Généralités (1)

PHYSIQUE CELLULAIRE

FUSION MEMBRANAIRE (1) GÉNÉRALITÉS

Jean-Pierre HENRY

17 Octobre 2008

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

1- Trafic membranaire intracellulaire

La voie de sécrétion

• Le transfert entre compartiments intra-cellulaires se fait par des vésicules

• Bourgeonnement du

compartiment donneur, transport, puis fusion avec le compartiment accepteur

• Centrifuge: voie de sécrétion, terminée par la fusion avec la

membrane plasmique: exocytose

• Centripète: voie d’endocytose

La voie de sécrétion

• Sécrétion de protéines membranaires fluorescentes

Fusion dans la voie d’endocytose

• Fusion endosome-endosome

• Marquage Rab5, protéine de la membrane des endosomes

Importance physiologique de l’exocytose

• La sécrétion constitutive est importante pour

– Le renouvellement des composants de la membrane cellulaire

– La communication cellulaire

• La sécrétion régulée est à la base de la

communication cellulaire neuronale ou endocrine

• Il existe d’autres formes de sécrétion:

– Sécrétion à partir des lysosomes – La réparation membranaire

– Sécrétion des exosomes

Réparation membranaire

• Une lésion membranaire permet une entrée de Ca²⁺

• La montée de Ca²⁺ induit des fusions membranaires

• L’apport de membrane permet de colmater la brèche

Formation et fusion des exosomes

• Les exosomes se forment par bourgeonnement à partir de la membranes lysosomes

• Formation de

« multivesicular bodies »

• Ils sont sécrétés par

exocytose des lysosomes

• La topologie est inverse d’une exocytose directe

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

2- La fusion virale

Infection par des virus enveloppés

• De nombreux virus sont

enveloppés par une membrane, issue de la cellule d’origine et portant des protéines virales

• L’infection peut se faire par fusion avec la membrane plasmique (A, SIDA), ou par fusion avec une membrane endosomiale, après endocytose (B, virus de la grippe)

• Les protéines de l’enveloppe

assurent la spécificité cellulaire et la fusion membranaire

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

3- La fusion cellule-cellule

Fusions cellule-cellule

au cours du développement

• Les fusions peuvent être hétérotypiques: fécondation

• Elles peuvent être homotypiques: ex. fusion des myoblastes. Les noyaux sont en bleu et l’actine en vert (expérience in vitro)

Caractéristiques des fusions membranaires physiologiques

• Les fusions sont, en général, très spécifiques:

– À l’intérieur de la cellule, il existe des compartiments donneurs et accepteurs

– Les fusions cellules-cellules participent au développement

• Les fusions sont, en général, très régulées:

– Régulation spatiale: l’exocytose peut se faire à des sites bien déterminés

– Régulation temporelle: dans les neurones, la fusion peut avoir lieu en moins d’une ms

Quelles sont les protéines impliquées? Sont-elles les mêmes dans tous les cas

ASPECTS PHYSIQUES DE LA FUSION MEMBRANAIRE

Survol historique

Les différentes forces mises en jeu

• Forces répulsives:

– Effets stériques: ondulation des membranes (Hellfrich) – Effets électrostatiques: charges des têtes polaires des

phospholipides, forces d’hydratation

• Forces attractives:

– Forces hydrophobes, type Van der Wals

 Les forces attractives l’emportent à très faible distance

Mesure des forces: Surface Forces Apparatus JN Israelachvili

• Bicouches lipidiques

déposées sur 2 lames de mica

• Géométrie: 2 cylindres croisés

• Distances mesurées par interférométrie (≈1Å)

C A Helm et al(1992) Biochemistry 31, 1794

Adhésion et fusion par SFA

• Approche de 2 bicouches de PC d’œuf

• En C, les 2 couches entrent en contact et il apparaît une singularité

• L’extension de la singularité est interprétée comme une hémifusion

• Ce phénomène n’est pas observé avec de la PC pure

Adhésion et fusion par SFA

• Le processus adhésion-fusion requiert une proximité des membranes (quelques nm)

• Les forces intermembranaires qui régissent

l’adhésion ne sont pas suffisantes pour induire la fusion

• La fusion est contrôlée par l’attraction hydrophobe entre les chaînes carbonées exposées à la phase aqueuse

• L’exposition nécessite un « remodelage » de la membrane: défaut, déplétion, augmentation de la température,stress osmotique

Le modèle du pédoncule

• Le processus de fusion passe par deux intermédiaires remarquables:

• La formation d’un pédoncule (stalk) correspondant à l’hémifusion (fusion des deux monocouches en cis)

• La formation d’un pore correspondant à la fusion des monocouches en trans

• Le pédoncule initial peut donner lieu à un diaphragme

• L’extension du pore conduit à la fusion totale.

(Chernomordik and Kozlov (2008) Nature Struct Mol Biol, 15, 675)

Analyse théorique du modèle

• Le modèle suppose le re-modelage de la bicouche phospholipidique. Quel est le coût énergétique?

• Deux principales approches: i) étude macroscopique du film continuu; ii) modélisation moléculaire

• L’énergie correspondant aux fluctuations thermiques de la membrane a été évaluée à 40 kT

• L’énergie du pédoncule selon le modèle est variable selon la nature du phospholipide; pour le DOPC, elle est de l’ordre de 45 kT et pour DOPE, elle est

négative

• La formation du pédoncule n’est pas « hors de prix »

Structure théorique du pédoncule

• a) et b) obtenues par l’approche des milieux continus (énergies de courbure, tilt)

• c) obtenue par modélisation moléculaire

• Dans ces modèles, il n’y a aucun « vide » entre les molécules, mais un tilt des chaînes carbonées

• La courbure des monocouches est importante

Courbure des membranes: courbure

spontanée, géométrie des phospholipides

• Les phospholipides sont classés en 3 groupes selon leur géométrie :

• Les cônes inversés (grosse tête

polaire, ex.: LysoPC) favorisent une courbure positive de la

monocouche

• Les formes cylindriques (PC)

donnent des monocouches planes

• Les cônes (tête compacte, ex.: PE, DAG et acide arachidonique)

favorisent une courbure négative

Effet de la courbure spontanée sur la fusion

-

Courbure du pédoncule:

monocouche cis

facilite inhibe

Effet PL sur la fusion

PE, AA LysoPC

Lipide

inhibe facilite

Effet PL sur la fusion

+

Courbure du pore:

monocouche trans

- +

Courbure monocouche

Cône Cône inversé

Géométrie

Approche expérimentale

(Chernomordik et al (1995) Biophys J, 69, 922

cis trans

• Une cuve comporte 2 compartiments séparées par une membrane de téflon, percée d’un trou

• On dépose une bicouche plane au niveau du trou

• Des liposomes comportant une porine sont introduits dans un compartiment (cis)

• On impose un voltage entre les compartiments et la fusion correspond à un courant

Approche expérimentale (2)

• La cuve contient 20 mM Ca²⁺ (agrégation des vésicules sur la bicouche)

• A t=0, on ajoute en cis 270 mM urée (stress osmotique qui entraîne des fusions

• A,B, C: additions en cis; D,E,F: additions en trans

• L’acide arachidonique en trans bloque les

fusions

•La LysoPC bloque en cis et stimule en trans

Approche expérimentale (3)

• Les liposomes contiennent de la Rh-PE quenchée dans leur membrane et de la calcéine (soluble) dans la lumière

• On observe une dilution de la Rh-PE sans dilution de la calcéine

• Interprétation: hémifusion

Conclusions

• La fusion membranaire nécessite une approche des membranes jusqu’à quelques nanomètres

• La courbure des membranes est un paramètre important

• D’autres paramètres sont: la tension de membrane, la composition chimique

• Deux intermédiaires ont été mis en évidence: le pédoncule et le pore de fusion

LA FUSION VIRALE

Un modèle « simple » de fusion de membranes biologiques

Mécanisme de la fusion virale

• La membrane virale comporte des protéines qui déterminent la spécificité cellulaire (étape de

reconnaissance)

• La membrane virale comporte un système de fusion membranaire (pas de participation de la membrane cible)

• Le système fusogène doit être activé: acidité du compartiment endosomial, protéases

• La fusion permet l’introduction du programme génétique du virus dans la cellule

Le virus de l’influenza (grippe)

• La membrane du virus comporte des pointes (spikes) qui

reconnaissent l’acide sialique de glycoprotéines cellulaires

• Le virus est internalisé dans des vésicules endocytotiques

• Il s’accumule dans des lysosomes (pH≈5)

La protéine des pointes HA (hémagglutinine)

• La protéine HA est

protéolysée en HA₁ et HA₂

• La pointe est formée d’un trimère de (HA₁-HA₂), à gauche. La membrane virale est en bas et le site de reconnaissance en haut

• HA₁:site de reconnaissance

• HA₂: insertion membrane virale (Nter), peptide de fusion (Cter, orange)

Structure à pH7: peptide de fusion (hydrophobe) masqué

A pH5, HA

change de conformation

• Les structures de HA₂ sont différentes à

pH5 et pH7

• A pH5, structure en bâtonnet: boucle B se structure, peptide de fusion accessible

• Le peptide d’ancrage et le peptide de

fusion sont voisins

• Structure allongée intermédiaire

Mécanisme hypothétique de fusion

• L’activation se fait par protéolyse, puis par acidification

• La structure intermédiaire est caractérisée par des interactions coil-coiled et l’insertion du peptide de fusion

• Le repliement correspond à une hémifusion

• Le pore de fusion est bordé par des protéines HA₂ en épingle à cheveux

(Sapir et al, 2008, Dev Cell, 14, 11)

Mise en évidence de l’hémifusion:

fusion de cellules exprimant HA avec une bicouche plane (1)

• La bicouche contient Rh-PE quenchée; elle est horizontale et sépare 2 compartiments à V imposé

• (Haut) HA native, trans

membranaire; (Bas) HA-GPI, ancrée dans le feuillet externe

• La fusion est induite par

protéolyse, puis acidification

• Conductance:fusion,

fluorescence:continuité des membranes

(Melikyan et al, 1995, J Cel Biol, 131, 679)

Mise en évidence de l’hémifusion:

fusion de cellules exprimant HA avec une bicouche plane (2)

• Avec HA-wt, on observe une fusion complète

– Pores de fusion réversibles (2-20 nS)

– Extension: 1µS, soit ~ 1µm

• Transfert de fluorescence après formation du pore stable

• Avec GPI-HA, pas de pore et transfert de fluorescence:

hémifusion

• L’ouverture du diaphragme requiert de stresser les 2 monocouches

L’hémifusion précède la fusion protéine fusogène du VIH

• On utilise un pseudo virus doublement marqué (jaune)

– Membrane lipidique DID (rouge)

– NC-GFP, protéine soluble

• Fusion avec des cellules

• Vert: rouge disparu; fusion lipides (tête de flèche, flèche)

• Vert disparaît:fusion complète

(Markosyan et al, 2005, Mol Biol Cell 16, 5502)

Protéines de fusion de classe II le virus de la forêt de Semliki

• Alphavirus enveloppé à ARN

• A l’extérieur, réseau de

protéines régulier, E₁ et E₂

• La protéine E₁ est fusogène

• Structure très différente de HA (feuillets β)

• Ancrage transmembranaire en C-ter; peptide fusogène interne

• A pH7, le peptide est à l’interface E₁E₂ et il est masqué

• Les protéines sont parallèles à la membrane

Comparaison de HA

et E

• La membrane virale est en bas, le récepteur cellulaire (HA₁, E₂) est en haut

• Le peptide fusogène (N-ter à gauche, interne à droite) est masqué dans les deux cas

Structure de E

à pH5

• Le C-ter (hydrophobe) a été coupé, E₁ a été acidifié en présence de liposomes, puis cristallisé avec un détergent

• La membrane figurée est la membrane cible (lysosome)

• On observe un changement de conformation et une trimérisation

(Gibbons et al, 2004, Nature, 427, 320)

• ^{A gauche:}

monomère à pH7

• Au centre:

monomère pH5

• A droite: Trimère

Mécanisme hypothétique de fusion (1)

• a) au repos, le peptide fusogène (orange) est

masqué, à l’interface E₁E₂

• b) à pH5 (lysosome), le complexe E₁E₂ est

dissocié, le peptide est exposé

• c) E₁ trimérise et le peptide contacte la membrane du lysosome

basé sur la comparaison des structures 2D et 3D à pH5 et 7

Mécanisme hypothétique de fusion (2)

• d) les trimères s’organisent en penta et hexamères en déformant la membrane cible

• e) le rapprochement des paries basale et apicale du complexe tire sur les

monocouches en cis

• f) celles-ci fusionnent (hémifusion)

• g) dans la structure finale, il y a ouverture du pore de fusion

Conclusion sur la fusion virale

• La fusion n’implique en général qu’une protéine de la membrane du virus (applications en biotechnologies)

• Il y a plusieurs types de protéines de fusion avec des séquences et des structures différentes

• Le peptide de fusion peut être terminal ou interne (non transmembranaire)

• La fusion implique un rapprochement mais aussi une déformation des membranes, obtenus par

changement de conformation (et oligomérisation)

• On peut mettre en évidence des intermédiaires

« hémifusion » et « pore de fusion »