STRUCTURE ET ACTIVITE DE LA CHROMATINE IN VITRO

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Pays, E. (1974, November). Structure et activité de la chromatine in vitro (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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-···--·---J

Facu lt e des Sciences

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

Laboratoire de Cytologie et d Embryologie Moleculaires Prolesseur J. BRACHET

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STRUCTURE ET ACTIVITE DE LA CHROMATINE IN VITRO

Memo ire presente p ur 1 · obtent ion du grade

de Docteur en Sci~nces zoologiques

.

^~

Etienne PAYS

19 74

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0 CT. 1974

R· ep: .

Facu lte des Sciences

Laboratoire de Cytologie et d Embryologie Moleculaires Prolesseur J. BRAC HET

STRUCTURE ET ACTIVITE DE LA CHROMATINE IN VITRO

Memo ire pre aent e pour 1 · obtent ion du grade

de Docteur en Sciences zoologiques

Etienne PAYS

Novembre 1 g 74

lement et sur le plan des id~es, et sans qui cette th~se n1aurait jamais vu le jour.

Une grande partie de ce travail a 6t& effectu&e ·en collaboration avec A. Ronssef que je tiens tout particuli~rement ~ remercier,.non seulement pour son efficacit&

et ses id&es enrichissantes, mais aussi pour sa bonne humeur constante et son dynamisme inalt&rable.

Certaines exp6riences ant &t& r&alis6es en collaboration ou gr£ce ~ 11aide

pr&cieuse de J. Flamant et de M. Janowski, avec lesquels j'ai eu d1autre part des discussions aussi longues que fructueuses. En outre, je remercie Michel pour ses dens inestimables de nucl&ase Sl, et de DNase II quand le besoin s1en fit sentir.

De rng1ne, je tienn ~ ren~re grgce au professeur P. Chambon pour son don tr~s g&n&reux d1a aman~tine trit{&e, au professeur V. Krsmanovic pour m'avoir initi&

aux methodes d1exp&rimentation dans le domaine des RNA polym&rases eucaryotiques, et au professeur J. He3rst pour m'avoir aide~ d6terminer la constante de s&dimen- tation de mes preparations de DNA.

Il me se~ait difficile de remercier ici'tous ceux qui, d'une mani~re ou d'une autre, m1ont encore assist& au cours de cc travail~ Que tousles chercheurs du Laboratoire de Cytologie et d1Embryologie Mol~culaires sachent cependant que je leur suis profond&ment reconnaissant.

Ce travail a &te effectu& grlce au soutien financier du Fonds National de la Recherche Scientifique, auquel j'adresse aussi tous mes remerciements.

I. Hise au point des donn&es actuelles sur la regulation de la transcription chez les Eucaryotes.

1. Chromatine: definition.

~---

1.1. Isolemcnt 1.2. Composition

1~2.1. Histones

1.2.2. Proteines acides 1.2.3. RNA

1.2.4. Enzymes

1.2.4.1. RNA polymerases 1.2.4.2. Autres enzymes

~!-!E~~~~E~E~~~~-g~-~~-~~E~~~!~~~-!~-~~!E~·

2.1. Mesures quantitatives

2.1.1. Activit& par rapport au DNA 16

2~1.2. Variations de l'activite sous l'influence de divers facteurs

experimentaux 17 2.1.3. Variations de l'activite en fonction de l'etat physiologique de

la cellule 18 2.1.4. Cas particulier des actions hormonales

2.1.4.1. Oestradiol 20

2.1.4.2. Pr9gesterone 21

2.1.4.3. Testosterone 21

2.1.4.4. Hydrocortisone 21

2.184.5. Aldosterone 22

2.1.4.6. AutreS hormones animales 22

2.1.4.7. Vitamine D3 23

2.1.4.8. Hormones vegetales 24

2.1.5. Conclusions 24

P• 1 1 2

4

8

11 14

2.2. Mesures qualitatives

2.2.1. Resultats des experiences d1hybridation 25 2.2.2. Les RNA polymerases eucaryotiques transcrivent-elles plus sp&cifi-

quement la chromatine que ne le fait la RNA polymerase de E.coli? 27 3. Arrangement des constituants de la chromatine en fonction de la transcrip-

tion.

---

3.1. Arrangement des histones dans la chromatine 29 3.2. Liaison des.histones au DNA de la chromatine; relation avec la

conformation du DNA 31

3.3. Y a-t-il du DNA nu dans la chromatine? Relation avec l'euchromatine 34

3.4. Eu- et heterochromatine 38

4.

R6le du DNA dans la regulation de la transcription.

---·---

4.1.

Retention d'acides amines

4.2.

Repetition de sequences nucleotidiques

4.3.

Sequences tres repetitives: relations avec 1¹heterochromatine

. constitutive

L~.4.

Sequences moyennement rep&titives: role de regulation?

4o5• ^Sequences non r&petitives: g~nes de structure

5.

Role des proteines dans la regulation de la transcription.

---

5.1.

Histones

5.1.1. Specificite

5.1.2. Modifications secondaires

5.1.3.

Role

5.1.4. Interactions in vitro avec des polyanions

42 42 45 46 48

49

~.Q ~ 52

53

5.2.3.

Role

5.2.4. Conclusions generales 5.3. Autrcs proteines

5o3ol• Hybridase

5.3.2. Facteurs cytoplasmiques migrant dans le noyau 5.3.3. Proteases

6. Mecanismes de regulation de la transcription au niveau cellulaire:

faits et hypotheses.

---

57 58.

59

59

60

3.1. Effets de la DNase sur la transcription de la chromatine in vitro 3.1.1. Travail publie

3.1.2. Di$CUssion complementaire

3.2. Modifications de structure de la chromatine i la suite d'une '

86 88

86

6.1. R8le des divisions cellulaires 60

6.2. DNA informationnel 61

6.3. Couplage entre la transcription et la traduction 61 6.4. Modeles theoriques de regulation de 1¹ex~ression genetique chez les

Eucaryotes 63

II. But du travail. 66

III. Rcsultats experimentaux et discussion.

!!-~~!~~~~~-g~~~~~~~~-

1.1. Extractions et purifications 1.2. Syntheses de RNA in vi!.!2.

~!-~~~~~~~!E!!~~-!~-~!!~~·

2.1. Par-ame t r-e s 2.1.1. Cinetiques

2.1.2. Effet de la concentration du template et de la polymerase 2.1.3. Effet de la composition ionique du milieu

2.1.3.1. Cations bivalents 2.1.3.2., Sels

2.1.4. Effets de differents inhibiteurs

2.1.5. Effets d1inhibiteurs de la RNase ou des proteases 2.2. Nature du produit forme

2.2.1. Taille 2.2.2. Specificite

2.2.2.1. Effet du cortisol in vivo et in vitro 2.2.2.2. Hybridation du RNA au DNA

2.2.2.2.1. Hybridations sur filtre

2.2.2.2.2. Hybridations avec un grand exces de DNA 2.2.2.3. Specificite de·la RNA polymerase

2.2.2.3.1. Specificite tissulaire 2.2.2.3.2. Nucleotides d'initiation

3. Arrangement fonctionnel des composants de la chromatine. ·

---

. 67

68

68 69

70 70 72 74 74

76 76

81

83 8'+

3.3. Denaturation thermique de la chromatin~

3.4.

Fractionnement en eu- et heterochromatine

4.

Analyse de la composition du DNA du foie de rat.

---·---

4.1. Hethodes 4.2. Hesultats

fragmentation 101 103 105

rv.

Resume.

106 107

109 110 5. Essais de reassociation de proteines au DNAe

---

cRNA: RNA chromosomial de Bonner HnRNA: RNA h&t&rog~ne nucl&nire nRNA: RNA nucl&aire

chrRNA: RNA synth&tis& par la chromatine in vitro dRNA: RNA synth&tis& par le DNA in vitro

RP: RNA polym&rase

RP II: RNA polym&rase du type II chez les eucaryotes RP C ou RP Coli: RNA polym&rase de E.coli

Chr: chrornatine

Tm: tempfrature moyenne de fusion

Cot: produit (concentration des nucl&otitles (moles/litre)x temps d1incubation (sec)) utilis& lors d'exp&riences de renaturation d'acides nucl6iques

Cot 1/2: valeur de Cot correspondant ~la moiti& de la renaturation cpm: coups par-minute

rpm: r&volutions par minute DO: densit& optiqu~

DTT: dithiothreitol

TCA: acide trichloroac&tique PCA: acide perchlorique

---·---

1. Chromatine: d6finition.

1.1~ Isolement.

La chromatine est le complexe form& par le DNA, des proteines et du RNA dans le noyau des cellules en interphase. Apr~s lyse.des noyaux purifi&s dans un milieu de faible force ionique, la chromatine s&dim~nte sous la forme d'un agregat macro~

moleculaire insoluble. Pour 6viter au maximum la contamination de ce compJ.exe par des elements cytoplasmiquss, de la membrane nucl&aire ou des prot6ines solu- bles nucl6aires, il faut laver la chromatine par des methodes qui ne modifient pa~

sa structure et sa composition. C1est

&

ce stade que se situe le probl~me majeur de toute les recherches concernant la chromatine: comment definir avec exactitude quels en sont les composanta structurels, et comment d&terminer son degr& de purete par des crit~res constants? Plusieurs suggestions ont et& faites pour preciser la puret& de la chromatine native: le rapport de l'absorption dans l'ultraviolet 3~0 nm/260 nm doit @tre inf&rieur ~ 0,05 (1); les cinq fractions d'histones doivent 3tre toutes pr&sentes (en taus cas, chez les M&tazoaires); on ne doit pas pouvoir deceler de phospholipides· membranaires (2, 794); le rapport prot6ines/DNA doit se situer entre 1:1 et 2:1 (l); le rapport RNA/DNA doit @tre inf&rieur

a

^{0,2 (l); le profil} de.denaturation thermique ne doit pas gtre bipha- sique (3); on ne doit pas observer de pie~ 280 nm lorsqu'on &tudie la chromatine en dichroisme circulaire (3); la chromatine doit contenir des sites~ haute

affinite pour le bromure d'&thidium (4); la chromatine doit mi~rer sous.la forme de mat&riel homog~ne en &lectro~hor~sc zonale (5), ~ travers du saccharose concen tr& (6), ou dans un gradient de chlorure de c&sium apr~s fixation~ la formalde- hyde (170, 794). Cependant, ces criteres d&pendent toujours de l'interpr&tation que les auteurs donnent de la d&finition de la chromatine, et il est certain que la grande variabilit& des resultats obtenus en &tudiant ~structure, la composi- tion ou 11activit6 de la chromatine est due~ un manque d'uniformisation des m&thodes d1extraction et de purification.

1.2. Composition.

Deux composants essentiels caract&risent la chromatine: le DNA nucl~aire et les

~istones. La presence de ces dernieres proteines, qui permettent de diff&rencier la chromatine des eucaryotes et les chromosomes bact&riens, est A mettre en rapport avec la taille et la complexite du materiel g&n&tique chez les orGanismes sup&rieurs, qui imposent une restriction beaucoup plus importante de l'activite ''template'' de ce materiel, ainsi qu'une protection plus developpee co1tre

11activit8 des nuclcnses.

Mais la variation dans la composition de la chromatine ~rovenant de diff&rents org3nes ou de diff&rentes especes, ou m@me la variation de sn composition en fonction des m&thodes d1extraction, r~side au niveau des prot6ines non-histones et du HNA.

Nous allons bri~vement d6finir la nature de ces divers composants.

1.2~1. Histones.

Les histones sent des prot&ines basiques de petite taille (PM de 11.282 ~environ 20.000), principalement localis6es dans les ~oyaux des eucaryotes.

On les subdivise g&n~ralement en cinq classes comportant des subdivisions secondaires (7, 8).

TABLE 1. Nomenclature and clrara clcr isf ics of historic fractions from calf thymus

Varieties of Nomenclature

Rasmussen Jones & Iwa i Starbuck Lys/ Ar~ Mo], wt.

Dcscrlptlve" Cl al Buller ct al ct al Proposed!

(2·1) I (25) (26) (27)

Lys-r ich fl Ala-1 ich, very KAP 2o?i.1t ... 20,o:x/).lt

Lys-rich

f"''

^{f:!b Ser-rich, slightly KAS 2. s• 13,77·1°}

Slightly Lys-rich Lys-rich

llbl f:!J2 Leu-rich, In- Ar~-lys rich l.AK i.o-i.zv> ~1s,ooob,b

termed. ^(AL)

r

^{n Glu-rich, Arg· ARE} o.n"·• ^{15, J2'1~·•}

Arg-rlch rich

IV f2al Gty-rich, Ar~- Gly-r ich, GRK 0.791 I I ,2S2 r

rich A rs-rich

(GAR)

• This nomcuclo ture is qjl! ocr.rsionally used,

r, Values from D~L:lr.gt! S: Smith (20) .

.:. This bis.to~c hac. been sequenced by lwai, Ishika wa &. Haya s'il (:!(:).

1 This ::istono l.n s been >c·qm·:>ccd by Dc l.a ngc. Hooper & Smith 12Sl.

e Nore th:it ~i:1nl'Jfl ct :11 (2';' finJ a rninor frJctio11 of histone ARE in calf lhymu! (:!0% of major fr~clion) which contains just one CySH.

1 This histonc ha s been scqucncec by Delonge ct al (30) a nd by Ogawa et ol (3().

:\ ... c P:irti.11 5.cquc:idng of 1'~is hiStonc l1:i~ been rlor:c hy P .. dl & Co'<.· (J/.).

11 P.:Htial scqt1e•1:inc of this histonc h.1~ r.c~·n done by S1J£_a110 ct al (3Jt, 1 Th i'i r.omcncla !urc h.u bL·~·n modi!icd from t!ie orir;iinl (I 9~~ 11.

; Thi) nnmc:n...:1:1~u~c w:i'.\:n!rt:~d r:n rv .1 t;rOllf} nf~is:orw ~l1~11·,j~1~ ,1! the Gordon ConfC"rt"ncc on ~u:~c.u Pro!ci'1 ... cr.rom:iti11 Stn:Cll!tC~ :iml Gt·n~ Hct~ub~inn, July, 1'!72. II is l~~1Sr:l! O:"l tl·c S'..ind.ud IL!P~\C 5in~~C·

lc:h;r <.:ode for amino '.'\C;~!!t '1110 on the: f0~lowin~ rule eJch ~isrone is n:lm::c! wilh the tlm.:'! k•Pcrc !lt:indin:;

for its three 1~1o:;t :ibunc:!:rnt amino 3cids. in cl::crc . .ning onkr. This n.:>men.:l..iturc i3 in ptc:pJrJtion for puii·

llcation (23).

Le nombre d~ 6es subdivisions doit probablement se situer aux alentours de douze

(9); dans une classe, les diff&rentes sous-fractions se comportent de la m8me mani~re quand des modifications sont apport~es ~la m&thode d1extraction, et elles s1isolent simultan&ment. La distinction entre les diverses subdivision est malais&e: il faut avoir recours ~des chromatographies en s~rie (10) ou ~ d tr~s lon3ues &lectrophor&ses (9) pour les reconnaitre; mais le nombre et les propri6t6s des diff~rcnts composants restent constants et reproductibles dans

les limites d1une m8me technique. Les sous-fractions peuvent ~rovenir surtout

de changements localis6s, par des modifications secondaires (m&thylation, phospho- rylntion, ac&tylation) de la structure primaire invariante. Par example, 240

sous-frnctions peuvent th&oriquement exister dans la fraction f2al, en supposant ou non une phosphorylation de la s&rine 11 puis dans chaque cas une m&thylation ou non de la lysine 20, puis dans chaque cas une phosphorylation ou non de l'histidine 18 ou

75

ou 18 et

75,

une ac6tylation ou non de la lysine 16, etc •••

Au cours de l'&volution, les histones sent apparues concomitamment ~ l'apparition

du noyau cellulaire et de la diff&rienciation des tissus. Elles sent, en effet, absentes chez les bact&ries, et on les rencontre toujours chez ~es eucaryotes.

Le fait qu'elles soient apparues t8t dans l1&volution, qu1on les observe syst&- matiquement dans le noyau et que leur composition reste d&finie ~ un point tel qu1elle permet une classification, sugg~re ~ans ambiguit6 qu'elles joucnt un r8le fondamental dans la vie des orsanismes diff6renci&s. A cause de leur importancet la possibilit& de leur alt&ration par mutations non l&tales a 6t6 s&v~rement

r6duite, de .sorte que lcur structure s'est conserv&e chez taus les Stres vivants

(11, 12). Il ya environ 1.000 copies de chaque g~ne d1histone, et ces copies

semblent Stre tr~s fid~les; le RNA messager des histones forme un hybride stable avec le DNA de nombreux invert&br6s, vert&br6s ou plantes sup&rieures, ce qui permet de penser que les g~nes codant pour la synth~se des histones ont &t& tr~s peu modifi&s au cours de l1&volution (13). Le taux mutationnel de ces s&quences

·a &t& s&v~rement r&duit, au point d1emp@cher les substitutions de nucl&otides en troisi~me position des codons, ce,qui dans beaucoup de cas entra~ne cependant

l'incorporation du m@me acide amin& ~la mSn1e place dRns la prot6ine (13): on peut done supposer qu'une pression s6lective s'est effectu6e au niveau des acides

nucl&iques, peut-@tre dans la conformation du DNA ou des RNAs messagers.

Les s&quences r6p&titives codant pour les histones ne contiennent pas de s6quencee uniques alternant avec elles en &trait voisinage (ll~, 15): on peut done les

classer dans la mSme cat&gorie que les cistrons ribosomiaux (16), constitu&s

aussi par de longues s6quences r&p6titives invariantes. Birnstiel et al (809) ont d1ailleurs isol& ces s&quences, qui comme dans le rDNA sent constitu6es de tan- dems de g~nes invariants espac&s par des s6quences tr~s variables.

D1apr~s leur degr& de constance relative au cours de l1&volution, on peut subdivi- ser les cinq fractions principales d'histones e11 trois cat&gories:

1 °) taux de mutations extremement faible: f.3 et f2al;

2°) taux interm&diaire: f2b et f2a2;

3°) taux a s s e z &leve:

fl

(13, 17)-

Ce classement est int&rcssant, car il se retrouve si on regroupe les fractions d1histones d1apr~s leurs analogies de s&qucnces: l'extr&mit& N de f2al (r&sidus 1 ~ 45) a 16 acidcs amines basiques de plus que d'acidcs amines acides, et 11ex7 tr&mit& C (r&sidus 46 ~ 102) en a 3; 11extr6mit& N de f3 (r&sidus 1 ~ 53) en a

18, et l1extr6mit6 C (r&sjdus 54 a 135) en a ^1~; 11extr8mit& N de f2b (r6sidts l a

50)

en a 16~ et l'extr&mit& C (r&sidus 51

A

125) en a

5;

l'extr&mit& N de f2a?

(r&sidus 1 ~ 36; 37 ~ 117) ~n a 13+2, l'extr6mit& C (118

a

^{129) en a 5; fl a une}

s&quence tout-~-fait diff&rente de celle des autres hi. tones: l'extr&mit& N

(r&sidus la 11-1) en a 7, la partie centrale (1+2 cl 107) en a 6 et l'extr&mit&· C en

A 40 (la s6quence de cette extr&mit& n'est pas encore connue compl~tement).

En outre, les trois cat&gories (f3+f2al), (f2b+f2a2) et fl semhlent @tre associ&e de la m@me mani~re en tois groupes distincts dans la chromatine (voir plus loin:

3.10 Arrangement des histones dans la ~hromatine).

Les histones prot~gent le DNA centre la d&naturat~on thermique (18); chcz J.es Dinoflagellatcs, ou la chromatine semble contenir mains de prot&ines basiques que chez les euc~ryotes, le DNA est moins stabilis& centre la d&naturation thermique (19).

Les histones sont responsables de la structure dR la chromatine (voir 3.1.) et de la r&pression de la transcription (voir 5.1.); chez les Champignons, ou on ne trouve pas d'histones dans les chromosomes interphasiques, la chromatine poss~de une activit~ "template" t r e s elevee (20).

Le lieu de leur synthese semble atre cytoplasmique (21); le pool d'histones libre1 est tres faible' (22) et la synth~se des histones augmente quand le DNA se r&pli-

que (18). Pendant la r&plication du DNA, les histones preexistantes rest~nt aur

les fibres parentales tandis que les histones n&osynthetis&es se collent aux

nouveaux brins de DNA ( 23;, 8:5~Du RN.I\ messae;er e s t continuellement transcri t pour la synth~se de fl pendant les clivages cellulaires au cours du develop~ement

embryonnaire: fl est la seule prot&ine paternelle dans un hybride interspecifique entre Echinodermes (24). Quand le DNA est r6pliqu6, toutes les fractions d1histo- nes sont phosphorylees; f2a2 est phosphorylee immediatement apres sa synthese, puis rapidement d&phosphoryl&e: la phosphorylation semble concerner la fixation de la region N terminale au. DNA; f2al subit des ac&tylations et d&acetylations s&quentielles de la lysine dans la region N terminale, ce qui semble necescaire

~la fixation co~recte de f2al au DNA (25).

1.2.2. ProteineR acides.

Les proteines acides nucleaires ne ferment pas, comme les histones, une categorie de prot&ines bien definie~-La composition de ce groupe varie d1apres la m6thode d1extraction et sa seule caract[rj.stique est la predominance·

.

d1acides amines acides, au plut8t l'abscnce de basicite.

Selon la technique de Dounce et Hilgartner (26), qui eliminent les globulines et les histones par un traitement des noyaux cl l'HCl O,l N, les lipides par des traitements successifs ~ l1ether/&thanol et le chloroforme/&thanol et enfin le DNA par un traitement enzymatique, les prot6ines residuelles acides pr6sentent un ph6nom~ne de gelification dQ ~ l'etablissement de pants disulfures entre les molecules. Ces prot6ines semblent li&es au DNA par des liaisons covalentes (27).

Elles protegent le DNA centre 1¹action d&naturante de l'HCl employ& po11r extraire les histones (28). Ces prot&ines acides comportent au mains deux cha~nes peptidi- ques differentes, dent les acides amines N terminaux sont la lysine et la thr&o- nine .(28).

Derurnez et al (29) ont compare la pr o t e i.n e "r e sd due L'l e '! fermement a t t ac he o au DN.'\

et la pr-o t e i n e "alcalino-soluble" extraite des d~soxyribonucleoprot&ines apr es elimination de la majcure partic des proteines par le NaCl 2 ~!: ils ont montr&

une identit& de ces prot&ines au point de vue de leur composition en acides amines, et observe des similitudes entre ces proteines chez diff&rentes espaces.

Des travaux plus detaill&s sur les prot6ines acides du noyau ont 6t& effectu&s par T.Y. Wang. Apres deux extractions, par du Tris ~lg++ et du NaCl lM, Wang solubilise les desoxyribonucleoprot&in~s par du d6soxycholate 2

%,

puis pr&cipite les prot&ines acides ~pH 6, puis pH 5 et par l1addition de sulfate d'ammonium au surnageant de la fraction pH

5.

Dans une autre technique, il elimine les histones en diluant 11extrait au NaCl 1 M jusqu1~ une molarite de 0,14 M: le complexe DNA/histones precipite et les proteines acides passent en solution (30, 31). 11 obtient ain~i quatre fractions (residual RNP; pH 6; pH j; Ammonium Sulfate pp.) contenant 90

%

de proteines, 10

%

de RNA, et des traces de DNA (32, 33). Leur caracteristique·essentielle, outre leur het&rog&neit& et leur caract~re non- basique, est de contenir du tryptophane, absent dans les histones. Ces prot&ines acides incorporent des acides amin&s, selon un m6canisme peut-@tre distinct du mecanisme ribosomial connu (32, 34, 35): ce m&canisme exige une source d1&nergie, du magn&sium, et est stimul& par le DNA; en presence de ribosomes ou des enzymes solubles du syst~me ribosomial, il n'y a pas d'augmentation de la prot6osynth~se.

11 faut souligner toutefois que Wang est le seul ~ attribuer ccs particularit&s aux prot6ines acides du noyau. Il est certain que sa pr&paration de prot6ines aci des contient aes pr&curseurs ribosomiaux, sous la forme de particules sph&riques

0

de 50 ~ 250 A de diam~tre (32, 34). On Y trouve aussi une DNA polym6rase dent l'a tivit& n&cessite la presence de gro~pes thiols {30, 31) et des phosphoprot§ines

(31, 652). Le renouvellement de ces prot~ines est tr~s rapide (33, 34, 35).

Elles ferment in vitro des complexes avec les histones, surtout avec la fraction fl (36' 37).

Hnilica et Bess (38) ont signal& la presence, dans la fraction f3 des hi$tones, d'un ensemble de proteines acides associ&es ~du mat6riel po~ynucl&otidique, responsable de l'aer&gation de cette fraction. A la suite de la d6couverte du RNA chromosomial par l1equipe de Bonner (voir 1.2.3.), on a cru pouvoir as. imileri ces proteines aux prot&ines li&es par covalence ~ ce type de RNA, mais la plupart des auteurs n'ont pas confirm& ce point de vue.

Leveson et Peacocke (39) ant isol6 des prot6ines non-histones en dissociant des

complexes DNA/prot&ines apr~s &limination des ions m&talliques par le 4~amino-

salicylate, et ont obtenu au moins cinq fractions s6parables ~ partir de l'het~ro, chromatine (L~O).

Zbarsky et Gcorgiev (41) ant fractionn6 des noyaux par traitement au NaCl, et ont isol6 un complexe DNA/prot&ines acides par pr6cipitation ~ 11acide sulfurique

dilue.

Marushige et al (42) ant isol6 des prot'ines acides ~ partir de la chromatine du foie de rat, par precipitation~ 11HC1 0,2 N, puis solubilisation dans du SDS 1 %:

le materiel obtenu est tr~s het6rog~ne et contient du tryptophane; il r&a~it avac

les 'histones ct avcc le DNA.

Benjamin et Gelhorn (43) ant traite des noyaux ~ l1HC1 O,l M, puis au CsCl 4 M/

lysine 0,02 M (pH ll16)/EDTA/mercapto6thanol$ obtenant ainsi des fractions

heterog~nes de prot6ines phosphorylees. Cet ensemhle complexe est similaire dans les foies de rat et de souris.

Allfrey et al (1~4, 45, 46) ant etudie plus particuli~rement un groupe de proteine•

acides nucl&aires phosphorylees, isolees par lavaBe de la chromatine dans du NaCl 0,5 M, puis extraction des histones par de 11HC1 0125 N, elimination des lipides par le chloroforme et le methanol, et cnfin extraction au ph'nol suivie du pas- sage en solution aqueuse par dialyse centre des solutions~ concent~ations decroit santes en acide ac&ti~ue, et croissantes en ur6e, puis en SDS. Ces prot&ines

sont het&rog~nes et tiss11lo-sp&cifiques. Elles se combinent sgecifiquemcnt ~ leur DNA en stimulant sa transcription; de plus, la stimulation sp&cifique de la

synth~se d1une prot6ine de ce groupe a et& mise en 6vidence dans le foie apr~s injection de cortisol.

Des methodes d1extraction plus deuces· ant &t6 utilisees pout tenter de ne pas denaturer des proteines qui pourraient avoir un r8le biologique important.

Paul et Gilmour (47), Umanskii et al (48), Chaudhuri (49), Elgin (50), Arnold et Young (51), Levy et al (52)¹ Tuan et al (53), Graziano et Huang (54), Mac Gilli- vray et Rickwood (55), Spelsberg et aJ. (56) ont dissoci6 les 616ments de la chro- matine ~ haute force ionique en presence d'ur&e ou de chlorure de guanidine; le DNA est ensuite &limine par·ultracentrifugation ou filtration sur agarose, et les histones separ&es par chromatographie sur une colonne ~changeuse d'ions (DEAE

cellulose, QAE Sephadex, SE Sephadex, carboxymethylsephadex, SP Sephadex, hydroxy]

apatite). Au moyen de ces colonnes, ii est &galement possible de fractionner

les proteines acides, qui restent n&anmoins toujours het&rog~nes.

Wilson et Spelsberg (57) ont lib&r& plus de 95

%

des proteines acides de la

chromatine par un traitement de la chromatine dehiston6e ave6 de

.

la DNase I.

De nouveau, les profils d'electrophor~se montrent une sp&cificite d'organe ' entre

les differentes fractions de prot&ines acides.

Une methode int&ressante d'isolement et de fractionnement des prot&ines ncn- histones a &te imagin~e par Kleinsmith et al (58): sur une colonne de DNA cellulo·

se, une fraction faible de prot&ines acides reste fixee de mani~re sp&cifique et

I

ne s'en d6croche que dans du NaCl 0,6 H. Cetta fixation ressemble d celle obscrv&e par Teng, 'I'e n g et Allfrey (~·5¹ 1~·6); mais Ro1·1Ckamp et Seker:i.s (59) ae s im i Lcn't c e s

prot6ines ~des prot6ines de la membrane nucl&aire, car aucune fixation n'est observ&e si les noyaux ont 6t& isol6s en pr6sence de deterGents qui 6liminent cette membrane. Harlow et al (60) ant &galement observe que la membrane nucl&aire est une source importante de prot&ines acides associ6es ~la chromatine.

Goodwin et Johns (61) signalent ~ ce propos que, en pr&sence de NaCl 0,35 M, la

~uasi totalit& des proteines non-histones se d6tachent de la chromatine du thymus de ~eau (alors qu'il faut du NaCl 0,5-0,6 M pour commencer n en detacher les histones), ce qui sugg~rc que beaucoup de proteines acides ne sent pas associ&es fermement ~la chromatine.

Pederson (62, 63) n etudi& les prot&ines qui accompagnent le RNA h&teroG~ne

nucl6aire; ces prot&ines ont un pH iso&lectrique entre l~,9 et 8,3 et sont organo- sp&cifiques. A la suite d'une stimulation par le cort~sol, une augmentation du marquage est observee dans ces ribonucleoproteines, mais pas dans les proteines n6n-histones de la chromatine. D1apr~s Pederson, on pabrrait supposer que

beaucoup de variations m&taboliques observ&es dans les proteines acides de la chromatine ne seraient pas des prealables, mais des consequences d1une der&pres- sion de la transcriptionc Les prot&ines acides de la chromatine pourraient en fait @tre constituees en partie de prot6ines accom~agnant les RNAs lors de leurs transformations.nucl&aires, puis cytoplasmiques (64, 65), ce qui expliquerait le parallelisme entre la quantit& de prot&ines acides et l'activit& transcription·

nelle d1un tissu (56, 261).

Enfin Sonnenbickler et Nobis (66) ont·sj.gnal& que, par traitement de la chromatin

~ 11HC1 0,2 N, certaines histones. se fixent au DNA et se comportent d~A lors comme des prot6ines non-histones. Ilse p6urrait done que, par les m&thodes d1extraction et de purification de la chromatine au des prot6ines acides, on surestime la quantit& r&elle de prot&ines non-histones; cette quantite peut en fait Btre tr~s faible, comme dans la chromatine du thymus de veau par exemple (5 ~ 10

%

des histones) (61).

Goodwin et Johns (67, 68) ant isol& un groupe de prot&ines non-histones tout-~- fait particuli~res, qui migrent tr~s rapidement lors d1&lectrophor~ses en gel de polyacrylamide et contiennent Uh taux eleve d1acides amin~S acides et basiques.

Ces prot&ines sent extraites de la chromatine du thymus de veau par du NaCl 0,35M puis pr&cipitees entre 2 et 10

%

d'acide trichloronc&tique, et enfin fractionn&es sur carboxymethylcellulose et par &lectrophpr~se. Il s1agit de deux prot&ines qui sent capables de Se fixer

a

^{fl OU}

a

la polylysine. L1existence de ces prot&i- nes, consid&rees au d&but comme des contaminants des histones, a &t6 confirm&e par Smith et Stacken (69).

Des observations fnites in vivo indiquent que les proteines acides du noyau sent metaboliquement actives (70, 71, 72, 42). Elles contiennent souvent du RNA et semblent gtre dispersees irr&~uli~rement le lon3 du g~nome (73).

Sevaljevic (74) a r'cemment observ& que deux prot6ines acictes majeures de la

chromatine, dans les embryons d1oursins, se retrouvent dRns le cytoplasme, cc q1i indique que la synth~se ou le stocka~e des prot6ines acides nucl6aires s'effectu- erait, au mains en partie, dans le cytoplasme. Cotte observation est com~atibJ.c avec la suggestion de Pederson (62, 63), selon laquellc une partie des prot6ines acides de la chromatine serait synth&tis&e lors de la formation du RNA h&t6roc~nc nucl&aire, et accompagnerait ce dernier lors de ses transformations post-trans- cri~tionnelles, jusqu1au cytoplasme.

Lars du cycle mitotique, une partie des prot&ines acidos est conservce, tout comme les histones, pendant la mitose; le re~tant est m6tabolis6 au cours du cycl1 cellulaire (657).

Le r8le des prot6ines acides de la chromatine sera disc~t6 plus loin (5.2.).

1. 2 •

:5.

^RN A.

Le RNA chromosomial (cRNA) a &t& d&couvert par Huang et Bonner en 1965 (75), par centrifugation des nucl&ohistones de pois~ 39.000 rpm pendant 48 h dans du CsCl 2,09 M; il a &t& isol6 en association avec du mat6riel proteiquc dans la pellicule flottant

a

la surface du CsCl. Il pr6sente les caract&ristiques suivan- tes: grande richesse en une base rare, l1acide dihydrouridylique; cha!ne d¹une quarantaine de nucl&otides; interaction avec une prot&ine (primitivement cons~.- deree comme une.histone) par une liaison non ionique; induction de la formation de complexes dans ces prot&ines; presence de la forme ouverte de l'acide dihydro- uridylique1 responsable de l'interaction avec ln proteine; analogie avec les tHNAs.

Benjamin et al (76) ont isole un RNA du m@me type

a

^{partir du foie de rat. Lars d}

son association avec la prot&ine~ ce RNA est insensible

a

la RNase; de plus, il est het&rog~ne et presente, comme le cRNA de pois, une grande richesse en adenine et en uridine. Il n'est cependant pas exclu que le RNA de Benjamin soit une

forme intermediaire de RNA messager, associ&e

a

^{une proteine basique nucleairc}

avant son attachemcnt aux ribosomes. Il ne presente en effet pas la grande riches seen acide dihydrouridylique caract6ristique du cRNA; il parait het6rog~ne et semble li&

a

une proteine basique.

Une etude plus approfondie du cRNA et de sa liaison

a

une~proteine a et& fournic par Hu·ng

(77, 78),

dans le cas de la chromatine de l1embryon de poulet.

Par digestion du complexe

a

la pronase, puis hydrolyse alcaltne du RNA, Huane a obtenu, outre des nucleotides, un lien pept Ld i qua a t t ac ho 8- un e base dihy,d.ro- pyrimidique. Ce lien, homog~ne au point de vue chromatographique et electrophor6- tique, a &te hydrolyse par l'HCl 6 N, fournissant un residu serine et de la

a

^{alanine, produit de} d&composition de la base rare. Il s'agit d1une liaison

amide. Le cRNt pr&sente une hyperchromicite faible par rapport au tRNA (12

%

^{d n}

un tampon phosphate 10 mM) et rapidement reversible; on n'observe pas de chan ·e- ment d1hyperchromicit& si_on hydrolyse le peptide ouquel le RNA est attach~.

Le rapport A+G/U+C+UdiH avoisine l'unit& (78).

Dahmus et Mac Connell ont, en 1969, isole le cRNA de ccllulcs d1ascites de rt

(79): ce RNA s'hybride avec 3,8

%

^du e&nome~ ce qui correspond hien aux 5

%

obtcnus pour le cRNJ\ de nois (80) et nux

4 %

pour le cRNA de poulet. I.e cRNJ\

diff~re du tRNA et du rRNJ\ par son haut pourcentage d1hybridation, et du mRNA par son manque de marquage rapide; de plus, des comp&titions d1hybridation ant

&t& effectu&es entre ces diff&rents RNAs, et lcs r&sultats ont &t& n6eatifs.

Il ne s t a g i t pa s non plus d l un pr o du i t de degrndat:i.on de, tRNAs9 car son t aux de m&thylation est ba s , au contrnire d'e s tRNJ\s.

Shih et Bonner (81) ont obtenu du cRNA ~ part~r de chromatine du thymtis de vea1.

Ce RNA s'hybride avec 1

%

du DNA.

Jacobson et Bonner (82) ont compare la·teneur en bases rares des diff&rents cRNAs 1

obtenus: taus ces RNAs poss~dent un nucleoside rare sous forme ouverte ~ 11&tat natif, c1est-~-dire quand ils sent unis ~ une prot&ine. Cette pyrimidine est de la dihydrouracile pour le pois, le poulet ct le thymus de veau, et de la dihydro- thymine pour la tumeur ascite de rat.

Bekhor et al (83) ont montr& que le cRNA s1hybride ~ l~ forme native du DNA.

Cette propri&te est peut-@tre due a la presence de dihydropyrimidine dans le RNA.

Le cRNA semble indispensable~ la r&association convenable des elements dissoci&G de la chromatin~: en l'absence d'uree ou en pr&sence de nitrate de zinc ou de RNase, la r&association n'est plus specifique (84, 85). Or l'uree favorise 11hybridation du RNA au DNA et le nitrate de zinc, comme la RNase, d&truit s&lectivement le RNA.

Sivolap et Bonner (86), puis Holmes et al (87) ant montr& que 11hybridation du

cRNA s1effectue avec les s&quences r&petitives du DNA.Ila et& sug~6re (87) q~e

le cRNJ\ deriverait de la portion de HnRNA restant dans le noyau. Enfin, Mayfield et Bonner (88) ant raffin& la m&thode d'extraction du cRNA et observe des courbes de competition diff&rentes entre les cRN~s de diff&rents tissus. D1apr~s ces

r&sultats, le cRNA semblernit jouer un r8le d'activateur plut8t que de r6pres cur lors de la transcription. Les auteurs notent qu'en suivant leur nouvelle m&thode d'extraction (s2ns passer par la centrifugation ~ur CsC1)7 on ne trouve que peu de prot&ines associ6es au cRNA.

Dans un travail de Dahmus (78), une comparaison int&ressante a et& faite entre le cRNA et un RNA cytoplasmique 3

s,

extrait du cytoplasme salon les ~8mes m6tho- des que pour le cRNA. Ce RNA entre en competition avec le cRNA pour 50

%

cle ses sequences; il sature 1,8

%

du DN1. et toutes ses seqiences sont contenues d ns le

cRNA. Il represcnte 5

%

^{du RNA} cellulaire total et est associ&, dans le cytoplaam

~ une prot&ine. 11 semblerait done qu'une portion du cRNA soit confinee dans 1.

chromatine, tandis que le restant serait identique ~ un RNA retrouv& ~la fois dans le cytoplasme et le sue nucl~aire. Ces r6sultats sent~ rapprocher de ceux Shaw et Huang (89), qui croient avoir isol& le cRNA lie~ un peptide, dans le cytoplasme du ccrveau d'embryon de poulet de quinze jours. Ce peptide est forte-