Préparation de cytochrome C de muscle cardiaque bovin
1. Lyse des cellules: récupération d'un extrait brut
Dilacérer environ 3 g de muscle cardiaque dans 10 mL de tampon phosphate sodique 25 mM pH 7,0 à 4°C. Homogénéiser (homogénéisateur électrique). Centrifuger à 12 000 g pendant 15 minutes à 4°C (utiliser une série de tubes microfuges de 1,5 mL). Après centrifugation, chaque échantillon présente un culot, un surnageant aqueux mais aussi une couche lipidique de surface. Prélever soigneusement 1 à 2 mL de surnageant aqueux.
2. Adsorption du cytochrome C sur une résine échangeuse de cations
Essorer environ 6mL d'échangeur fort de cations équilibré en tampon phosphate sodique 0,025 mol/L pH 7,0 puis transférer dans un petit Becher. Ajouter alors les 2 mL de tampon phosphate sodique 0,025 mol/L et les 2 mL d'extrait brut. Agiter 30 minutes sous agitation magnétique, si possible à 4°C.
Récupérer la résine grâce à filtre.
Question: Le pHi du cytochrome c;est de 10,6. Écrire et justifier le réaction d'échange d'ions obtenue.
3.
Elution du cvtochrome C de la résine
Transférer la résine dans une mini colonne de chromatographie. Percoler environ 6 mL de tampon phosphate sodique 25 mmol/L pH 7,0. Récupérer cet éluat = fraction E1 et conserver. Percoler alors environ 4 mL de tampon phosphate sodique 25 mmol/L pH 7,0 + NaCI 500 mmol/L. Récupérer cet éluat
= fraction E2 et conserver. Percoler alors environ 4 mL de tampon phosphate sodique 25 mmol/L pH 7,0 + NaCl 1000 mmol/L. Récupérer cet éluat = fraction E3. L'éluat E3 recueilli est de couleur rouge et contient le cytochrome C. Conserver la fraction E3.
Questions: Schématiser le processus chromatographique. Comment qualifier le mode d'élution choisie ?
4. Relarqaqe de protéines contaminantes
Pour 1 mL de fraction E3 (conserver le reliquat), ajouter doucement en agitant 0,56 g de sulfate d'ammonium et 0,03 g de carbonate d'ammonium. Atteindre la dissolution complète des sels, laisser reposer 1 semaine à 4°C. Centrifuger à 12 000 g.
Question: Justifier cette étape. Qu'observe-t-on dans le tube de relargage?
5. Elimination des sels de relargage et des molécules de petite taille
Par dialyse pendant une nuit contre 200 mL de tampon phosphate sodique 0,01mol/L pH 7,0. Récupérer le contenu du boudin = fraction E3+. Conserver.
6. Etude spectrophotométrique des fractions
6.1. Réaliser le spectre différentiel de référence du cvtochrome c
Une solution commerciale de cytochrome c à 1g/L en tampon phosphate sodique 25mM pH 7,0 est fournie. Mesurer l'absorbance vers 410 à 420 nm. Si l'absorbance est supérieure à 1 diluer la solution dans le tampon pour amener l'absorbance à moins de 1. La solution est alors aliquotée en 2 fractions : une réduite par le dithionite (le fer du cytochrome y sera à l'état fe2+), l'autre oxydée par du ferricyanure de potassium (le fer du cytochrome y sera à l'état fe3+). Tracer le spectre différentiel entre la forme réduite et oxydée (référence = cyt. c oxydé, mesure = cyt. c réduit) sur l'intervalle 380-600 nm. Le spectre différentiel doit montrer 3 bandes caractéristiques du cyt. c : la bande g vers 420 nm, la bande b vers 520 nm et la bande a vers 550 nm.
Pour la réduction, on utilisera du dithionite de sodium Na2S2O4 , par exemple 10µL d'une solution à 30mmol/L dans le tampon, préparée extemporanément, pour 2mL d'une solution de cytochrome c. Pour l'oxydation, on utilisera une solution 20 mM de potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6), par exemple 20µL dans une cuvette de 2 mL de solution de cytochrome c.
Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles 1/2
6.2. Étude des fractions B par réalisation de spectres différentiels Selon la méthode du paragraphe 4.1. Conclure.
7
. Analyse électrophorétique SDS-page des fractions
Voir document dédié.
Bibliographie : http://aci.mta.ca/courses/biochemistrv/BC4521/expt4.html
