Difficultés rencontrées

Durant notre stage à l’URBPSA, nous avons été confrontés à quelques difficultés. Il s’agit :

- des coupures périodiques et régulières d’eau et du courant électrique qui ont entravé le bon déroulement de nos activités au laboratoire ;

- du dysfonctionnement de certains appareils de stérilisation.

- de l’insuffisance des matériels de laboratoire 2.3. Approches de solution

Les difficultés que nous avions eues à rencontrer ne sont pas restés inertes aux approches de solutions. Ainsi pour palier à ces difficultés nous pouvons :

- mettre en place un forage pour l’approvisionnement en eau

- mettre à la disposition de l’URBPSA un groupe électrogène pour palier au problème de délestage

- écrire des projets de recherches pour bénéficier de fonds pour les recherches

- équiper le laboratoire des matériels et d’appareils de stérilisation - mettre en place une équipe dynamique de réparation des appareils

2.4. Problème identifié

Le crabe fumé obtenu par procédé traditionnel de fumage au Bénin est une source non négligeable de protéines animales pour les populations.

Malheureusement, ce produit de pêche est transformé et vendu dans des conditions peu hygiéniques pouvant entraîner sa contamination par des microorganismes pathogènes et par voie de conséquence affecter la santé du consommateur. La littérature consultée révèle un manque de données sur la qualité microbiologique du crabe fumé et vendu au Bénin. Il s’avère donc

important d’évaluer la qualité microbiologique de cette denrée en vue d’évaluer les risques que courent les consommateurs.

TROISIEME PARTIE :

Evaluation de la qualité microbiologique des

crabes fumés vendus dans le marché Dantokpa

3.1 Généralités sur le crabe Callinectes amnicola 3.1.1. Morphologie du crabe Callinectes amnicola

Le crabe est un invertébré crustacé décapode brachyoure (courte queue) de l’embranchement des Arthropodes. Les crustacés sont des animaux invertébrés au corps formé de segments articulés. Ils sont fondamentalement constitués de trois parties : la tête, le thorax et l’abdomen (Miserey, 2005). Le corps du crabe est formé de la fusion de la tête et du thorax (céphalothorax) qui sont recouverts par une carapace et portent latéralement cinq paires de pattes ambulatoires.

Callinectes amnicola a une carapace quadrangulaire épaisse, grossièrement granulée de couleur brun verdâtre et portant des épines antérolatérales généralement longues. La première paire de pattes est transformée en pinces dissymétriques qui servent à la nutrition et à la défense. Les quatre autres paires servent à la locomotion et/ou à la natation. Les individus possèdent une paire d’yeux et une pièce buccale (Miserey, 2005). Cette espèce atteint des tailles beaucoup plus importantes (12,2 cm de long chez le mâle et 14,9 cm de long chez la femelle).

Figure 1 : Crabe du genre Callinectes amnicola

3.1.2. Valeur nutritionnelle des crabes

La chair des crustacés est riche en eau, en azote non protéique, en histidine, en tryptophane, en phosphore, en vitamines et contient peu de glucides (Guiraud et Galzy, 1980). Le tableau ci-dessous donne la composition chimique et la valeur nutritionnelle moyenne de 100 grammes de partie comestible (FAO, 1979).

Tableau 1:Composition chimique et valeur nutritionnelle des crustacés

La contamination primaire de matières premières alimentaires se fait par l’eau, le sol, l’air et les poussières. Lorsqu’elles sont transformées, les matières premières subissent de nouvelles contaminations propres au contexte de l’unité de transformation (ambiances, surfaces, eau, matériels, personnels etc.) et aux processus technologiques qui conduisent au produit fini.

3.1.4. Contaminations liées à l’air et aux poussières

L’atmosphère environnant les produits alimentaires contient de nombreuses particules dont le nombre peut varier de quelques centaines de milliers à plusieurs millions de germes par m³. Parmi ces particules 103 à 104 sont des unités formant des colonies (Bourgeois et al., 1996). La contamination microbienne atmosphérique est surtout constituée par des bactéries, des moisissures (Aspergillus, Penicillium etc.) et plus rarement des levures

(Torulopsis). Parmi les bactéries, prédominent les sporulées et les Micrococcus (Zimmer-mann et Nikodermusz, 1981). Les produits alimentaires sont exposés à cette contamination lorsqu’ils ne sont pas protégés par un emballage.

3.1.5. Contaminations par les unités de production et de transformation L’unité de transformation et son environnement sont la source de nouvelles contaminations qui s’ajoutent à la contamination antérieure. Les responsables de ces nouvelles contaminations sont encore l’air, le sol et l’eau. Mais il faut signaler également l’importance des équipements et le vendeur. Le vendeur est sans doute la principale source de contamination surtout quand il est en contact prolongé avec les produits. L’homme produit des particules en grande quantité, et proportionnellement à son activité (de 100.000 à 10.000.000 par minute) (Bourgeois et al., 1996). Parmi elles, nombreuses sont des germes pathogènes ou non, ou en sont porteuses (Lucas, 1980). Les principales sources sont la sphère oro-nasale, le système pileux, les mains et les vêtements. Le risque de contamination à partir des surfaces en contact avec les produits est très élevé. Il s’agit notamment des cuves, outils, emballages etc. La nature des matériaux est déterminante (Ehedg, 1993). Les matériaux naturels sont les plus contaminants (bois, papiers etc.) et on leur préfèrera les plastiques et les métaux inoxydables.

La présence de zones difficilement nettoyables sur les outils est aussi cause des contaminations (Lelieveld et al., 1992). La contamination par les surfaces a été maintes fois démontrée (Sinigaglia, 1992) dans toutes les branches de l’industrie alimentaire. Les biofilms qui se développent suite à l’adhésion, puis à la croissance des microorganismes sont en grande partie source de contamination par les surfaces (Tijhuis et al., 1994).

3.1.6. Généralités sur les différents germes rencontrés dans le crabe fumé Les différents germes susceptibles de contaminer le crabe fumé sont les germes aérobies mésophiles, les staphylocoques, les anaérobies sulfito-réducteurs, les coliformes fécaux et E. coli ainsi que les salmonelles. La probabilité pour que la

plupart des bactéries responsables d’infections digestives chez l’homme provoquent de graves maladies est faible en cas de cuisson adéquate du crabe avant consommation. Toutefois, il existe un risque indirect car ces bactéries peuvent s’avérer être des germes de toxi- infection alimentaire (Huss, 1995) et des pathogènes opportunistes.

3.1.6.1. Les germes aérobies mésophiles : la flore totale

Les germes aérobies mésophiles sont les différents microorganismes pathogènes ou non susceptibles de se retrouver dans un aliment. Il s’agit des germes aérobies pouvant se multiplier dans des conditions ambiantes à 30°C (Bonnefoy et al., 2002) et ne constituant pas une famille bactérienne particulière. Cette flore regroupe les Enterobacteriaceae, les Bacillus, les staphylocoques, Pseudomonas, les bactéries lactiques ou autres agents éventuellement pathogènes. La flore totale renseigne sur l’hygiène globale de l’aliment. La présence en grand nombre de microorganismes aérobies mésophiles sur un aliment montre qu’il y a eu une contamination lors de la préparation ou lors du stockage associée à un développement microbien à un moment donné au cours de la préparation, du stockage ou tout au long de la période de stockage.

3.1.6.2. Les salmonelles

Les bactéries du genre Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Ce genre regroupe de petits bacilles, Gram négatif habituellement mobiles par des cils péritriches, mais des mutants immobiles peuvent exister (S. gallinarum). Ces bactéries mesurent 0,7 à 1,5 μm de diamètre, pour 2 à 5 μm de longueur et sont aéro-anaérobies facultatives, oxydase négative et nitrate réductase positive.

L’ingestion de souches de Salmonella sp par l’homme peut provoquer de nombreuses infections appelées salmonelloses, notamment des fièvres typhoïde et paratyphoïde (dues à des sérovars strictement humains : Salmonella typhi, S.

paratyphi A et à un degré moindre S. Paratyphi B transmis par l’eau et les aliments souillés) et des gastro-entérites et toxi-infections alimentaires

collectives (dues à des sérovars ubiquitaires pouvant transiter chez l’homme et chez l’animal). Le nombre de germes pouvant provoquer une maladie infectieuse est parfois très faible (de l’ordre de 1 à 50 par 100g de produit) et dépend de l’espèce et du consommateur qui peut exprimer une fièvre de 39°C à 40°C, des douleurs abdominales, des nausées, des vomissements et un syndrome diarrhéique caractérisé par des selles liquides et fétides (AFSSA, 2002).

3.1.6.3. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positive, non sporulée, coagulase positive, à coque mesurant 0,5 à 1μm de diamètre souvent disposé en grappe et appartenant à la famille des Micrococcaceae. Cette espèce fait partie des bactéries aéroanaérobies facultatives, mais préférant le métabolisme aérobie.

C’est un germe mésophile, capable de se multiplier entre 4°C et 46°C. Cette bactérie est halophile et xérophile car elle se développe même en présence de sel et du sucre et survit dans les aliments déshydratés (Fosse et Margas, 2004 ; Bailly et al., 2012).

Staphylococcus aureus a la capacité de produire des toxines dans l’aliment dont l’ingestion provoque une intoxination. Tous les staphylocoques présents dans les aliments ne sont pas entéro-toxinogènes mais 70-80 % des souches produisent des exotoxines dont les entérotoxines staphylococciques A, B, C1, C2, C3, D, E et H, la toxine du choc toxique staphylococcique et les toxines exfoliatives A et B (Cavalli, 2003). La toxinogénèse a lieu pendant la phase exponentielle de croissance, pour une température comprise entre 10°C et 45°C (Fosse et Margas, 2004).

Chez l’homme, Staphylococcus aureus est un germe commensal de la cavité nasale. Il vit dans les glandes sébacées et sudoripares et les bulbes pileux. Le principal site pour les mains est le bout des doigts (en relation avec l’habitude de se gratter le nez). La contamination des produits de pêche est donc possible au moment de l’éviscération, du décorticage et surtout chaque fois qu’il y a un contact direct entre l’homme et les denrées. S. aureus est alors admis comme

germe indicateur de contamination humaine (ou animale ou originelle) dans les aliments (aliments crus en particulier). Cette notion permet donc d’accepter des staphylocoques en petit nombre dans les aliments. Le risque d’intoxination devient grand lorsque leur nombre atteint ou dépasse 10 000/g d’aliment (Larpent, 2000).

Les troubles tels que nausées, vomissements et diarrhées peuvent apparaître chez les consommateurs après ingestion d’un aliment contenant les toxines.

L’entérotoxine staphylococcique étant très stable à la chaleur, la simple cuisson reste inefficace pour assurer la destruction de la toxine et assainir en toute sécurité un produit de viande contaminé. Il va falloir éviter la contamination ou s’opposer à la multiplication du germe et à la sécrétion de la toxine en ne traversant pas la zone dangereuse (20°C- 50°C) ou en n’y résidant que fort peu de temps (ne jamais dépasser une heure).

3.1.6.4. Les coliformes fécaux et E.coli

Ce sont des bacilles gram négatifs, aérobie-anaérobie facultatifs, dépourvus d’oxydase, fermentant le lactose. Les coliformes fécaux sont un sous-groupe des coliformes totaux et comptent parmi leurs membres des espèces de bactéries comme Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. La bactérie Escherichia coli est l’indicateur d’agents entéropathogènes le plus fiable, et donc le meilleur moyen de détecter une contamination fécale récente (Edberg et al., 2000).

Escherichia coli (colibacille) est une entérobactérie mobile capable de fermenter le lactose et de produire de l'indole. E. coli fait partie de la flore commensale du tube digestif de l'homme et de nombreux animaux. Cependant, certaines souches d’E.coli peuvent être pathogènes, entraînant alors des gastro-entérites, infections urinaires, méningites. Il représente à lui seul la plus grande partie de la flore bactérienne aérobie de l'intestin (espèce aérobie dominante) à raison de 10⁸ par gramme de fèces sur une flore totale de 10¹¹ à 10¹² bactéries par gramme.

Les coliformes fécaux sont plus spécifiques de contaminations fécales (mauvais lavage des mains, produits contaminés lors de l’éviscération, de l’exposition ou

de la vente) ou de contaminations telluriques. Bien que la présence de coliformes fécaux témoigne habituellement d’une contamination d’origine fécale, plusieurs coliformes fécaux ne sont pas d’origine fécale, provenant plutôt d’eaux enrichies en matière organique, tels les effluents industriels du secteur des pâtes et papiers ou de la transformation alimentaire (Barthe et al., 1998 ; OMS, 2000).

La recherche de E. coli et des coliformes fécaux est réalisée pour surveiller la contamination d’origine fécale d’aliments n’ayant pas subi de traitements destinés à détruire les entérobactéries : les crustacés et les mollusques par présentes dans les aliments inspirent des préoccupations croissantes.

3.1.6.6. Les anaérobies sulfito-réducteurs

Ces bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont des hôtes normaux de l’intestin de l’homme et des animaux, mais on les rencontre fréquemment dans la nature et en particulier dans le sol (bactéries telluriques) et dans les matières organiques en cours de putréfaction. Ces germes sont très résistants en raison de leur caractère sporulé. Ils sont souvent, quelques fois avec d’autres germes sporulés, les seuls survivants d’une contamination ancienne de l’aliment. Parmi les Clostridium sulfito-réducteurs, C. perfringens occupe une place très importante:

en effet, ce germe est très souvent à l’origine de toxiinfections d’origine alimentaire.

Clostridium perfringens est un bacille Gram positif sporulé, tellurique, anaérobie strict, sulfito-réducteur et immobile de la famille des Bacillaceae.

Cette espèce est thermophile, sa température optimale de croissance étant comprise entre 40 et 45°C, mais elle est toutefois capable de se développer à des

températures comprises entre 15°C et 50°C. Les spores thermosensibles de C.

perfringens résistent 5 minutes à 100°C et produisent l’entérotoxine qui est responsable des intoxications alimentaires (Cavalli, 2003; Fosse et Margas, 2004). Le seuil au-dessus duquel il y a intoxication est 105 ufc/g (AFSSA, 2006). C’est une bactérie tellurique largement répandue dans l’environnement qui peut contaminer les sédiments.

Ce germe ubiquiste est un hôte normal du tube digestif des animaux et de l’homme. La chair de crabe peut être contaminée au moment de l’éviscération et après un traitement thermique non adéquat pour détruire les spores. L’homme se contamine en ingérant des aliments contenant des bactéries. Les denrées incriminées sont les préparations conservées à l’abri de l’air (masses importantes, immersion dans un liquide, emballage étanche), refroidies lentement puis réchauffées lentement, ce qui favorise la multiplication des bactéries et la production de toxines (AFSSA, 2006). Les symptômes apparaissent entre 6 et 24 h, généralement 10 à 12 h, après l’ingestion du repas contaminé. Ils se traduisent surtout par la diarrhée et de violents maux de ventre, parfois de nausées. Le plus souvent, cette affection guérit spontanément en 2-3 jours. Toutefois, des mortalités ont été observées chez des personnes âgées et

Le matériel biologique de cette étude est constitué de crabes fumés de l’espèce Callinectes amnicola.

Figure 2 :Crabes fumés achetés au marché Dantokpa 3.2.3. Matériels de laboratoire

Au nombre de tous les matériels que nous avons utilisés pour notre recherche, nous pouvons citer :

 une balance de capacité 220g et de précision 10^-4g pour quantifier les milieux de culture et les échantillons

 les tubes à vis et capotex pour la répartition des bouillons et la culture des spores d’anaérobies sulfito-réducteurs

 les flacons de 500ml pour la préparation des milieux de culture et pour la préparation des suspensions mères

 les boites de Pétri en plastique et en verres stériles pour la mise en culture des germes

 les pipettes graduées de 1 à 5ml et les pipettes pasteur pour effectuer les dilutions et le prélèvement des solutions

 les portoirs pour disposer les tubes

 le vortex pour l’homogénéisation du contenu des tubes

 l’incubateur et les étuves pour incuber les bactéries et leur permettre de se multiplier

 un bain-marie utilisé pour homogénéiser et aussi pour fondre les milieux de culture ;

 deux autoclaves pour la stérilisation des milieux de culture et des matériels et la destruction des bactéries après dénombrement

 des réfrigérateurs pour la conservation des milieux de culture, des bactéries et tous les objets stériles

 plaque chauffante pour la destruction des milieux contenus dans les boites de Pétri vendeuses choisies au hasard dans le marché pendant le stage. Les prélèvements ont été mis dans des sachets stériles qui ont été soigneusement étiquetés avec tous les renseignements afférents au produit puis déposés dans une glacière contenant des carboglaces congelés. Les échantillons ont été acheminés au laboratoire où ils ont été immédiatement analysés. L’échantillonnage s’est déroulé sur cinq semaines et au total 25 échantillons de crabes fumés ont été prélevés dans le marché de Dantokpa.

3.2.4.2. Préparation de la suspension-mère et des dilutions décimales

25g de chaque échantillon ont été prélevés de manière aseptique et broyés à homogénéisé. La dilution 10^-1 a été ainsi obtenue. Ensuite, 1ml de la dilution 10

-1 a été ajouté à 9 ml de diluant contenu dans un autre tube à essai pour obtenir la

dilution 10^-2. Des dilutions décimales successives ont été ainsi réalisées jusqu’à la dilution 10^-6.

Figure 3 :Crabes fumés à broyer dans un mortier 3.2.4.3. Dénombrement de la flore totale

Le dénombrement de la flore totale a été réalisé selon la norme ISO 4833: 2003.

1ml de chacune des dilutions a été prélevé à l’aide de pipettes stériles puis déposé dans des boites de Pétri stériles. Nous y avons ensuite coulé 10 à 15 ml du milieu Plate Count Agar (PCA OXOID CM0463) maintenu en surfusion à une température de 45°C puis l’ensemble a été parfaitement homogénéisé. Après solidification complète, les boîtes de Pétri ont été retournées et incubées à 30°C pendant 72 heures. Le dénombrement a été fait après 24 heures, 48 heures et 72 heures pour éviter l’entassement. La lecture a été faite par comptage des boîtes contenant entre 30 et 300 colonies.

Les résultats ont été exprimés par gramme de produit. Pour chaque type de microorganisme dénombré, le nombre de germes a été exprimé en Unité Formant Colonies par gramme de produit initial (ufc/g) et déterminé par la formule suivante :

𝐍 = (𝐧𝟏+𝟎,𝟏𝐧𝟐)𝐱𝐝𝟏^{∑𝐜𝐨𝐥𝐨𝐧𝐢𝐞𝐬} Avec N : le nombre d’UFC par gramme de produit initial, n1 : le nombre de boîtes considérées à la première dilution retenue ;

n2 : le nombre de boîtes considérées à la seconde dilution retenue ; d1 : le facteur de la première dilution retenue.

3.2.4.4. Dénombrement des coliformes fécaux

Le dénombrement des coliformes fécaux a été fait sur gélose VRBG (violet cristal, rouge neutre, bile, glucose,) selon la norme ISO 4832:2006. Après ensemencement de 1 ml de chaque dilution dans la boite de Pétri stérile, 13 ml de VRBG maintenu en surfusion à une température de 45°C ont été coulés en première couche puis l’ensemble a été parfaitement homogénéisé. Après solidification, une seconde couche de 9 ml de VRBG a été coulée. Les boîtes ont été incubées à 44°C pendant 24 à 48 heures. Les colonies caractéristiques rouges violacées d’un diamètre de 0,5 mm avec halo de précipité de sels biliaires ont été dénombrées en profondeur de la masse de gélose sur les boites contenant 15 à 150 colonies.

3.2.4.5. Technique de dénombrement d’Escherichia coli

Escherichia coli a été dénombré selon la norme AFNOR BRD- 07/1-07/93 ; la démarche consiste à repiquer des colonies suspectes de coliformes fécaux sur la gélose EMB. L’aspect vert brillant des colonies après 24 heures d’incubation à 30°C confirme la présence d’E.coli dans l’échantillon

3.2.4.6. Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs

Pour le dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs, le milieu utilisé est le TSN suivant la norme ISO 15213, 2003. Après ensemencement de 1ml des dilutions dans des tubes à vis, ces tubes ont été pasteurisés à 80°C pendant 10min au bain-marie. Les tubes ont été un peu refroidis puis la gélose TSN a été donc coulée en doubles couches puis incubé à 37°C pendant 24 à 48heures.

Les ASR présentent des colonies noires au fond du tube.

3.2.4.7. Dénombrement de Staphylococcus aureus

Le dénombrement des S. aureus a été fait suivant la norme ISO 6888-1 : 1999 avec la gélose Baird Parker. Ainsi, 100µl de chaque dilution ont été étalées à l’aide d’un étaleur sur la gélose BP préalablement préparée avec le complément de jaune d’œuf au tellurite de potassium, coulée et séchée. Les boites ensemencées ont été incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures. La présence de S.

aureus donne des colonies noires, brillantes, convexes, de 1,5 mm de diamètre, entourées d’un halo clair (protéolyse) de 2 à 5 mm de diamètre. Des zones opaques peuvent apparaître plus tardivement dans le halo clair ; elles sont dues à l’activité lipolytiqueet lécithinolytique du germe.

3.2.4.8. Dénombrement des levures et moisissures

Pour le dénombrement des levures et moisissures, le milieu utilisé est la gélose Sabouraud Dextrose Agar au chloramphénicol suivant la norme NF ISO 7954 : 1998. Ainsi, 100µl de chaque dilution ont été étalés à l’aide d’un étaleur stérilisé sur la gélose Sabouraud préalablement préparée, coulée et séchée.

3.2.4.9. Recherche de Salmonella sp

La recherche de Salmonella sp a été faite suivant la norme NF EN ISO 6579 : 2002 qui est la méthode horizontale de référence pour la recherche de Salmonella. Cette recherche a été faite en plusieurs étapes :

- Le pré enrichissement a été effectué en incubant la dilution mère (25 g de

- Le pré enrichissement a été effectué en incubant la dilution mère (25 g de