Généralités (2)

PHYSIQUE CELLULAIRE

FUSION MEMBRANAIRE (2) GÉNÉRALITÉS

Jean-Pierre HENRY

28 Octobre 2008

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

1- Trafic membranaire intracellulaire

La voie de sécrétion

• Le transfert entre compartiments intra-cellulaires se fait par des vésicules

• Bourgeonnement du

compartiment donneur, transport, puis fusion avec le compartiment accepteur

• Centrifuge: voie de sécrétion, terminée par la fusion avec la

membrane plasmique: exocytose

• Centripète: voie d’endocytose

La voie de sécrétion

• Sécrétion de protéines membranaires fluorescentes

Fusion dans la voie d’endocytose

• Fusion endosome-endosome

• Marquage Rab5, protéine de la membrane des endosomes

Importance physiologique de l’exocytose

• La sécrétion constitutive est importante pour

– Le renouvellement des composants de la membrane cellulaire

– La communication cellulaire

• La sécrétion régulée est à la base de la

communication cellulaire neuronale ou endocrine

• Il existe d’autres formes de sécrétion:

– Sécrétion à partir des lysosomes – La réparation membranaire

– Sécrétion des exosomes

Réparation membranaire

• Une lésion membranaire permet une entrée de Ca²⁺

• La montée de Ca²⁺ induit des fusions membranaires

• L’apport de membrane permet de colmater la brèche

Formation et fusion des exosomes

• Les exosomes se forment par bourgeonnement à partir de la membranes lysosomes

• Formation de

« multivesicular bodies »

• Ils sont sécrétés par

exocytose des lysosomes

• La topologie est conservée par rapport à une

exocytose directe

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

2- La fusion virale

Infection par des virus enveloppés

• De nombreux virus sont

enveloppés par une membrane, issue de la cellule d’origine et portant des protéines virales

• L’infection peut se faire par fusion avec la membrane plasmique (A, SIDA), ou par fusion avec une membrane endosomiale, après endocytose (B, virus de la grippe)

• Les protéines de l’enveloppe

assurent la spécificité cellulaire et la fusion membranaire

IMPORTANCE PHYSIOLOGIQUE

3- La fusion cellule-cellule

Fusions cellule-cellule

au cours du développement

• Les fusions peuvent être hétérotypiques: fécondation

• Elles peuvent être homotypiques: ex. fusion des myoblastes. Les noyaux sont en bleu et l’actine en vert (expérience in vitro)

Caractéristiques des fusions membranaires physiologiques

• Les fusions sont, en général, très spécifiques:

– À l’intérieur de la cellule, il existe des compartiments donneurs et accepteurs

– Les fusions cellules-cellules participent au développement

• Les fusions sont, en général, très régulées:

– Régulation spatiale: l’exocytose peut se faire à des sites bien déterminés

– Régulation temporelle: dans les neurones, la fusion peut avoir lieu en moins d’une ms

Quelles sont les protéines impliquées? Sont-elles les mêmes dans tous les cas

ASPECTS PHYSIQUES DE LA FUSION MEMBRANAIRE

Survol historique

Les différentes forces mises en jeu

• Forces répulsives:

– Effets stériques: ondulation des membranes (Hellfrich) – Effets électrostatiques: charges des têtes polaires des

phospholipides, forces d’hydratation

• Forces attractives:

– Forces hydrophobes, type Van der Wals

 Les forces attractives l’emportent à très faible distance

Mesure des forces: Surface Forces Apparatus JN Israelachvili

• Bicouches lipidiques

déposées sur 2 lames de mica

• Géométrie: 2 cylindres croisés

• Distances mesurées par interférométrie (≈1Å)

C A Helm et al(1992) Biochemistry 31, 1794

Adhésion et fusion par SFA

• Approche de 2 bicouches de PC d’œuf

• En C, les 2 couches entrent en contact et il apparaît une singularité

• L’extension de la singularité est interprétée comme une hémifusion

• Ce phénomène n’est pas observé avec de la PC pure

Adhésion et fusion par SFA

• Le processus adhésion-fusion requiert une proximité des membranes (quelques nm)

• Les forces intermembranaires qui régissent

l’adhésion ne sont pas suffisantes pour induire la fusion

• La fusion est contrôlée par l’attraction hydrophobe entre les chaînes carbonées exposées à la phase aqueuse

• L’exposition nécessite un « remodelage » de la membrane: défaut, déplétion, augmentation de la température, stress osmotique

Le modèle du pédoncule

• Le processus de fusion passe par deux intermédiaires remarquables:

• La formation d’un pédoncule (stalk) correspondant à l’hémifusion (fusion des deux monocouches en cis)

• La formation d’un pore correspondant à la fusion des monocouches en trans

• Le pédoncule initial peut donner lieu à un diaphragme

• L’extension du pore conduit à la fusion totale.

(Chernomordik and Kozlov (2008) Nature Struct Mol Biol, 15, 675)

Analyse théorique du modèle

• Le modèle suppose le re-modelage de la bicouche phospholipidique. Quel est le coût énergétique?

• Deux approches principales : i) étude macroscopique du film continu; ii) modélisation moléculaire

• L’énergie correspondant aux fluctuations thermiques de la membrane a été évaluée à 40 kT

• L’énergie du pédoncule selon le modèle est variable selon la nature du phospholipide; pour le DOPC, elle est de l’ordre de 45 kT et pour DOPE, elle est

négative

• La formation du pédoncule n’est pas « hors de prix »

Structure théorique du pédoncule

• a) et b) obtenues par l’approche des milieux continus (énergies de courbure, tilt)

• c) obtenue par modélisation moléculaire

• Dans ces modèles, il n’y a aucun « vide » entre les molécules, mais un tilt des chaînes carbonées

• La courbure des monocouches est importante

Courbure des membranes: courbure

spontanée, géométrie des phospholipides

• Les phospholipides sont classés en 3 groupes selon leur géométrie :

• Les cônes inversés (grosse tête

polaire, ex.: LysoPC) favorisent une courbure positive de la

monocouche

• Les formes cylindriques (PC)

donnent des monocouches planes

• Les cônes (tête compacte, ex.: PE, DAG et acide arachidonique)

favorisent une courbure négative

Effet de la courbure spontanée sur la fusion

-

Courbure du pédoncule:

monocouche cis

facilite inhibe

Effet PL sur la fusion

PE, AA LysoPC

Lipide

inhibe facilite

Effet PL sur la fusion

+

Courbure du pore:

monocouche trans

- +

Courbure monocouche

Cône Cône inversé

Géométrie

Approche expérimentale

Chernomordik et al (1995) Biophys J, 69, 922

cis trans

• Une cuve comporte 2 compartiments séparées par une membrane de téflon, percée d’un trou

• On dépose une bicouche plane au niveau du trou

• Des liposomes comportant une porine sont introduits dans un compartiment (cis)

• On impose un voltage entre les compartiments et la fusion correspond à un courant

Approche expérimentale (2)

• La cuve contient 20 mM Ca²⁺ (agrégation des vésicules sur la bicouche)

• A t=0, on ajoute en cis 270 mM urée (stress osmotique qui entraîne des fusions

• A,B, C: additions en cis; D,E,F: additions en trans

• L’acide arachidonique en trans bloque les

fusions

•La LysoPC bloque en cis et stimule en trans

Approche expérimentale (3)

• Les liposomes contiennent de la Rh-PE quenchée dans leur membrane (ligne 1) et de la calcéine

(soluble) dans la lumière (ligne 2)

• On observe une dilution de la Rh-PE sans dilution de la calcéine

• Interprétation: hémifusion

Conclusions

• La fusion membranaire nécessite une approche des membranes jusqu’à quelques nanomètres

• La courbure des membranes est un paramètre important

• D’autres paramètres sont: la tension de membrane, la composition chimique

• Deux intermédiaires ont été mis en évidence: le pédoncule et le pore de fusion