Imagerie moléculaire des lésions d'athérosclérose vasculaires et valvulaires chez la souris

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Imagerie moléculaire des lésions d’athérosclérose vasculaires et valvulaires chez la souris

Guillaume Rucher

To cite this version:

Guillaume Rucher. Imagerie moléculaire des lésions d’athérosclérose vasculaires et valvulaires chez

la souris. Médecine humaine et pathologie. Normandie Université, 2019. Français. �NNT :

2019NORMC401�. �tel-02064013�

THÈSE

Pour obtenir le diplôme de doctorat

Spécialité PHYSIOLOGIE ET BIOLOGIE DES ORGANISMES - POPULATIONS - INTERACTIONS

Préparée au sein de l'Université de Caen Normandie

Ιmagerie mοléculaire des lésiοns d'athérοsclérοse vasculaires et valvulaires chez la sοuris

Présentée et soutenue par Guillaume RUCHER

Thèse soutenue publiquement le 13/02/2019 devant le jury composé de

Mme CATHERINE GHEZZI Professeur des universités, Université Grenoble Alpes Rapporteur du jury M. FABIEN HYAFIL Professeur des universités, UNIVERSITE PARIS 7 PARIS

DIDEROT Rapporteur du jury

Mme HÉLÈNE ELTCHANINOFF Professeur des universités, UNIVERSITE ROUEN NORMANDIE Membre du jury M. ALAIN-PIERRE GADEAU Directeur de recherche, Université de Bordeaux Membre du jury M. PIERRE-YVES MARIE Professeur des universités, UNIVERSITÉ LORRAINE Président du jury M. ALAIN MANRIQUE Professeur des universités, UNIVERSITE CAEN NORMANDIE Directeur de thèse M. LUDOVIC BERGER Professeur des universités, UNIVERSITE CAEN NORMANDIE Co-directeur de thèse

Thèse dirigée par ALAIN MANRIQUE et LUDOVIC BERGER, Signalisation,

électrophysiologie et imagerie des lésions d'ischémie-reperfusion myocardique

(Caen)

REMERCIEMENTS

Il e se a diffi ile de e e ie tout le o de a ’est g â e à l’aide de o breuses pe so es ue j’ai e à terme ce travail.

En tout premier, je voudrais remercier Alain Manrique et Ludovic Berger sans qui ce travail

’au ait ja ais pu être réalisé , pou leu supe isio et leu e p ie e ui ’o t ta t apporté.

Je e e ie l’e se le de o ju de th se d’a oi accepté et p is le te ps d’ alue e travail . Cathe i e Ghezzi et Fa ie H afil ui ’o fait l’ho eu d’ t e appo teu s de ma thèse. Pierre-Yves Marie et Alain- Pie e Gadeau ui o t sui i l’ olutio de e t a ail à t a e s leur participation à mon Comité de Suivi de Thèse. H l e Elt ha i off ui a a ept d’off i son expertise clinique sur ce travail de recherche fondamentale.

Je tiens à remercier la Fédération Hospitalo-Universitaire REMOD-VHF d’a oi contribuer au financement de ce travail de thèse.

Je tiens sincérement à e e ie l’e se le de es oll gues de l’ EA4650/SEILIRM pour leur aide et leur collaboration qui ont permis de faire avancer ce projet. Je remercie Laurent Sallé et Ro ai Gui a a d ui ’o t offe t la possi ilit d’e seig e à l’U i e sit . Je remercie Stéphane Allouche qui a pris le temps de traiter mes échantillons même tard en fin de journée.

Je remercie Quentin Dupas pour son aide précieuse et son expertise en biologie cellulaire et moléculaire. Je remercie Christophe Simard, présent au quotidien pour son soutien moral et son humour.

Je remercie chaleureusement Lucie Camelière et Jihène Fendri pour leur aide et leur

Je remercie Maëlle Guyot et Ni olas Elie pou l’e se le du t a ail u’ils o t a o pli et leu aide su la ise e pla e et l’e ploitatio des do es histologi ues.

J’e p i e a g atitude à l’e se le des stagiai es ui o t pa ti ip de p s o e de loi à la mise au point et la réalisation des expérimentations.

Bie ide e t, je e e ie l’e se le de l’ uipe de l’aile B de C e o . C li e pou so aide à o i o po atio et o a li atatio à Cae . L’ uipe de a ipulateu s adio Christelle, Marie-Christine et Jean-Marc pour ces bons moments passés au travail comme en deho s. Sa s ou lie Ah ed, ui ’a a u eilli en tant que colocataire de bureau malgré mon tempérament.

Je oud ais e e ie l’e se le des uipes et olla o ateu s de C e o ui o t toujou s été présents pour répondre à mes interrogations et ’aide , e pa ti ulie Ni olas Del oi pou so e pe tise e t aite e t d’i age et Palma Pro pour son aide pour la rédaction des de a des d’auto isatio d’e p i e tatio a i ale .

Enfin, je remercie ma famille et mes amis pour leur soutien psychologique et leur amour qui

’ ont permis d’alle au out de e t a ail .

Merci à Cynthia pour tout.

La si pli it est la sophiti atio de l’e t e.

Léonard De Vinci

A mon grand- p e…

Tables des matières

ABREVIATIONS ... 5

L’ATHEROSCLEROSE ... 6

La pla ue d’ath o e ... 6

Fo atio de la pla ue d’ath o e ... 6

P og essio de la pla ue d’ath o e ... 8

Minéralisation de la plaque ... 8

Minéralisation valvulaire ... 10

Les facteurs de risque cardiovasculaire ... 11

Effet d e l’i suffisa e ale ... 14

Effet de l’i adiatio ... 15

Mod les u i s d’ath os l os e... 16

Mod le u i d ficie t pou l’apolip ot i e E (ApoE

) ... 17

Modèle murin déficient pour le récepteur aux LDL ou Ldlr

... 18

L’IMAGERIE DES LESIONS VASCULAIRES ET VALVULAIRES ... 20

Tomographie à Emission de Positons ... 20

18

F-Fluorodéoxyglucose ... 21

18

F-Fluorure de sodium ... 22

Imagerie par Résonance Magnétique ... 23

Imagerie par ultrasons ... 25

OBJECTIFS ... 27

RESULTATS ... 28

Optimisation des p a a t es d’a uisitio et de e o st u tio e i age ie i oTEP/TDM. ... 28

I age ie ol ulai e des l sio s d’ath os l ose. ... 54

D eloppe e t d’u od le u i de t isse e t ao ti ue pa i adiatio lo alis e. .. 77

DISCUSSION ... 101

CONCLUSION ... 106

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 107

ABREVIATIONS

3D-OSEM : 3D-Ordered Subset Expectation Maximization ADN : acide désoxyribonucléique

ApoE : Apolipoprotéine E

BMP: Bone Morphogenetic Protein

CMLV: Cellulaire musculaire lisse vasculaire FBP : Filtered Back Projection

FDG : fluorodésoxyglucose Gy : Gray

ICAM: Intercellular Adhesion Molecule IL : Interleukine

IRM : Imagerie à Résonance Magnétique LDL : Low Density Lipoprotein

NADPH: nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NaF : fluorure de sodium

NO : Oxyde nitrique

Runx2: Runt-related transcription factor 2 TDM : Tomodensitométrie

TEMP : Tomographie à Emission Monophotonique TEP : Tomographie à Emission de Positons

TGF- β : Transforming Growth Factor- β TNF α : Tumor Necrosis Factor- α

VCAM : Vascular Cell Adhesion Molecule

L’ATHEROSCLEROSE

Les maladies cardiovasculaires sont une cause majeure de décès et d’i alidit

et l ’ath os l ose est u e des principales conditions pathologiques sous-jacentes. Le d eloppe e t de l’ath os l ose est u p o essus complexe, chronique et multifactoriel, à progression lente et le plus souvent asymptomatique, qui touche principalement les artères de moyen et g os ali e. Elle o duit à l’ paississe e t de la paroi vasculaire et au rétrecissement progressif de la lumière artérielle par une pl a ue d’ath o e par ailleurs susceptible de se rompre e t d’e t aî e des o pli atio s a dio as ulai es aigues telles que l’i fa tus du o a de ou l’a ide t as ulai e al .

La pla ue d’ath o e

F o atio de la pla ue d’ath o e

La pla ue d’ath o e est une lésion inflammatoire résultant de lésions endothéliales

provoquées essentiellement par les lipoprotéines athérogènes. Le stade histopathologique

i itial sulte de l’a u ulatio de ellules spu euses, 'est -à-dire de macrophages sous-

endothéliaux chargés de LDL oxydés, formant les stries lipidiques

. L’a u ulatio de

lipoproteines atherogènes est facilité par l’e iste e d’u e d sfo tio e doth liale ou

a ti atio e doth liale ui i duit pa ailleu s l’e p essio à la su fa e de l’e doth liu de

ol ules d’ah sio telles que VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) ou ICAM-1

(intercellular adhesion molecule)

. A un stade plus a a , l’e p essio de es ol ules

d’adh sio est ai te ue par les cytokines inflammatoires sécrétées par les composants de

la pla ue d’ath o e. Ces p otei es d’adh sio pe ette t au monocytes de se lier à

l’e doth liu puis de pénètrer dans la paroi du vaisseau où ils se différencient en

macrophages

. Ces macrophages joueront un rôle clé dans le processus pathologique . D’u e

part ils produisent des facteurs (cytokines inflammatoires, métalloprotéinases) qui forment u e ou le d’auto - a plifi atio de l’i fla atio et du e rutement des macrophages et contribuent au dévéloppement de la plaque

. D’aut e pa t, ertains macrophages en se chargant de lipoprotéines en excès dans ce milieu vont se différencier en cellules spumeuses (Figure 1).

Figu e . M a is es ol ulai es et ellulai es de l’i itatio et la p og essio de la pla ue d’ath os l ose d’ap s O a et al.

.

L’a o da e de lipides dans la paroi vasculaire va entraîner la formation du œu lipidi ue.

L’ olutio de la plaque se poursu it a e la fo atio d’ une chape fibromusculaire autour de

e œu lipidi ue pe etta t sa stabilisation progressive et son isolation de la lumière

artérielle

. Cette chape est composée de cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV)

provenant de la média du vaisseau et de composants extracellulaires entre autre sécrétés par

ces mêmes CMLV. La formatio de la hape s’a o pag e do d’ un changement de profil

phénotypique des CMLVs qui vont perdre leur profil contratile au profit d’u ph ot pe

P og essio de la pla ue d’ath o e

L’ olutio le te de la pla ue d’ath o e est a a t is e pa u e aug e tatio sig ifi ati e de so olu e. A la suite de l’a u ulatio de lipides et des autres éléments cellulaires et moléculaires qui composent la plaque, le volume de plaque augmente progressivement. Cette progression de la plaque va s’ associer à un remodelage artériel initialement excentrique qui peut, jus u’à un stade avancé de la pathologie, compenser la perte de diamètre de la lumière du vaisseau par augmentation du diamètre totale du vaisseau. On parle alors de remodelage compensateur. A long terme, la diminution du diamètre vasculaire associée à la progression de la plaque va accentuer le degré de sténose vasculaire.

Cette phase de progre ssio s’a o pag e d’aut e s phénomènes tels que la minéralisation de la plaque. Le contexte inflammatoire est propice à la minéralisation comme cela a été observé da s d’aut es ad es pathologi ues tel s que la tuberculose, les sclérodermies, ou dans certains cancers. Le processus de minéralisation as ulai e o duit à l’a u ulatio de istau d’h d o apatite au sei de la pla ue d’ath o e et à l’appa itio de al ifi atio s vasculaires. La présence de calcifications artérielles, si elle correspond à une entreprise de stabilisation de la plaque d’ath o e, este o e la d sfo tio e doth liale asso i e à u e augmentation du risque cardiovasculaire

.

Minéralisation de la plaque

Même si tous les mécanismes qui lien t l’i fla atio et la i alisatio ne sont pas

pa faite e t d its, l’i fla atio h o i ue et ou e au sei de la pla ue est u ilieu

riche en cytokines et radicaux libres. Ces facteurs ont été précedemment décrits comme étant

des régulateurs des gènes ostéogéniques. Ainsi, des facteurs de transcription de la

superfamille des TGF- β (Transforming Growth Factor- β ) sont retrouvés au sein des plaques tel

que BMP 2 et 4 (pour Bone Morphogenetic Protein 2 et 4) et agissent par la voie de signalisation Smad. Le rôle de BMP2 a notamment été mis en évidence dans la différenciation ostéogénique et chondrogénique de progéniteurs multipotents

. Au fur et à mesure de l’ olutio de la pathologie, l’e p ess ion des BMP est augmentée et est retrouvée dans les différents types cellulaires qui composent la lésion d’ath os l ose (cellules endothéliales, spu euses et les CMLV . L’a ti atio de la oie sig alisatio pa la liaiso des BMP su leu s récepteurs entraîne u e aug e tatio de l’e p essio des fa teu s de transcription ostéogéniques clés tels que Runx2 (Runt-related transcription factor 2) et osterix (Figure 2).

Ceci conduit à un changement phénotypique des CMLV en cellules de type ostéoblastique

avec l ’e p essio de a ueu s sp if iques. Ces cellules so t a a t is es pa l’e p essio

de la phosphatase al ali e à l’o igi e de la s th se de l a matrice osseuse par dépot de

istau d’h d o apatite. Initiallement, les dépôts de istau d’h d o apatit e vont être à

l’o igi e de simples microcalcifications. Il a été montré par imagerie moléculaire in vivo que

l’a ti it osteog i ue et l’ apparition de ces microcalcifications était associée à un état

inflammatoire avancé au niveau des bordures des lésions d’ath os l ose

. De plus, du fait

de leur présence les microcalcifications vont entraîner une réponse pro-inflammatoire dans

ces régions induisant un effet d’auto -amplification du phénomène

. A e stade d’ olutio

de la maladie, les microcalcifications peuvent être des causes de rupture de la plaque à

l’o igi e d’ e e e ts li i ues s es

. Si le processus inflammatoire se maintient, la

progression des dépôts va conduire à la formation, non plus de microcalcifications mais de

macrocalcifications. Les macrocalcifications vont être associées à la chape fibromusculaire et

ai si o t i ue à la sta ilit de la pla ue à l’i e se des i o al ifi atio s.

Figure 2. Mecanismes moléculaires du changement phénotype des cellules musculaires lisses vasculaires à l’o igi e de la minéralisatio as ulai e d’ap s Joh so R. et al.

Minéralisation valvulaire

Ce même phénomène de minéralisation existe au niveau des valves cardiaques, vraisemblab le e t e elatio a e l’asso iatio d’u st ess a i ue et d’u ph o e inflammatoire. En réponse à des lésions endothéliales, macrophages et infiltrats de cellules T sont retrouvés précocément dans ces valves

. Da s e as, l’e p essio de BMP et est médiée par les myofibroblastes et les pré-ostéoblastes. Malgré tout, les marqueurs de la différenciation ostéogénique sont retrouvés dans le tissu valvulaire, notamment Runx2

. L’appa itio de al ifi atio s au niveau des valves est un signe de dégénérescence valvulaire

uelle soit ati e ou d’o igi e hi u gi ale

. L élévation de la postcharge du ventricule gauche

secondaire au retrécissement aortique est à l’o igi e d’u p hénomène de remodelage

ventriculaire gauche, qui se caractérise par une hypertrophie ventriculaire gauche. Avec le

temps, la capacité contractile du œu pourra s’alt e et conduire à une dysfonction

systolique

. A un stade tardif, une dilata tio e t i ulai e gau he ai si u’ une régurgitation mitrale peuvent apparaitre chez une minorité de patients évoluant vers une cardiomyopathie dilatée. Une dégéneresence peut être observée sur les autres valves cardiaques. Les données de «Framinghan Heart Study » montre que les patients avec une calcification annulaire mitrale présentent un risque relatif a u d’ accident vasculaire cérébral corrélé avec la taille des calcifications

.

Les facteurs de risque cardiovasculaire

Ho is le se e, l’age et l’h dit , les fa teu s de is ue a dio as ulai e so t odifia bles :

hypertension artérielle, dyslipidémie, diabète, tabac, obésité et sédentarité. Ces facteurs de

risque se potentialisent plus u’ils e s’additio e t , et sont souvent associés chez un même

patient

(Figure 3). L’h pe te sio est u e aladie h o i ue au o igi es di e ses ais so

i pli atio da s l’i itiatio de l’ath os l ose est lai e e t d fi i. Sous l’effet de

l’aug e tatio de la p essio a t iel le , les o t ai tes h od a i ues s’a e tue t et

peuvent être à l’o igi e des p e i es l sio s au i eau de l’e doth liu . Ces l sio s o t

déclencher une p olif atio ellulai e, u e odelage as ulai e, l’apoptose ai si que

l’ augmentation de la perméabilité cellulaire

. L ’e p essio de a ueu s ol ulai es et de

molécul es d’adh sio t oig e de l’i fla atio e doth liale . Cette étape initiatrice va

conduire à la migration des monocytes au sein de la lésion de la plaque et contribuer à son

développement.

Figure 3. Schéma récapitulatif des intéractions entre les phénomènes physiopathologiques à l’o igi e du d eloppe e t des l sio s d’ath os l ose, d’ap s Hurtubise et al.

L’h pe holeste ol ie fa o ise l’i itiatio et la p og essio des pla ues d’ath o e.

L’a u ulatio i t a ellulai e de holest ol et l’o datio des LDL a outit à l’apoptose des cellules endothéliales, contribuent à la dysfonction endothéliale

et à l’ ta lisse e t d’u n environnement proinflammatoire à un stade précoce de la plaque. La production excessive de toki es au i eau e doth lial e t aî e l’e p essio de ol ules d’adh sio telles ue ICAM-1 et VCAM-1 qui déclenchent le recrutement des monoctyes et leur activation en macropha ges. Ces a ophages, e s’i filt a t da s la l sio d’ath os l ose, o t se charger en lipoprotéines en excès dans cet environnement pour se différencier en cellules spumeuses au sein de la plaque.

L’o datio des lipides, ota e t sous l’effet du ta agis e, joue u ôle majeur dans la

associés à la production endogène de ces molécules favorisent la modification des lipides par oxydation. Une a ug e tatio de l’o datio des lipides a t d o t e hez les patie ts fu eu s, eflet d’u e aug e tatio du st ess o datif et/ou d’u e d sfo tio des s st es anti-oxydants

. Les i sop osta es so t u e fa ille de lipides p o e a t d’u ta olis e adi alai e de l’a ide a a hido i ue, sugg a t leur utilité comme biomarqueurs in vivo de la défaillance du système antioxydant

. Une augmentation de la production de 8-epi-PGF2a, facteur de la famille des isoprostanes, a été retrouvée chez des patients fumeurs alors que l’a t l’i to i atio ta agi ue entraînait dans les jours qui suivent une dimunition de la production de ce facteur

. Chez des patients qui ont subit une endartériectomie, ce facteur a été et ou au i eau de la pla ue d’ath os l ose ai si ue da s le sa g et les u i es

. L’o yde nitrique (NO) est u fa teu asodilatateu e dog e p oduit pa l’e doth élium qui

o t i ue au ai tie d’u to us as ulai e et o t i ue à la p olif atio des ellules

us ulai es lisses as ulai es ai si u’à la fo tio pla uettai e. Les cellules endothéliales

sont sensibles aux contraintes de cisaillement et via le factor Kruppel- like KLF et l’O de

Nitrique Synthase III (ou NOS III pour nitric oxide synthase ou eNOS pour endothelial nitric

oxide synthase), elles sont capables d’i dui e une vasodilatation, phénomène conservateur

de la fonction endothéliale. Les facteurs de risque cardiovasculaire ont une action directe sur

la capacité de dilatation des vaisseaux par altération de la fonction de la eNOS. Cette

dysfonction endothéliale secondaire aux facteurs de risque cardiovasculaire a été mise en

ide e hez l’Ho e sous la fo e d’u e alt atio de la aso ot i it o o ai e e

réaction au test au froid

. U e di u itio de l’e p essio de la p ot éine eNOS est retrouvée

au i eau de l sio s d’ath os l ose de patie ts induisant une diminution significative de

En plus de ces facteurs de risque, plusieurs conditions peuvent accélérer le développement de s l sio s d’ath os l ose, telles ue l’i suffisa e ale ou la adioth apie.

Effet de l’i nsuffisance rénale

Chez le patie t as ulai e, la p se e d’u e insuffisance rénale est souvent un marqueur du au ais o t ôle des fa teu s de is ues tels ue le dia te et l’h pe te sio a t ielle. Au ou s de l’i suffisa e ale, uelle u’e soit l’o igi e, il e iste u e activation du système rénine-angiotensine, une dyslipidémie (qui se a d’auta t plus i po ta te ue l’o igi e de l’i suffisa e ale est ph oti ue ai si u’u e i fla atio chronique avec une aug e tatio de l’e p essio de toki es i ula tes

. Le risque de morbi-mortalité a dio as ulai e asso i à l’i suffisa e ale est lai e e t ide tifi , la mortalité cardiovasculaire étant 15 à 30 fois plus élevée chez les patients insuffisants rénaux

. Cette augmentation de la mortalité est retrouvée chez toutes les catégories de patients mais elle est d’auta t plus a u e hez les jeu es pat ients (25 à 35 ans)

.

Chez les patie ts i suffisa ts au , l’a ti atio du s st e ine-angiotensine associée et la retention hydro-sodée sont à l’o igi e de l’aug e tatio de la p essio sa gui e

. Les pla ues d’ath o e de ces patients sont classiquement caractérisées par une calcification plus importante en comparaison aux lésions retrouvées dans la population générale

. L’alt atio de la fo tio ale i duit des odifi atio s de la dist i utio des o posa ts du plasma altér a t la st u tu e de l’e doth liu et/ou sa fo tio fa o isa t les l sio s as ulai es. U e aug e tatio des a ueu s sa gui s de l’i nflammation est retrouvée chez les patients insuffisants rénaux

.

L’alt atio de la fo tio ale o duit à u e odifi atio des lipides et l’a u ulatio de

to i es u i ues est à l’o igi e d’u e sti ulatio du st es s oxy datif et de l’i fa atio ui

va contribuer à la dysfonction endothéliale et la progression de l a pla ue d’ath os l ose. La dysfonction endothéliale est une anomalie retrouvée dans les pathologies rénales

. L’attei te de la dispo i ilit du NO est u it e ajeu à l’o igi e d’u e aug e tatio du st ess o datif. Les a is es du st ess o datif da s l’u ie est e particulier conduit par l’a tio de la NADPH o dase. La sti ulatio de la NADPH o dase o duit à l a production d’a io supe o yde. Cet environnement pro-oxydant est un facteur majeur de la modification des lipides et favorise le développement de la plaque comme vu précédemment.

Effet de l’ irradiation

La radiothérapie est une thérapeutique basée sur les effets biologiques des rayonnements ionisants qui reste couramment utilisée pour le traitement des tumeurs solides, notamment le cancer du sein

. Les conséquences de la radiothérapie sur la mortalité cardiovasculaire ont été mis en éviden e pa l’ a ug e tatio d’u fa te ur 1,5 à 3 des infarctus du myocarde dans une population traitée par radiothérapie

. Les atteintes pouvent se révéler plusieurs dizai es d’a es ap s l’i adiatio

et affecter toutes les structur es du œu : artères coronaires, valves, myocarde et système de conduction

. La fréquence des complications est proportionnelle à la dose

. L’ exposition d’u e dose de 10 Gy sur cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical humaine en culture montre une production de facteurs inflammatoires tels que les interleukines 6 et 8 (IL-6 et IL-8) . L’i adiatio de ces cellules e t ai e gale e t l’e p essio des ol ules d’adh sio à l’o igi e du recrutement des monocytes circulants

.

Les effets cytotoxique s di e ts ou i di e ts se o dai e à la adiol se de l’eau et à la

l’i fla atio et la d sfo tio e doth liale e ui a p o ou oi l’i itatio et la p og essio des pla ues d’ath rosclérose

.

Au niveau des valves, une étude a montré, 20 ans après l’e positio au rayonnements, une incidence élevée de l’ paississe e t des feuillets valvulaires et la présence de calcifications chez les patients avec une sténose modérée à sévère ou une régurgitation

. Ces conditions sont des caractéristiques du rétrécissement aortique. Une récente étude a montré que l’ olutio du t isse e t ao ti ue hez des patie ts t ait s pa radiothérapie était accélérée avec une augmentation significative de la morbi-mortalité

. L’e positio à une dose de 10 Gy de cellules interstitielles de valve aortique humaine entraine dans les 24 premières heures un changement de profil phénotypique de ces cellules. Une augmentation de l’e p essio des a ueu s ost og i ues de BMP -2 et Runx2 était retrouvée associée à une a ug e tatio de l’e p essio de la phosphatase alcaline

.

Mod les u i s d’ath oscl ose

L’util isation de modèles animaux est u outil i dispe sa le da s l’a al se de la physiopathologie de certains phénomènes i pli u s da s l’ath os l ose. Plusieurs espèces peuvent être utilisées pour l ’ tude de l’ath os l ose , mais la plus utilisée reste la souris. En effet, les modèles murins présentent de nombreux avantages comme une reproduction facile, l’utilisatio apide d’a i au adultes dès 8 sema i es d’âge , le oût et l’a s à des modèles génétiquement modifiés.

Le poi t ajeu li ita t l’utilisatio des od les u i s pou l’ tude de l’ath os l ose est

que les souris ne développent que peu de lésions au niveau coronaire alo s ue ’est u e

localisation privilégiée hez l’ Homme. De plus, les souris sont caractérisées par un

développement très précoce de lésions au niveau de la racine aortique, probablement en lien

avec des contraintes hémodynamiques plus importantes du fait d’u e fréquence cardiaque élevée (environ 600 battements par minute).

L’ évènement majeur qui a encour ag l’a al se de l’ath os l ose hez le od le u i est l’appa ition des souris génétiquement modifiées déficientes pour l’e p essio de l’apolipop ot i e E apoE , ui sous u gi e o al d elopp ent rapidement des lésions d’ath os l ose

. Un autre modèle murin a été proposé, basé sur des souris déficientes pou le e epteu au LDL, si ula t l’h pe holeste ol ie fa iliale

. Ces deux modèles sont caractérisés par une hypercholestérolémie qui est un prérequis au développement de lésions d’ath os l ose .

Mod le u i d fi ie t pou l’apolip ot i e E (ApoE

)

L’apoE est u e lipop ot i e plas ati ue ui se t de liga d pou l’assi ilatio des lipoprotéines non- HDL. L’a se e d’apoE est a a t is e pa u e a u ulatio de lipoprotéines riches en ester de cholesterol et apoB48

. Ainsi le développement de lésions accélérées chez ces animaux peut être observé

. De plus, une amplification de ce développement peut être engendré par la supplémentation du régime alimentaire en lipides.

L’appa itio des l sio s est o se e au i eau de la a i e ao ti ue, l’a he ao ti ue, l’a t e innominée, les arètres carotides et est corrélée au régime alimentaire et à sa durée

. Il a gale e t t o t ue la p o o atio d’u e i suffisa e ale h o i ue pe et u e a l atio du ph o e d’ath os l ose chez ces animaux

.

Suite à la atio d’u e i suffisa e ale pa hi u gie , les souris ApoE

présentent un

profil pathologique particulier, avec notament une hypercalcémie assoc i e à l’u ie . Après

toujours accompagné d ’u e h pe holest ol ie. Cepe da t l’ apparition de calcifications était directement liée à la supplémentation du régime alimentaire en phosphate, calcium et vitamine D3. Ce régime enrichi semble être une étape clé pour l’o se atio de macrocalcifications exacerbées dans le modèle ApoE

.

E plus des l sio s as ulai es, l’appa itio de l sio s d’ath os l ose au i eau al ulai e a été observée sur des souris ApoE

adultes âgées de 30 semaines

. L’e i hisse e t du régime alimentaire

ou la supplémentation en acroléine

a permis de mettre en évidence le développement de lésions au niveau d e la al e ao ti ue a e la ise e ide e d’u e infiltration macrophagique, la présence de myofibroblastes ainsi qu ’u e a ti it ost og i ue avec la présence de phosphatase alcaline

ou de calcifications

.

La souris déficient e pou l’apoE est u od le de hoi pou effe tue u e a al se des lésions précoces de l’ath os l ose, avec une capacité de reproduction similaire à des animaux sauvages ce qui rend leur coût de production accessible.

Modèle murin déficient pour le récepteur aux LDL ou Ldlr

Le epteu au LDL, tout o e l’apoE et l’ apoB100, est largement exprimé au niveau des membranes des leucocytes et est responsable de la clairance aux lipides dans le sang. La fonction majeure de ce récepteur est de médier la clairance hépatique des lipoprotéines.

L’a se e de epteu au LDL h pati ues est espo sa le de l’a ulu atio d’apoB riches en LDL chez des souris déficientes pour ce récepteur. Mais des mécanismes de

o pe satio s e iste t au i eau h pati ue e ui e pe et pas d’o se e de l sio s

d’ath os l ose ajeu es hez de s souris nourries par un régime normal

. Par contre, chez

ces animaux soumis à un régime enrichi à 1,25% de cholestérol, un dépôt de lipides a été

o se tout le lo g de l’ao te asso i à u e l atio du holest ol plas ati ue

.

La mise e ide e de l sio s d’ath so l ose au i eau al ulai e ao ti ue a t gale e t

rapporté sur ce modèle, avec des dépôts calciques

et la présence de myofibroblastes

à

l’issu d’u gi e e i hi e lipides pe da t t ois ois. Surtout, les vélocités au niveau de la

valve aortique étaient augmentées de 0,96 à 1,36 m/s chez les animaux soumis à un régime

supplémenté. Etonnament, la ise e pla e d’u p og a e d’e t ai e e t asso i au

gi e i he e lipides di i uait fo te e t l’i ide e de la suppl e tatio su la esu e

du flux (0,99 m/s)

.

L’IMAGERIE D ES LESIONS VASCULAIRES ET VALVULAIRES

Il e iste de o euses odalit s d’i age ie ui pe ette t d’ alue la p og essio de l’ath os l ose e li i ue humaine. Mais du fait de la taille des modèles précliniques, notamment chez les rongeurs, un certain nombre de c es thodes d’ aluatio e so t pour le moment pas transposables ou mal adaptées pour une recherche préclinique. L ’ e ge e de machines dédiées à l’ aluatio p li i ue su le petit a i al a permis de mettre en place de nouvelles stratégies d’ide tifi ation de marqueurs moléculaires des processus physiopathologiques. Cependant, compte tenu de la taille des structures vasculaires, un important travail reste à fournir pour l’opti isatio de la solutio spatiale et te po elle en i age ie de l’ath os l ose . L’i age ie a dia ue est u e odalit d’i age ie qui nécessite une synchronisation aux signaux physiologiques (fréquence cardiaque et respiratoire). Des capteurs externes sont couramment utilisés pour suivre l’ le t o a diog a e et la fo tio respiratoire des animaux et permettre l’a uisitio d’i ag es synchronisées aux moments d’i o ilit cardio-respiratoire.

Du fait du nombre important d’ acteurs moléculaires, l ’i age ie ol ulai e et notamment l’i age ie pa To og aphie à E issio de Posito s TEP a été précocément proposée pour évaluer in vivo l es l sio s d’ath os l ose .

Tomographie à Emission de Positons

L’i age ie en Tomographie à Emission de Positons (TEP) est u e thode d’i age ie moléculaire basée su l’utilisatio de ol ules spécifiques d’u ta olis e do et marquées par un atome radioactif émetteur de positons.

Après avoir parcouru dans la matière une distance qui d pe d de l’ e gie du posito (cette

distance correspond au libre parcours moyen du positon), le positon interagit avec un électron

du ilieu. C’est la a tio d’a ihilatio ui o duit à l’ issio de deu photo s ga a is à 180° avec une énergie de 511 keV chacun. L’i age ie TEP est as e su la d te tio en coïncidence de ces deux photons.

L’ effet de volume partiel est clairement une limite technique pour la quantification en TEP. En effet, pour des structures dont la taille est inferieure à 2 fois la résolution spatiale, le signal receuilli sera sous estimé, proportionnel à la taille de la structure et non plus uniquement à la concentration radioactive de la molécule marquée. L’ tale e t du sig al « spill over ») est u e o s ue e de l’effet de o lume partiel. E p ati ue, la pe te de sig al s’a o pag e d’u tale e t de e sig al e s les st u tu es f oides adja e tes « spill out »). Dans le cas d’u e st u tu e e h posig al au sei d’u e st u tu e haude 'est -à-dire avec une forte fixation ra dioa ti e , o e pa e e ple la a it e t i ulai e gau he e tou e d’u myocarde fixant le

F-Fluodeoxyglucose , l’ tale e t se fait de l’a ti it environante vers l’o jet f oid « spill in »).

Malgré ces limites, la TEP reste un outil de choix p ou l’ aluatio de l’ath os l rose du fait des différents radiopharmaceutiques disponibles et de leur spécificité pour les phénomènes qui accompagnent l ’ initiation ou de la progression de la plaque.

18

F-Fluorodéoxyglucose

La plupart des études po ta t su l’ath os l ose o t utilisé le

F-fluorodéoxyglucose (

F-

FDG) pour visualiser le phénomène inflammatoire. Le

F-FDG est un analogue du glucose qui

s’ accumule dans les cellules a e u appo t d’a u ulatio p opo tio elle à la gl o lyse au

sein de ces cellules et à l’e p essio des t a spo teu s du glu ose. C’est un

GLUT 4, insuline-dépendant) puis est phosphorylé en

F-FDG-6-phoshate pa l’he oki ase

. Cependant, le

F-FDG-6-phoshate ’est pas métabolisé et s’a u ule au sein des cellules. Les macrophages sont des cellules à haute capacité glycolytique et leur glycolyse est augmentée e o latio a e le i eau d’a tivation inflammatoire. Plusieurs études, à la fois réalisées hez l’Ho e et da s des modèles animaux, ont montré une accumulation de

F-FDG associée à une infiltration macrophagique quantifiée par histologie au sein de lésions d’ath os l ose

. De plus, la g a de ep odu ti ilit de l’ aluatio de l’ accumulation de

18

F-FDG da s l’ao te et les a t es a otides a été clairement démontrée hez l’Ho e

.

18

F-Fluorure de sodium

Le

F-fluorure de sodium (

F-NaF) est un radiopharmaceutique du métabolisme osseux, initialement proposé pour la recherche de cancer osseux, de métastases osseuses ainsi que pou l’ aluatio de l’ost opo ose

. L’utilisatio de e radiopharmaceutique a permis de mettre en évidence des microcalcifications présentent lors de certains cancers du sein ou de

tastases osseuses hez des patie ts attei ts d’u a e à la p ostate

.

Le

F-NaF, au niveau des sites actifs de minéralisation, va être incorporé par échange de son

fluor marqué avec le groupe hydroxyle des istau d’h d o apatite. Cette incorporation est

retrouvé au niveau des sites actifs de minéralisation et des microcalcifications où les

contraintes de cisaillement induisent des microfractures de la plaque avec un risque de

thrombose sous-jacent

. L’i o po atio du radiopharmaceutique au niveau myocardique

est négligeable et des études préliminaires cliniques ont montré to ut l’i t t de l’utilisatio

du

F-NaF pou l’i age ie des pla ues au i eau o o a ie

. L ’i o po atio du

F-NaF est

asso i e à u is ue plus le d’ e e ts a dio as ulai es et est o l à l’o se atio

de dépôt calcique par tomographie à rayon X au niveau carotidien

. Il a été mis en évidence

chez des patients avec une sténose aortique, une incorporation du

F-NaF augmentée de 50%

en comparaison aux patients sains

. Ces premières études confirment la spécificité du

F- NaF pou l’ évaluation de sites actifs de minéralisation vasculaires et valvulaires.

Au mo e t où ous d a io s e p ojet, il ’e istait au u e tude p li i ue in vivo de l’utilisatio de e adiopha a euti ue pou so appli atio au pathologies cardiovasculaires

.

Imagerie par Résonance Magnétique

L’i age ie par Résonance Magnétique (IRM) est une moda lit d’i age ie o i asi e et o

i adia te ui pe et d’a oi a s à l’ alu ation de différents constituants de la plaque

d’ath o e

. L’IRM à haute solutio permet d ’ alue hez l’Ho e la taille de la plaque

par la mesure de son épaisseur ou de son volume, de mettre en évidence une rupture de la

hape fi euse et d’ alue sa composition (lipide, fibrose, calcium, thrombus). La distinction

entre les plaques à haut r is ue d’ e e e ts a dio as ulai e s est possible du fait de

l’e ellente discrimination entre les différents signaux qui composent la plaque. Il a été

o t ue l’IRM pe et de ett e e ide e les pla ues carotidiennes avec une chape

fibreuse fine ou rompue lors d’a ide ts vasculaires cérébraux

ainsi que la corrélation entre

l’a u ulatio de lipides et un profil de patients plus susceptibles à un événement

cardiovasculaire majeur

. Du fait de ces c a a t isti ues te h i ues, l’IRM est u outil id al

pou effe tue le sui i de l’ olution de la pathologie comme ont pu le montrer des études

s’i t essa t au lien entre la diminution de LDL par usage de statines et les risques

d’appa itio d’ e e e ts a dio as ulai es

.

o e u outil d’a al se morphologique ais gale e t o e outil d’ide tifi atio de phénomènes physiopathologiques. Le princip e est d’ide tifie des a teu s ol ulai es ou cellulaires qui peuvent être ciblés de façon spécifique aux différents processus pathologiques i te e a t da s l’ath os l ose. Ai si de ou eau age ts de o t aste o t t d elopp s as s su l’utilisatio n de particules d’o de de fer de tailles différentes . L’i age ie in vivo de l’a ti it a ophagi ue a t proposée après injection de particules de fer de petite taille (USPIO pour ultra-small super-paramagnetic particles of iron oxide, SPIO pour super- paramagnetic iron oxide nanoparticles et MPIO pour microparticle of iron oxide)

. L’utilisatio de es ou eau age ts de o t aste p se te l’a a tage d’ t e fa ile e t transposable pour des études précliniques sur des modèles animaux de petites tailles par ciblage des particules de fe à l’aide de leu o jugaiso a e des a ti o ps d’u e esp e a i ale sp ifi ue. Cette thodologie a t appli u e pou alue l’a ti atio e doth liale

90

, la néoangiognèse

ou l’apoptose. Le tableau 1 résume les caractéristique de taille des différentes particules de fer déjà utilisées.

L ’IRM off e u e meilleure solutio spatiale et te po elle ue les odalit s d’i age ie nucléaire telles que la TEP ou la tomographie par émission monophotonique (TEMP). De plus, elle est non irradiante ce qui permet une analyse répétée dans le temps en évitant les riques potentiellement associés à une exposition répétée aux rayonnements.

A o t a io et d’auta t plus da s le ad e de l’i age ie a dia ue ui essite la

synch o isatio de l’a uisitio d’i age a e le th e a dia ue et espi atoi e, l’IRM est

une méthodologie qui requiert un te ps d’a uisitio long en comparaison à la tomographie

à rayons X pour une résolution spatiale comparable. De plus, la sensibilité de détection des

agents de contraste utilis s este plus fai le u’a e les te h i ues d’i age ie u l ai e , essita t l’ad i ist atio d’u e plus g a de ua tit de ol ules .

Tableau 1. Tableau récapitulatif des tailles des particules de fer utilisées pour l'Imagerie par Résonance Magnétique.

Particules Taille

Microparticles of iron oxide (MPIO) 0,9 à 4,5 µm Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIO) 50 à 300 nm Ultra-small superparamagnetic iron oxide (USPIO) 15 à 30 nm Imagerie par ultrasons

L’i age ie pa ult aso s est u e odalit d’i age ie ou a te e li i ue pou u e évaluation rapide, non-irradiante et non invasive de la fonction cardiaque.

Du fait des progrès technologiques et de l’app a itio d’outils hog aphi ue s adaptés à l’utilisatio hez le petit a i al, l’ hog aphie de la fo tio cardiaque chez des modèles de rongeurs est couramment utilisée. Elle permet une analyse anatomique avec une résolution suffisante pour observer un remodelage structurel ainsi que des mesures fonctionnelles, notamment en Doppler.

L’utilisatio de p oduit de o t aste ult aso o e i o ulles a t p opos pou a lio e

la isualisatio des pla ues d’ath os l ose. Les microbulles augmentent la réflectivité du

sang, et donc le signal échographique ou le signal Doppler. Le ciblage des microbulles aux

biomarqueurs des cibles moléculaires de l’ath os l ose est possi le. Cepe da t, le ciblage

ne peut être réalisé que pour les composants en contact avec la lumière artérielle. Cette

certains cas. Le ciblage des microbulles à la P-sélectine montre une augmentation importante (environ 40 % de leu fi atio au i eau de l’ao te a do i ale hez des sou is C Bl /J stimulées par le tumor necrosis factor-alpha (TNF- α )

.

E plus de l’a al se a ato i ue, l’ hog aphie pe et d’ alue e tai s paramètres fonctionnels cardiaques comme la fraction de raccourcissement du ventricule gauche ou les mesures de flux à travers les valves, et de suivre facilement leur évolution au cours du temps.

L’ ho -Doppler a été utilisée pour mettre en évidence l’effet d’u gi e dia tog e ou d’u stress physique sur les vélocités transalvulaires aortiques sur des modèles précliniques d’ath os l ose

.

OBJECTIFS

C’est da s e o te te u’o t t alis s ces travaux de thèse, do t l’o je ctif était l’ aluatio in vivo des lésions d ’ath os l ose pa l’i age ie ta oli ue . Trois volets successifs ont constitué mon travail de thèse :

1. Une évaluation et une optimisation des paramètres d’a uisitio et de e o st u tio en imagerie microTEP/TDM pour l’ aluatio et la ua tifi atio de la i alisat ion vasculaire dans un modèle murin d ’ath os l ose a l e.

2. U e tude p li i ue des ph o es d’i fla atio endothéliale par IRM aux MPIO- α VCAM-1 et de minéralisation à par TEP au

F-NaF dans un modèle murin d’ath os l ose a l e.

3. La mise en place et la caractérisation d’u ou eau modèle murin de rétrécissement

aortique calcifié radio-induit.

RESULTATS

Optimisation des pa a t es d’ac uisitio et de eco st uctio e i age ie ic oTEP/TDM .

Ce trava il s’o ie te su l’i ide e des pa a t es d’a uisitio et de e o st uction sur la

ua tifi atio du ta olis e de i alisatio da s u od le u i d’ath os l ose .

L’i age ie p li i ue essite u e solutio spatiale importante sans diminution du ratio

signal sur bruit et il a t o t ue les pa a t es d’a uisitio e t de reconstruction TEP

avaient une incidence su la ua tifi atio de l’i o po atio du

F-FDG chez le rat

. En plus

de l’ tude de l’ imagerie TEP, une partie de ce travail a été effectuée su l’ aluatio de la dose

d pos e lo s d’a uisitio s scanner à rayons X à haute résolution. Nous avons montré que

l’aug e tatio de la solutio spat ial e des i age ies s a e s’a o pag ait d’u e

augmentation très importante des doses déposées (résolution dans le plan : 163 µm, dose :

1,67 Gy ; résolution dans le plan : 62 µm, dose : , G . E i age ie TEP, l’utilisatio d’u

algorithme 3D-Ordered Subset Expectation Maximization (3D-OSEM) augmentait

significativement la résolution spatiale e o pa aiso à l’utilisatio de l’algo ith e Filte ed

Back Projection (FBP) (1,42 ± 0,35 mm vs. 1,91 ± 0,08, p<0,001). De plus, l’aug e tatio du

o e d’it atio s utilisées lors des reconstructions 3D- OSEM ai si ue l’appli atio d’u

zoom de facteur 2 permettaient une optimisation de la résolution spatiale. Cette optimisation

des méthodes de reconstruction TEP a permis de mettre en évidence son importance pour la

ua tifi atio de l’i o po ration osseuse du

F-NaF et sur la visualisation des incorporations

vasculaires aortiques. Not e p ojet a is ide e la essit de l’opti isatio des

pa a t es d’a uistio et de e o st u tio i oTEP/TDM da s le ad e d’ tude

préclinique ainsi que de la faisa ilit de l’ aluatio de l’a ti it de i alisa tion vasculaire

da s u od le u i d’ath os l ose a l e.

Title: Performance evaluation of a dedicated preclinical PET-CT system for the assessment of mineralisation process in a mouse model of atherosclerosis.

Authors.

Guillaume Rucher

, Lucie Cameliere

, Jihene Fendri

, Ahmed Abbas

, Kevin Dupont

, Said Kamel

, Nicolas Delcroix

, Axel Dupont

, Ludovic Berger

, Alain Manrique

.

Institutions.

1

Normandie Univ, UNICAEN, EA 4650, 14000 Caen, France

2

Chirurgie Vasculaire, CHU de Caen, Avenue de la Côte de Nacre, 14000 Caen, France

3

Normandie Univ, UNICAEN, EPHE, INSERM, U1077, Neuropsychologie et Imagerie de la Mémoire Humaine, 14000 Caen, France

4

Inserm UMR-1088, Université de Picardie Jules Verne, Centre Universitaire de Recherche en Santé (CURS), 80025 Amiens, France

5

CNRS, UMS-3048, GIP Cyceron, Campus Jules Horowitz, 14000 Caen, France

6

Esprimed SAS, 1 Mail du professeur Georges Mathé, 94800 Villejuif, France

7

Médecine Nucléaire, CHU de Caen, Avenue de la Côte de Nacre, 14000 Caen, France Corresponding author.

Alain Manrique, GIP Cyceron, Campus Jules Horowitz, Boulevard Henri Becquerel, BP 5229,

14074 Caen, France. Email: manrique@cyceron.fr, tel: (+33) 231 470 287.

Abstract.

Purpose: The purpose of this study was to assess the impact of acquisition and reconstruction Positron Emission Tomography-Computed Tomography (PET-CT) parameters on the assessment of mineralisation process in a mouse model of atherosclerosis.

Procedures: All experiments were performed on a dedicated preclinical PET-CT system. CT was evaluated using 5 acquisition configurations using both a tungsten wire phantom for in- plane resolution assessment and a bar pattern phantom for cross-plane resolution. Furthermore, the radiation dose of these acquisition configurations was calculated. The PET system was assessed using longitudinal line sources to determine the optimal reconstruction parameters by measuring central resolution and its coefficient of variation. An in vivo PET study was performed using uremic ApoE

, non-uremic ApoE

and control mice to evaluate optimal PET reconstruction parameters for the detection of sodium fluoride ([

F]NaF) aortic uptake and for quantitative measurement of [

F]NaF bone influx (Ki) with a Patlak analysis.

Results: For CT, the use of 1 x 1 and 2 x 2 binning detector mode increased both in-plane and cross-plane resolution. However, resolution improvement (163 to 62 microns for in-plane resolution) was associated with an important radiation dose increase (1.67 to 32.78 Gy). With PET, 3D-Ordered Subset Expectation Maximization (3D-OSEM) algorithm increased the central resolution compared to FBP (1.42 ± 0.35 mm vs. 1.91 ± 0.08, p<0.001). The use of 3D- OSEM with 8 iterations and a zoom factor 2 yielded optimal PET resolution for preclinical study (FWHM= 0.98 mm). These PET reconstruction parameters allowed the detection of [

F]NaF aortic uptake in 3/14 ApoE

mice and demonstrated a decreased Ki in uremic ApoE

/-

compared to non-uremic ApoE

and control mice (p<0.006).

Conclusions: Optimizing reconstruction parameters significantly impacted on the assessment

of mineralisation process in a preclinical model of accelerated atherosclerosis using [

F]NaF

PET. In addition, improving the CT resolution was associated with a dramatic radiation dose increase

Keywords: preclinical PET-CT, [

F]NaF, atherosclerosis, vascular mineralisation, bone

metabolism.

Introduction

Atherosclerosis is a multi-process pathology involving inflammation, necrosis and mineralisation and remains a leading cause of death and disability worldwide. The composition and inflammatory state of plaque is predominant to define its vulnerable status and the risk of clinical events. Non-invasive assessment of atherosclerosis has evolved considerably, from the evaluation of stenosis to complex characterization of plaque features and metabolic activity [1].

Mineralisation is an early process in the development of atherosclerotic plaque resulting in the formation of hydroxyapatite crystals within the plaque. This deposition of hydroxyapatite crystals is the consequence of phenotypic changes of vascular smooth muscular cells (VSMCs) into an osteoblast-like expression profile, leading to the expression of Cbfa1 transcription factor and alkaline phosphatase activity [2]. Considered to be a passive, degenerative and end-stage process of vascular disease, some studies showed that the involving features are similar to bone formation [2–4] and several conditions promotes calcium vascular deposition, including aging, atherosclerosis, diabetes, and chronic kidney disease (CKD).

In clinical setting, Positon Emission Tomography (PET) is widely used for the assessment of

metabolic activity in various pathologic conditions. Sodium fluoride ([

F]NaF) is a bone

radiopharmaceutical, which is long used for the analysis of skeletal metabolism. Recent studies

showed the potential of [

F]NaF as an early marker of atherosclerosis through its affinity for

active mineral deposition within the plaque [5 – 7]. The development of dedicated preclinical

scanners allows in vivo assessment of metabolic processes in small animal models of

cardiovascular disease. Given the size of small animal models, preclinical imaging requires a

high spatial resolution without loss in signal-to-noise ratio. It has been shown in phantom and

animal studies that acquisition and reconstruction parameters may impact the quantification of

tracer uptake [8]. Especially, the determination of optimal acquisition and reconstruction

mineralisation. In addition, the combined assessment of anatomical landmark using micro-

computed tomography (micro-CT) may induce a significant additional radiation exposure of

animals that has not been widely investigated yet. The aim of this study was to evaluate the

impact of PET-CT acquisition and reconstruction parameters on the detection of mineralisation

activity in a preclinical model of accelerated atherosclerosis.

Materials and methods.

All acquisitions were performed using a dedicated preclinical PET-CT system (Inveon®, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany). The CT allows an adjustable tube voltage ranging from 35 to 80 kVp and adjustable current ranging from 100 to 500 µA. The PET detector features a LSO 20 x 20 crystals array, with 64 detector blocks (detector element size: 1.59 mm x 1.59 mm x 10 mm) with a 16.1 cm ring diameter and an axial field of view (FOV) of 12.7 cm.

Phantom and performance evaluation.

Micro-CT system assessment. A series of 4 successive acquisitions was performed using a

combination of detector binning mode and exposure time to evaluate the impact of increasing the resolution on the radiation dose to the animal. The transaxial FOV was set to 1.9 x 2.8 cm and the reconstruction and display matrix to 1024 x 1024 in all cases. These data were compared to a standard attenuation correction acquisition according to the default procedure provided by the manufacturer (transaxial FOV of 5.4 x 7.9 cm, 120 projections over 220 degrees). The acquisition parameters are summarized in Table 1. As previously described [9], we used a tungsten wire phantom for the in-plane spatial resolution assessment and a micro-CT resolution bar pattern phantom (QRM GmbH, Möhrendorf, Germany) was used to qualitatively evaluate the cross-plane resolution. This phantom is made of bar and point patterns having diameters ranging from 5 to 150 µm line/point thickness. The phantoms were placed in the centre of the FOV using build-in laser guides. The in-plane modulation transfer function (MTF) of the tungsten phantom for each configuration was used as a metric of in-plane micro-CT resolution and measured using a dedicated software (MTFCalc, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany).

The assessment of profile intensity acquired using the bar pattern phantom was processed using

AMIDE software [10]. The smallest visible pattern assessing the pixel intensity profile was

To assess the dose radiation delivered during micro-CT acquisitions, we used an X-ray dosimeter (DCT10RS, RTI Electronic AB, Sweden) placed in a 30 mm diameter plastic cylindrical phantom. The X-ray dose was measured twice with the dosimeter placed at the centre of the FOV, then once with an offset of 10 mm from the centre of the FOV at 0°, 90°, 180° and 270°. The mean of central and peripheral doses were calculated then divided by the axial FOV (DoseCtr and DosePer, respectively). Then, the dose for each acquisition parameter was calculated using the Equation 1:

𝑜 𝑒 = ∗ 𝑜 𝑒 + ∗ 𝑜 𝑒𝑃𝑒 (Eq.1)

To calculate the standard deviation of data, we performed the acquisitions centred on a 1-mL syringue filled of water. We used Osirix v6.5.2 to draw 3 regions of interest (ROIs) on 3 slices of the axial plane including more than half of the volume of water. The mean of standard deviation was calculated for each configuration.

Preclinical PET system assessment. To evaluate the PET modality, we used a custom-made

resolution phantom consisting of 5 longitudinal line sources (internal diameter < 1 mm) at 1- cm intervals filled with a

F solution (10.6 MBq) totally immersed in water. After a low dose CT for attenuation correction (the acquisition parameters are detailed in table 1, reconstruction

#5), a 600-second list mode acquisition was performed using energy and coincidence windows

of 350-650 keV and 3.4 ns, respectively. Data were reconstructed using a dedicated software

(Inveon Acquisition Workplace, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany) with different

settings: (i) Filtered Back Projection (FBP) reconstruction with a Butterworth filter (order 1,

axial cut-off frequency 0.3 or 0.5), and (ii) 3D-Ordered Subset Expectation Maximization (3D-

OSEM) with 4 subsets and successively 4, 8 and 16 iterations. Each method was used

Animal model. Fifteen male C57BL/6 ApoE

mice were assigned to uremic (n= 7) or non- uremic (n= 8) groups. As previously described [11], uremia was induced by renal electrocoagulation at 8 week-old followed by contralateral nephrectomy at 10 week-old. A control group consisted of 4 C57BL/6J mice. The institutional animal ethics committee approved the animal experiments (#3979).

In vivo PET acquisitions and reconstruction. At 16 week-old, animals were kept under anesthesia with isoflurane 2% gas in a mixed of O

and N

O (1:2). Following attenuation CT acquisition, [

F]NaF injection (≈18 MBq) was performed intravenously through a tail vein catheter and dynamic acquisitions of emission data was performed using a 3600 sec list mode started simultaneously with the tracer injection (energy and coincidence windows of 350-650 keV and 3.4 ns, respectively). Emission data were rebinned into the following consecutive time frames: 12 x 5, 3 x 10, 6 x 30, 5 x 600 s. Based on phantom results, images series were reconstructed using FBP (Butterworth filter order 1, axial cut-off frequency 0.5) and 3D-OSEM (with successively 4 and 8 iterations) using a zoom factor 2 without scatter correction. In 9 animals, aortas were harvested immediately after PET imaging, washed in 0.9% NaCI solution, weighted and residual activity was measured using a gamma counter (2470 Wizard

, Perkin Elmer, USA). Residual activity was expressed as a percentage of the injected dose per g of aorta (%ID/g).

In vivo PET post-processing. Post-processing was performed using Carimas v2.4 software

(Turku PET Centre, Turku, Finland). In order to assess the impact of reconstruction parameters

on quantitative analysis we evaluated the [

F]NaF uptake in (i) sternum, (ii) vertebrae and (iii)

femur using a Patlak graphical analysis. Cylindrical volumes of interest (VOI) were drawn

encompassing the sternum, a thoracic vertebra, a lumbar vertebra and the proximal part of the

left femur. The same pattern of VOIs was designed for all examinations and these VOIs were

manually fitted to each animal. Image-derived input function was obtained using a cylindrical

VOI placed over the abdominal vena cava. Maximum tissue time-activity curves (TACs) were calculated from all VOIs. Patlak graphical analysis was performed from 10 to 40 minutes dynamic data to measure the fluoride bone influx rate constant (Ki) in 7 ApoE

mice and 4 control mice. Aortic [

F]NaF uptake was assessed using a semi-quantitative method in all ApoE

mice. The [

F]NaF activity was represented with a color scale starting just upon the plasma activity determined drawing a VOI over the abdominal vena cava with a maximum set to 200% of the plasma activity measured at the last frame of the data for each examination [12].

An uptake in a region close and above to the heart was considered as a positive aortic [

F]NaF uptake.

Statistical analysis

Values are presented as mean ± SEM. Continuous data were compared using the Wilcoxon

signed-rank test or Mann – Whitney U test when appropriate. A multivariate analysis using a

linear model was used to evaluate the effect of animal group (uremic ApoE

, non-uremic

ApoE

and control group), bone location (sternum, vertebrae, femur), reconstruction algorithm

(FBP, 3D-OSEM 4 iterations and 3D-OSEM 8 iterations) and their interactions on the

assessment of the fluoride bone influx rate (Ki) in animals. Post hoc analysis was performed

using Dunn comparisons. Statistical analyses were performed using JMP 11 (SAS institute,

Cary, NC).

Results

Phantom and performance evaluation

Table 1 summarizes the results of the micro-CT assessment. The use of binning 4 x 4 decreased significantly both in-plane and cross-plane resolution compared to binning 1 x 1 and 2 x 2. Due to a failure of the MTF measurement software, the in-plane resolution of the image corresponding of the CT attenuation was not assessed. The radiation dose dramatically increased with the improvement of spatial resolution, ranging from 0.05 to 32.78 Gy (see figure 1). The mean standard deviation of the signal increased with the radiation dose and decreased with the optimization of the acquisition parameters (178.6 vs. 322.8 using 3000 ms of exposure and 900 ms, respectively).

The measurements of central resolution and its coefficient of variation of micro-PET system are summarized in Table 2. The 3D-OSEM algorithm increased significantly the central resolution compared to Filtered Back Projection (1.42 ± 0.35 mm vs. 1.91 ± 0.08, p<0.001 respectively). The coefficient of variation using FBP was higher compared to 3D-OSEM (8.64

± 1.98 vs. 13.86 ± 2.13, p<0.0001 respectively). The linear model analysis demonstrated that

the use of a zoom factor 2 during the reconstruction process significantly improved the central

resolution (p<0.0001), especially when using 3D-OSEM (p<0.0001 for the interaction between

zoom and reconstruction algorithm, see figure 2). Using a zoom factor 1, the central resolution

was 1.74 ± 0.03 vs. 1.95 ± 0.04 for 3D-OSEM and FBP respectively (p= 0.04). In contrast, the

difference between the reconstruction algorithms was increase when using a zoom factor 2

(1.09 ±.0.04 vs. 1.88 ± 0.03 for 3D-OSEM and FBP respectively, p= 0.02). The COV was also

impacted by applying a zoom factor, but to a lesser extent (p<0.05). Scatter correction did not

influence the central resolution and the coefficient of variation. Similarly, increasing the

number of iterations to 16 did not affect the central resolution compared to 8 iterations when

In vivo study

We assessed the impact of reconstruction parameters on fluoride bone influx rate in an experimental atherosclerotic context. As illustrated in table 3 and in figure 4, the linear model demonstrated a significant impact of animal phenotype (p<0.0001) and reconstruction algorithm (p<0.0001) on Ki measurements. The FBP reconstruction was not able to demonstrate any difference between animal groups for Ki measurements. Nevertheless, using 3D-OSEM algorithm we found that Ki decreased in uremic ApoE

mice compared to non- uremic ApoE

and to control mice (p<0.006).

As illustrated in figure 3, there was a significant impact of reconstruction method in the assessment of aortic uptake of [

F]NaF. No aortic uptake was found using FBP reconstruction.

Conversely, 4/15 (26%) ApoE

mice (3/7 uremic and 1/8 non-uremic) presented an aortic

uptake using 3D-OSEM algorithm with 8 iterations, which was absent with 3D-OSEM with 4

iterations. In the remaining 11 animals, there was no aortic uptake using 3D-OSEM with 4 and

8 iterations. Ex vivo measurements using gamma counter demonstrated a higher aortic uptake

of [

F]NaF in animals with positive (n= 4) compared to negative (n= 5) PET examination

(respectively 3.54 ± 1.89 vs. 0.47± 0.22 % ID per g, p< 0.05).

Discussion

In this study, we demonstrated that the optimization of micro-CT acquisition parameters yielded a significant increase of spatial resolution, but also led to a dramatic increase of radiation dose. We further showed that 3D-OSEM reconstruction and the application of a zoom factor 2 during the reconstruction process increased the resolution of PET images. In addition, we found that reconstruction process had a significant impact on the results of qualitative and quantitative assessment of mineralisation process using [

F]NaF.

Phantom study

To date, there is no consensus for standardization of micro-CT acquisition parameters, with values ranging from 50 to 80 kVp, 0.18 to 500 mA and 9 to 750 ms for the voltage, current and exposure time respectively [13–16]. In this study, all CT acquisitions were performed using the same voltage and current. The optimization of acquisition parameters was obtained by increasing detector binning, the exposure time being adapted to obtain an optimal saturation histogram from the scout view as recommended by the manufacturer (except for the reconstruction #2). While using the low dose CT acquisition for attenuation correction, the tungsten wire was not detected in the images and did not allow the measurement of in-plane resolution. In addition, under these specific conditions, the cross-plane resolution was poor, over 150 microns. However, a simple increase of magnification led to in-plane and cross-plane resolution of 163 and 100 microns respectively, similar to that obtained using cardiovascular preclinical MRI [17]. As previously demonstrated [9], it was possible to further increase the resolution using a combination of increased exposure time and detector binning. However, this optimization induced a dramatic increase of the radiation dose to the animals. Our results are consistent with Ford et al. [18] who demonstrated using a computer simulation that image quality estimated as the COV of the linear attenuation coefficients was proportional to [dose]

1/2

and to the [isotropic voxel size]

. At equivalent image quality, they demonstrated that