Le traçage isotopique pour étudier la production par les microorganismes du sol d’oxyde nitreux, gaz à effet de serre

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Olivier Mathieu, Jean Lévêque, Marie- Jeanne Milloux, Florian Bizouard, Francis Andreux, et al.. Le traçage isotopique pour étudier la production par les microorganismes du sol d’oxyde nitreux, gaz à effet de serre. uB Sciences, Université de Bourgogne, 2008, pp.145-151. �hal-02661459�

S ^{CIENCES DE}

L ’A ^{LIMENT ET}

A ^GRO

ENVIRONNEMENT

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SCIENCES DE L’A^{LIMENT ET} A^GRO-ENVIRONNEMENT

uBB SCIENCESN°3

■Nathalie CAYOT¹

■Elisabeth GUICHARD¹

■Andrée VOILLEY²

1UMR 1129 FLAVIC (Flaveur,Vision et Comportement du consommateur) ENESAD-INRA-UB, 17 rue Sully, 21000 Dijon

2EA EMMA, ENSBANA, Université de Bourgogne, 1 esplanade Erasme, 21000 Dijon

Une approche intégrée à différentes échelles pour expliquer les qualités sensorielles des crèmes dessert

Préambule : Implication des équipes dijonnaises dans l’action COST 921 Le bilan scientifique ici présenté concerne un projet visant à comprendre comment la structure d’un aliment peut moduler la perception de sa flaveur.

Rappelons que, pour que l’arôme d’un aliment soit perçu, les molécules vola- tiles le constituant doivent être libérées de la matrice alimentaire et rejoindre les récepteurs olfactifs situés dans les fosses nasales. La manière dont les molécules sont libérées et la perception de l’arôme conditionnent fortement la qualité globale de l’aliment perçue par le consommateur.

Pour mener à bien ce projet, différents chercheurs dijonnais ont été impliqués, entre 2002 et 2007, dans l’action COST 921 (voir l’encadré concernant les actions COST). Celle-ci avait précisément pour objet l’étude de l’organisation structurale des matrices alimentaires et son influence sur la libération et la perception de la flaveur : « FOOD MATRICES : STRUCTURAL ORGANI- SATION FROM NANO TO MACRO SCALE AND ITS IMPACT ON FLAVOUR RELEASE AND PERCEPTION »

Dix-neuf pays étaient signataires de cette action : Allemagne, Autriche, Belgique, Bulgarie, Danemark, Espagne, Finlande, France, Irlande, Italie, Lituanie, Norvège, Pays-Bas, Pologne,

République tchèque, Royaume Uni, Slovénie, Suède, et Suisse. L’animation scientifique a été assurée par Nathalie Cayot (UMR 1129 FLAVIC ENESAD- INRA-UB).

Pour échanger nos réflexions, nous avons au total organisé sept colloques dans les pays européens partenaires (dont un à Dijon en avril 2005) ainsi que diverses autres réunions de travail.

L’action COST 921 a également financé le séjour de jeunes chercheurs dans des laboratoires partenaires : Antonio Chana, post doctorant espagnol de l’UMR FLAVIC, a bénéficié d’un séjour d’un mois à l’Université de Wuppertal pour une étude de modélisation moléculaire ; Géraldine Savary, docto- rante de l’UMR FLAVIC, a séjourné 15 jours à l’ETH de Zürich pour des études en microscopie confocale. Enfin, nous avons accueilli pendant 15 jours Maria Martuscelli, enseignant-chercheur de l’université italienne de Teramo, pour des mesures de coefficients de partage d’arôme.

Les travaux présentés dans le texte qui suit ont été réalisés par des chercheurs du campus dijonnais ou par des cher- cheurs européens accueillis dans nos laboratoires.

Qu’est-ce qu’une action COST ?

Fondée en 1971, COST est une structure intergouvernementale destinée à favoriser la coopération scientifique et technique au niveau européen. Les actions COST couvrent aussi bien des programmes de recherche fondamentale ou appliquée que des activités d’utilité publique. Les sujets déposés le sont à l’initiative des scientifiques et experts techniques eux- mêmes.

Les financements accordés par la communauté européenne permettent de couvrir des frais de déplacement et d’hébergement ainsi que des frais de publication, favorisant ainsi les échanges scientifiques avec des collègues européens et la réalisation d’études inter-laboratoires autour d’une thématique définie.

www.cost.esf.org

Quelle stratégie de recherche ?

Pour répondre à la question posée, notre stratégie a été d’explorer un modèle d’étude commun aux différents laboratoires européens partenaires de ce projet. L’étude a été menée à différentes échelles, allant du niveau moléculaire (interactions entre les composés d’arôme et les ingrédients de l’aliment

modèle) au niveau macroscopique (perception sensorielle par l’être humain), en passant par le niveau microscopique (relation entre la structure de l’aliment modèle et la dynamique moléculaire des composés d’arôme).

Nos actions et expérimentations ont donc concerné ces trois niveaux : 1. à l’échelle moléculaire :

a. regroupement des données disponibles sur les composés volatils choisis pour aromatiser notre modèle

b. modélisation moléculaire des inter- actions entre composés d’arôme et ingrédients non volatils constitutifs du modèle d’étude

2. au niveau microscopique : a. description de la méso-structure et caractérisation rhéologique¹du modèle d’étude

b. mesure de la diffusion des molécules d’arôme au sein du modèle d’étude 3. au niveau macroscopique : a. suivi de la libération d’arôme in vitro

b. perception des qualités organoleptiques in vivo

Parmi les groupes de travail créés pour répondre à ces questions de recherche, deux ont été co-animés par des chercheurs dijonnais : Elisabeth Guichard, pour le groupe « Molecular level » (particuliè- rement point 1b) et Andrée Voilley pour le groupe « Flavour release » (particulièrement point 3a).

Pourquoi avoir choisi les crèmes dessert comme modèle d’étude ? Quelle composition et quelle texture ?

Le modèle d’étude commun devait avant tout permettre aux différentes équipes participantes de développer leur thématique de recherche et également correspondre à une réalité économique.

Les crèmes dessert comptent parmi les produits laitiers les plus consommés à travers l’Europe : natilla en Espagne, custardau Royaume Uni, vlaaux Pays- Bas. Elles sont issues des traditions culinaires familiales. Leur préparation industrielle est relativement récente mais cette famille des desserts lactés a connu un développement spectaculaire depuis le milieu des années 1980.

Les matières premières à la base de sa fabrication sont :

- le lait, composant majeur, qui peut être ajusté en matière grasse et additionné de poudre de lait et/ou de protéines de lait sous différentes formes (de façon à modifier la teneur en protéines) - les matières sucrantes, ajoutées sous forme de fructose, de sirop de glucose, de miel, de saccharose, etc.…

- les gélifiants ou épaississants (extraits d’algues, amidons...) qui permettent de varier les textures

- enfin, pour le goût, on peut ajouter du cacao, du chocolat, du caramel... par exemple.

Nous avons donc choisi pour le COST 921 de travailler sur un modèle de crème dessert, produit pouvant être apprécié de façon internationale. Après quelques essais et dégustations, nous avons adopté une recette à base de lait entier, de sucre, d’amidon et de carra- ghénanes (gélifiants extraits d’une algue). Nous avons ensuite établi un protocole commun de préparation au moyen d’un matériel simple - donc facilement disponible dans l’ensemble des laboratoires (Photo 1) - et une aromatisation par un arôme fraise (ou, suivant les laboratoires, uniquement par certains composés volatils constitutifs de l’arôme fraise). Divers partenaires industriels, producteurs d’arôme ou d’autres ingrédients alimentaires, ainsi que des grands noms de l’industrie alimentaire ont été associés à notre réflexion et ont fourni les lots d’ingrédients.

Chaque laboratoire a ensuite travaillé à partir de ce produit sur la recette de référence ou sur des systèmes simplifiés, pour les aspects moléculaires notamment.

Les crèmes desserts ainsi préparées étaient des produits qualifiés de semi-liquides à semi-solides, tels que des flans ou des crèmes pâtissières ou encore des crèmes dessert de type uBB SCIENCESN°3

Photo 1 :Dispositif expérimental utilisé pour la préparation des crèmes dessert modèles. Un bain-marie permet de chauffer les ingrédients dispersés dans le lait. Le mobile d’agitation est norma- lisé et la vitesse d’agitation contrôlée de façon à obtenir un cisaillement repro- ductible du produit.

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Danette®. Des méthodes rhéologiques simples ont été établies pour permettre de caractériser de manière standardisée les produits obtenus dans les différents laboratoires : un test en pénétrométrie permettant de mesurer la fermeté du produit gélifié et un test en viscoélasti- cimétrie qui permet de caractériser plus finement la structure des produits en découplant la composante visqueuse d’un produit (caractère liquide) et la composante élastique du même produit (caractère solide). La texture finale des produits pouvait être modulée par un cisaillement appliqué ou non lors du refroidissement du produit.

[CAYOT, 2006.]

Perception des qualités organoleptiques de la crème dessert in vivo par un jury d’évaluateurs entraînés

Des crèmes dessert ont été réalisées en faisant varier la texture par un traitement mécanique mais sans changer la com- position chimique (habituellement le formulateur industriel choisit de varier la texture en changeant la composition du produit mais avec un procédé de fabrication constant). Ceci nous a permis de connaître l’effet d’une modification de texture sur la perception et la libération des arômes. Trois textures ont été obtenues et ont été perçues par le jury d’analyse sensorielle comme étant significativement différentes. Le traitement mécanique effectué sur les crèmes les plus consistantes a ainsi permis d’obtenir des textures moins consistantes. Ces trois crèmes dessert ont été aromatisées avec du benzaldéhyde (note aromatique « amande ») et du caproate d’allyle (note aromatique

« ananas »). Une diminution significative de la perception de l’arôme de ces deux molécules a été observée lorsque la consistance de la crème augmente [TOURNIER et al., 2006a].

Afin de savoir si ces différences de perception peuvent s’expliquer par des

différences de libération des arômes, nous avons réalisé des mesures de ciné- tique de libération du benzaldéhyde et du caproate d’allyle in vivo au cours de la dégustation des crèmes desserts par la technique du NoseSpace-APCI-MS (Photo 2). Cette technique permet de suivre la libération des molécules odorantes dans les fosses nasales en fonction du temps lors de la consommation du produit alimentaire. Les courbes obtenues pour les deux arômes dans les trois crèmes de textures différentes sont présentées

sur la Figure 1. Le caproate d’allyle est libéré de façon plus intense que le ben- zaldéhyde mais les persistances sont identiques. Lorsque la crème est plus liquide (C20), le maximum d’intensité est atteint plus rapidement. Ces données peuvent en partie expliquer que l’intensité d’arôme est perçue plus faiblement dans les crèmes les plus consistantes (C0 et C10) lors de l’analyse sensorielle des produits par les évaluateurs [TOURNIER et al., 2006b].

Figure 1 :Cinétique de libération suivie in vivo par la technique APCI-MS pour le benzaldéhyde (BENZ) et le caproate d’allyle (CAPRO) lors de la dégustation de crèmes desserts de structure variable. C0 est une crème épaisse, C10 une crème semi-épaisse et C20 une crème liquide

Photo. 2 :Mesure de la libération des arômes in vivo par nose-space APCI-MS (spectrométrie de masse à source à pression atmosphérique). Le cobaye humain – volontaire - mange le produit de façon aussi « normale » que possible. Les molécules volatiles qui atteignent les fosses nasales sont aspirées par un tube puis analysées (en qualité et en quantité).

Photo 3 : Flacon permettant la mesure du coefficient de partage des composés volatils en phase d’équilibrage dans un bain-marie. La petite vanne située sur le bouchon permet le prélèvement et l’analyse de l’air situé au-dessus du produit.

Rétention et libération d’arôme : mesures in vitro

Pour mieux comprendre les relations entre perception des arômes et texture des produits, et afin de nous affranchir des variations de physiologie et de perception entre les différents évaluateurs, nous avons procédé à des mesures in vitro.

En ce qui concerne les mesures in vitro, la rétention de l’arôme fraise dans les différentes crèmes dessert (lait entier ou lait écrémé, texture plus ou moins liquide …) a d’abord été étudiée en mode statique. Comme illustré sur la Photo 3, les échantillons sont placés dans des flacons étanches et dans un environnement contrôlé en température.

Les composés volatils, en fonction de leur volatilité et des interactions engagées avec les autres constituants de la matrice, se partagent entre la matrice et la phase gazeuse. Lorsque l’équilibre est atteint, les concentrations des différents composés d’arôme sont mesurées dans la phase gazeuse. Ces données permettent de calculer un coefficient de partage entre le produit et l’air au-dessus du produit, ce qui nous renseigne sur les interactions entre chacun des composés volatils et la matrice. Par comparaison des résultats obtenus pour des matrices de compositions différentes, on peut en déduire l’influence des différents constituants de la matrice. La Figure 2 montre l’influence de la matière grasse du lait sur certains de ces coefficients de partage [MARTUSCELLI, et al., 2008]. De façon générale, la présence de matière grasse augmente la rétention des arômes dans les aliments.

Bien sûr la température ambiante influence le partage des composés d’arôme entre le produit et la phase gazeuse: une augmentation de la température provoque une augmentation de la quantité de composés volatils dans la phase gazeuse mais dans des proportions différentes d’un composé à l’autre (Figure 3, [SEUVRE et al., 2008]).

La libération des composés a ensuite été suivie en mode dynamique. On s’est placé volontairement hors de l’équilibre thermodynamique en favorisant le relargage des composés volatils en agitant le système et/ou en purgeant la phase gazeuse. On cherche ainsi à mimer certains phénomènes qui se produisent lors de la consommation d’un produit alimentaire : ouverture de l’emballage, mélange du contenu, mise en bouche, mastication….

La Figure 4 montre une courbe obtenue lors du suivi de la libération d’un composé volatil (l’acétate d’isoamyle) à partir d’un modèle simplifié (une suspension d’amidon et non une crème dessert contenant la totalité des ingrédients).

La modélisation de telles courbes a permis d’extraire des paramètres tels que des vitesses de libération ou des coefficients de transfert apparents. Dans le cas des suspensions d’amidon, nous avons montré que la libération des composés d’arôme formant des interactions avec l’amylose (macromolécules constitutives de l’amidon) était gouvernée principa- lement par ces interactions. A l’inverse, les composés volatils ne formant pas d’interactions avec l’amidon sont soumis à l’influence de la structure de la matrice. Plus il y a d’amidon solubilisé, moins les arômes sont libérés. En outre, plus la température est basse, plus ces effets sont marqués[LAFARGE et al., 2008].

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Figure 2 : Pourcentages de rétention de quelques composés de l’arôme fraise dans des crèmes dessert contenant du lait entier (FFM) ou du lait écrémé (SM) (MARTUSCELLI et al., 2008).

Figure 3 :Influence de la température (T) sur le coefficient de partage (K) de différents composés de l’arôme fraise dans l’eau et dans la crème dessert modèle. (SEUVRE, et al. 2008).

EB : butanoate d’éthyle, EH : hexanoate d’éthyle, C3H : cis-3-hexenol

Figure 4 :Suivi de la libération de l’acétate d’isoamyle dans la phase gazeuse à partir d’une suspension d’amidon de maïs durant une agitation permanente ( LAFARGE et al., 2008). Les points sont des valeurs expérimentales. La ligne continue représente le modèle mathématique utilisé pour calculer les différents paramètres de cette courbe de libération.

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Description de la méso-structure et de la rhéologie du modèle d’étude

Pour mieux comprendre l’influence de la structure de matrice sur la libération d’arôme, différents modèles ont été observés à l’échelle microscopique. Une coloration différenciée des différents

constituants permet de visualiser l’organisation de la matrice. Sur la Figure 6, constituée de photographies d’observations réalisées en microscopie confocale sur un modèle à base d’amidon, de carraghénane et de saccharose, les grains d’amidon apparaissent en rouge et des agglomérats gélifiés de carraghé- nane apparaissent en vert.

Savary et al. (2008) ont démontré que cette structure était obtenue suite à l’agitation du produit lors de son refroidissement. En effet, sur la Figure 7, on peut suivre le gonflement des grains

d’amidon lors d’un chauffage sans agitation. On observe que, contrairement à ce qui est observé sur la Figure 6 où il y a eu agitation après la phase de chauffage, le carraghénane est ici réparti de façon homogène en fin de chauffage. L’agitation du produit modifie donc sa structure et par conséquent peut modifier la capacité du produit à retenir les arômes.

La matrice obtenue est un système mixte constitué de grains d’amidon gonflés englués dans un gel de carra- ghénane plus ou moins fractionné par

Figure 7 :Sections optiques de microscopie confocale d’un modèle à base d’amidon, de carraghénane et de saccharose. Observations à 25, 60 et 85°C au cours d’un chauffage réalisé sans agitation (SAVARY et al., 2008). La comparaison avec la Figure 6 montre que l’absence d’agitation conduit à une structure homogène alors que le cisaillement après refroidissement (Fig. 6) semble induire une ségrégation entre l’amidon et le carraghénane.

Figure 5 :Profil de variation des paramètres rhéologiques G’

(composante solide) et tg δ(composante liquide) pour une matrice gélifiée à base de saccharose, d’amidon et de carraghénane (A) et profil de libération de l’hexanoate d’éthyle à partir de cette même matrice lors de l’agitation (B) (SAVARY et al., 2007). Pour les deux profils, l’origine des temps est le début de l’agitation.

Figure 6 :Sections optiques de microscopie confocale d’un modèle gélifié à base d’amidon, de carraghénane et de saccharose (SAVARY et al., 2008).

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l’agitation réalisée lors du refroidisse- ment du produit. On voit également qu’une partie du carraghénane peut entrer à l’intérieur des grains d’amidon.

Si on augmente la concentration en carraghénane, la phase gélifiée augmente et il en résulte une texture plus rigide du système obtenu (Figure 8) : les valeurs de la composante élastique (G’, paramètre indicateur du caractère solide du produit) augmentent avec la concentration en carraghénane.

Diffusion des molécules d’arôme au sein du modèle d’étude

Une fois cette organisation microscopique connue, nous avons mesuré la diffusion des molécules volatiles au sein de cet amas de grains d’amidon et de carraghénane.

Cette mesure a été effectuée par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

bidimensionnelle. L’échantillon de gel est soumis à un champ magnétique et on suit le déplacement de la signature chimique des composés cibles au cours du temps. La Figure 9 montre le coefficient de diffusion mesuré pour un des consti- tuants de l’arôme fraise – le butyrate d’éthyle – dans des solutions de saccharose de différentes concentrations et dans le modèle amidon + carraghénane + saccharose.

Il apparaît clairement que la concentration en saccharose a une influence prépon- dérante sur la diffusion du composé volatil, ce qui est connu depuis longtemps.

Au-delà d’une certaine concentration en saccharose, la viscosité augmente brutalement et en conséquence la diffusion chute. Néanmoins on constate un effet supplémentaire de la structure gélifiée sur la diffusion.

Modélisation moléculaire des interactions entre composés d’arômes et ingrédients non volatils constitutifs du modèle d’étude

Si de nombreuses études ont montré que les arômes peuvent être retenus par les macromolécules de l’aliment par des interactions plus ou moins fortes, peu d’études ont conduit à la détermination précise des sites de fixation. C’est pourquoi dans le cadre de cette action, des méthodes spectroscopiques associées à des outils de modélisation moléculaire ont été mises en place sur un modèle qui avait déjà été bien étudié au préalable au sein de l’UMR-FLAVIC [GUICHARD et LANGOURIEUX, 2000], à savoir une protéine laitière bien caractérisée, la β-lactoglobuline.

Rappelons que le modèle d’étude choisi (crème dessert), outre le sucre, l’amidon et les carraghénanes, contient en grande quantité des protéines provenant du lait.

Les interactions entre la b-lactoglobuline et 2 composés d’arôme, la β-ionone et la γ-décalactone ont été étudiées par spectroscopie de résonance magnétique uBB SCIENCESN°3 Figure 9 :Coefficients de diffusion moyens (m²·s^-1) du butyrate d’éthyle mesurés à 30°C dans des solutions de

saccharose de différentes concentrations et dans le modèle amidon + carraghénane + saccharose (SAVARY et al., 2005).

Les différences significatives au seuil de 5% sont indiquées par des lettres différentes sur les histogrammes.

Figure 8 :Caractérisation rhéologique par viscoélasticimétrie de matrices modèles à base de saccharose, d’amidon et de carraghénanes, de différentes teneurs en carraghénanes (teneurs croissantes de C1 à C3) (SAVARY et al., 2008).

Coefficient de diffusion (m2 .s-1 )

nucléaire² (RMN) bidimensionnelle [LÜBKE et al., 2002]). Les spectres de RMN ont été réalisés en solution aqueuse à pH 2.0 pour que la protéine soit dans un état de monomère, sur la protéine seule et sur les complexes protéine-arôme. La visualisation de la région des groupements NH-CHa montre les signaux dus aux couplages entre les protons liés aux atomes N- et C- des liaisons peptidiques (Figure 10). Les différences de déplacements observées sur les spectres peuvent être attribuées à des changements de conformation de la protéine dus à la présence des composés

d’arôme. Les résultats de modélisation moléculaire montrent que la plupart des acides aminés de la protéine affectés par l’interaction avec la γ-décalactone sont localisés dans la cavité centrale alors que l’interaction avec la β-ionone affecte les acides aminés situés dans un site sur la surface extérieure de la protéine (Figure 11). En associant des résultats de RMN et des données de modélisation moléculaire, nous avons ainsi démontré l’existence de deux sites de fixation différents des arômes sur la β-lactoglobuline [Tromelin et Guichard, 2006].

Ainsi, les protéines présentes dans le produit interviennent probablement aussi dans les mécanismes de rétention des molécules d’arôme, tout comme les polyosides ou encore la matière grasse.

Conclusion

L’arôme fraise, retenu pour cette étude, était constitué de quinze composés volatils à différentes concentrations dans la triacétine (solvant) ; ces composés représentent les différentes classes chimiques de l’ensemble des 360 composés que l’on peut identifier dans un extrait de fraise. Chaque composé d’arôme peut avoir un comportement spécifique du fait de ses propriétés physico-chimiques et des interactions qu’il peut développer avec certains des ingrédients de la crème dessert (amidon, protéines ou lipides du lait …). Il est par conséquent très difficile de délivrer une conclusion univoque pour cette étude.

Les conclusions de chaque partie de l’étude ont été regroupées dans la représentation très schématique proposée Figure 12. De façon globale, plus la crème dessert est épaisse et solide, plus la perception de l’arôme peut être affaiblie. Les fluctuations mesurées pour les différents composés volatils et les différentes textures montrent le rôle important du formula- teur lorsqu’un changement d’arôme, de recette ou encore une modification de procédé interviennent au cours de la fabrication des produits alimentaires. _■

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Figure 11 :Représentation par modélisation moléculaire des acides aminés de la β-lactoglobuline impliqués dans l’interaction avec la γ-décalactone (gauche) et la β-ionone (droite).

Figure 10 :Partie d’un spectre de RMN bidimensionnelle du proton montrant les pics de corrélation dans la région NH- CHR, avec les numéros des acides aminés impliqués dans l’interaction de la β-lactoglobuline avec la β-ionone.

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Bibliographie

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Définitions

1 La rhéologie est l'étude de la déformation et de l'écoulement de la matière sous l'effet d'une contrainte appliquée. Dans la pratique, elle permet de déterminer les propriétés mécaniques macroscopiques à partir d'une étude basée sur la structure micro ou nanoscopique du matériau, par exemple la taille moléculaire et l'architecture d'un polymère en solution ou encore la distribution de taille de particules dans une suspension solide.

2 Le principe de la RMN est basé sur les propriétés que certains noyaux d'atome acquièrent lorsqu'ils sont placés dans un champ magnétique intense. Ils peuvent alors interagir avec des ondes radio pour émettre des signaux. Ces signaux permettent d'identifier la structure des différents composés présents.

Figure 12 :Représentation schématique des conclusions de l’étude COST921

La rhizosphère : une zone d’interactions intenses entre le vivant et le minéral

Selon la définition récente donnée par Hartmann et al. (2008), la rhizosphère inclut à la fois les racines et la zone de sol entourant les racines et influencée par celles-ci. Cette définition est un élargissement de celle proposée par Lorenz Hiltner en 1904. La rhizosphère est le siège d’interactions complexes et variées entre les racines, les microorga- nismes telluriques et les composantes physico-chimiques du sol.

Les plantes sont des organismes autotrophes¹ producteurs primaires dans la chaine trophique grâce à la photosynthèse.

Durant ce processus, l’énergie solaire et le dioxyde de carbone atmosphérique captés par les feuilles sont convertis au niveau des chloroplastes en molécules organiques. Une partie de ces composés organiques est incorporée dans le sol au cours du cycle de développement des plantes sous forme de rhizodépôts dans la rhizosphère et à l’issue de leur déve- loppement sous forme de résidus.

L’incorporation de ces composés organiques dans le sol a un rôle essentiel pour la microflore tellurique dans l’environnement

principalement oligotrophe²que constituent les sols. D’une façon plus générale, cette incorporation contribue au stockage du

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SCIENCES DE L’A^{LIMENT ET} A^GRO-ENVIRONNEMENT

uBB SCIENCESN°3

Biologie des communautés dans la rhizosphère :

analyse des interactions plantes ^- champignons mycorhizogènes à arbuscules ^- bactéries

■Diederik VAN TUINEN²

■Graziella BERTA³

■Philippe LEMANCEAU¹

Figure 1 :Représentation schématique des interactions plantes - champignons mycorhizogènes à arbuscules - bactéries dans la rhizosphère. Au cours de cet article sont présentées principalement les interactions plantes - champignons mycorhizogènes à arbuscules ainsi que les interactions entre la symbiose mycorhizienne correspondante et les bactéries (flèches noires). Les autres interactions entre les trois types de partenaires dans la rhizosphère sont indiquées pour mémoire (flèches grises).

■Barbara PIVATO^1,3*

■Pierre OFFRE^1*

■Christophe MOUGEL¹

■Sylvie MAZURIER¹

1 UMR INRA 1229, Université de Bourgogne, Microbiologie du Sol et de l’Environnement, CMSE, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon, France

2 UMR INRA 1088, CNRS 5184, Université de Bourgogne, Plante-Microbe-Environnement, CMSE, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon, France

3 Università del Piemonte Orientale ‘Amedeo Avogadro’, Dipartimento di Scienze dell’Ambiente e della Vita, via Bellini 25/G, 15100 Alessandria, Italie

*Ces auteurs ont contribué de façon équivalente au travail.

carbone dans le sol et constitue une composante importante du cycle de cet élément dans le cadre des changements globaux, climatiques en particulier.

La relation trophique de la microflore avec les racines des plantes est même obligatoire dans le cas des microorganismes biotrophes comme par exemple les champignons mycorhizogènes à arbuscules (MA). Ces champignons telluriques appartiennent au phylum récemment érigé des Gloméromycètes (Schüßler et al., 2001). Ils établissent une symbiose³à bénéfices réciproques avec la grande majorité des familles de plantes (92%) (Wang et Qui, 2006). L’origine de cette symbiose, appelée symbiose mycorhi- zienne à arbuscules (MA), a été datée sur la base de preuves fossiles au Dévonien (400 millions d’années, Redecker et al., 2000; Remy et al., 1994), correspondant au début de la colonisation de la terre par les plantes. Au cours de la symbiose MA, le champignon développe dans le sol un vaste mycélium, pouvant atteindre 20 m/cm³, et modifie l’architecture racinaire (Gamalero et al., 2002), augmentant ainsi le volume de sol prospecté par la plante.

En retour, les racines fournissent à ces

champignons les composés organiques nécessaires à leur métabolisme. Ces composés peuvent représenter jusqu’à 20% du carbone total fixé par la plante et incorporé dans les photosynthétats (Barea et al., 2002 ; Smith et Read, 1997). Cette symbiose est étudiée à Dijon au sein de l’UMR Plante- Microbe-Environnement (PME).

La relation trophique plantes - microor- ganismes est également essentielle dans le cas des microorganismes non symbiotiques dont la grande majorité est hétérotrophe. Les plantes libèrent une part très significative de leurs photosynthétats sous forme de rhizodépôts, en moyenne 17% (Nguyen, 2003), ce qui se traduit par une augmentation très significative de l’abondance et de l’activité de la microflore tellurique dans la rhizosphère comparée à celles du sol. En l’absence de cette fourniture de composés organiques, la microflore est en stase compte-tenu des faibles ressources en composés carbonés dis- ponibles dans les sols (Lockwood, 1977). L’apport massif de composés organiques par les racines entretient donc une vie microbienne intense dans

la rhizosphère. La quantité et la compo- sition de ces rhizodépôts varient selon le génotype végétal, espèce et même variété, le stade phénologique et le type de racine. Les populations microbiennes disposant des activités enzymatiques nécessaires au catabolisme des composés contenus dans ces rhizodépôts bénéficient d’un avantage compétitif comparées à celles qui en sont dépourvues. Outres ces composés organiques, les rhizodépôts contiennent des molécules impliquées dans la communication moléculaire entre plante et microflore conduisant à des phénomènes de reconnaissance et donc de colonisation privilégiée. A contrario, la présence de composés impliqués dans des phénomènes de défense de la plante contre des bioagresseurs, composés phénoliques par exemple, se traduit par une réduction de l’abondance des populations qui y sont sensibles et donc par une augmen- tation de celles qui y sont résistantes (Hartmann et al., 2008). L’ensemble de ces équilibres conduit à la sélection par la plante des populations microbiennes les mieux adaptées à l’environnement rhizosphérique.

Compte-tenu du coût que représente pour les plantes la libération de composés organiques au niveau de leurs racines, il a été proposé que ce coût doive nécessairement correspondre à un bénéfice pour les plantes pour que le processus de rhizodéposition se soit maintenu et soit partagé par l’ensemble des végétaux. Ainsi, la microflore associée aux racines contribue à la nutrition minérale et en eau des plantes. C’est en particulier le cas des champignons MA qui prélèvent grâce à des transporteurs spécifiques (Gianinazzi-Pearson et al., 2000 ; Harrison, 2005) du phosphore et des oligo-éléments présents généralement en quantités limitées et peu mobiles dans les sols. C’est le cas également des bactéries fixatrices d’azote, dont les plus connues appartiennent aux Rhizobia, qui forment avec les légumineuses des symbioses à bénéfices réciproques où la plante fournit aux bactéries les composés organiques nécessaires à leur fonction- nement et où les bactéries fixent l’azote

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Figure 2 :Représentation schématique de la boucle de rétroaction des interactions plantes-microorganismes dans la rhizosphère.

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atmosphérique au niveau des nodosités (Perret et al., 2000). Des travaux récents conduits au sein de l’UMR MSE en collaboration avec l’UMR ‘Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes’ de Montpellier montrent également que certaines populations de Pseudomonas améliorent l’alimentation des plantes en fer (Vansuyt et al., 2007).

Outre la nutrition des plantes, les microorganismes rhizosphériques contri- buent à la santé des plantes. Cook et al.

(1995) proposent ainsi que la stratégie mise en place par les plantes pour se protéger contre les maladies d’origine tellurique reposerait sur l’entretien d’une microflore dont certaines populations limitent la croissance saprophyte des agents pathogènes (antagonisme micro- bien) par la synthèse d’antibiotiques et/ou la compétition (pour le fer en particulier via la synthèse de sidérophores) et/ou élicitent les réactions de défense de la plante limitant ainsi le développement parasite des pathogènes (Cook et al., 1995 ; Robin et al., accepté pour publication ; Van Loon et al., 1998). Parmi ces populations microbiennes protectrices, une attention particulière est dédiée aux groupes des champignons MA et des Pseudomonas spp. fluorescents qui font l’objet de recherches depuis de longues années au sein du Centre de Microbiologie du Sol et de l’Environnement (CMSE).

Au-delà de l’intérêt écologique que représente l’analyse des interactions complexes dans la rhizosphère, la meilleure connaissance de leur déterminisme représente un challenge pour proposer des pratiques agricoles qui tirent au mieux partie de ces interactions afin de réduire l’utilisation d’intrants de synthèse (engrais, pesticides). Ceci constitue un des objectifs de l’Opération Structurante de l’Agroécologie de la Parcelle Cultivée regroupant les quatre UMRs du végétal associées à l’INRA (Biologie et Gestion des Adventices, LEGumineuses, MSE et PME) ainsi que les Unités Expérimentales de l’INRA.

Les recherches résumées dans cet article s’intègrent dans la thématique générale de l’écologie de la rhizosphère. Elles correspondent au travail réalisé dans le

cadre de deux thèses : celle de B. Pivato réalisée en cotutelle (Universités de Bourgogne et du Piémont Oriental, co-dirigée par G. Berta et Ph.

Lemanceau) en collaboration avec l’UMR PME au sein du CMSE et celle de P. Offre (co-dirigée par C. Mougel et Ph.

Lemanceau).

Objectifs des recherches et stratégie d’étude

L’objectif des thèses était d’améliorer notre connaissance de l’écologie des interactions complexes entre (i) la plante et la commu- nauté des champignons MA et entre (ii) la symbiose ainsi établie et la communauté bactérienne associée (Figure 1).

La stratégie suivie est celle couramment a p p l i q u é e a u s e i n d e l ’ é q u i p e

‘Dynamique des Interactions Plantes - Microorganismes’ de l’UMR MSE. Elle consiste à faire varier l’environnement rhizosphérique en cultivant des génotypes

de plante différents, puis à analyser l’impact sur la microflore (structure, diversité et activité) qui en résulte, et enfin à déterminer les conséquences des variations de la microflore sur la croissance, le développement et la santé des plantes. Ces conséquences influencent en retour la libération de photosynthétats par la plante et donc la microflore associée… Il s’agit donc d’étudier la boucle de rétroaction que constituent les interactions plantes - microorganismes (Figure 2).

Les recherches réalisées dans le cadre des deux thèses ont porté successivement sur (i) l’analyse de l’effet du génotype végétal sur la structure et la diversité génétiques de la communauté de champignons MA colonisant les racines, (ii) l’influence de la symbiose MA sur la structure et la diversité génétiques de la communauté bactérienne, et finalement (iii) l’influence des bactéries préféren- tiellement associées aux racines mycorhizées sur l’établissement de la symbiose MA.

Figure 3 :Dynamique de la structure génétique des communautés bactériennes au cours du développement de Medicago truncatula. A) Stades phénologiques : végétatifs (I : 4 feuilles, II : Ramifications primaires, III : Ramifications secondaires) et reproducteurs (IV : Floraison, V : Maturation des graines) ; B) Empreintes génétiques (profils A-RISA) représentant la structure génétique de communautés bactériennes ; C) Analyse multivariée des profils A-RISA de la communauté bactérienne au cours des différents stades phénologiques de M. truncatula.

Développement d’un bioessai et d’une méthodologie pour caractériser les communautés bactériennes dans la rhizosphère

Il a d’abord été nécessaire de développer un bioessai permettant d’analyser les interactions complexes entre la plante, la symbiose MA et la communauté bactérienne. La plante utilisée est Medicago truncatula qui constitue une plante-modèle pour l’analyse des interactions plantes – microorganismes (Cook, 1999). M. truncatula a été cultivé dans un sol méditerranéen (Mas d’Imbert) correspondant à la zone de diversification des médics annuelles. Ce sol était maintenu en jachère depuis plusieurs années avec la présence de médics annuelles indigènes. M. truncatula a été cultivée dans ce sol en pots en conditions contrôlées en chambre climatisée. Le niveau de mycorhization, par les populations indigènes de champignons MA, a été mesuré selon la méthode de Trouvelot et al.(1986) et la structure génétique des communautés bactériennes a été caractérisée au cours du développement des plantes. Cinq stades phénologiques (trois végétatifs et deux reproducteurs) ont été considérés (Figure 3A). La structure des commu- nautés bactériennes a été caractérisée

sur la base du polymorphisme de taille de l’intergène (InterGenic Spacer, IGS) séparant les deux sous-unités riboso- miques à partir d’ADN directement extrait des racines et amplifié avec des amorces consensus pour les bactéries (A-RISA, Automated-Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) (Ranjard et al., 2001).

La taille de l’intergène peut varier de 50 à plus de 1500 paires de bases selon les espèces bactériennes. La méthode A-RISA permet de séparer les IGS de tailles différentes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les profils de bandes ainsi obtenus représentent l’empreinte génétique de la communauté bacté- rienne considérée correspondant à sa structure génétique (Figure 3B).

Les résultats obtenus révèlent un bon taux de mycorhization de M. truncatula dans le sol étudié avec un maximum atteint lors de la transition entre les stades végétatifs et reproducteurs.

L’analyse multivariée des profils A-RISA au cours du développement de M.

truncatula montre que la structure génétique de la communauté bacté- rienne évolue significativement au cours du temps (Figure 3C), confirmant bien la dynamique temporelle de l’environnement rhizosphérique liée aux variations de la rhizodéposition.

Cependant, on peut noter une similarité des communautés bactériennes observées au stade de maturation des graines

(stade V) et aux premiers stades végé- tatifs (I & II), suggérant une résilience de l’effet rhizosphère (Figure 3C).

L’ensemble de ces résultats publiés dans la revue New Phytologist (Mougel et al., 2006) a permis de (i) valider les conditions de culture de M. truncatula favorables à la mycorhization par la communauté fongique indigène et de (ii) déterminer le stade phénologique auquel le taux de mycorhization et l’effet rhizosphère sur la communauté bactérienne sont les plus élevés (Stade végétatif III).

Influence du génotype

végétal sur la communauté de champignons mycorhizogènes à arbuscules

En dépit de leur longue évolution commune (400 millions d’années, Remy et al., 1994) et de la dépendance de chacun des partenaires à son hôte, il n’existe pas de spécificité stricte entre les plantes et les champignons MA (Sanders, 2002) contrairement à la symbiose bactérienne plus récente conduisant à la fixation de l’azote atmosphérique. En effet, différentes espèces de Glomeromycetessont capables de coloniser les racines de différentes

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Figure 4 : Comparaison de l’abondance des Glomeromycetes et des UTOs (Unités Taxonomiques Opérationnelles) de Glomus, mesurée par PCR quanti- tative, dans le sol non cultivé et dans les racines de Medicago polymorpha, M. murex, M. laciniata et M.

truncatula.

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espèces végétales qui elles-mêmes sont colonisées par différentes espèces fongiques (Gollotte et al., 2004; van Tuinen et al., 1998). Des travaux récents cependant indiquaient que la communauté de champignons MA influence la composition et la productivité du couvert végétal (Vandenkoornhuyse et al., 2003 ; Van der Heijden et al., 1998).

Nos recherches visaient donc à évaluer si en retour le génotype végétal influence la composition de la communauté de champignons MA colonisant les racines.

La stratégie d’étude a consisté à comparer la diversité et la structure génétiques des champignons MA colonisant les racines de quatre espèces de médics annuelles (M. laciniata, M. murex, M.

polymorpha et M. truncatula) dont la distance génétique est connue (Béna, 2001). M. murex etM. polymorphasont proches phylogénétiquement et partagent un nombre de chromosomes particulier (2n=14) diffèrent de celui de M. laciniata et M. truncatula (2n=16) (Béna et al.,

1998 ; Falistocco et Falcinelli, 2003).

M. laciniataest la plus ancienne espèce des quatre et M. truncatula la plus distante (Béna et al., 1998). Les quatre espèces diffèrent également selon leur distribution géographique même si celle-ci est associée au bassin méditer- ranéen (Béna et al., 2005).

Ces quatre espèces de médics annuelles ont d’ailleurs été cultivées dans un sol du bassin méditerranéen (Mas d’Imbert) couvert de médics annuelles indigènes.

La diversité des champignons MA colonisant les racines de ces quatre espèces a été évaluée en caractérisant le polymorphisme de l’extrémité 5’ de la grande sous-unité de l’ADN ribosomique par séquençage selon la méthode développée par van Tuinen et al.(1998) après extraction de l’ADN directement des racines. Deux cent quarante six séquences de cette sous-unité ont ainsi été obtenues et leur analyse phylogéné- tique a permis d’identifier 12 Unités Taxonomiques Opérationnelles (UTOs)

appartenant toutes au genre Glomus.

L’analyse de ces séquences indique claire- ment que la diversité de la communauté de champignons MA ne diffère pas significativement selon l’espèce de médic, ce qui confirme bien l’absence de spécificité d’hôte déjà décrite dans la littérature. Des amorces spécifiques amplifiant les séquences correspondant aux principales UTOs ont été obtenues et utilisées pour quantifier par PCR (Polymerase Chain Reaction) quantitative leur abondance dans les racines de chaque espèce de médic et dans le sol non cultivé. Les résultats obtenus montrent que comme attendu l’abondance des champignons symbiotiques est plus élevée dans les racines que dans le sol, mais surtout ils mettent en évidence la différence significative d’abondance de trois des UTOs testées selon les espèces de médics (Figure 4).

Au total, l’ensemble des résultats obtenus au cours de cette étude, qui a fait l’objet d’une publication dans New

Figure 5 : Identification des groupes bactériens préférentiellement associés aux racines mycorhizées de Medicago truncatula. A) Analyse multivariée des profils A-RISA des communautés bactériennes associées aux génotypes de M. truncatula mycorhizés (myc+/nod+ &

myc+/nod-) et non mycorhizé (myc-/nod-), les nombres indiquent les marqueurs moléculaires expliquant les différences de structure entre ces deux types de communautés bactériennes. B) Analyse phylogénétique des séquences partielles de l’ADNr 16S des marqueurs moléculaires, indiquant que les groupes bactériens correspondants appartiennent aux familles des Oxalobacteraceae et des Comamonadaceae.

A

B