gram négatif habituellement mobiles par des cils péritriches, mais des mutants immobiles peuvent exister (S. gallinarum). Ces bactéries mesurent 0,7 à 1,5 μm de diamètre, pour 2 à 5 μm de longueur et sont aéro-anaérobies facultatives, oxydase négative et nitrate réductase positive.
L’ingestion de souches de Salmonella sp par l’homme peut provoquer de nombreuses infections appelées salmonelloses, notamment des fièvres typhoïde et paratyphoïde (dues à des sérovars strictement humains : Salmonella typhi, S.
paratyphi A et à un degré moindre S. Paratyphi B transmis par l’eau et les aliments souillés) et des gastro-entérites et toxi-infections alimentaires
collectives (dues à des sérovars ubiquitaires pouvant transiter chez l’homme et chez l’animal). Le nombre de germes pouvant provoquer une maladie infectieuse est parfois très faible (de l’ordre de 1 à 50 par 100g de produit) et dépend de l’espèce et du consommateur qui peut exprimer une fièvre de 39°C à 40°C, des douleurs abdominales, des nausées, des vomissements et un syndrome diarrhéique caractérisé par des selles liquides et fétides (AFSSA, 2002).
3.1.6.3. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positive, non sporulée, coagulase positive, à coque mesurant 0,5 à 1μm de diamètre souvent disposé en grappe et appartenant à la famille des Micrococcaceae. Cette espèce fait partie des bactéries aéroanaérobies facultatives, mais préférant le métabolisme aérobie.
C’est un germe mésophile, capable de se multiplier entre 4°C et 46°C. Cette bactérie est halophile et xérophile car elle se développe même en présence de sel et du sucre et survit dans les aliments déshydratés (Fosse et Margas, 2004 ; Bailly et al., 2012).
Staphylococcus aureus a la capacité de produire des toxines dans l’aliment dont l’ingestion provoque une intoxination. Tous les staphylocoques présents dans les aliments ne sont pas entéro-toxinogènes mais 70-80 % des souches produisent des exotoxines dont les entérotoxines staphylococciques A, B, C1, C2, C3, D, E et H, la toxine du choc toxique staphylococcique et les toxines exfoliatives A et B (Cavalli, 2003). La toxinogénèse a lieu pendant la phase exponentielle de croissance, pour une température comprise entre 10°C et 45°C (Fosse et Margas, 2004).
Chez l’homme, Staphylococcus aureus est un germe commensal de la cavité nasale. Il vit dans les glandes sébacées et sudoripares et les bulbes pileux. Le principal site pour les mains est le bout des doigts (en relation avec l’habitude de se gratter le nez). La contamination des produits de pêche est donc possible au moment de l’éviscération, du décorticage et surtout chaque fois qu’il y a un contact direct entre l’homme et les denrées. S. aureus est alors admis comme
germe indicateur de contamination humaine (ou animale ou originelle) dans les aliments (aliments crus en particulier). Cette notion permet donc d’accepter des staphylocoques en petit nombre dans les aliments. Le risque d’intoxination devient grand lorsque leur nombre atteint ou dépasse 10 000/g d’aliment (Larpent, 2000).
Les troubles tels que nausées, vomissements et diarrhées peuvent apparaître chez les consommateurs après ingestion d’un aliment contenant les toxines.
L’entérotoxine staphylococcique étant très stable à la chaleur, la simple cuisson reste inefficace pour assurer la destruction de la toxine et assainir en toute sécurité un produit de viande contaminé. Il va falloir éviter la contamination ou s’opposer à la multiplication du germe et à la sécrétion de la toxine en ne traversant pas la zone dangereuse (20°C- 50°C) ou en n’y résidant que fort peu de temps (ne jamais dépasser une heure).
3.1.6.4. Les coliformes fécaux et E.coli
Ce sont des bacilles gram négatifs, aérobie-anaérobie facultatifs, dépourvus d’oxydase, fermentant le lactose. Les coliformes fécaux sont un sous-groupe des coliformes totaux et comptent parmi leurs membres des espèces de bactéries comme Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. La bactérie Escherichia coli est l’indicateur d’agents entéropathogènes le plus fiable, et donc le meilleur moyen de détecter une contamination fécale récente (Edberg et al., 2000).
Escherichia coli (colibacille) est une entérobactérie mobile capable de fermenter le lactose et de produire de l'indole. E. coli fait partie de la flore commensale du tube digestif de l'homme et de nombreux animaux. Cependant, certaines souches d’E.coli peuvent être pathogènes, entraînant alors des gastro-entérites, infections urinaires, méningites. Il représente à lui seul la plus grande partie de la flore bactérienne aérobie de l'intestin (espèce aérobie dominante) à raison de 108 par gramme de fèces sur une flore totale de 1011 à 1012 bactéries par gramme.
Les coliformes fécaux sont plus spécifiques de contaminations fécales (mauvais lavage des mains, produits contaminés lors de l’éviscération, de l’exposition ou
de la vente) ou de contaminations telluriques. Bien que la présence de coliformes fécaux témoigne habituellement d’une contamination d’origine fécale, plusieurs coliformes fécaux ne sont pas d’origine fécale, provenant plutôt d’eaux enrichies en matière organique, tels les effluents industriels du secteur des pâtes et papiers ou de la transformation alimentaire (Barthe et al., 1998 ; OMS, 2000).
La recherche de E. coli et des coliformes fécaux est réalisée pour surveiller la contamination d’origine fécale d’aliments n’ayant pas subi de traitements destinés à détruire les entérobactéries : les crustacés et les mollusques par exemple. La recherche des coliformes fécaux est souvent préférée à celle d’E.
coli en raison de sa rapidité.
3.1.6.5. Les levures et moisissures
Les levures et moisissures sont des agents importants de détérioration des aliments acides ou à faible activité d’eau. Les mycotoxines qu’ils excrètent et présentes dans les aliments inspirent des préoccupations croissantes.
3.1.6.6. Les anaérobies sulfito-réducteurs
Ces bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont des hôtes normaux de l’intestin de l’homme et des animaux, mais on les rencontre fréquemment dans la nature et en particulier dans le sol (bactéries telluriques) et dans les matières organiques en cours de putréfaction. Ces germes sont très résistants en raison de leur caractère sporulé. Ils sont souvent, quelques fois avec d’autres germes sporulés, les seuls survivants d’une contamination ancienne de l’aliment. Parmi les Clostridium sulfito-réducteurs, C. perfringens occupe une place très importante:
en effet, ce germe est très souvent à l’origine de toxiinfections d’origine alimentaire.
Clostridium perfringens est un bacille Gram positif sporulé, tellurique, anaérobie strict, sulfito-réducteur et immobile de la famille des Bacillaceae.
Cette espèce est thermophile, sa température optimale de croissance étant comprise entre 40 et 45°C, mais elle est toutefois capable de se développer à des
températures comprises entre 15°C et 50°C. Les spores thermosensibles de C.
perfringens résistent 5 minutes à 100°C et produisent l’entérotoxine qui est responsable des intoxications alimentaires (Cavalli, 2003; Fosse et Margas, 2004). Le seuil au-dessus duquel il y a intoxication est 105 ufc/g (AFSSA, 2006). C’est une bactérie tellurique largement répandue dans l’environnement qui peut contaminer les sédiments.
Ce germe ubiquiste est un hôte normal du tube digestif des animaux et de l’homme. La chair de crabe peut être contaminée au moment de l’éviscération et après un traitement thermique non adéquat pour détruire les spores. L’homme se contamine en ingérant des aliments contenant des bactéries. Les denrées incriminées sont les préparations conservées à l’abri de l’air (masses importantes, immersion dans un liquide, emballage étanche), refroidies lentement puis réchauffées lentement, ce qui favorise la multiplication des bactéries et la production de toxines (AFSSA, 2006). Les symptômes apparaissent entre 6 et 24 h, généralement 10 à 12 h, après l’ingestion du repas contaminé. Ils se traduisent surtout par la diarrhée et de violents maux de ventre, parfois de nausées. Le plus souvent, cette affection guérit spontanément en 2-3 jours. Toutefois, des mortalités ont été observées chez des personnes âgées et des jeunes enfants.
3.2. Matériel et Méthodes 3.2.1. Zone d’étude
Nos prélèvements ont été effectués dans le marché Dantokpa situé dans le département du littoral. Ce marché a été choisi car il représente le plus grand marché du Bénin où les productrices de crabes fumés viennent distribuer leurs produits.
3.2.2. Matériel biologique
Le matériel biologique de cette étude est constitué de crabes fumés de l’espèce Callinectes amnicola.
Figure 2 :Crabes fumés achetés au marché Dantokpa 3.2.3. Matériels de laboratoire
Au nombre de tous les matériels que nous avons utilisés pour notre recherche, nous pouvons citer :
une balance de capacité 220g et de précision 10-4g pour quantifier les milieux de culture et les échantillons
les tubes à vis et capotex pour la répartition des bouillons et la culture des spores d’anaérobies sulfito-réducteurs
les flacons de 500ml pour la préparation des milieux de culture et pour la préparation des suspensions mères
les boites de Pétri en plastique et en verres stériles pour la mise en culture des germes
les pipettes graduées de 1 à 5ml et les pipettes pasteur pour effectuer les dilutions et le prélèvement des solutions
les portoirs pour disposer les tubes
le vortex pour l’homogénéisation du contenu des tubes
l’incubateur et les étuves pour incuber les bactéries et leur permettre de se multiplier
un bain-marie utilisé pour homogénéiser et aussi pour fondre les milieux de culture ;
deux autoclaves pour la stérilisation des milieux de culture et des matériels et la destruction des bactéries après dénombrement
des réfrigérateurs pour la conservation des milieux de culture, des bactéries et tous les objets stériles
plaque chauffante pour la destruction des milieux contenus dans les boites de Pétri
des marqueurs à encre indélébile pour marquer les échantillons, tubes, flacons et boites de Pétri
du papier aluminium pour couvrir les matériels pour la stérilisation et la conservation
du ruban adhésif pour étiqueter tous les milieux de cultures déjà préparés afin de les identifier
3.2.4 Méthodologie
3.2.4.1. Technique d’échantillonnage
Cinq (5) échantillons de crabes fumés ont été prélevés par semaine chez cinq vendeuses choisies au hasard dans le marché pendant le stage. Les prélèvements ont été mis dans des sachets stériles qui ont été soigneusement étiquetés avec tous les renseignements afférents au produit puis déposés dans une glacière contenant des carboglaces congelés. Les échantillons ont été acheminés au laboratoire où ils ont été immédiatement analysés. L’échantillonnage s’est déroulé sur cinq semaines et au total 25 échantillons de crabes fumés ont été prélevés dans le marché de Dantokpa.
3.2.4.2. Préparation de la suspension-mère et des dilutions décimales
25g de chaque échantillon ont été prélevés de manière aseptique et broyés à l’aide d’un mortier stérile. 225 ml d’eau peptonnée alcaline stérile à 2 % de NaCl ont été ensuite ajoutés au broyat. Le mélange homogénéisé constitue la suspension-mère.
Pour la préparation des dilutions décimales, 1 ml de la suspension-mère a été mis dans un tube à essai contenant 9 ml de diluant (Tryptone sel) et homogénéisé. La dilution 10-1 a été ainsi obtenue. Ensuite, 1ml de la dilution 10-
1 a été ajouté à 9 ml de diluant contenu dans un autre tube à essai pour obtenir la
dilution 10-2. Des dilutions décimales successives ont été ainsi réalisées jusqu’à la dilution 10-6.
Figure 3 :Crabes fumés à broyer dans un mortier 3.2.4.3. Dénombrement de la flore totale
Le dénombrement de la flore totale a été réalisé selon la norme ISO 4833: 2003.
1ml de chacune des dilutions a été prélevé à l’aide de pipettes stériles puis déposé dans des boites de Pétri stériles. Nous y avons ensuite coulé 10 à 15 ml du milieu Plate Count Agar (PCA OXOID CM0463) maintenu en surfusion à une température de 45°C puis l’ensemble a été parfaitement homogénéisé. Après solidification complète, les boîtes de Pétri ont été retournées et incubées à 30°C pendant 72 heures. Le dénombrement a été fait après 24 heures, 48 heures et 72 heures pour éviter l’entassement. La lecture a été faite par comptage des boîtes contenant entre 30 et 300 colonies.
Les résultats ont été exprimés par gramme de produit. Pour chaque type de microorganisme dénombré, le nombre de germes a été exprimé en Unité Formant Colonies par gramme de produit initial (ufc/g) et déterminé par la formule suivante :
𝐍 = (𝐧𝟏+𝟎,𝟏𝐧𝟐)𝐱𝐝𝟏∑𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐞𝐬 Avec N : le nombre d’UFC par gramme de produit initial, n1 : le nombre de boîtes considérées à la première dilution retenue ;
n2 : le nombre de boîtes considérées à la seconde dilution retenue ; d1 : le facteur de la première dilution retenue.
3.2.4.4. Dénombrement des coliformes fécaux
Le dénombrement des coliformes fécaux a été fait sur gélose VRBG (violet cristal, rouge neutre, bile, glucose,) selon la norme ISO 4832:2006. Après ensemencement de 1 ml de chaque dilution dans la boite de Pétri stérile, 13 ml de VRBG maintenu en surfusion à une température de 45°C ont été coulés en première couche puis l’ensemble a été parfaitement homogénéisé. Après solidification, une seconde couche de 9 ml de VRBG a été coulée. Les boîtes ont été incubées à 44°C pendant 24 à 48 heures. Les colonies caractéristiques rouges violacées d’un diamètre de 0,5 mm avec halo de précipité de sels biliaires ont été dénombrées en profondeur de la masse de gélose sur les boites contenant 15 à 150 colonies.
3.2.4.5. Technique de dénombrement d’Escherichia coli
Escherichia coli a été dénombré selon la norme AFNOR BRD- 07/1-07/93 ; la démarche consiste à repiquer des colonies suspectes de coliformes fécaux sur la gélose EMB. L’aspect vert brillant des colonies après 24 heures d’incubation à 30°C confirme la présence d’E.coli dans l’échantillon
3.2.4.6. Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs
Pour le dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs, le milieu utilisé est le TSN suivant la norme ISO 15213, 2003. Après ensemencement de 1ml des dilutions dans des tubes à vis, ces tubes ont été pasteurisés à 80°C pendant 10min au bain-marie. Les tubes ont été un peu refroidis puis la gélose TSN a été donc coulée en doubles couches puis incubé à 37°C pendant 24 à 48heures.
Les ASR présentent des colonies noires au fond du tube.
3.2.4.7. Dénombrement de Staphylococcus aureus
Le dénombrement des S. aureus a été fait suivant la norme ISO 6888-1 : 1999 avec la gélose Baird Parker. Ainsi, 100µl de chaque dilution ont été étalées à l’aide d’un étaleur sur la gélose BP préalablement préparée avec le complément de jaune d’œuf au tellurite de potassium, coulée et séchée. Les boites ensemencées ont été incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures. La présence de S.
aureus donne des colonies noires, brillantes, convexes, de 1,5 mm de diamètre, entourées d’un halo clair (protéolyse) de 2 à 5 mm de diamètre. Des zones opaques peuvent apparaître plus tardivement dans le halo clair ; elles sont dues à l’activité lipolytiqueet lécithinolytique du germe.
3.2.4.8. Dénombrement des levures et moisissures
Pour le dénombrement des levures et moisissures, le milieu utilisé est la gélose Sabouraud Dextrose Agar au chloramphénicol suivant la norme NF ISO 7954 : 1998. Ainsi, 100µl de chaque dilution ont été étalés à l’aide d’un étaleur stérilisé sur la gélose Sabouraud préalablement préparée, coulée et séchée.
3.2.4.9. Recherche de Salmonella sp
La recherche de Salmonella sp a été faite suivant la norme NF EN ISO 6579 : 2002 qui est la méthode horizontale de référence pour la recherche de Salmonella. Cette recherche a été faite en plusieurs étapes :
- Le pré enrichissement a été effectué en incubant la dilution mère (25 g de crabe fumé + 225ml d’eau peptonnée tamponnée (BPW OXOID CM0509) à 37°C pendant 18 heures ±2heures.
- L'enrichissement : le milieu utilisé est le Rappaport-Vassiliadis (RV OXOID CM0669). 10 ml de ce milieu ont été mis dans un tube et stérilisé au préalable auquel nous avons ajouté 0,1 ml du milieu de pré enrichissement. Les tubes ont été incubés à 41,5°C pendant 24 heures.
- L'isolement : les géloses Salmonella-Shigella (SS) et XLD ont été fondues, refroidies et coulées dans des boîtes de Pétri. Après solidification, l'ensemencement a été réalisé à partir d’une oëse du milieu RV. La boîte a été incubée à 37°C pendant 24 heures.
- L'identification : les colonies rouges ou roses à centre noir sont les colonies caractéristiques de ce germe. Elles ont été prélevées et ensemencées sur la gélose nutritive ordinaire (NA DIFCO 213000), purifiées puis identifiées au plan biochimique au moyen d’une galerie API 20E.
3.2.5. Analyse statistique
Les résultats ont été exprimés en Unité Formant Colonies par gramme (UFC/g) puis comparés aux critères microbiologiques et appréciés suivant un plan d’échantillonnage à trois (03) classes pour tous les germes sauf Salmonella qui a été exprimé en ‘‘Présence’’ ou en ‘‘absence’’. A partir des différentes bases de données, les moyennes et les erreurs standards ont été calculés. Les différences observées au niveau des résultats ont été comparées à l’aide du test de student.
3.3 Résultats et discussion 3.3.1. Résultats
Le tableau 3 présente les charges microbiennes moyennes des crabes fumés et vendus dans le marché Dantokpa. A la lecture de ce tableau, il ressort que 100%
des échantillons analysés ont des charges microbiennes supérieures à celle normative (5.104 UFC/g) exigée par la Direction Générale de l’Alimentation en France (2000) pour les crabes et crustacées cuits. La charge microbienne moyenne des échantillons en flore totale est de 12,01.108 ufc/g. 32% et 20%
respectivement des échantillons investigués ne sont pas satisfaisants en ce qui concerne les coliformes fécaux et Escherichia coli au regard des critères fixés par cette même direction. Les charges microbiennes en coliformes fécaux et Escherichia coli des échantillons sont respectivement de 60,2 ufc/g et 24,1 ufc/g. 44% des échantillons investigués ont des quanta microbiens supérieurs à celui exigé (2 ufc/g). Par ailleurs, ces résultats révèlent que 100% des échantillons sont satisfaisants en ce qui concerne la souche de S. aureus et de Salmonella sp. En effet, tous les échantillons sont exempts de Salmonella sp et présentent des charges microbiennes en S. aureus inférieures à celle exigée par la norme. Il faut signaler que les échantillons véhiculent des levures et moisissures avec des charges microbiennes respectives de 9,4.102 ufc/g pour les levures et 9,2.102 ufc/g pour les moisissures.
Les résultats relatifs aux corrélations entre les charges microbiennes moyennes des échantillons sont résumés dans le tableau. De ce tableau, il ressort que la concentration en coliformes fécaux est positivement et faiblement corrélée avec la concentration en E. coli (r=1 ; p<0,05). De plus, la concentration en levures est positivement et fortement corrélé avec la concentration en moisissures (r=0,93 ; p<0,001). En d’autres termes, nous pouvons dire que plus la charge microbienne en coliformes fécaux est élevée, plus la charge microbienne en E.
coli est aussi élevée et plus la charge microbienne en levures est élevée et plus la charge microbienne en moisissures est aussi élevée.
Tableau 2 : Charge microbienne des crabes fumés vendus à Dantokpa Variable Dantokpa
Normes* % de non- conformité
M ES
FAMT 104 (UFC/g) 33,05 8,2 5.104 100%
CF (UFC/g) 28,69 5,6 10 32%
E. coli 11,47 3,16 10 20%
S. aureus (UFC/g) 4,8 1,37 102 0%
Salmonella (UFC/g) 0 0 Absence 0%
Levures 102 (UFC/g) 9,4 2,43 - -
Mois 102(UFC/g) 9,2 2,7 - -
ASR (UFC/g) 4,8 9,94 2 44%
FAMT=flore aérobie mésophile totale, CF= Coliformes Fécaux, Mois : Moisissures, ASR= germes aérobie sulfito-réducteurs, M= Moyenne, ES= Erreur Standard, * Source : GLF, 2000.
Tableau 3:Corrélation entre les charges microbiennes
Variable FAMT CF E.coli S. aureus L. M. ASR
FAMT 1
CF -0,19 NS 1
E. coli -0,19 NS 1,00 * 1
S. aureus -0,18 NS -0,04 NS -0,04 NS 1 L. -0,07 NS 0,38 NS 0,33 NS 0,01 NS 1 M. -0,06 NS 0,30 NS 0,30 NS -0,13 NS 0,93 *** 1 ASR 0,21 NS -0,11 NS -0,11 NS -0,12 NS -0,18 NS -0,06 NS 1
FAMT : Flore Aérobie Mésophile Totale ; CF : Coliformes fécaux ; L : Levures ; M : Moisissures, ASR : Anaérobies Sulfito-Réducteurs, NS : non significatif; *: faiblement corrélé ; *** : fortement corrélé
3.3.2. Discussion 3.3.2.1. Flore totale
Le quantum microbien moyen en flore totale des échantillons de crabe fumé prélevés dans le marché Dantokpa est de 33,05.104 ufc/g. Cette valeur est largement supérieure à celle normative (5.104 ufc/g). Cette forte charge microbienne des échantillons de crabes en flore aérobie mésophile totale qui englobe les microorganismes pathogènes d'une part et certains germes d'altération d'autre part peut s’expliquer par leur contamination sur toute la chaine de production incluant la contamination au lieu de pêche et au lieu de vente. Ces contaminations sont tout aussi liées aux diverses manipulations du crabe et aux techniques de conditionnement de cette pendant le transport vers le marché. La présence en nombre important de germes aérobies mésophiles dans les échantillons investigués serait liée au manque d’hygiène lors du fumage et de la vente des crabes qui sont exposés à l’air libre lors de la vente sans un minimum de couverture. Cette contamination en fore totale a une double incidence : - sur le plan technologique, elle sous-entend que le processus d'altération microbienne est fortement engagé pendant qu’au plan hygiénique, elle fait suspecter la présence de microorganismes pathogènes dans les produits.
3.3.2.2. Coliformes fécaux et E. coli
Les niveaux moyens de contamination par les coliformes fécaux et E. coli des crabes fumés et vendus au marché Dantokpa sont supérieurs à ceux indiqués par la réglementation française. La contamination des crabes par les coliformes fécaux et Escherichia coli considérés comme des germes indicateurs de contamination fécale et de mauvaises pratiques d’hygiène durant le traitement et post traitement des crabes serait due à la non éviscération, au non salage avant fumage et aux différentes manipulations des crabes par la productrice et les clients après fumage.
