4 Résultats et discussion
4.1 Choix d’une méthode de synthèse
Rappelons que le but de ce travail est d’améliorer la radiosynthèse des acides aminés marqués au fluor-18 (6-[18F]fluoro-L-DOPA 1, 2-[18F]fluoro-L- tyrosine 2, 4-[18F]fluoro-L-phénylalanine 3 et 2-[18F]fluoro-L-phénylalanine 4) pour permettre son implémentation dans un automate de synthèse FASTlab présent dans notre laboratoire suite à une collaboration entre General Electric (GE) et le Centre de Recherches du Cyclotron. La chimie devant être incorporée dans le FASTlab devra être compatible avec le module et les rendements devront être aussi élevés que possible. Le temps de synthèse devra être inférieur à 2 heures (t1/2
18F).
Les principales méthodes de préparation des acides aminés aromatiques marqués au fluor-18 ont été décrites dans la partie bibliographique de ce travail. Au départ de fluor électrophile, la synthèse comporte généralement 3 étapes : marquage d’un précurseur acide aminé protégé ou non, hydrolyse des groupements protecteurs éventuellement présents et purification sur HPLC semi-préparative. La méthode proposée par Namavari en 1992 semble la plus intéressante à mettre en œuvre. Elle permet d’obtenir la FDOPA 1 au départ d’un précurseur organostannique avec un rendement corrigé de 25 % après 50 minutes de synthèse. De plus, cette synthèse a été reprise par de nombreux auteurs afin de l’implémenter sur des automates disponibles ou non dans le commerces (de Vries 1999, Chang 2000, Fuchtner 2008, Kao 2011). Par la voie nucléophile, le fluor-18 est généralement introduit sur un précurseur facile à marquer et le squelette de l’acide aminé est élaboré au cours d’une synthèse multi-étapes ce qui implique une étape énantiosélective pour obtenir le carbone chiral de l’acide aminé avec la bonne configuration. Parmi les différentes méthodes de synthèse énantiosélective proposées dans la littérature pour la préparation de la FDOPA 1, celle impliquant l’alkylation énantiosélective d’un dérivé de la glycine au moyen d’un dérivé halogéné par PTC a été reprise par de nombreux auteurs (Lemaire et al., 1999-2001-2004 ; Zhang et al., 2002 ; Yin et al.
2003 ) fournit un rendement en produit final (25 – 30 %) et l’excès énantiomérique (> 95 %) est remarquable. Cette voie de synthèse a également été automatisée (Shen et al. 2009).
Les principales caractéristiques de ces deux modes de production de la FDOPA 1 sont reprises dans le tableau 10.
Voie électrophile
Voie nucléophile Equation nucléaire
20Ne(d,)18F
18O2(p,n)18F H218
O(p,n)
Nature de la cible Gaz Eau
Activité produite 9,25 - 37 GBq 250 - 1000 mCi
37 - 185 GBq 1 - 5 Ci Agent de fluoration [18F]F2 [18F-] Rendement radiochimique
maximal théorique 50 % 100 %
Quantité de fluor-19 50 - 200 µmol n.c.a.
Activité spécifique 74 MBq/µmol 2 mCi/µmol
> 37 GBq/µmol
> 1 Ci/µmol
Quantité (mg) 2 - 10 n.c.a.
Rendement radiochimique (%) 25 25-30
Excès énantiomérique (%) 97 - 99 97
Temps de synthèse (min) 50 100
Activité théorique disponible en FDOPA 1 (EOS)
1,6 - 6,5 GBq 45 - 180 mCi
0,74 - 40,7 GBq 20 - 1100 mCi Tableau 10 : Comparatif des
méthodes électrophiles et nucléophiles
L’utilisation du fluor [18F]F2 pose divers problèmes. Sa production nécessite l’utilisation d’une cible gazeuse (18O2 ou 20Ne) et la présence de fluor-19 est indispensable dans la cible lors de l’irradiation ce qui entraine une diminution de l’activité spécifique (74 MBq (2 mCi)/µmol). Dans ce cas, l’activité maximale en [18F]F2 pour démarrer une synthèse est de maximum 1 Ci (37 GBq) alors qu’avec la méthode nucléophile, il est possible d’obtenir jusqu’à 10 Ci (370 GBq) de fluorure [18F]F-.
La meilleure synthèse électrophile de FDOPA 1 est décrite dans la littérature par Namavari et al. en 1992 [90]. Son rendement est de 25 % après 50 minutes de synthèse. Pour la voie nucléophile, la méthode proposée par Lemaire et al. en 2004 [160] procède avec un rendement également de l’ordre de 25 % en FDOPA 1. La synthèse est cependant plus complexe à mettre en œuvre puisqu’elle nécessite plusieurs étapes et une durée de 100 minutes. Malgré ce temps de synthèse plus
long, la voie nucléophile est pour diverses raisons nettement plus avantageuse. En effet, l’activité disponible en début de synthèse sous formes de [18F]F- peut être supérieure à 10 Ci (370 GBq). Cette activité élevée est donc compatible avec un temps de synthèse plus long.
Les excès énantiomériques obtenus par la voie électrophile (97 – 99 %) et ceux obtenus par la voie nucléophile (97 %) sont forts similaires. Dans la méthode électrophile, le précurseur de marquage est porteur du carbone chiral avec la bonne configuration alors que la méthode nucléophile implique une étape énantiosélective pour introduire le carbone chiral.
Notons que l’activité spécifique obtenue fin de synthèse par la méthode nucléophile est au minimum 500 fois plus importante que celle obtenue par la méthode électrophile. Une activité spécifique élevée permet d’étudier des récepteurs présents en faible quantité sans risquer de saturer les sites de fixation ou d’induire des perturbations dans le processus métabolique étudié. La faible quantité de produit fluor-19 dans l’injectable est également un avantage du point de vue toxicologique.
En effet, certains de ceux-ci sont extrêmement toxique et ce même en faible concentration (quelques g/l). L’utilisation de composés radiopharmaceutiques produit par voie nucléophile permet d’injecter, si nécessaire, un volume plus important (3 - 4 mL) sans dépasser la quantité au-delà de laquelle le composé froid associé est toxique.
Au vu de ces différentes constatations, la voie nucléophile semble la plus appropriée pour la préparation d’acides aminés marqués au fluor-18. Parmi les nombreuses voies de synthèse évoquées dans la partie bibliographiques de ce travail, l’approche proposée par Lemaire et al. en 1999 résumée dans la figure 68 semble la plus prometteuse. Cette synthèse comporte deux étapes importantes. La première (I) consiste à préparer le dérivé bromé au départ de l’aldéhyde marqué au fluor-18. La seconde (II) consiste à introduire le centre d’asymétrie de la molécule. A notre avis, moyennant certaines modifications, il devrait être possible de la mettre en œuvre dans un automate de synthèse FASTlab (GE).
Figure 68 : Radiosynthèse de la FDOPA 1 par PTC énantiosélective
Cependant avant toute automatisation, les points suivant de la radiosynthèse devront être améliorés:
L’acide bromhydrique gazeux est un agent corrosif difficilement stockable et manipulable qui en cas de fuite peut provoquer des brûlures et des problèmes respiratoires chez les opérateurs ainsi que des dégâts (corrosion) au matériel environnant. L’acide bromhydrique gazeux doit impérativement être remplacé par un réactif plus simple à manipuler
L’excès énantiomérique final dépend directement de la température durant l’étape d’alkylation. La synthèse décrite ci-dessus (Figure 68) nécessite le refroidissement préalable du dérivé halogéné 12 avant son utilisation dans la réaction d’alkylation qui doit impérativement se dérouler à 0°C. Si cette condition n’est pas respectée, les excès énantiomériques en produit final peuvent être relativement faibles (< 80 %). Le temps requis pour refroidir cette solution d’halogénure de benzyle de la température ambiante à 0°C rallonge d’autant la durée de synthèse et de ce fait, l’activité totale disponible pour l’injection chez l’homme en est d’autant réduite.
Idéalement, cette réaction devrait se dérouler à température ambiante. La synthèse et l’étude de nouveaux catalyseurs chiraux s’avère donc indispensable.
Les groupements méthoxy des précurseurs sont difficilement hydrolysables et nécessitent des conditions dures (HI, 200°C, 20 minutes).
Des précurseurs possédant des groupements protecteurs plus labiles que les méthoxy permettraient également de diminuer le temps de la synthèse et ainsi d’accroitre l’activité disponible en fin de processus.
Au cours de ce travail, nous tenterons d’optimiser ces différents points. Les solutions apportées à ces différents problèmes sont présentées dans ce chapitre qui comprend quatre sections. La première décrit les améliorations réalisées pour la préparation de divers halogénures de benzyle marqués au fluor-18. La deuxième est consacrée à la synthèse de nouveaux catalyseurs chiraux et à l’évaluation de leur efficacité dans la réaction d’alkylation. La troisième partie est dédiée à la recherche de nouveaux groupements protecteurs. La dernière est dédiée à l’automatisation de la synthèse ainsi modifiée au moyen d’un automate de synthèse du commerce (FASTlab).
4.2 Préparation des halogénures de benzyle marqués au fluor-18 4.2.1 Généralités
Sur base de l’étude bibliographique réalisée ci-avant, il apparait que la synthèse des halogénures de benzyle marqués au fluor-18 implique le plus souvent la mise en œuvre de trois étapes clés :
Marquage par substitution nucléophile aromatique d’un composé aromatique nitré ou de son sel d’ammonium quaternaire correspondant
Réduction de l’aldéhyde en phase liquide ou sur SPE au moyen d’un agent réducteur
Halogénation de l’alcool [18F]fluorobenzylique obtenu au moyen d’un réactif approprié
Exceptionnellement, cette préparation au départ de l’aldéhyde fluoré peut être réalisée en phase liquide en une seule étape au moyen de diiodosilane. Même si dans ce cas, la synthèse du dérivé halogéné au départ du benzaldéhyde marqué au fluor-18 ne nécessite qu’une étape, cette méthode a été abandonnée car elle était complexe à mettre en œuvre.
D’un point de vue chimique les réactions sur support solide sont particulièrement intéressantes car dans ce cas, la réduction et l’halogénation peuvent être réalisées sur le même support. De plus l’utilisation d’un large excès de ces réactifs est non problématique puisqu’ils sont facilement éliminés.
Cette approche sur support solide est maintenant couramment utilisée pour la conversion de l’aldéhyde en alcool [136, 156, 160, 161, 179, 185-187]. Celui-ci est cependant généralement élué du support avant de poursuivre la synthèse Néanmoins, dans la synthèse nucléophile que nous avons retenue, la préparation du bromure de 2-[18F]fluoro-4,-5-diméthoxybenzyle 12 est entièrement décrite sur la phase solide (Figure 69). Dans cette méthode, l’aldéhyde 9 fixé sur un support solide est réduit par du borohydrure de sodium en solution aqueuse. L’excès d’eau présent sur la cartouche est déplacé au moyen d’hexane. La cartouche est conservée mouillée avec ce solvant avant d’y faire passer un flux d’acide bromhydrique gazeux.
Figure 69 : Préparation des halogénures de [18F]fluorobenzyle sur SPE
Bien que cette approche fournisse le bromure de benzyle avec de bon rendement, la manipulation d’un gaz n’est pas facile à mettre en œuvre surtout pour du matériel destiné à être utilisé en milieu hospitalier. De plus, cette approche n’est pas adaptée à la préparation du bromure de 2-[18F]fluorobenzyle 29 et du bromure de 4-[18F]fluorobenzyle 28, intermédiaires clés requis pour l’obtention de la 4-FPhe 3 et 2-FPhe 4. En effet, dans ce cas le processus s’accompagne d’une perte importante d’activité sous forme de produit gazeux et le rendement en bromure de 2- [18F]fluorobenzyle 29 et du bromure de 4-[18F]fluorobenzyle 28 sont très faibles (± 15 %). Avant de poursuivre cette synthèse d’acides aminés, il s’avère donc nécessaire d’optimiser cette étape.
4.2.2 Marquage du [18F]fluorobenzaldéhyde
La première étape de la synthèse des halogénures de benzyle marqués au fluor-18 nécessite le marquage d’un [18F]fluorobenzaldéhyde. Cette étape de substitution nucléophile sur aromatique au départ d’un précurseur ammonium ou nitro est actuellement réalisable dans le diméthylsulfoxyde sans problème particulier. La durée du marquage est cependant un peu plus courte au départ d’un sel d’ammonium (2,5 min / 15 min).
Certains aldéhydes pouvant être obtenus au départ de 2 précurseurs différents (dérivé nitré et sel d’ammonium quaternaire). Les précurseurs testés au cours de ce travail pour la synthèse des acides aminés aromatiques marqués au
fluor-18 sont décrits dans le tableau 11 et leurs structures décrites dans la figure 70.
Différents précurseurs peuvent être utilisés pour obtenir le même acide aminé aromatique marqué au fluor-18.
Figure 70
Précurseurs [18F]fluorobenzaldéhydes Acide aminés H OMe NMe3+
NO2 18
F Rendement de marquage (d.c., %) 31
R2, R3,
R4
- R1 - 34 R1
69 ± 3
(n = 5) 2-FPhe 4
33 R2, R3, R4
- - R1 34 R1
73
(n = 2) 2-FPhe 4
32 R1, R2,
R4
- R3 - 6 R3
73 ± 4
(n = 15) 4-FPhe 3
5 R1, R2,
R4
- - R3 6 R3
71 ± 5
(n = 25) 4-FPhe 3 30 R2,
R4, R3 R1 - 23 R1
74 ± 5
(n=50) FTYR 2
16 R2 R3, R4 R1 - 9 R1
50 ± 5
(n = 10) FDOPA 1
8 R2 R3, R4 - R1 9 R1
61 ± 4
(n = 5) FDOPA 1
7 R2
OCH2O
(R3,R4) - R1 35 R1
70 ± 3
(n = 3) FDOPA 1
Tableau 11 : Précurseurs et rendements de marquage corrigé de la décroissance (d.c.)
La procédure utilisée pour réaliser la préparation des différents [18F]fluorobenzaldéhydes comporte deux étapes. La première consiste à activer le fluor-18 et la seconde à réaliser l’introduction de ce fluor-18 sur le noyau aromatique. Comme précédemment expliqué, le fluor-18 récupéré du cyclotron en solution dans l’eau enrichie n’est pas réactionnel. La technique permettant d’augmenter sa réactivité implique la fixation du fluorure [18F]F- en solution dans l’eau sur une résine échangeuse d’ions (cartouche QMA; Waters) et l’élution de celle-ci avec 500 µL d’une solution composée d’eau et d’acétonitrile (v/v 1/1) contenant du carbonate de potassium (0.1 M) et du cryptand K222 (0.1 M). L’éluat obtenu est évaporé à 110°C sous flux d’azote puis séché de manière azéotropique avec de l’acétonitrile (3 X 100 µL) pour finalement obtenir du fluorure « anhydre » (1000 - 10000 ppm eau).
Les différents précurseurs préalablement solubilisé dans le DMSO sont alors ajoutés au résidu obtenu après évaporation. Les conditions de marquage des composés décrits dans le tableau 10 sont légèrement différentes selon la nature du groupement partant (NO2, NMe3
+). La réaction est réalisée soit pendant 3 minutes au départ des précurseurs ammoniums soit en 15 minutes au départ des dérivés nitrés.
Les rendements de marquage ont été déterminés en tenant compte de la pureté radiochimique du produit marqué. Celle-ci a été déterminée par des analyses TLC et HPLC. Pour ce calcul de rendement, l’activité en solution a également été mesurée pour tenir compte du fluor-18 adsorbé sur les parois du réacteur de marquage. Le rendement de marquage a finalement été déterminé en utilisant la formule ci-dessous. Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 11:
Le marquage au départ de deux précurseurs différents (sel d’ammonium quaternaire ou dérivé nitré) fournit le même [18F]fluorobenzaldéhyde. Par exemple le trifluorométhanesulfonate de 2-formyl-N,N,N-triméthylbenzenaminium 31 et le 2- nitrobenzaldéhyde 33 permettent d’obtenir le 2-[18F]fluorobenzaldéhyde 34. Le trifluorométhanesulfonate de 4-formyl-N,N,N-triméthylbenzenaminium 32 et le 4- nitrobenzaldéhyde 5 fournissent le 4-[18F]fluorobenzaldéhyde 6. Le 6- [18F]fluorovératraldéhyde 9 est obtenu au départ du trifluorométhanesulfonate de 2- formyl-4,5-diméthoxy-N,N,N-triméthylbenzenaminium 16 et du 6- nitrovératraldéhyde 8. A l’exception du composé 9, les rendements sont généralement élevés.
Récemment Machulla et son équipe ont décrit le N,N-diméthylformamide (DMF) comme un solvant plus approprié que le DMSO pour réaliser le marquage des benzaldéhydes [165, 192]. Cependant, dans notre cas l’utilisation de DMF n’a pas permis d’obtenir de meilleurs rendements en [18F]fluorobenzaldéhydes.
Les précurseurs ammoniums quaternaires peuvent générer des rejets gazeux radioactifs sous forme de [18F]fluorométhane lors de l’étape de marquage [193].
Lors de l’utilisation de ce type de précurseur, le bilan d’activité réalisé à la fin de la synthèse est supérieur à 95 %.
4.2.3 Préparation des alcools [18F]fluorobenzylique
L’exploitation de la stratégie sur support solide à la préparation des halogénures de benzyle marqués au fluor-18 implique la fixation de l’aldéhyde préalablement marqué sur une cartouche en phase inverse (SPE) de type C18. Des cartouches contenant différentes quantité de phase ont été évaluées (400 mg et 1 g).
Les détails de ces investigations sont repris dans le paragraphe dédiés aux halogénures de benzyle.
Après marquage, la solution de DMSO contenant le [18F]fluorobenzaldéhyde a été diluée dans l’eau (20 mL) et la solution résultante passée au travers d’une cartouche SPE C18. Ceci s’accompagne de la fixation du [18F]fluorobenzaldéhyde sur le support solide tandis que le DMSO et les réactifs n’ayant pas réagi ([18F]F-, carbonate de potassium, précurseur ammonium quaternaire, K222) passent au travers de la cartouche. Lors de l’utilisation d’un précurseur nitré, ce dernier reste fixé sur la cartouche et suit la même chimie que le dérivé [18F]fluoré. Lors de la purification finale du composé radiopharmaceutique, il faudra séparer le composé marqué au fluor-18 du dérivé nitré. L’aldéhyde fixé sur SPE est ensuite converti en alcool benzylique par passage d’une solution aqueuse de borohydrure de sodium (50 mg/mL) comme décrit dans la partie bibliographique de ce travail. Cette méthode n’est pas vraiment innovante puisqu’elle est déjà en usage au Centre de Recherches du Cyclotron mais de par sa facilité, nous avons décidé de la conserver.
Pour l’étape suivante d’halogénation, contrairement à beaucoup de méthodes décrites dans la littérature, l’alcool [18F]fluorobenzylique est maintenu sur la cartouche SPE pour l’étape subséquente d’halogénation.
4.2.4 Intermédiaires halogénures
Les principales méthodes de synthèse d’halogénure de benzyle [18F]fluorés décrites dans la littérature ont été présentées dans la partie bibliographie de ce travail. Nous avons notamment vu que les bromure de benzyle peuvent être préparés soit au moyen d’acide bromhydrique en solution aqueuse (HBr 48%) [191], soit
d’acide bromhydrique en solution dans un solvant organique (HBr dans l’éther diéthylique) [186] soit en phase gazeuse (HBrg) [156, 160].
L’acide bromhydrique en solution dans l’éther est incompatible avec la synthèse sur support solide puisque dans ce cas, le dérivé bromé serait plus que probablement élué du support solide. L’acide bromhydrique gazeux est un réactif corrosif et difficile à manipuler rendant l’automatisation difficile. Dès lors, nous avons décidé d’utiliser l’acide bromhydrique en solution aqueuse sur support solide.
En effet, la synthèse sur le support solide comme nous l’avons évoqué précédemment possède plusieurs avantages.
Pas ou peu de purifications nécessaires
Après réduction, l’alcool précédemment obtenu est conservé sur le support solide
Le dérivé halogéné devrait être disponible en fin de préparation dans un faible volume (1,5 - 2,5 mL) du solvant organique de notre choix.
Aucune étape d’évaporation ne devrait être requise ce qui simplifiera d’autant l’automatisation
La stratégie envisagée est résumée sur le schéma suivant (Figure 71).
Figure 71 : Stratégie mise en œuvre pour la préparation du bromure de [18F]fluorobenzyle 24 sur SPE
Cette approche a tout d’abord été utilisée pour préparer le bromure de benzyle de la 2-[18F]fluoro-L-tyrosine 2. Pour ce faire, le 2-[18F]fluoro-4- méthoxybenzaldéhyde 23 a d’abord été préparé à partir du sel d’ ammonium par substitution nucléophile au moyen de fluor-18 et réduit sur support solide comme décrit ci avant pour obtenir l’alcool 2-[18F]fluoro-4-méthoxybenzylique 25.
Pour l’étape d’halogénation subséquente, l’alcool benzylique a été gardé sur le support solide et une solution aqueuse d’acide bromhydrique (HBr 48%) passée directement sur la cartouche. Après 5 minutes de réaction à température ambiante, l’activité fixée sur la cartouche a été éluée au moyen de 2 mL d’acétonitrile. Ce brut de réaction a ensuite été analysé par TLC et HPLC. Ces analyses montrent la présence d’un composé majoritaire possédant un Rf (0,88 ; DCM/EtOAc 90/10) et
un temps de rétention (3,1 min ; 70/30 ACN/eau, 1 mL/min) correspondant à la référence froide du bromure de 2-[18F]fluoro-4-méthoxybenzyle 24. Dans ce cas, un séchage préalable à l’hexane comme précédemment décrit lors de l’utilisation de HBr gazeux n’est plus nécessaire.
Le rendement de conversion de l’aldéhyde [18F]fluoré en bromure de benzyle est supérieur à 85 % et la pureté radiochimique est de 89 %. Les « wastes » correspondant à l’étape de réduction et d’halogénation contiennent très peu d’activité et les analyses réalisées dessus montrent que l’activité perdue l’est uniquement sous forme de fluorures [18F]F-.
Dans un souci d’optimisation du temps de réaction, la cinétique de la réaction a été étudiée. Pour cela, l’acide bromhydrique a été laissé en contact avec la cartouche durant des temps plus courts (5; 3; 1; 0,5 min). L’activité est ensuite éluée de la cartouche au moyen d’acétonitrile. Les analyses ont été réalisées comme décrit ci-dessus et les résultats ne montrent pas de différences significatives de rendements entre 30 secondes et 5 minutes de réaction. Tous les résultats acquis au cours de ce travail l’ont été après 2 minutes.
De ces résultats, il apparait que l’acide bromhydrique gazeux initialement utilisé par Lemaire et al. peut-être substitué avantageusement par une solution aqueuse d’acide bromhydrique concentré. Des études complémentaires réalisées au moyen d’acide de concentration inférieure (24%) fournissent un mélange d’alcool benzylique et de dérivé halogéné dans un rapport 80/20. La réaction nécessite donc l’utilisation d’acide concentré.
Lorsque le bromure de 2-[18F]fluoro-4-méthoxybenzyle 24 est élué de la cartouche avec un solvant organique non miscible à l’eau tel que le toluène, dichlorométhane, éther diéthylique,…, une seconde phase apparait (300 – 400 µL).
Cette phase aqueuse à caractère acide est gênante pour la réaction d’alkylation que nous envisageons de réaliser par la suite puisque cette réaction nécessite un milieu fortement basique. De plus, la base de Schiff 19 nécessaire à la réaction s’hydrolyse en milieu acide.
Pour résoudre ce problème diverses solutions ont été envisagées
La plus simple à mettre en œuvre consiste à laver la cartouche après l’halogénation avec un faible volume d’eau (< 5 mL). Lors de cette opération, aucune perte d’activité n’a été observée. L’activité a ensuite été éluée de la SPE soit au moyen de toluène soit d’acétonitrile. Dans les deux cas, l’activité décrochée (15 - 20 %) est présente essentiellement sous forme d’alcool 2-[18F]fluoro-4-
méthoxybenzylique 25. La présence d’eau dégrade le dérivé halogéné. Cette voie a donc été abandonnée.
Nous avons alors envisagé d’éliminer l’excès d’acide en passant l’éluat au travers d’une cartouche contenant un composé capable de le neutraliser. Bien qu’envisagée dans un premier temps, les résines échangeuses d’ions et les résines porteuses d’une fonction amine tertiaire n’ont pas été utilisées à cause de leur faible capacité. Il faudrait 4,4 g de résine à 1 milliéquivalent par gramme pour neutraliser 500 µL d’acide bromhydrique concentré (HBr 48%).
Pour éliminer cet excès d’acide, nous avons placé en ligne une cartouche contenant du carbonate de potassium (1.8 g). Dans ces conditions, après élution au toluène, l’éluat recueilli ne contient qu’une seule phase. Le bromure de 2- [18F]fluoro-4-méthoxybenzyle 24 est obtenu avec un rendement de l’ordre de 63 %.
La nature de l’activité restée sur la cartouche de carbonate a été déterminée après lavage de celle-ci à l’acétonitrile. La TLC montre que la cartouche retient 3 % de bromure de benzyle. L’utilisation d’une cartouche de 1 g de carbonate de potassium permet de réduire les pertes en halogénure de benzyle à moins de 0,5 %
4.2.5 Halogénures de benzyle : autres
Cette méthode d’obtention du bromure de 2-[18F]fluoro-4-méthoxybenzyle 23 a été extrapolée à la synthèse des dérivés iodés et chlorés. Pour cela, l’acide bromhydrique a été substitué respectivement soit par de l’acide iodhydrique (HI 57%), soit par de l’acide chlorhydrique (HCl 37%). Les rendements en iodure de 2- [18F]fluoro-4-méthoxybenzyle (65 %) et en chlorure de 2-[18F]fluoro-4- méthoxybenzyle (60 %) sont similaires à ceux du dérivé bromé (63 %)
Cette technique de préparation des halogénures de benzyle (X= Cl, Br, I) a également été appliquée à la synthèse d’autres dérivés halogénés (Figure 72). Dans ce cas la synthèse a été réalisée au départ des [18F]fluorobenzaldéhydes 6, 9, 23, 34 et 35 eux-mêmes préparés au départ des précurseurs ammonium quaternaire (@) et nitrés (#) correspondants. Les résultats sont repris dans le tableau 12.
A l’exception des halogénures de benzyles 6 et 34 qui ont nécessité l’utilisation d’une cartouche SPE contenant 1 g de phase C18, les résultats repris dans le tableau ci-dessous (Tableau 12) ont été obtenus avec des cartouches C18 de 400 mg.
Figure 72 : Structure des halogénures de [18F]fluorobenzyle
[18F]fluorobenzaldéhyde Halogénures de benzyle (Figure 72)
[18F] H OCH3 X=Cl X=Br X=I
23@ 24 R1 R2, R4 R3 60 63 ± 3
(n = 23)
65 ± 5 (n = 26)
9@ 12 R1 R2 R3, R4 40 40 ± 3
(n = 3)
45 ± 5 (n = 6)
9# 12 R1 R2 R3, R4 - 51 52
35# 27 R1 R2
OCH2O
(R3,R4) - 48 65
6@ 28 R3
R1, R2, R4
- - > 2 -
34@ 29 R1
R2, R3, R4
- - > 2 -
Tableau 12 : Rendements en halogénures de [18F]fluorobenzyle (d.c.) au départ de précurseurs
ammoniums quaternaires (@) ou nitrés (#)
Les résultats repris dans ce tableau montrent que la réaction est presque quantitative avec les composés 24, 12 et 27 à température ambiante. Cependant dans ces conditions, aucune réaction n’est observée pour les composés 28 et 29 et ce même après un temps de réaction relativement long (30 minutes).
Cette méthode développée pour obtenir les halogénures de benzyles nécessaires à la préparation de la FDOPA 1 et de la FTYR 2 n’est malheureusement pas applicable tel quel à la préparation des dérivés halogénés nécessaires à la synthèse de la 2-[18F]fluoro-L-phénylalanine 4 et de la 4-[18F]fluoro-L- phénylalanine 3. En effet dans ces conditions, le rendement maximum en dérivé halogéné est 2 %. Les améliorations réalisées pour tenter d’augmenter le rendement sont décrites dans les paragraphes suivants.
4.2.6 Halogénures de benzyles de la [18F]fluorophénylalanine 4.2.6.1 Acides halogénés aqueux à 60°C
Il existe plusieurs méthodes qui permettent d’augmenter la vitesse d’une réaction chimique: emploi d’un catalyseur, augmentation de la température de réaction, changement de solvant, … . Pour une application future, la solution la plus simple à mettre en œuvre serait de chauffer la cartouche. Dans ce cas aucun réactif additionnel ne serait requis et la stratégie sur SPE toujours d’actualité.
Pour tester cette approche, l’alcool 4-[18F]fluorobenzylique 36 a été préparé comme décrit précédemment sur des cartouches contenant 1 g de phase C18. La cartouche préalablement mouillée au moyen d’acide halogéné concentré (HI 57%, HBr 48%, HCl 37%) a été chauffée à 60°C durant 5 minutes. Après réaction, l’activité a été éluée avec 3 mL d’acétonitrile et l’éluat analysé par HPLC et par TLC. Sur base de la pureté radiochimique obtenue, le rendement global de ces synthèses a été calculé. Les résultats obtenus sont repris dans le tableau 13. D’après les résultats y figurant, il apparait que cette approche est adaptée à la synthèse des halogénures de 4-[18F]fluorobenzyles 28 (X = Cl, Br, I) (Figure 73). Les rendements sont bons et la conversion du benzaldéhyde en dérivé halogéné est supérieure à 85 %. Néanmoins, un rendement plus faible est observé pour le dérivé chloré.
(Tableau 13)
Figure 73 Halogénures de 4-[18F]fluorobenzyle 28
(Figure 73) X = Cl X = Br X = I
Rendement (d.c., %) 45 67 67
Tableau 13 : Rendements en halogénures de 4-[18F]fluorobenzyle
Comme précédemment décrit, l’élution finale a été réalisée au moyen d’un solvant organique tel que le toluène, le dichlorométhane et l’éluat passer au travers d’une cartouche de 1 g de carbonate de potassium connectée à la sortie de la C18.
Malheureusement dans ces conditions et contrairement au composés halogénés 12, 24 et 27, le dérivé halogéné 28 se décompose pour fournir l’alcool 4- [18F]fluorobenzylique 36.
Pour éviter ce problème, d’autres sels inorganiques ont été testés : le formiate de sodium (HCO2Na), l’hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) et le dihydrogénophophate de potassium (KH2PO4). Parmi ces cartouches, seule celles au formiate de sodium permettent d’éviter la dégradation de l’halogénure de benzyle 28. En pratique, cette cartouche est également connectée directement à une seconde colonne contenant un peu de desséchant (sulfate de sodium ou carbonate de potassium). Ces conditions permettent la récupération du dérivé halogéné non dégradé en phase homogène et en l’absence d’une seconde phase.
Les résultats obtenus pour les halogénures de 2-[18F]fluorobenzyle 29 et de 4-[18F]fluorobenzyle 28 au départ des sels d’ammoniums (@) et des dérivés nitrés (#) sont présentés dans le tableau 14.
Figure 74 : Halogénures de [18F]fluorobenzyle 28 & 29 Halogénure de benzyle (Figure 74)
R1 R2 X = Cl (%) X = Br (%) X = I (%) 29@ 18F H 12 ± 2
(n = 3) 40 52
29# 18F H 14 59 62
28@ H 18F 41 64 ± 4
(n = 9)
63 ± 5 (n = 6)
28# H 18F 36 59 58
Tableau 14 : Rendements (d.c.) en halogénures de benzyle 28 et 29 au départ de précurseurs
ammoniums quaternaires (@) ou nitrés (#)
Au vu de ces résultats, les dérivé bromés et iodés sont obtenus avec d’excellents rendements et ce aussi bien au départ des dérivés nitrés que des sels d’ammoniums quaternaires. Par contre, la synthèse du dérivé chloré est moins aisée comme en témoigne le faible rendement obtenu pour le chlorure de 2- [18F]fluorobenzyle 29 dont le taux de conversion au départ de l’aldéhyde n’est que de 18 %.
4.2.6.2 Bromation au moyen de HBr/HOAc (33%)
La méthode présentée ici apparait avantageuse puisqu’elle permet de réaliser facilement, en un laps de temps très court, la conversion d’un aldéhyde [18F]fluoré aromatique à l’halogénure de benzyle correspondant (X = Cl, Br, I). Cependant, pour la préparation des composés 28 et 29, le chauffage de la cartouche est requis ce qui complique une automatisation éventuelle. Pour surmonter ce problème, nous avons décidé de tester un autre acide couramment utilisé en chimie organique : il s’agit de l’acide bromhydrique en solution dans l’acide acétique (HBr/HOAc 33%).
Le 4-[18F]fluorobenzaldéhyde 6 a été préparé comme décrit ci-avant et la réaction d’halogénation sur support solide testée au moyen de cet acide (HBr/ HOAc 33%). La réaction a été réalisée pendant 5 minutes à température ambiante et après élution à l’acétonitrile, le milieu a été analysé par TLC et HPLC. Ces analyses montrent que l’utilisation de cet acide est compatible avec une préparation à température ambiante du dérivé bromé 28. Le rendement non purifié est de 58 %.
Dans une seconde série d’expériences, lors de l’élution au toluène, une seconde phase non miscible est présente. L’éluat récupéré a ensuite été neutralisé et séché par passage au travers d’une cartouche de formiate de sodium et de sulfate de sodium. Dans ce cas, le processus s’accompagne d’une contre-pression élevée rendant difficile une automatisation future. Alternativement, l’excès d’acide halogéné peut également être éliminé au moyen d’une solution aqueuse de formiate d’ammonium [194]. Nous avons préféré utiliser la forme sodique de ce sel qui évite la formation d’ammoniac (NH3) capable de réagir avec les halogénures de benzyle.
Cependant, l’automatisation de ce procédé par lavage au formate de sodium devrait être plus complexe à mettre en œuvre que l’utilisation d’un support solide.
Après l’halogénation, la cartouche a été lavée avec 5 mL d’une solution de formiate de sodium. Cependant, ce lavage s’accompagne d’une élution partielle et d’une perte importante du dérivé halogéné qui se retrouve dans le waste.
Néanmoins, l’activité encore présente sur la C18 est majoritairement du bromure de 4-[18F]fluorobenzyle 28 qui peut être élué au toluène. Dans ces conditions, le rendement de la réaction n’est plus que de 28 %. Pour éviter cette perte, différentes cartouches ou associations de cartouches ont été testées.
Après différentes optimisations, il s’avère qu’une cartouche Oasis HLB (400 mg) placée en série avec une cartouche C18 (1 g) permet de conserver le bromure de 4-[18F]fluorobenzyle 28 durant l’étape de lavage au formiate de sodium. Lors de cette étape de lavage, l’activité migre de la C18 vers la cartouche Oasis placée en ligne et par conséquent l’activité n’est plus perdue. Après élution des deux cartouches au moyen de toluène, les analyses HPLC et TLC réalisées sur l’éluat
confirment bien la présence du produit recherché. Les rendements de synthèse en bromure de 4-[18F]fluorobenzyle 28 et bromure de 2-[18F]fluorobenzyle 29 sont de respectivement 58 ± 9 % (n = 4) et de 32 % par la voie acide acétique sur support solide au départ des précurseurs ammoniums quaternaires. L’écart type important observé lors de ces synthèses est dû à la présence d’un produit radioactif secondaire non identifié qui apparait quelques fois lors ces préparations. Actuellement, cette approche n’a pas été optimisée.
4.2.7 Halogénures de benzyle : résumé
Au cours de la première partie de ce travail, la synthèse des différents halogénures de [18F]fluorobenzyle (X = Cl, Br, I) a été simplifiée. L’implémentation de la méthode sur un support solide au moyen d’acide en solution aqueuse ou dans l’acide acétique facilement manipulables simplifie grandement l’automatisation de cette partie de la synthèse. En modifiant la nature de l’acide (HCl 37%, HBr 48%, HBr/HOAc 33%, HI 57%), il est possible d’obtenir le dérivé chloré, bromé ou iodé de divers halogénures de benzyle substitués ou non. Ces différents réactifs en combinaison avec un support solide (C18, Oasis HLB) ont permis de convertir rapidement l’alcool [18F]fluorobenzylique en halogénure de [18F]fluorobenzyle et ce avec d’excellents rendements. Selon le substrat de départ, la synthèse des dérivés halogénés (X = Cl, Br, I) est possible à température ambiante ou à 60°C. La synthèse des dérivés bromés est cependant réalisable à température ambiante soit au moyen de HBr 47% ou d’HBr/HOAc 33%.
L’excès d’acide utilisé pour la réaction d’halogénation est facilement éliminé par passage sur une colonne de carbonate de potassium, de formiate de sodium ou une combinaison de ces deux réactifs. La neutralisation peut également être réalisée au moyen d’une solution aqueuse de formiate de sodium. Les halogénures de benzyle marqués au fluor-18 peuvent être récupérés au moyen d’un faible volume (2 - 2,5 mL) de solvant organique (dichlorométhane, acétonitrile, toluène, …)
Comme les réactions de réduction et d’halogénation ainsi que les purifications sont réalisées sur support solide, cette synthèse devrait facilement être implémentée sur un automate de synthèse (FASTlab).
Les rendements des principaux halogénures de benzyles (Figure 75) synthétisés au cours de ce travail sont résumés dans le tableau 15.
Figure 75 : Structure halogénures de [18F]fluorobenzyle
Rendement en halogénures de benzyle (d.c., %) (Figure 75)
[18F] H OCH3 X = Cl X = Br X = I
RT 60°C RT 60°C HBr/HOAc RT 60°C
12@
R1 R2 R3, R4
40 - 40 ± 3
(n = 3) / - 45 ± 5
(n = 6) -
12# - - 51 - - 52 -
24@ R1 R2, R4 R3 60 - 63 ± 3
(n = 23) - - 65 ± 5
(n = 26) -
27# R1 R2
OCH2
(R3,R4) - - 48 - - 65 -
28#
R3 R1, R2,
R4 -
- 36 - 59 - - 58
28@ - 41 > 2 64 ± 4
(n = 9)
58 ± 9
(n = 4) - 63 ± 5
(n = 6)
29@
R1 R2, R3, R4
-
- 12 ± 2
(n = 3) > 2 40 32 - 52
29# - 14 - 59 - - 62
Tableau 15 :Rendements en halogénures de [18F]fluorobenzyle au départ de précurseurs ammoniums quaternaires (@) ou nitrés (#)
Dans la seconde partie de ce travail, ces halogénures de [18F]fluorobenzyle seront utilisés pour réaliser la réaction d’alkylation de la base de Schiff 19 en présence de différents catalyseurs chiraux.
4.3 Catalyseurs chiraux 4.3.1 Généralités
Dans la littérature, l’alkylation énantiosélective d’un dérivé de la glycine au moyen d’un halogénure de [18F]fluorobenzyle peut être réalisée soit par utilisation d’un auxiliaire de chiralité [128, 129, 131, 134, 161], soit par PTC [146, 156, 160].
Actuellement au Centre de Recherches du Cyclotron, la réaction d’alkylation de la base de Schiff 19 est réalisée par PTC à 0°C au moyen d’un catalyseur de type spiroammonium 22 (Figure 76). Cette méthode permet d’obtenir un excès énantiomérique supérieur à 95 %.
Figure 76 : Alkylation énantiosélective par PTC
Cette approche présente néanmoins certaines limitations. Le temps requis pour refroidir la solution d’halogénure de benzyle de la température ambiante à 0°C rallonge d’autant la durée de synthèse et de ce fait, l’activité totale disponible pour l’injection chez l’homme en est d’autant réduite. D’autre part, cette étape de la synthèse nécessite un système de refroidissement ce qui complique l’automatisation.
Celle-ci serait grandement simplifiée si la réaction d’alkylation pouvait être réalisée à température ambiante. Afin d’atteindre cet objectif, nous avons étudié l’influence de divers catalyseurs chiraux sur l’excès énantiomérique de cette réaction. La structure des catalyseurs est présentée dans la figure 77 et le tableau 16.
Figure 77 : Catalyseurs chiraux
Catalyseurs à base de cinchonidine (Figure 77)
R1 R2 R3
20 -CH=CH2 -CH2-anthracén-9-yl -CH2-CH=CH2
37 -C2H5 -CH2-C6H4-2-CN -CH2-CH=CH2
38 -C2H5 -CH2-C6H2-(3,4,5-F3) -CH2-CH=CH2
39 -C2H5 CH2-anthracén-9-yl CH2-C6H5
Tableau 16 : Catalyseurs chiraux à base de cinchonidine
Le catalyseur 22 est un dérivé du binol. Les catalyseurs 20, 37, 38 et 39 sont des dérivés de la cinchonidine 21 tandis que le catalyseur 40 est un dérivé diphénique. Les catalyseurs présentés ci-dessus sont soit disponibles commercialement (20 et 22), soit ont déjà été synthétisés dans notre laboratoire (37 et 38). Les catalyseurs 39 et 40 devront quant à eux être préparés. Leurs caractéristiques ainsi que leurs synthèses [160, 161] sont décrites dans les paragraphes ci-après.
4.3.2 Préparation des catalyseurs
4.3.2.1 Catalyseur à base de cinchonidine 39
Notre intérêt s’est tout d’abord porté sur le catalyseur 39 décrit par Lygo [154]. Il s’agit du bromure de (1S, 2S, 4S, 5R)-1-(anthracèn-9-ylméthyl)-2-((R)- benzyloxy(quinolin-4-yl)méthyl)-5-éthyl-1-azoniabicyclo-[2.2.2]- octane 39 dont la structure est reprise dans la figure 78 . Les excès énantiomériques en chimie classique obtenus à température ambiante (25°C) pour l’alkylation de la base de Schiff 19 par divers dérivés bromés en présence de ce catalyseur sont repris dans le tableau 17.
Figure 78 : Alkylation de la base de Schiff 19 au moyen de divers halogénures de benzyles en présence du catalyseur 39 Quantité de catalyseur
(mol %) R-X Rendement
(%)
Excès énantiomérique (%) (R)
10 PhCH2Br 85 94
10 4-Br-C6H4-CH2Br 80 94
10 (2-naphtyl)-CH2Br 83 93
10 CH2=CH-CH2Br 87 92
Tableau 17 : Excès énantiomérique et rendement obtenu en présence du catalyseur 39
Les excès énantiomériques sont très bons à température ambiante et plus particulièrement avec le bromure de benzyle et le bromure de 4-bromobenzyle (94 %). Ces résultats prometteurs nous ont incités à réaliser la synthèse de ce catalyseur dans notre laboratoire. Cette synthèse, bien décrite dans la littérature implique trois étapes au départ de la cinchonidine 21 (Figure 79).
Figure 79 : Voie de synthèse du catalyseur 39
La première consiste à réduire au moyen d’hydrogène la double liaison présente sur le noyau quinuclidine de la cinchonidine 21. La seconde consiste à quaterniser l’amine aliphatique de la dihydrocinchonidine 41 par le 9- chlorométhylanthracène [152, 195]. La dernière étape implique la protection de la fonction alcool sous forme d’éther benzylique [151]. Ces différentes étapes sont décrites plus en détails dans les paragraphes suivants.
Préparation de (R)-((2S,4S,5R)-5-éthylquinuclidin-2-yl) (quinolin-4- yl)méthanol 41
La première étape de la synthèse consiste à hydrogéner la cinchonidine 21 (Figure 80)
Figure 80 : Hydrogénation de la cinchonidine 21
Cette réaction a été réalisée à l’aide d’hydrogène et d’un catalyseur au palladium. Le rendement de cette étape de réduction conduisant au (R)-((2S,4S,5R)-
5-éthylquinuclidin-2-yl) (quinolin-4-yl)méthanol) 41 est de 66 %. Ce faible rendement résulte vraisemblablement de la mauvaise solubilité du produit hydrogéné dans le solvant de la réaction. Les analyses par ESI-MS et la RMN 1H 13C (Annexes 1 & 2) ont permis de confirmer la structure du composé.
Synthèse du chlorure de (1S,2S,4S,5R)-1-(anthracèn-9-ylméthyl)5-éthyl-2-((R)- hydroxy(quinolin-4-yl)méthyl)-1-azoniabicyclo[2.2.2]octane 42
La dihydrocinchonidine 41 a été quaternisée par réaction avec le 9- chlorométhylanthracène. La réaction procède à reflux dans le toluène (Figure 81).
Figure 81 : Quaternisation de l’amine 41
Le produit 42 précipite dans le milieu réactionnel et peut selon ces auteurs après filtration être directement utilisé pour l’étape suivante [195]. Cependant, dans notre cas, cela n’a pas été possible car sa pureté était insuffisante. Pour cette raison le produit a été purifié sur une colonne de silice au moyen d’un éluant composé de dichlorométhane et de méthanol (93/7). Après évaporation des solvants, un solide jaune a été obtenu avec un rendement de 63 %. La structure de l’ammonium quaternaire a été confirmée par RMN (Annexes 3 et 4) et ESI-MS.
Synthèse du bromure de (1S,2S,4S,5R)-1-(anthracèn-9-ylméthyl)-2- ((R)benzyloxy(quinolin-4-yl)méthyl)-5-éthyl-1-azoniabicyclo-[2.2.2]octane 39
Lors de la dernière étape de cette synthèse, la fonction hydroxyle présente sur l’amine 42 a été protégée sous forme d’éther benzylique (Figure 82) au moyen de bromure de benzyle.
Figure 82 : Protection de la fonction alcool pour obtenir le catalyseur 39
La protection a été réalisée dans un mélange eau/dichlorométhane. Dans ce cas, l’agent de transfert est le réactif lui-même. Le produit a été récupéré en phase organique puis purifié sur colonne de silice avec un rendement de 60 %. Les caractéristiques du catalyseur 39 sont conformes à celles décrites dans la littérature.
Le spectre RMN 1H et 13C sont présentés dans les annexes 5 et 6.
Le rendement global de synthèse pour le catalyseur 39 à partir de la cinchonidine 21 est de 25 %.
4.3.2.2 Catalyseur diphénique 40
Le deuxième catalyseur à avoir attiré notre attention est le catalyseur décrit par l’équipe de Maruoka [196]. Quelques-uns des résultats obtenus par ces auteurs au moyen de ce catalyseur de configuration (S) sont décrits dans le tableau ci- dessous (Figure 83 et tableau 18).
Figure 83 : Alkylation énantiosélective en présence du catalyseur 40
