TRAVAUX PRATIQUES DE GENETIQUE
(Semestre 4)
TP 1
GENETIQUE D’UN CHAMPIGNON MICROSCOPIQUE A TETRADES NON ORDONNEES.
Année universitaire : 2019 - 2020
UNIVERSITE HASSAN II- CASABLANCA
FACULTE DES SCIENCES BEN M’SIK Département de Biologie
Tétrade non ordonnée
4 spores haploïdes
Saccharomyces cerevisiae
1. Intérêts de saccharomyces :
Saccharomyces cerevisiae est une levure de brasserie et de boulangerie. C’est un champignon ascomycète unicellulaire dont la cellule mesure 5 à 10 μm de longueur. Cet organisme présente une complexité cellulaire proche de celle des organismes supérieurs, ce qui le rend idéal pour des études génétiques et biochimiques. C’est un eucaryote, son noyau possède 18 chromosomes et subit mitose et méiose. Son cytoplasme possède un système mitochondrial.
Saccharomyces peut être cultivée, comme d’autres micro-organismes, sur un milieu solide ou liquide. L’absence de mobilité en milieu solide permet la constitution des clones cellulaires distincts. Saccharomyces a une croissance rapide (une division toutes les 2 à 4 heures), se maintient facilement à l’état haploïde ou diploïde, se repique facilement et peut subir une micromanipulation pour une analyse individuelle des spores produites par méiose.
Les levures sont utilisées comme « ferments » en technologie des industries alimentaires (brasserie, vinification, panification…). Saccharomyces est une des levures les mieux connues.
Sa caractéristique principale est sa capacité de produire l’alcool éthylique avec libération de dioxyde de carbone sous forme de bulles, ce qui fait lever la pate. En général, les levures industrielles n’ont pas de reproduction sexuée et sont polyploïdes, contrairement aux levures de laboratoire qui sont seules adaptées à l’étude génétique.
2. Cycle biologique de saccharomyces :
Saccharomyces cerevisiae se reproduit par bourgeonnement (reproduction asexuée) et par conjugaison (reproduction sexuée).
Les cellules haploïdes proviennent d’ascospores. Elles sont petites et sphériques. Elles se reproduisent par bourgeonnement : un petit bourgeon se forme en un point quelconque de la membrane cellulaire, ce bourgeon grossit et lorsqu’il a atteint un certain volume, le noyau subit une mitose, un des deux noyaux s’engage dans le bourgeon qui s’isole de la cellule-mère ; le bourgeon se détache et par croissance devient une cellule adulte, les cellules haploïdes ont tendance à s’agréger en milieu liquide.
Deux cellules haploïdes de types sexuels différents peuvent « conjuguer » lorsqu’elles sont mises en présence. Les deux conjuguants sont désignés par les sigles a et α. La conjugaison commence par la fusion des deux cytoplasmes (plasmogamie), ce qui donne une cellule à deux noyaux ou dicaryon. Ensuite, les deux noyaux fusionnent (caryogamie) pour donner un zygote 2n (a/ α). Le zygote est une cellule dont le diamètre est le double de celui d’une cellule haploïde adulte. Ces cellules diploïdes peuvent se reproduire par bourgeonnement et ne s’agrègent pas en milieu liquide.
Cycle de croissance et de reproduction de Saccharomyces cerevisiae
Mitoses
Induction par des facteurs sexuels Induction par des
facteurs sexuels
Mitoses Mitoses
Méioses Asque
Fusion et formation du zygote (2n)
Ascospore de signe a Ascospore de
signe α
Mitoses
Le retour à la phase haploïde se fait par méiose. Les cellules diploïdes qui subissent la méiose vont donner naissance à quatre cellules-filles haploïdes appelées spores ou ascospores du fait de leur localisation dans un sac appelé asque. Les spores sont en disposition tétraédrique et ne sont donc pas ordonnées dans l’asque.
La plupart des caractères étudiés chez les levures n’est pas directement observable et nécessite des tests particuliers.
Une levure « normale » (=sauvage) peut se développer et se multiplier sur un milieu chimiquement très simple (milieu minimum). La souche est dite « prototrophe ».
Certaines des souches (mutantes) sont incapables de se développer sur ce milieu minimun.
Pour leur développement, ces levures nécessitent l’addition d’un ou plusieurs produits (acides aminés, bases) au milieu minimum. La souche est dite « auxotrophe ».
Le mileiu nutritif sur lequel toute les souches de levures sont capables de se développer est qualifié de milieu complet.
3. Protocole expérimentale :
La levure peut être cultivée facilement et en masse. Il est donc possible d’analyser un grand nombre d’individus et de déceler un événement génétique rare.
L’analyse directe des produits de méioses présente de nombreux atouts pour l’analyse génétique :
➢ L’absence de relation dominance-récessivité. Le phénotype exprime directement le génotype.
➢ Certains caractères des spores sont directement visibles tels que la couleur, la taille, la forme, (visible au microscope). Ceci évite de devoir mettre les spores en culture pour révéler les phénotypes.
➢ La possibilité d’analyser une seule méiose à la fois (analyse d’une tétrade).
La méthode consiste à tester pour la croissance sur divers milieux sélectifs : - Les souches de départ (haploïdes).
- Les cellules diploides issues des croisements de 2 souches (zygotes).
- Les spores obtenues par dissection des asques après méiose.
Les milieux utilisés sont :
➢ Milieu complet (MC)
➢ Milieu minimum (Mm)
➢ Mm additionné de l’un et/ou l’autre produit correspondant aux auxotrophies des souches révélées par les tests de départs.
Analyse génétique de deux caractères chez Saccharomyces cerevisiae : a) Souches utilisées :
Souche 1 = S1 (souche sauvage) Souche 2 = S2 (signe sexuel a) Souche 3 = S3 (signe sexuel α)
b) Test des souches de départ et des produits du croisement de ces souches (zygotes) :
Les boîtes de pétri, contenant chacune un type de milieu sélectif donné, ont été ensemencées avec chacune des souches 1, 2, 3 et les zygotes résultant du croisement (S2XS3) (voir fiche 1).
Les colonies blanches, circulaires, légèrement bombées sont le résultat de la multiplication des cellules attestant de la croissance de la souche sur le milieu.
En l’absence de croissance, seule la trace du dépôt de l’ensemencement est visible.
1. Reporter les résultats des tests de croissance en indiquant par un (+) la présence de la croissance et par un (-) l’absence de croissance des 3 souches parentales et des diploïdes sur les 5 milieux sélectifs dans le tableau 1. Déduire les phénotypes des souches testées.
2. Que révèle le phénotype des diploïdes ?
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c) Analyse des tétrades :
Après avoir mis 18 clones diploïdes à sporuler, leurs 18 tétrades respectives (de 1 à 18) ont été disséquées. De chaque tétrade sont isolées les 4 spores (A, B, C, D). Après croissance sur Mc, les clones correspondants ont été répliqués sur les milieux sélectifs (Mm, Mm + Cys, Mm + Pro et Mm + Cys + Pro) (voir Fiche 2, 3 et 4).
TABLEAU 1
d)
Observation et interprétation :
3. Reporter les résultats des tests de croissance des spores sur les 5 milieux sélectifs dans le tableau 2 (boites n° 6 à 20) et écrire les phénotypes des spores.
N° Spores Mm Mm + Cys
Mm + Pro
Mm + Cys
+ Pro Phénotypes Génotypes Type
1
A B C D 2
A B C D 3
A B C D 4
A B C D 5
A B C D 6
A B C D 7
A B C D 8
A B C D 9
A B C D
TABLEAU 2:
N° Spores Mm Mm + Cys
Mm + Pro
Mm + Cys
+ Pro Phénotypes Génotypes Type
10
A B C D 11
A B C D 12
A B C D 13
A B C D 14
A B C D 15
A B C D 16
A B C D 17
A B C D 18
A B C D
4. Quel type de ségrégation observe-t-on pour chacun des marqueurs ? En déduire le nombre de gène(s) muté(s) par caractère.
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5. Ecrire les génotypes des 2 souches parentales et des spores (sur le tableau 2) obtenues après le croisement.
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6. En déduire le type de tétrade (DP, DR ou T) sur le tableau 2.
7. Etudier la relation de liaison ou d’indépendance entre les gènes et établir la carte factorielle.
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8. A l’aide d’un schéma précis et complet, expliquer la formation d’un asque DR
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Compte rendu TP1
Analyse génétique de deux caractères chez Saccharomyces cerevisiae :
Nom et prénom : Date : Groupe :
1. Reporter les résultats des tests de croissance en indiquant par un (+) la présence de la croissance et par un (-) l’absence de croissance des 3 souches parentales et des diploïdes sur les 5 milieux sélectifs dans le tableau 1. Déduire les phénotypes des souches testées.
2. Que révèle le phénotype des diploïdes ?
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3. Reporter les résultats des tests de croissance des spores sur les 5 milieux sélectifs dans le tableau 2 (boites n° 6 à 20) et écrire les phénotypes des spores.
N° Spores Mm Mm + Cys
Mm + Pro
Mm + Cys
+ Pro Phénotypes Génotypes Type
1
A B C D 2
A B C D 3
A B C D 4
A B C D 5
A B C D 6
A B C D TABLEAU 1
TABLEAU 2
N° Spores Mm Mm + Cys
Mm + Pro
Mm + Cys
+ Pro Phénotypes Génotypes Type
7
A B C D 8
A B C D 9
A B C D 10
A B C D 11
A B C D 12
A B C D 13
A B C D 14
A B C D 15
A B C D 16
A B C D 17
A B C D 18
A B C D
4. Quel type de ségrégation observe-t-on pour chacun des marqueurs ? En déduire le nombre de gène(s) muté(s) par caractère.
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5. Ecrire les génotypes des 2 souches parentales et des spores (sur le tableau 2) obtenues après le croisement.
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6. En déduire le type de tétrade (DP, DR ou T) sur le tableau 2.
7. Etudier la relation de liaison ou d’indépendance entre les gènes et établir la carte factorielle.
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8. A l’aide d’un schéma précis et complet, expliquer la formation d’un asque DR
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