NUTRITION ET CROISSANCE DES BACTÉRIES
Tout organisme vivant devrait trouver dans son milieu la totalité des substances dont il a besoin pour la génération de l'énergie et la biosynthèse cellulaire.
Les éléments chimiques de ce milieu qui est utilisé pour la croissance bactérienne sont connus sous le nom d'éléments nutritifs ou exigences nutritionnelles.
La nutrition doit être satisfaite par deux types de substances (nutriments) :
• Les substances élémentaires,
• Les substances énergétiques
LES BESOINS NUTRITIONNELS DES BACTÉRIES
À un niveau élémentaire, les exigences nutritionnelles d'une bactérie telle que Escherichia coli sont révélés par la composition élémentaire de la cellule qui consiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, et les traces de Zn, Co, Cu, et Mo.
Les éléments majeurs ou macroéléments
Éléments Majeurs, leurs sources et fonctions dans les cellules bactériennes
L'élément % du poids sec
Source Fonction
Carbone 50 composés organiques ou CO2
composant Principal de matière cellulaire
Oxygène 20 H2O, composés
organiques, CO2, et O2
Composant de matière et eau cellulaire; l’O2 est l’accepteur final d'électrons dans la respiration aérobie
Azote 14 NH3, NO3, composés
organiques, N2
Composant d'acide es aminés, nucléotides et coenzymes
Hydrogène 8 H2O, composés
organiques, H2
constituant principal des composés organiques et de l’eau cellulaire
Le
phosphore
3 Phosphates inorganiques (PO4) (PO4)
Composant d'acide es nucléiques, nucléotides, phospholipides, LPS, acide es teichoiques,
Soufre 1 SO4, H2S, So, composé
organiques soufrés
Composant de cystéine, méthionine, glutathion, plusieurs coenzymes
Potassium 1 Sels de Potassium Principal cation inorganique cellulaire et cofacteur pour certaines enzymes
Le
magnésium
0.5 Sels de Magnésium cation Inorganique cellulaire, cofacteur pour certaines réactions enzymatiques
Calcium 0.5 Sels de Calcium cation cellulaire Inorganique, cofacteur pour certaines enzymes et un composant essentiel des endospores
Fer 0.2 sels de Fer Composant des cytochromes, de certaines non-heme fe- protéines et un cofacteur pour quelques réactions enzymatiques
Les Oligo-éléments
Les oligo-éléments sont des ions de métaux exigés par certains micro-organismes en faibles quantités.
Les oligo-éléments agissent habituellement comme
cofacteurs pour les réactions enzymatiques
essentielles de la cellule.
Carbone et Sources d’Énergie
Tous les organismes vivants ont besoin d’une source d'énergie.
Les organismes qui utilisent l'énergie lumineuse sont appelés
« phototrophes ».
Les organismes qui utilisent les réactions chimiques pour produire de l’énergie sont appelés « chimiotrophes ».
Les organismes qui utilisent (oxydent) une forme organique de carbone sont appelés « organotrophes ».
Les organismes qui oxydent des composés inorganiques sont appelés
« lithotrophes ».
Les exigences des organismes en carbone doivent être satisfaites par du carbone organique ou par du CO2.
Les organismes qui utilisent le carbone organique sont des hétérotrophes ( ou organotrophes)
les organismes qui utilisent le CO2 comme seule source de carbone pour leur croissance sont appelés
« autotrophes».
Le Type alimentaire la Source D'énergie la Source du
Carbone Exemples
Photo-autotrophes lumière CO2 Cyanobactéries, quelques
bactéries pourpres et bactéries vertes
Photo-hétérotrophes lumière Composés
organiques quelques bactéries pourpres et bactéries vertes
Chimio-autotrophes ou Lithotrophes (Lithoautotrophes)
Composés
inorganiques ex: H2, NH3, NO2, H2S
CO2 Quelques bactéries et plusieurs Archéobactéries
Chimio-hétérotrophes
ou Hétérotrophes Composés organiques Composés
organiques La plupart des bactéries et quelques Archéobactéries
D'après les sources de carbone et d'énergie utilisées pour la croissance, quatre types alimentaires majeurs peuvent être définis chez les procaryotes
Les types alimentaires majeurs chez les procaryotes
Les facteurs de croissance
Ce sont des substances essentielles que le microorganisme est incapable de synthétiser à partir des éléments nutritifs disponibles dans le milieu.
Les facteurs de croissance accomplissent des rôles spécifiques dans les réactions de biosynthèse.
Le besoin en facteur de croissance résulte du
blocage ou absence des voies métabolique dans les
cellules.
Les facteurs de croissance englobent généralement trois catégories de substances : les acides aminés, les bases azotées et les vitamines.
Certains acides gras aussi peuvent être
considérés comme facteurs de croissance
puisqu’il existe des souches bactériennes
qui sont incapables de les synthétiser.
Ces composés doivent être ajoutés lors de la préparation des milieux de culture utilisés pour cultiver ces bactéries.
Ils ont en commun deux principales caractéristiques :
Leur action se fait à de très faibles concentrations.
– 1 à 4μg/L pour les vitamines
– 10 mg/L pour les bases nucléotidiques, – 25mg/L pour les AA
Leur étroite spécificité.:
•Le nicotinamide peut être remplacé par l’ac nicotinique, mais pas par la 4 amido-pyridine
Les souches de bactéries mutantes qui exigent un facteur de croissance non requis par la souche de type sauvage (parente) sont connues sous le nom d’ «auxotrophes».
Le type sauvage est appelé « prototrophe »
Les besoins en facteurs de croissance d’une espèce microbienne peuvent quelquefois être satisfaits par la présence d’une autre espèce qui précisément synthétise ce facteur.
Ce phénomène d’interaction métabolique est connu
sous le nom de « syntrophie » (= repas avec).
MILIEUX DE CULTURE
Pour la croissance de toutes les bactéries, il est obligatoire de les mettre dans un environnement biochimique et biophysique approprié.
L’environnement biochimique (nutritionnel) est rendu
possible grâce au milieu de culture ; et selon les besoins
spécifiques de bactéries particulières, une grande
variété et types de milieux de culture ont été
développés avec des buts et usages différents.
Types de Milieux de Culture
Les milieux de culture peuvent être classés dans plusieurs catégories selon leur composition ou usage.
Un milieu chimiquement défini (synthétique) est celui dont la composition chimique exacte est connue avec précision.
Un milieu complexe (indéterminé) est celui dont la constitution chimique exacte n'est pas connue ; on dit qu’il est empirique.
Un milieu défini est un milieu minimum s'il fournit seulement les éléments nutritifs exacts (y compris tous les facteurs de croissance) dont l'organisme a besoin pour sa croissance.
Exemple de milieu synthétique pour la croissance de Bacillus megaterium
Composants quantité Fonction du composant
pH 7,0 saccharose 10.0 g source de C et d'énergie
K2HPO4 2.5 g Tampon pH; source de P et K KH2PO4 2.5 g Tampon pH; source de P et K (NH4)2HPO4 1.0 g Tampon pH; source de P et N MgSO4 7H2O 0.20 g source de S et Mg++
FeSO4 7H2O 0.01 g Source de Fe++
MnSO4 7H2O 0.007 g Source de Mn++
Eau 985 ml
Milieu complexe (empirique) pour la croissance de bactéries exigeantes.
Composants quantité Fonction du composant pH 6.6
Extrait de bœuf 1.5 g Source de vitamines et autres facteurs de croissance Extrait de levure 3.0 g Source de vitamines et autres facteurs de croissance Peptone 6.0 g Source d'acides aminés, N, S, et P
Glucose 1.0 g C et source de l'énergie Agar 15.0 g Agent solidifiant Inerte
Eau 1000 ml
Un milieu sélectif est un milieu qui contient un (ou plusieurs) composé (s) ajouté qui inhibera ou préviendra la croissance de certains types ou espèces de bactéries tout en encourageant la croissance de l'espèce désirée.
On peut ajuster aussi les conditions physiques d'un milieu de culture, tel que le pH et la température pour le rendre sélectif pour des organismes qui sont capables de grandir sous ces certaines conditions.
EXIGENCES PHYSIQUES ET ENVIRONMENTALES
Les microorganismes doivent trouver dans leur environnement toutes les substances nutritives pour assurer une bonne croissance.
Leur croissance dépend aussi des conditions physicochimiques du milieu.
Un certain nombre de facteurs tels que la température, le pH, la salinité, la pression d’oxygène…etc., ont un effet sur la croissance des bactéries.
Effet de l'Oxygène
Les aérobies strictes (ou aérobies obligatoires) exigent l’O2 pour leur croissance; ils utilisent l’O2 comme dernier accepteur des électrons au cours de la respiration aérobie.
Les anaérobies strictes (parfois appelés aérophobes) n'en ont pas besoin ou bien ils utilisent l’O2 comme un élément nutritif. En fait, l’O2 est une substance toxique qui tue ces microorganismes ou inhibe leur croissance.
Les anaérobies Facultatifs (ou aérobies facultatifs) sont des microorganismes qui peuvent permuter entre les deux types de métabolismes aérobie et anaérobie.
Les anaérobies aérotolérants sont des bactéries avec un type de métabolisme exclusivement anaérobie (fermentative) mais ils sont insensibles à la présence d'O2. Ils vivent exclusivement par fermentation avec ou sans O2 dans leur milieu.
La réponse d'un organisme à l’O2 dans son milieu dépend de la présence et la distribution de plusieurs enzymes qui réagissent avec l’O2 et plusieurs radicaux de l'oxygène qui sont invariablement produits par les cellules en présence d'O2.
Toutes les cellules contiennent des enzymes capables de réagir avec l’O2.
Par exemple, l’oxydation des flavoprotéines (transporteurs d'électrons dans la chaîne respiratoire) par l’O2 produit du peroxyde (H2O2) comme produit majeur et en petites quantités, un même radical libre plus toxique, le superoxyde ou O2-.
Chez les aérobies et les anaérobies aérotolérants, la possibilité d’accumulation mortelle du superoxyde est prévenue par l'enzyme
« superoxide dismutase ».
Tous les microorganismes qui peuvent vivre en présence d'O2 contiennent la superoxide dismutase. La majorité des microorganismes contient la catalase, enzyme qui décompose H2O2.
Bien que certaines bactéries aérotolérantes telles que les bactéries lactiques n’aient pas de catalase, elles décomposent le H2O2 grâce aux peroxydases qui mobilisent les électrons à partir du NADH2 pour réduire le peroxyde en H2O.
Les anaérobies obligatoires (strictes) ne
possèdent pas de superoxyde dismutase,
peroxidase et/ou la catalase, et par
conséquent subissent des oxydations
mortelles causées par plusieurs radicaux
quand ils sont exposés à l’O
2.
Enzymes de détoxification de l’O2 chez les procaryotes.
Groupe Superoxyde
dismutase Catalase Peroxydase Aérobies strictes et la plupart des
anaérobies facultatifs (par exemple Entériques)
+ + -
La plupart des anaérobies aéro-
tolérants (par exemple Streptocoques) + - + Anaérobies strictes (par exemple les
Clostridies, Méthanogènes,…) - - -
Dans les milieux de cultures et les fermenteurs industriels les valeurs de pH doivent être contrôlés pour avoir des taux de croissance opt grâce à des solutions tampons.
Il existe des bact acidophiles des bact neutrophiles des bact alcalophiles
Effet du pH sur la croissance
Valeurs minimales de pH chez quelques bactéries
Bacillus cereus
Clostridium botulinum, Group I C. perfringens
Escherichia coli O157:H7 Lactobacillus plantarum Listeria monocytogenes Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica
4.9 4.6 5.0 4.5 3.3 4.1 4.8 4.2
Effet de la Température sur Croissance
Les micro-organismes peuvent virtuellement exister dans tous les milieux où il y a de l'eau liquide, sans se soucier de sa température.
En 1966, Thomas Brock, a découvert des archaebactéries thermophiles dans les sources chaudes bouillantes du Yellowstone National Parc.
Ce sont des "extrêmophiles ".
Les procaryotes peuvent être subdivisés en plusieurs groupes:
Par exemple, les microorganismes ayant une température optimale voisine de 37 ° C (la température du corps des animaux à sang chaud) sont appelés des mésophiles.
Les microorganismes qui ont une température optimale entre approximativement 45 ° C et 70 ° C sont des thermophiles.
Quelques archaebactéries ont une température optimale
de 80 ° C ou plus et une température maximale d’environ
115 degrés et sont connus sous le nom de thermophiles
extrêmes ou hyperthermophiles.
Les organismes qui préfèrent le froid sont appelés des psychrophiles et sont définis par leur aptitude de se développer à 0 ° C.
Les psychrotrophes constituent une variante de
psychrophiles (qui ont une température optimale de
10 à 15 ° C habituellement) qui croissent à 0 ° C mais
ont une température optimale dans la catégorie des
mésophiles, température ambiante.
Quelques Termes regroupant les microorganismes en fonction de la température de croissance.
Température de croissance (en °C)
Groupe Minimum Optimum Maximum Commentaire Psychrophile En
dessous de 0
10-15 En dessous
de 20
Se développent le mieux à température relativement basse
Psychrotrophe 0 15-30 Au-dessus
de 25 Capables de se développer à T basse mais préfèrent des T modérées
Mésophile 10-15 30-40 En dessous
de 45
La plupart des espèces bactérienne. Ceux qui vivent en association avec les animaux à sang chaud
Thermophile 45 50-85 Au-dessus
de100 Une grande variation des T optimales et maximales chez les thermophiles
Température de croissance de quelques bactéries et archaebactéries.
Température de croissance (en °C)
Bactérie Minimum Optimum Maximum
Listeria monocytogenes 1 30-37 45
Vibrio marinus 4 15 30
Pseudomonas maltophilia 4 35 41
Staphylococcus aureus 10 30-37 45
Escherichia coli 10 37 45
Streptococcus pneumoniae 25 37 42
Bacillus flavothermus 30 60 72
Thermus aquaticus 40 70-72 79
Methanococcus jannaschii 60 85 90
Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90
Pyrobacterium brockii 80 102-105 115
Les bactéries Psychrophiles sont adaptées au milieu froid grâce à la composition de leur membrane plasmique qui contient des acides gras en grande partie non saturés.
Quelques psychrophiles, en particulier ceux de l'Antarctique contiennent des acides gras poly-insaturés qu’on ne trouve généralement pas chez les procaryotes.
Les psychrophiles ont aussi des enzymes qui continuent à fonctionner, bien qu'à vitesse réduite, à des températures voisines de 0 °C.
Les extrêmophiles sont des organismes qui se développent mieux dans des environnements extrêmement froids, acides, basiques ou chauds.
Par exemple Pyrolobus fumarii est un hyperthermophile qui se développe mieux à 106 ° C.
Cet organisme a donc besoin de biomolécules extrêmement stables pour survivre.
Sans une stabilité accrue dans la membrane :
• la cellule se désintégrerait,
• sortie et entrée massives de molécules à travers la membrane,
• destruction des gradients chimiques que la cellule utilise pour son énergie,
• diffusion des protéines
• arrêt des processus métaboliques de la cellule.
Les thermophiles sont adaptés aux températures au-dessus de 60 °C par différents moyens.
Souvent, les thermophiles ont un pourcentage élevé de bases GC dans leur ADN.
Les acides gras de la membrane des bactéries thermophiles sont saturés et permettent à leurs membranes de rester stables et fonctionnelles à hautes températures.
Les membranes des archaebactéries hyper-thermophiles sont composées de sous unités à répétition d’un composé en C5, le phytane, un isoprenoid ramifié, saturé, qui contribue largement à l’aptitude de ces bactéries à vivre dans les milieux surchauffés.
Les protéines de structure (par exemple les protéines des ribosomes, les protéines de transport ou perméases…) et les enzymes des thermophiles et des hyper-thermophiles sont très stables à températures élevées par comparaison à leurs équivalents chez les mésophiles.
Les protéines sont modifiées de plusieurs manières y compris la déshydratation ainsi que les petits changements dans leur structure primaire, ce qui explique leur stabilité thermique.
L’activité de l’Eau
La disponibilité d'eau pour une cellule dépend de sa présence dans l'atmosphère (humidité relative) ou sa présence dans une solution ou une substance (activité de l'eau).
L'activité de l'eau (Ae) de H2O pure est égale à 1.0 (100%
eau).
L’activité de l'Eau est affectée par la présence de solutés tels que les sels ou les sucres qui sont dissouts dans l'eau.
Plus la concentration du soluté d'une substance est élevée, plus l'activité de l'eau est faible et vice versa.
Les microorganismes vivent généralement sur une gamme d'Ae de 1.0 à 0.7.
L'Ae du sang humain est 0.99;
Ae de l’eau de mer = 0.98;
Ae du Grand Lac salé (USA) = 0.75.
Les Ae des sols agricoles sont comprise entre 0.9 et
1.0.
Le NaCl est un soluté qu’on trouve en grande concentration dans la nature, et quelques micro- organismes sont nommés selon leur comportement en présence de sel.
Les micro-organismes qui exigent du NaCl pour croissance sont des halophiles:
Les halophiles faibles exigent 1 à 6% de sel, les halophiles modérés exigent 6 à 15% sel.
Les halophiles extrêmes qui exigent 15 à 30% NaCl pour
leur croissance se trouvent parmi les archaebactéries.
Les bactéries qui sont capables de développer à concentrations de sel modérées, bien qu'ils croissent le mieux en absence de NaCl, sont dites halotolérantes.
Bien que les halophiles soient "des osmophiles "
(les halotolérants sont "des osmotolérants")
Le terme osmophile est réservé aux organismes qui sont
capables de vivre habituellement dans les milieux à forte
concentration de sucre.
Les microorganismes qui vivent dans les milieux secs sont appelés des xérophiles.
L'abaissement de l'activité de l'eau pour prévenir la
croissance bactérienne est à la base de la
conservation de la nourriture par séchage ou par
addition de fortes concentrations de sel ou sucre.
Tableau 9. Les activités de l'eau (Aw) limitantes pour la croissance de quelques procaryotes.
Microorganisme Ae minimale pour la croissance
Caulobacter 1,00
Spirillum 1,00
Pseudomonas 0,91
Salmonella/E. coli 0,91
Lactobacillus 0,90
Bacillus 0,90
Staphylococcus 0,85
Halococcus 0,75
CROISSANCE BACTÉRIENNE
La croissance peut être définie comme «un accroissement ordonné de tous les composants d’un organisme ».
Elle dépend de l’aptitude de la cellule à former
un nouveau protoplasme à partir des éléments
nutritifs disponibles dans l'environnement.
Chez la plupart des bactéries, la croissance implique la croissance de la masse cellulaire et du nombre de ribosomes, la duplication du chromosome bactérien, la synthèse de nouvelles parois et membranes plasmiques, la séparation des chromosomes, la formation du septum, et la division cellulaire.
Ce processus asexué de reproduction est appelé fission binaire.
La croissance est donc synonyme de multiplication, puisque toutes les 20 minutes environ, une bactérie telle qu’Escherichia coli peut donner naissance à deux (nouvelles) bactéries.
Les modifications induites les plus notables
concernent le pH, le potentiel d’oxydoréduction, la
conductivité, la pression osmotique, la tension
superficielle et la viscosité.
TECHNIQUES D’ÉTUDE DE LA CROISSANCE
Chez les organismes unicellulaires tels que les bactéries, la croissance peut être mesurée grâce à deux paramètres différents: la variation de la masse cellulaire et la variation du nombre de cellules.
Sur un milieu solide, ensemencé en surface, une cellule bactérienne donne naissance en 24 heures à une colonie.
En étalant une suspension de volume connu et en dénombrant les colonies, on peut déduire le nombre de bactéries présentes initialement.
Cette méthode ne permet pourtant pas l’étude cinétique de la croissance. C’est la raison pour laquelle on a recours habituellement aux milieux liquides.
Les techniques de mesure de la croissance sont fondées sur l’évolution du nombre de microorganismes ou de leur masse par unité de volume ou de poids du milieu.
Ces deux grandeurs sont difficilement comparables.
La croissance du nombre de germes est un phénomène discontinu,
l’accroissement de la masse est un processus continu en fonction du temps.
Cette distinction est surtout valable dans le cas de la croissance synchrone, situation exceptionnelle, lorsque toutes les cellules de la population considérée se divisent en même temps.
Dans les conditions normales, au contraire, les cycles de croissance pour chacune des cellules de la population se font au hasard et sont totalement asynchrones.
Les deux valeurs (nombre et masse) progressant alors de façon parallèle peuvent être considérées comme statistiquement équivalentes.
Quelques Méthodes utilisée pour mesurer la croissance bactérienne
Méthode Application Observations
Dénombrement microscopique Enumération des bactéries lactiques
Pas de distinction entre les cellules mortes et les cellules vivantes Le comptage des cellules
viables (comptage de colonies)
Énumération de bactéries dans les aliments, sol, eau, cultures de laboratoire… etc.
Très sensible si l’étalement se fait dans des conditions optimales
Mesure de la turbidité Estimation de grands nombres de bactéries dans les milieux liquides clairs et les bouillons
Rapide et non destructive, mais ne peut pas détecter de densités
cellulaires moins de 107 cellules par ml Mesure de l’azote total et des
protéines
Mesure du rendement cellulaire total de cultures très denses
Application pratique dans les
laboratoires de la recherche seulement Mesure d'activités Biochimiques
par exemple la consommation de l’O2 , production de CO2, production d’ATP
Tests microbiologiques Exige des standards fixes pour lier l’activité chimique à la biomasse ou au nbre de cellules
Mesure du poids sec ou du poids frais des cellules
Mesure du rendement cellulaire total des cultures
Probablement plus sensible que le dosage de l’azote ou des protéines totales
Mesure du nombre de cellules Lecture au microscope
La méthode est pratiquée couramment pour les microorganismes de grande taille (plusieurs μm) comme les levures. On utilise un hématimètre (cellule de Thoma, de Malassez, Petroff Hausser).
Avec les bactéries de petite taille, on utilise des grossissements très forts, ce qui réduit notablement la profondeur et le diamètre du champ.
On a recours le plus souvent à la technique de Breed qui consiste à étaler un volume connu (0.01 ml généralement) de la suspension bactérienne sur une aire de 1 cm à la surface d’une lame porte-objet.
Après séchage, fixation et coloration, les bactéries sont comptées dans plusieurs champs microscopiques dont on a, au préalable, mesuré le diamètre à l’aide d’un micromètre objectif.
Ceci n’est possible que dans la mesure où l’on a affaire à des cellules bien individualisées, mais s’avérere impossible en présence d’agrégats ou d’espèces filamenteuses.
Epifluorescence
Les bactéries sont colorées par un fluorochrome comme l’acridine orange, puis examinées en lumière ultraviolette.
On peut théoriquement compter sélectivement les bactéries vivantes qui ont une fluorescence verte (ADN double brin apparié) et les bactéries mortes dont la fluorescence rouge résulte de la combinaison du fluorochrome avec l’ADN dénaturé.
Dénombrement après culture
Le dénombrement des microorganismes viables est une méthode communément utilisée.
Un volume fixe de la suspension brute (ou des dilutions) est étalé à la surface d’un milieu gélosé dans une boite de Petri ou incorporé au milieu avant sa solidification.
Après incubation à une température convenable, le nombre de colonies apparues correspond au nombre de cellules microbiennes présentes dans le volume analysé de la suspension.
L’analyse est faite en plusieurs exemplaires.
Le nombre de colonies retenu après lecture des boites devra être compris entre 30 et 300.
Il faut remarquer que les chaînettes, les amas ou les agglomérats microbiens ne donnent qu’une seule colonie.
C’est pourquoi on doit exprimer les résultats non pas en nombre de cellules mais en unités formant colonies (UFC).
Dénombrement des bactéries par la méthode des dilutions.
1. L’échantillon est dilué de 10 en 10;
2. 1 ml de chacune des dilutions est incorporé en milieu gélosé solide et soigneusement homogénéisé;
3. Après incubation au temps et à la température convenable on procède au dénombrement, en choisissant de préférence les boîtes qui contient entre 30 et 300 colonies.
On peut aussi estimer le nombre de cellules viables dans une culture par inoculation de quantités fixes de la suspension initiale et de ses dilutions, en milieu liquide.
Le tube qui donnera une culture après incubation contiendra au moins une bactérie viable.
En inoculant ainsi 3, 5 ou même 10 tubes par dilution, on augmente la précision des résultats qui sont fournis par des tables statistiques (tables de Mac Crady).
Le nombre de cultures positives considérées dans 3 dilutions successives donne le nombre le plus probable (NPP) de micro- organismes viables présents dans la culture initiale (voir travaux dirigés).
La précision obtenue dans ces conditions est nettement inférieure à la précédente.
La méthode par filtration sur membrane est aussi très classique dans le cas d’études spéciales (analyses des eaux, etc.).
Elle consiste à filtrer un volume déterminé d’une suspension sur une membrane filtrante en cellulose qui est ensuite déposée sur un milieu convenable.
Elle a l’avantage de concentrer les bactéries présentes en faible quantité dans un milieu.
Mesure de la biomasse
Détermination du poids sec
Mesure de base, elle permet la détermination de paramètres spécifiques (vitesse de croissance, taux de production de métabolite).
Les micro-organismes sont récoltés par centrifugation (ou par filtration sur membrane), le culot (ou le filtre) est desséché à 100- 110 °C.
Après refroidissement à température ambiante en atmosphère sèche ils sont ensuite pesés.
Le poids est exprimé généralement en grammes de matière sèche par litre.
La mesure du poids sec totalise toute la masse cellulaire, vivante et morte.
Mesure du trouble
C’est une méthode simple, rapide et actuellement la plus utilisée pour évaluer la masse microbienne.
Il s’agit d’une méthode optique générale, appelée turbidimétrie, fondée sur la propriété que présente toute solution d’absorber une partie de l’intensité d’un faisceau de lumière qui la traverse en
ligne droite.
Elle mesure le pourcentage de lumière absorbée (concentration ou épaisseur du milieu trouble) par rapport à l’intensité du faisceau de lumière incidente Io.
Par définition log (lo/I) représente l’absorbance (A).
En négligeant l’intensité de lumière réfléchie et diffusée, on peut écrire:
log (Io/I) = K.C.L
où K est le coefficient d’absorption.
C la concentration de cellules (ou biomasse) L le trajet optique (épaisseur de la cuve).
L’absorbance est proportionnelle à la concentration cellulaire. Il y a cependant une limite à cette linéarité aux fortes concentrations.
Elle varie avec les micro-organismes et une droite de corrélation avec la matière sèche doit être établie dans chaque cas (en général cette limite se situe aux environ de 0,8 unités d’absorbance à 650 nm).
Les mesures sont effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 650 nm pour laquelle l’absorption de la lumière par le milieu est la plus faible.
Il existe des bio-photomètres automatiques qui permettent de suivre les cinétiques en continu.
Cette technique ne peut être appliquée avec les milieux de culture très colorés ou troubles.
Mesure des constituants cellulaires
Le constituant cellulaire idéal devrait, être ubiquiste et disparaître rapidement des cellules après leur mort ;
être absent du milieu ou tout au moins ne pas être associé à des éléments figurés abiotiques qui ne peuvent pas être séparés des cellules et
être dans les cellules en concentration à peu près constante quel que soit leur état physiologique.
Le dosage de l’azote cellulaire par Kjeldal ou Bradford représente une méthode facile mais relativement peu sensible.
Les méthodes actuelles les plus prometteuses sont fondées sur le dosage par bioluminescence de L’adénosine-5’-triphosphate (ATP) ou des nucléotides flavoniques (FAD, FMN).
Il est possible également de suivre la cinétique de production d’une enzyme (spécifique) par les microorganismes au cours de leur développement.
Les mesures ne sont pas toujours convertibles en biomasse lorsque la concentration en enzymes (endo- ou exocellulaires) n’est pas proportionnelle à la multiplication, comme c’est le cas par exemple pour la glutamate- décarboxylase d’E. coli, qui n’est synthétisée par les bactéries qu’en fin de croissance.
Mesure de l’activité cellulaire
On peut mesurer:
• la consommation d’un substrat présent dans le milieu,
• la concentration d’un constituant cellulaire,
• la production d’une molécule excrétée par les cellules,
• la variation d’une propriété physicochimique du milieu.
Il existe en effet une relation stœchiométrique entre les éléments nutritifs majeurs nécessaires à la croissance et les produits formés.
Mesure de la consommation de substrat
Le substrat peut être une source de carbone, une source d’azote, d’oxygène ou un facteur spécifique de croissance.
La crédibilité de la méthode dépend de la précision du dosage, de la présence de substances interférentes et de la masse cellulaire formée par unité de substance nutritive consommée.
Lorsque ce rapport est faible, comme c’est le cas avec les substances carbonées, azotées et l’oxygène, la corrélation avec la masse cellulaire peut être bonne.
La consommation de l’oxygène constitue un bon indicateur de l’activité des micro-organismes aérobies.
Lorsque les conditions expérimentales sont parfaitement standardisées, la vitesse de consommation de l’oxygène peut être corrélée avec la vitesse de la croissance.
Mesure des produits d’excrétion
Au cours de leur développement, les micro- organismes rejettent dans le milieu extérieur les produits de leur métabolisme.
Les métabolites primaires (acides aminés, acides organiques) ne sont pas rejetés en quantité notable car la cellule qui les synthétise en a besoin pour sa croissance.
Ces molécules synthétisées par la cellule ne sont pas de bons indicateurs de la biomasse.
Au contraire, certains produits de catabolisme constituent de véritables déchets dont la cellule doit se débarrasser; leur dosage peut se révéler alors utile.
Il en est ainsi du CO2 qui résulte de l’oxydation des substrats carbonés (sucres notamment) par les microorganismes aérobies et anaérobies.
Mesure des variations physicochimiques du milieu
Les variations physicochimiques du milieu traduisent une évolution de la croissance.
Les modifications de pH, de conductivité électrique, de potentiel d’oxydoréduction et d’énergie calorifique libérée par les cellules peuvent ainsi être mesurées avec intérêt.
Cette méthode ne sert qu’à établir une relation entre la vitesse de croissance et la vitesse de variation du paramètre mesuré.
Mesure du pH.
L’acidification des milieux au cours de la croissance est liée à la dégradation des sucres, tandis que l’alcalinisation dérive de celle des sources azotées.
Les indicateurs de pH sont couramment utilisés en microbiologie pour mettre en évidence un développement microbien ou pour rechercher une activité enzymatique sur un substrat avec libération d’un métabolite acide ou basique.
D’un point de vue quantitatif, c’est surtout l’acidité qui est mise à profit.
Cette méthode, peu sensible, est cependant classiquement utilisée en industrie laitière, pour apprécier la qualité bactériologique du lait.
L’acidité du lait étant d’autant plus grande que la concentration bactérienne est élevée.
Mesure du potentiel d’oxydoréduction.
La baisse du potentiel rédox dans les cultures microbiennes résulte de la raréfaction du milieu en oxygène dissous et de son enrichissement en substances réductrices.
On peut l’évaluer à l’aide d’indicateurs rédox colorés tels que le bleu de méthylène, la résazurine ou encore le chlorure de 2,3,5- triphényltétrazolium.
Le temps nécessaire au virage de l’indicateur est inversement proportionnel au nombre de germes présents.
Ces méthodes sont simples mais peu précises et peu sensibles.
Mesure de la production de chaleur.
Toute réaction chimique s’accompagne d’une variation d’enthalpie.
Les réactions biologiques n’échappent pas à cette règle générale; elles se traduisent, au cours de la croissance microbienne, par un dégagement de chaleur lié à la dégradation des substrats énergétiques.
La microcalorimétrie permet de déceler ces faibles quantités de chaleur libérées par des échantillons de faible volume.
L’accroissement de la puissance thermique est étroitement associé à la croissance de la biomasse.
Croissance en milieu non renouvelé
La croissance des bactéries (dans un erlenmeyer de bouillon nutritif par exemple) est limitée.
Après une durée de culture, variable selon les espèces, elle s’arrête.
Ceci est dû au fait que l’on travaille avec un volume limité de milieu et donc avec des quantités précises et limitées de nutriments.
Le milieu finit par s’épuiser. C’est ce que l’on appelle la croissance en milieu non renouvelé par opposition à la croissance en milieu renouvelé, technique cherchant à repousser la limite de croissance, à obtenir une croissance continue.
Si la vitesse de croissance restait continuellement constante et maximale, la masse microbienne obtenue, en 48 heures, serait de l’ordre de milliers de fois la masse du globe terrestre.
La croissance est limitée par l’épuisement du substrat ou par l’accumulation de substances toxiques.
La courbe est obtenue en traçant l’évolution de la biomasse en fonction du temps, X = f(t) .
Le graphe représentant le logarithme népérien de la biomasse en fonction du temps, permet d’obtenir une zone linéaire (au niveau de la phase c de la courbe) de coefficient directeur k, dont l’équation peut s’écrire:
Log X = Log Xo + k (t – to)
En tout point de la courbe (X = f(t)) l’accroissement de biomasse peut donc être exprimé en termes de vitesse.
La vitesse de croissance est définie selon la relation
dX/dt = X.μx
Dans cette expression de la vitesse est un facteur dépendant du germe et des conditions de culture.
Ce facteur représente la vitesse de croissance
μ
x= l/X . dX/dt (unité t
-1)
Si cette vitesse est constante, on peut écrire:
Log X: Log X
o+ μ
x.(t - t
o)
La vitesse spécifique de croissance est donc représentée graphiquement par le coefficient directeur de la droite correspondant à la phase c de la courbe.
Elle est donc constante pendant cette phase et est appelée
aussi taux de croissance (ou taux de croissance népérien).
Phases de la croissance:
Différentes phases de la courbe peuvent être définies:
• la phase a où X reste identique à Xo c’est la phase de latence caractérisée par μx = 0;
• la phase b ou phase d’accélération : X augmente, μ augmente
• la phase c où X augmente en fonction du temps de façon exponentielle et Log X est proportionnel à t.
C’est la phase exponentielle où, μ (μmax) est constante et atteint sa valeur maximale dans les conditions expérimentales données
On peut la calculer en déterminant la pente de la droite correspondant à cette phase en prenant deux points d’abscisse t1 et t2 de coordonnées respectives X1 et X2.
On obtiendra alors l’équation:
μmax = (Log X2 – LogX1)/(t2-t1)
Pendant cette même phase on définit le temps de génération, noté G, qui exprime le temps correspondant à un doublement de la biomasse (ou à un doublement de population).
On peut l’exprimer mathématiquement.
D’après la relation (2) on peut écrire, X passant de Xo à 2Xo:
Log2Xo = LogXo + μ (t — to) ;
μ(t – to) = Log2Xo - LogXo = Log2Xo/Xo = Log2
t – to = Log2/μ (G = t – to) le temps de génération G = Log2 / μ
On remarquera que le nombre de divisions (générations) par unités de temps est donc égal à 1/G et donc égal à μ / Log2
G est déterminable graphiquement :
sur la courbe LogX = f(t), on prend deux points en phase exponentielle d’ordonnées respectives LogX et Log2X (ce qui correspond à un doublement de la biomasse).
La différence des abscisses correspondante donnera la valeur du temps de doublement de biomasse, c’est-à-dire du temps de génération G.
μ et G sont les deux paramètres d’état permettant de caractériser une croissance dans des conditions expérimentales déterminées:
•la phase d dite de décélération la croissance de X ralentit, μ diminue;
• la phase e où X est à son maximum et s’y maintient : c’est la phase stationnaire avec μ = 0
•la phase f où X diminue : elle est appelée phase de déclin. Les cellules meurent et l’on pourrait y définir un taux de mortalité.
Physiologie des phases
Phase de latence
C’est la phase pendant laquelle la vitesse spécifique de croissance est nulle, la biomasse n’augmente pas.
Cette phase dure plus ou moins longtemps selon les cas et parfois même n’existe pas, la culture démarrant immédiatement en phase exponentielle.
On a pu constater que, pour une expérience donnée, plus l’inoculum est important, plus la phase de latence est réduite (comme dans les cultures industrielles, par exemple).
Cela peut s’expliquer par un simple problème technique de détection de la biomasse, plus facile si l’inoculum est déjà important.
L’âge des bactéries semble également avoir une influence lorsque des cellules jeunes, de quelques heures, sont introduites dans un milieu neuf, la phase de latence peut être extrêmement courte; elle est, au contraire prolongée avec des bactéries provenant d’une culture en phase stationnaire ou en phase de déclin.
Un inoculum « âgé » peut contenir une grande quantité de cellules mortes et un faible taux de cellules viables qui devront se diviser de nombreuses fois avant de produire un trouble visible.
De plus les bactéries viables sont aussi dans un état physiologique peu favorable, il leur faut le temps nécessaire pour restaurer tous leurs systèmes enzymatiques mis en sommeil pendant leur maintien à l’état non proliférant.
La composition du milieu est un autre facteur.
Si un inoculum cellulaire est prélevé en phase exponentielle de croissance et introduit dans un milieu dont les constituants nutritifs (source de carbone, source d’azote) sont différents, on observe à nouveau une phase de latence.
Celle-ci traduit l’absence d’enzymes nécessaires à l’utilisation de ces nouveaux substrats et la nécessité pour la cellule de les synthétiser.
Une période «d’adaptation enzymatique» est nécessaire pour induire la synthèse de ces nouveaux enzymes.
Phase exponentielle
C’est la phase physiologique par excellence : les bactéries se multiplient sans difficulté.
Pendant cette phase on assiste à la libération de métabolites secondaires d’intérêt industriel (antibiotiques, toxines, etc.).
La vitesse de croissance est constante et maximale dans les conditions utilisées (taux de croissance).
La pente de la droite détermine μ; lui-même sous la dépendance des conditions d’environnement comme la température, le pH, la nature et la concentration des aliments.
Ces facteurs physicochimiques constituent les paramètres d’action de la croissance.
Les facteurs physicochimiques qui conditionnent la nutrition sont les mêmes que ceux qui influent sur la croissance.
Les plus importants sont la température, le pH et le substrat.
La température.
Dans des conditions expérimentales optimales de milieu, de température, de pH, etc., on peut observer trois types de courbes de croissance correspondant aux trois principales catégories de micro-organismes déjà définies précédemment.
•celle des bactéries mésophiles, qui vient d’être décrite;
•celle des bactéries thermophiles, qui se caractérise par une phase de latence très courte, une multiplication explosive avec un μ très élevé, une phase stationnaire très réduite et une phase de dégénérescence brutale qui conduit à 1’autolyse de la culture;
• celle des bactéries psychrophiles ou psychrotrophes, qui s’oppose point par point à la précédente.
La phase de latence est longue, de 2 à 8 jours.
La phase exponentielle progresse avec lenteur; μ est faible.
De même la phase maximale stationnaire peut s’étaler sur de longues périodes. La dégénérescence est lente.
• Le pH: l’influence du pH sur la croissance permet aussi de définir un pH optimal de culture comme pour la température.
• L’Ae: Toute diminution de ce paramètre entraîne un ralentissement de la croissance par action sur les réactions biochimiques faisant intervenir de l’eau.
Le taux de croissance népérien est diminué. On peut déterminer une Ae minimale au-dessous de laquelle la croissance est ralentie voire inhibée.
• Le substrat: La vitesse de croissance d’une espèce bactérienne dépend étroitement du milieu dans lequel on la cultive, c’est-à-dire du substrat.
Ainsi, avec B. subtilis, μ est respectivement de 0,3 et de 2 lorsque le milieu est un soluté synthétique citraté ou un bouillon nutritif.
Phase stationnaire
La phase exponentielle ne dure que quelques heures.
Le milieu devient de moins en moins favorable à la croissance.
Le nombre des cellules viables reste constant.
Il peut correspondre à un équilibre entre le nombre de cellules provenant de la multiplication et le nombre de cellules qui disparaissent par auto-lyse.
Il peut aussi traduire la persistance de bactéries vivantes en l’absence de tout développement.
Cette phase est caractérisée par un μ nul.
En fait, au niveau des cellules, certaines ne se divisent plus alors que d’autres se divisent encore et ceci en nombre égal : les bactéries se maintiennent à un état «non proliférant ».
On peut attribuer ce phénomène à un certain nombre de causes dont l’épuisement du substrat, l’accumulation de déchets toxiques ou l’évolution défavorable de l’environnement physique (dont le pH).
Si elles en ont la capacité, les bactéries peuvent également sporuler.
Cette phase peut durer de quelques heures à plusieurs jours.
La biomasse finale de bactéries, Xf, dépend du milieu et de ses composants.
Phase de déclin
Au cours de cette dernière phase, les bactéries ne se divisent plus.
Beaucoup d’entre elles meurent et sont lysées par les enzymes qu’elles libèrent (autolysines).
Le taux de mortalité peut être constant comme le taux de croissance.
Dans ce cas, il est représenté par une droite, le nombre de cellules détruites étant proportionnel au temps
Dans certains cas, des bactéries survivantes peuvent amorcer une nouvelle phase de multiplication aux dépens des substances libérées par la lyse.
Ce phénomène est connu sous le nom de croissance cryptique.
Phénomène de diauxie
Dans un milieu synthétique contenant un mélange de deux substrats carbonés, on peut observer une courbe anormale diphasique comme si deux croissances se succédaient.
Ce phénomène a été décrit par Monod sous le nom de diauxie.
On peut ainsi classer les sucres en deux groupes :
* G1 : glucose, saccharose, fructose, mannose;
* G2 : maltose, sorbitol, arabinose, inositol.
Seuls les mélanges G1 + G2 donnent un phénomène de diauxie.
On a décrit des phénomènes de triauxie, notamment avec le mélange glucose-glycérol-sorbitol.
CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE
Le contrôle de la croissance microbienne est nécessaire dans beaucoup de situations pratiques, et les avancées considérables en médecine, agriculture, et sciences de l’alimentation ont été faites grâce aux études faites dans ce domaine de la microbiologie.
Le contrôle de la croissance des microorganismes est effectué de deux manières principales :
(1) en tuant des micro-organismes ou (2) en inhibant leur croissance.
