La variabilité en enzymes de la membrane de la bordure en brosse de porcelet

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Maïmouna Kane

To cite this version:

Maïmouna Kane. La variabilité en enzymes de la membrane de la bordure en brosse de porcelet. 2011,

pp.1-30. �hal-01454166�

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3, rue du Clos Courtel

BP 90442, 35704 Rennes Cedex Licence professionnelle

Production industrielle, procédés et analyses en chimie et agroalimentaire

STAGE EFFECTUE DU 07 FEVRIER AU 27 MAI 2011

Par KANE MAIMOUNA

A L’Institut national de recherche agronomique UMR STLO

Sujet : la variabilité en enzymes de la membrane de la bordure en brosse du porcelet

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Maitre de stage : Rachel Boutrou, Chargée de recherche

INRA, AGROCAMPUS OUEST, UMR1253 Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, 65

rue de Saint-Brieuc, F-35042 Rennes, France

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Remerciements

Pour l’élaboration de ce travail, je tiens à remercier tout particulièrement Rachel Boutrou, mon maitre de stage pour toute son aide, pour sa gentillesse, ses conseils et dont le soutien inconditionnel m’a été bénéfique tout au long de ce stage.

Je remercie Sylvie Lortal et Joëlle Léonil, directrice et codirectrice de l’Unité Mixte de Recherche Science et Technologie du Lait et de l’Œuf pour m’avoir accueillie au sein du laboratoire.

Je remercie également Valérie Gagnaire pour son aide, ses conseils, sa bonne humeur et Michel Piot pour son apport dans les manipulations. Merci à Karima Bouzerzour.

Merci à tout l’UMR STLO, particulièrement à l’équipe Bioactivité et Nutrition.

Je remercie Florence Bude, responsable de formation à l’IUT de Rennes ainsi que tous les professeurs pour cette excellente formation.

Merci à Murielle Rabillier mon correspondant de stage.

Un clin d’œil à tous les stagiaires et les thésards de l’UMR STLO pour leur sympathie et avec qui j’ai passé de très bons moments.

Un grand merci à tout ce qui m’ont soutenu de près ou de loin et dont mon sort ne leur est pas indifférent. J’ai une pensée très forte pour ma famille, mes amis le happygrad pour leur amour et leur soutien !!!!

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SOMMAIRE

I. INTRODUCTION 5

II. CADRE DE STAGE 8

A. Présentation générale de l’Institut national de recherche agronomique 8

1. Historique 8

2. Capital et chiffre d’affaire 8

3. Activités de l’Inra 8

B. Présentation de l’Unité Mixte de Recherches STLO « Science et Technologie du Lait et de l’Œuf » 9

1. Missions 9

2. Organisation de l’UMR STLO 10

3. Organigramme de l’UMR STLO 10

III. CADRE PRATIQUE 11

A. Matériels et méthodes 11

1. Préparation des vésicules de la membrane de la bordure en brosse (VMBB) 11

1.1. Récupération de la muqueuse 12

1.2. Préparation des VMBB 12

2. Mesure d’activités spécifiques de la phosphatase alcaline et de la dipeptidyl peptidase IV 15

2.1 Dosage de la concentration en protéines totales 15

2.2 Dosage des activités de la phosphatase alcaline 15

2.3. Dosage des activités de la dipeptidyl peptidase IV 16

3. La digestion du caséinomacropeptide et du fragment (193-209) de la caséine β par les vésicules de la

membrane de la bordure en brosse 17

3.1. Dosage des groupements –NH 2 19

3.1.1. Milieu réactionnel et gamme étalon 19

3.1.2. Dosage en microplaque: 19

3.2. Dosage des acides aminés libres 20

B. Résultats et discussion 21

1. Données morphologiques 21

2. Estimation de l’enrichissement des VMBB 22

3. Activités enzymatiques spécifiques 23

4. Les cinétiques de digestion du caséinomacropeptide et du fragment (193-209) de la caséine 25

4

4.1. Dosage des groupements NH 2 26

4.2. Dosage des acides aminés libres 28

IV. CONCLUSION 30

V. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 33

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I. Introduction

L’intestin grêle est considéré comme un carrefour anatomique et physiologique important. Il est tapissé d’une membrane constituée de nombreux plis, les villosités intestinales. Ces villosités correspondent à une couche de cellules épithéliales appelées entérocytes entre la lumière intestinale et la circulation sanguine. Au niveau de chaque entérocyte, on observe d’autres plis plus petits et plus nombreux, les microvillosités qui constituent la «bordure en brosse» (figure 1). La membrane de la bordure en brosse est une membrane métabolique fonctionnelle, constituée de nombreuses enzymes impliquées dans la digestion et l’absorption des nutriments (Woodley 1994).

Parmi les enzymes situés sur la membrane de bordure en brosse on trouve les peptidases impliquées dans la phase terminale de la digestion des protéines. Ces peptidases sont situées vers l’extérieur de la membrane, dans la lumière intestinale; elles hydrolysent les peptides en contact avec la surface cellulaire. Il existe trois catégories de peptidases: les endopeptidases, les aminopeptidases et les carboxypeptidases. Les endopeptidases hydrolysent les liaisons internes des peptides. Leur action accroit le nombre de groupements aminés non terminaux.

Les aminopeptidases sont des enzymes qui ont la capacité de couper les liaisons peptidiques à partir de l’extrémité ŔN terminale (groupement aminé de la chaine peptidique), et les carboxypeptidases au niveau du ŔC terminal (groupement carboxylique ŔCOOH). C’est l’action coordonnée de ces enzymes qui permet la dégradation de protéines (Tobey et al 1985;

Boutrou et al 2008).

Dans le cadre de notre projet, les vésicules de membrane de la bordure en brosse situés à

l’extérieur des villosités et qui se retrouvent donc en face de la lumière intestinale en contact

avec les enzymes constituent notre outil de digestion. Elles sont préparées à partir d’intestin

grêle prélevés sur 14 porcelets nourris différemment tout au long de leur vie et les principales

enzymes mises en évidence sont la phosphatase alcaline et la dipeptidyl peptidase IV. La

phosphatase alcaline est une enzyme hydrolytique qui détache les groupements phosphate en

des protéines et des peptides. La dipeptidyl peptidase IV elle est une aminopeptidase qui

enlève les dipeptides à partir du groupement ŔN terminal de la chaine peptidique. Il s’agira de

mesurer l’activité de ces deux enzymes et d’analyser les profils de digestion de deux peptides

issus de protéine du lait : le caséinomacropeptide (CMP) et le fragment β (193-209) de la

caséine β. Les réponses apportées par cette étude permettront de mettre au point un outil pour

l’étude de la digestion intestinale chez le porcelet, modèle du nourrisson. Développer un outil

6

d’étude in vitro de la digestion chez le nourrisson permettra de réaliser des études

préliminaires et de limiter les études in vivo sur porcelet.

7 intestin grêle lumière intestinale villosités bordure en brosse ^VMBB

Figure 1 : De l’intestin grêle à la membrane de bordure en brosse

8

II. Cadre de stage

A. Présentation générale de l’Institut national de recherche agronomique

1. Historique

Créé en 1946 dans le contexte de la reconstruction nationale d’après-guerre et du projet de modernisation de l'agriculture française, l’Inra a accompagné depuis les mutations du monde agricole, des filières alimentaires et des territoires avec l’objectif de répondre aux attentes exprimées par la société, notamment celle de la suffisance alimentaire de la nation.

Les défis scientifiques et sociétaux sont aujourd’hui bien différents et ont une dimension mondiale profondes: évolutions de l'alimentation, érosion de la biodiversité, développement des maladies émergentes, progrès de la chimie verte... L’Inra a profondément renouvelé ses approches pour y répondre.

2. Capital et chiffre d’affaire

Les ressources de l’Inra proviennent pour 82,7 % de subventions pour charges de service public, 11,5 % de subventions et soutiens finalisés à l’activité de recherche, 4,7 % de produits valorisés de l'activité de recherche et prestations de services, 1,1 % d’autres subventions et produits. En 2009, l’Inra s’est octroyé 772,109 millions d’euros de ressources. Les dépenses de personnel représentent 71,5 % des dépenses, celles de fonctionnement 16,5 %, les frais d’infrastructure et informatique collective 8 %, l’immobilier 4 %.

3. Activités de l’Inra

L’Inra compte à son actif 1820 chercheurs, 2 427 ingénieurs et 4 249 techniciens répartis dans 14 départements scientifiques veillant à optimiser les liens recherche/enseignement supérieur.

Il accueille aussi 1000 chercheurs étrangers chaque année.

L’Inra c’est ainsi :

- 19 centres régionaux engagés dans 21 pôles thématiques prioritaires traduisent l’implication de l’Inra au cœur des dynamiques régionales et portent son engagement dans l’Espace européen de la recherche et les relations internationales.

- Un développement des liens avec l’enseignement supérieur en suivant une politique

guidée par l’objectif d’une implication plus forte dans la chaîne recherche-formation-

développement et la volonté de conserver une dimension nationale à sa stratégie

scientifique. La création des pôles d’excellence est une opportunité de consolider la

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spécialisation scientifique des implantations territoriales de l’Inra et de proposer un partenariat mutuellement avantageux.

- Un dispositif expérimental unique pour mener à bien des études tant sur les végétaux, les animaux et leurs produits, ainsi que sur l’environnement agricole. Les fermes et domaines expérimentaux, plateformes technologiques et plateaux techniques permettent également des recherches fondamentales sur des modèles animaux, végétaux ou microbiens divers et complémentaires pour élucider les bases biologiques des grandes fonctions d’intérêt agronomique. Plus récemment, l’Inra a mis en place de nouveaux dispositifs en appui aux recherches sur l’alimentation et l’environnement.

B. Présentation de l’Unité Mixte de Recherches STLO « Science et Technologie du Lait et de l’Œuf »

Le STLO est une unité mixte de recherche Inra/Agrocampus ouest. De ce fait elle est fortement impliquée à la fois dans la recherche et l’enseignement supérieur.

C’est un des quatre laboratoires de l’Inra dédié à l’étude du lait et de l’œuf et à leur transformation ; les autres étant localisés à Jouy-en-Josas, Poligny, et Aurillac.

Elle dépend pour l’Inra :

-de la direction « alimentation »

-de deux départements : le département « CEPIA : Caractérisation, Elaboration des Produits Issus de l’Agriculture » et le département « MICA : Microbiologie et Chaîne Alimentaire »

1. Missions

L’UMR STLO a pour principales missions de :

 Développer une expertise publique sur les composants du lait et de l’œuf en explorant leur structure, leurs multiples fonctionnalités, leur digestibilité, qu’elles soient natives ou soumises à divers procédés.

 Augmenter la qualité et la sécurité des produits laitiers fermentés par la connaissance de l’expression in situ des bactéries, la préservation et l’exploration de leur biodiversité.

 Former des étudiants et favoriser leur insertion dans la recherche, l’enseignement supérieur ou les entreprises privées.

 Faire bénéficier la société et l’industrie des nouvelles avancées scientifiques au

travers d’un partenariat régulier et diversifié.

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2. Organisation de l’UMR STLO

Elle regroupe une centaine de personnes dont 75 permanents, 12 doctorants et 10 détachés d'entreprises. Elle est organisée en :

- six équipes thématiques de recherche qui travaillent en étroite collaboration pour faire avancer les priorités scientifiques. Ensemble, elles offrent un panel complet d’outils et d’expertises en biochimie, physico-chimie, procédés et microbiologie, permettant des approches pluridisciplinaires des questions de recherche.

- deux plateformes certifiées ISO9001: l’une dédiée au lait et ses multiples transformations, l’autre à la préservation et l’exploration de la biodiversité des bactéries alimentaires.

- une équipe d’appui permettant de faciliter la vie quotidienne, les questions administratives, la maintenance informatique, la documentation…

3. Organigramme de l’UMR STLO

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III. CADRE PRATIQUE

A. Matériels et méthodes

Afin d’étudier la variabilité enzymatique de la membrane de la bordure en brosse, nous allons d’abord procéder à leur préparation, dans un second temps nous allons nous intéresser aux différentes activités enzymatiques et enfin étudier la digestion par ces enzymes au niveau des vésicules de la membrane de la bordure en brosse.

1. Préparation des vésicules de la membrane de la bordure en brosse (VMBB)

Les VMBB qui sont notre outil de digestion, sont préparées à partir de l’intestin grêle du porcelet. Cette préparation a pour rôle de concentrer et donc de récupérer toutes les enzymes qui y sont présentes.

Elle s’effectue dans le cadre de notre étude sur 14 porcelets âgés de 28 jours qui ont été nourris différemment tout au long de leur vie.

Tableau 1: type d'alimentation de chaque porcelet

Porcelet alimentation

Porcelet 28 T1

Porcelet 29 T2

Porcelet 30 T4

Porcelet 31 T3

Porcelet 32 T3

Porcelet 33 T1

Porcelet 34 T2

Porcelet 35 T3

Porcelet 36 T4

Porcelet 37 T3

Porcelet 38 T2

Porcelet 39 T3

Porcelet 40 T3

Porcelet 41 T3

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1.1. Récupération de la muqueuse

Les intestins prélevés à l’abattoir de l’Inra sont rincés au sérum physiologique puis conservés dans des Falcon à -80° C pour limiter les contaminations et les dégradations. Après décongélation, la muqueuse est récupérée en grattant sur plaque de verre. L’opération est effectuée sur un lit de glace pour préserver les activités enzymatiques de l’intestin. Le poids de muqueuse obtenue et la longueur de l’intestin sont mesurés.

Figure 2 : Dispositif expérimental de récupération de la muqueuse intestinale

1.2. Préparation des VMBB

Tout d’abord 20g de la muqueuse sont mélangés à 400 mL de tampon d’homogénéisation puis mixés pour être finement hachés. Les différents composants de ce tampon ont pour but de préserver les cellules de la dégradation mais aussi d’éviter une destruction ou une dénaturation des enzymes présentes.

 Tampon d’homogénéisation

Le tampon d’homogénéisation est préparé sous un volume de 1L. Il doit contenir, le tout complété avec de l’eau déminéralisée et dépourvue de germes (eau milli Q) :

100 mL Mannitol 0, 5 M

100 mL tampon tris HCl pH 7 20 mM 1 mL paraméthylsulfonic fluoride 100 mM

Lorsque l’homogénéisation est réalisée (Waring Blendor, 2x30 sec) on réserve 1 mL pour les dosages d’activités et on procède à une agitation sur glace en présence de CaCl 2 12.5 mM pendant 30 à 60 minutes.

 Solution de chlorure de calcium

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Le rôle du CaCl 2 est de précipiter les membranes. La solution est préparée sous un volume de 50 mL à une concentration de 1 M.

L’homogénat obtenu est centrifugé afin de culoter les débris cellulaires qui sont ensuite

éliminés. La centrifugation est réalisée pendant 15 minutes à une vitesse de 5000 g et une

température de 4° C dans deux pots de centrifugation 250 mL. Le surnageant (S1) obtenu lors

de cette première centrifugation est centrifugé 30 minutes à 12000 g, 4° C, on observe à ce

niveau des culots blancs et translucides qui contiennent les VMBB. Le culot (P2) va être

soumis à une resuspension dans 500 µL de tampon d’homogénéisation avec une fine aiguille

pour rendre les VMBB plus homogènes, on obtient un volume de 1 mL mis en aliquote dans

trois cryotubes (400 µL, 400 µL, 200 µL) qui sont congelés à -80° C. Pour estimer

l’enrichissement en activités enzymatiques au cours de la préparation 1 mL d’homogénat, de

surnageant S1 et S2, et aussi de culot P1 est prélevé et conservé à -80°C jusqu’à analyse.

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Figure 3 : Diagramme de préparation des vésicules de la membrane de la bordure en brosse Intestin grêle

Muqueuse Grattage

Homogénat Mixage

Centrifuga tion

Culot P1 Surna-

geant S1

Surna- geant S2

Culot P2 Centrifugati

on

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2. Mesure d’activités spécifiques de la phosphatase alcaline et de la dipeptidyl peptidase IV

Afin de mesurer les activités spécifiques des deux enzymes impliquées dans la digestion intestinale au niveau des vésicules de la membrane de la bordure en brosse chez les porcelets, il s’agira de déterminer la concentration des protéines totales présentes et de mesurer l’activité enzymatique de ces enzymes. En effet l’activité enzymatique rapportée au taux protéique permet d’obtenir l’activité spécifique.

2.1 Dosage de la concentration en protéines totales

La gamme d’étalonnage utilisée pour la détermination de la teneur en protéines des VMBB est réalisée à partir d’une solution mère d’albumine de sérum bovin à 1 g/L. 10 µL de chacune des solutions de la gamme sont mélangés à 250 µL de réactif de Bradford pour une incubation en microplaque pendant dix minutes à température ambiante et une coloration bleue apparaît en fonction de la teneur en protéines des solutions de la gamme. En effet, il y a formation d'un complexe entre le colorant, le bleu brillant G du réactif de Bradford, et les protéines en solution. Ce complexe colorant-protéine va présenter un maximum d’absorption à 595 nm, la quantité d'absorption est proportionnelle à celle en protéine présente. Ainsi l’absorbance des solutions de la gamme lue à 595 nm permet de tracer la droite d’étalonnage.

Les échantillons à doser sont quant à eux d’abord dilués au 1 : 20 dans de l’eau milli Q avant d’être dosés. Le mode opératoire est le même que celui des solutions de la gamme. Leur concentration en protéines est calculée à partir des densités optiques obtenues par rapport à celles de la gamme. Tous les dosages ont été faits en double et les résultats obtenus représentent la moyenne de ces dosages.

2.2 Dosage des activités de la phosphatase alcaline

Le substrat utilisé pour le dosage de la phosphatase alcaline est la paranitrophényl phosphate

(pNPP). La phosphatase alcaline catalyse l’hydrolyse de la paranitrophényl phosphate

(incolore) avec libération de phosphate et de paranitrophenol coloré en jaune en milieu

réactionnel basique.

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Phosphatase alcaline

pNpp paranitrophenol (jaune) On peut donc suivre l’apparition de ce produit au cours de l’hydrolyse en enregistrant l’absorbance du milieu réactionnel à 405 nm.

Pour ce fait, les P2 sont dilués au 1:1000, les homogénats et surnageant sont eux dilués au 1 :50 dans du tampon carbonate 1 M pH 9.4 pour permettre à la fois une hydrolyse totale du substrat mais aussi d’éviter une saturation en enzyme. Ensuite, 50 µL de ces échantillons sont mélangés à 50 µL de pNPP et les densités optiques sont lues immédiatement après ajout du réactif. Ces mesures sont effectuées à 37° C à une longueur d’onde de 405 nm pour une cinétique de 10 minutes à 1 minute d’intervalle. Une coloration jaune due à l’hydrolyse du substrat apparaît au cours du temps.

Calcul de l’activité enzymatique

L’activité enzymatique se définit comme étant la quantité en enzyme nécessaire pour convertir une nmole de substrat par seconde et par millilitre.

/sec : différence de DO 405 par minute D : facteur de dilution de l’échantillon Véch : volume de l’échantillon

Ɛ : coefficient d’extinction molaire du substrat

L’activité spécifique de la phosphatase alcaline est calculée sur chaque échantillon. Les dosages sont également réalisés en double et c’est la moyenne qui est prise en compte.

2.3. Dosage des activités de la dipeptidyl peptidase IV

Le substrat utilisé pour ce dosage est la Phe-Pro β-naphtylamide à 0.66 mM. 50 µL de ce

substrat sont mélangés à un volume équivalent d’échantillon à tester. Pendant une incubation

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de 25 minutes à l’étuve à 30°C, la réaction est arrêtée par addition de 50 µL de réactif de Fast Garnet toutes les cinq minutes afin de lire la densité optique à 550 nm.

Préparation de 10 mL de réactif de Fast Garnet : - 5mL de tampon acétate de sodium 2 M pH 4 - 3 mL d’eau distillée

- 1 mL de triton X 100

- 1 mL de solution Fast Garnet : Fast Garnet GBC salt à 10mg/mL d’eau osmosée, conservé en aliquotes à -20°C.

Le calcul de l’activité enzymatique se fait de la même manière que pour la phosphatase alcaline.

3. La digestion du caséinomacropeptide et du fragment (193-209) de la caséine β par les vésicules de la membrane de la bordure en brosse

Le caséinomacropeptide est un peptide obtenu par hydrolyse de la caséine kappa durant de la première phase de la digestion par les protéases gastriques. Elle est constituée de 64 résidus d’acides aminés et contient des sites de glycosylation allant de 0 à 7 (Boutrou et al 2008).

Dans le cas de notre étude, le caséinomacropeptide utilisé est dépourvu de glycosylation. Le fragment (193-209) de la caséine β, est constituée de 17 acides aminés, elle est également un résidu de la caséine béta du lait.

Figure 4: Séquence du caséinomacropeptide

Figure 5 : séquence du fragment (193-209) de la caséine β

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Par étudier la digestion par les enzymes des VMBB, on prépare du substrat à 5g/L dans du tampon Hepes-Tris. Le tampon Hepes-Tris est préparé sous une concentration de 35 mM supplémenté de 150 mM de chlorure de potassium (KCl) pour maintenir la pression osmotique. Le substrat est mélangé à un volume équivalent en solution de vésicule dilué au 1/10 dans le même tampon. Le mélange substrat-enzyme est incubé dans un bain-marie à 37°C. Des prélèvements de 250 µL de digestat sont effectués aux temps 0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 5 h. La réaction est arrêtée par une centrifugation de 45 secondes. Pour vérifier la pureté des substrats utilisés pour la digestion, des témoins de ces derniers sont réalisés. Un premier témoin est réalisé en début de digestion (au temps 0h) et un second est mis dans les conditions de digestion (bain-marie à 37°C) sans présence d’enzymes pour une durée de 5h. L’objectif de réaliser ces témoins est de vérifier s’il y a ou pas une hydrolyse du substrat seul au bout des 5h. Si on note une différence sur les temps 0 et 5h on pourra en conclure que le substrat au départ n’était pas pur ou a subit une hydrolyse enzymatique au cours de l’expérimentation.

Incubation 37°C

Figure 6 : Dispositif de la digestion de peptide par les vésicules de la membrane de la bordure en brosse.

VMBB dilué au

1/10 Peptide : 5g/L

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3.1. Dosage des groupements –NH 2

Le dosage des groupements NH 2 est un moyen de quantification de l’indice de protéolyse au cours de la digestion. Le réactif utilisé est le trinitrobenzène sulfonique (TNBS) 0.21 M dilué au 1/42 dans de l’eau désionisée. Le TNBS est un réactif spécifique aux groupements ŔNH 2

libres avec lesquels il se fixe pour donner un composé sulfite-trinytrophényl acide aminé dont l’absorbance est lue à 420 nm. On lit aussi la densité optique pour une gamme de glycine allant de 0 à 1.5 mM afin d’obtenir la droite d’étalonnage. Une coloration jaune apparait proportionnellement à la quantité en groupements ŔNH 2 .

3.1.1. Milieu réactionnel et gamme étalon

Le milieu réactionnel du dosage est préparé à partir de l’acide orthoborique. La dissolution étant difficile à froid, l’hydroxyde de potassium (KOH) concentré 5 M est utilisé pour augmenter le pH. Il s’en suit un chauffage pour dissiper le trouble puis le pH est ajusté à 9.20.

La gamme de glycine est préparée à partir d’une solution mère à 0.15 M que l’on dilue au 1/100 dans de l’eau désionisée.

3.1.2. Dosage en microplaque:

Pour quantifier les groupements -NH 2 issus de l’hydrolyse des peptides lors de la digestion,

10µL d’échantillon ou de solution de glycine (pour la gamme) sont mélangés à 100 µL de

borate de potassium et 40 µL de substrat TNBS. Après 1h d’incubation à l’étuve à 37°C dans

une microplaque la densité optique est lue à 420 nm contre un blanc borate de potassium 1 M

pH 9.2.

20

3.2. Dosage des acides aminés libres

Il consiste au dosage des acides aminés libres non fixés à la protéine par une liaison peptidique. Le réactif utilisé est la ninhydrine. Le principe repose sur la séparation des constituants des digestats par chromatographie échangeuse de cations à l’aide d’un analyseur automatique d’acides aminés. Ces acides aminés une fois extraits sont dilués dans du tampon citrate de lithium pH 2,2 et révélés par une réaction à chaud avec la ninhydrine. Lorsqu'un acide aminé en solution est chauffé en présence de ninhydrine en excès, il conduit à un chromophore avec un maximum d'absorption à 570 nm (bleu-violet). La réaction s'effectue en 3 étapes. La 1ère correspond à l'action d'une première molécule de ninhydrine sur l'acide aminé conduisant à un iminoacide et à une molécule de ninhydrine réduite. La 2ème correspond à l'action d'une 2ème molécule de ninhydrine sur l'iminoacide pour donner un aldéhyde. Cette 2ème molécule se condense finalement avec la molécule de ninhydrine réduite pour former le chromophore. La coloration résultante est mesurée aux longueurs d’onde 570 et 440 nm. En effet tous les acides aminés sont colorés en pourpre de Ruhemann à 570 nm, seule la proline qui elle est colorée en jaune à 440 nm. Les concentrations en acides aminés sont calculées directement à partir du logiciel relié au chromatographe en tenant compte d’un étalon interne d’acides aminés.

Cette quantification des acides aminés libres n’a pas fait l’objet de mes manipulations, en

effet elle nous a été réalisée indépendamment au sein du laboratoire.

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B. Résultats et discussion

1. Données morphologiques

Tableau 2: estimation du rapport masse muqueuse récupéré/longueur intestinale des porcelets

porcelet alimentation

Longueur intestin (cm)

Masse muqueuse(g)

Longueur intestin/masse muqueuse (g/m)

Porcelet 28 T1 217 37,97 17,49

Porcelet 29 T2 248 33,48 13,5

Porcelet 30 T4 186 30,6 16,45

Porcelet 31 T3 217 29,37 13,53

Porcelet 32 T3 185,5 31,35 16,9

Porcelet 33 T1 182,7 25,33 13,86

Porcelet 34 T2 212 35,25 16,62

Porcelet 35 T3 217 29,03 13,38

Porcelet 36 T4 201,5 30,09 14,93

Porcelet 37 T3 217 37,93 17,48

Porcelet 38 T2 201,5 33,76 16,75

Porcelet 39 T3 193,75 34,5 17,81

Porcelet 40 T3 201,5 33,09 16,42

Porcelet 41 T3 201,5 28,3 14,04

Le rapport longueur intestin/masse muqueuse permet de voir si l’alimentation a un effet sur le

développement physiologique de l’intestin.

22

Figure 7 : histogramme de la longueur intestinale/ masse de muqueuse des 14 porcelets groupés selon le type d’alimentation.

L’histogramme obtenu montre que l’on n’a pas de corrélation entre le rapport longueur intestin/masse muqueuse et le type d’alimentation. On retrouve parfois une égalité de ce rapport chez certains de ces porcelets avec des alimentations différentes.

2. Estimation de l’enrichissement des VMBB

La vérification de l’enrichissement permet de s’assurer de la bonne récupération des vésicules

de membrane de la bordure en brosse et par conséquent des enzymes présentes. Pour cet effet,

les quantités en enzymes au niveau de solution de VMBB de trois porcelets sont comparées à

celles des homogénats correspondants comme le montre le tableau suivant :

23

Tableau 4: vérification de l'enrichissement des échantillons des porcelets N°30, 34 et 40

Protéines C (g/L)

Activité spécifique de la PAL (nkat/mg)

Activité spécifique de la DPPIV (nkat/mg)

Homogénat pt30 4,79 19,72 0,39

P2 pt30 4,57 282,43 7,87

% enrichissement 14,32 20,43

Homogénat pt34 5,63 18,01 0,33

P2 pt34 13,23 172,34 3,08

% enrichissement 9,57 9,30

Homogénat pt40 6,13 91,71 0,23

P2 pt40 14,47 2572,00 2,64

% enrichissement 11,88 11,55

Les résultats obtenus montrent en moyenne un enrichissement autour de 10%, cela signifie que les concentrations en enzymes retrouvées au niveau des solutions de VMBB sont dix fois plus élevées que celles des homogénat. Cela montre d’une part l’importante présence des enzymes au niveau de cette partie de l’intestin grêle et d’autre part qu’une bonne récupération de ces enzymes a été effectuée.

3. Activités enzymatiques spécifiques

y = 0,3646x - 0,0034 R² = 0,9951

-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

ab sor b an ce à 595 n m

concentration (g/L)

24

Figure 8: droite d’étalonnage de la gamme BSA

Tableau 3 : concentration en protéines et activités de la phosphatase alcaline et de la dipeptidyl peptidase IV contenues dans les solutions de VMBB

Alimentation Porcelet

C (g/L) protéines

Activité enzymatique PAL(DO/min/mL)

Activité enzymatique DPPIV(DO/min/mL)

Activité spécifique PAL(nkat/mg)

Activité spécifique DPPIV(nkat/mg)

T1 Pt28 3,843 524,15 5,19 136,41 1,35

T1 Pt33 8,793 1370 36,04 221,81 5,84

T2 Pt29 9,457 2063,7 29,63 234,69 3,37

T2 Pt34 7,543 2280,2 40,74 172,34 3,08

T2 Pt38 6,177 1994,32 44,57 86,23 1,93

T3 Pt32 13,749 1546,23 25,38 205,00 3,36

T3 Pt35 7,589 2797,66 45,13 203,48 3,28

T3 Pt37 4,616 705,78 17,61 152,90 3,82

T3 Pt31 12,584 2580 50,95 272,83 5,39

T3 Pt39 14,465 1548,24 37,78 123,04 3

T3 Pt40 12,877 2571,94 37,78 177,80 2,61

T3 Pt41 3,843 1938,15 40,54 150,51 3,15

T4 Pt30 4,567 1290 35,93 282,43 7,87

T4 Pt36 9,457 926,39 18,11 122,07 2,39

Les résultats obtenus sur les concentrations en protéines totales montrent un écart d’un facteur

d’environ 6 entre les différents échantillons. Concernant les activités spécifiques de la

phosphatase alcaline et de la dipeptidyl peptidase IV, on retrouve respectivement des facteurs

d’environ 3 et 6. Cela montre qu’il existe une variabilité enzymatique assez importante entre

les différents porcelets. Des écarts s’observent également entre les porcelets ayant eu la même

alimentation ce qui confirme que le régime n’a pas d’influence sur les activités enzymatiques.

25

4. Les cinétiques de digestion du caséinomacropeptide et du fragment (193-209) de la caséine β

Afin d’étudier la digestion des enzymes présentes au niveau des VMBB nous procédons d’abord à un choix des échantillons sur les 14 porcelets. La méthode utilisée est l’ACP (Analyse en Composante Principale). C’est une technique qui permet la représentation graphique de grands tableaux de données trop complexes à décrire par les méthodes graphiques habituelles. Les variables dont nous tiendrons compte sont les activités spécifiques de la PAL et de la DPP IV.

Figure 9: analyse en composante principale sur les activités de la phosphatase alcaline et de la

dipeptidyl peptidase IV des VMBB préparées à partir d’intestin de 14 porcelets (N°28 à N°41)

26

D’après l’ACP on remarque sur le graphique des points dispersés selon l’alimentation ce qui montre de nouveau que le mode d’alimentation des porcelets depuis leur naissance n’a pas influencé sur leur système enzymatique concernant notamment la phosphatase alcaline et la dipeptidyl peptidase IV.

Par contre en corrélation avec le graphique des activités spécifiques de la PAL et da la DPPIV on remarque que le porcelet 30 présente la plus forte activité alors que le porcelet 38 lui présente une faible activité. C’est dans ce sens que nous allons étudier la digestion par les enzymes des VMBB sur ces deux porcelets.

4.1. Dosage des groupements NH 2

Figure 10 : détermination des groupements ŔNH 2 libres lors de la digestion du

caséinomacropeptide par les VMBB des porcelets 30 et 38 en présence du témoin (substrat seul).

Les équations de droite obtenues représentent les cinétiques en début de digestion c’est-à-dire avant atteinte du plateau et les pentes de ces droites représentent donc les vitesses de

digestion.

y = 10,08x + 7,8965 R² = 1

y = 9,7911x + 6,802 R² = 1

0 5 10 15 20 25

0 1 2 3 4 5

-N H 2 l ib re s (m M e q .g ly ci n e )

Temps (h)

pt30 pt38

témoin CMP0

27

Figure 11 : Détermination des groupements ŔNH 2 libres lors de la digestion du fragment (193- 209) de la caséine β par les VMBB des porcelets 30 et 38 en présence du témoin (substrat seul).

Avec les cinétiques obtenues on observe que la digestion des deux substrats s’effectue avec une très grande rapidité au bout seulement de trente minutes avec le CMP et 2 heures avec le fragment (193-209) de la caséine β et cela aussi bien pour le porcelet 30 que pour le porcelet 38 pour atteindre le plateau, c’est-à-dire une disparition complète des substrats. On remarque que les quantités en groupements aminées libres lors de l’hydrolyse du caséinomacropeptide sont bien supérieures à celles obtenues avec le fragment (193-209) de la caséine β. Cela se justifie par le fait que le caséinomacropeptide présente une plus longue chaîne d’acides animés.

Et concernant les indices de protéolyse, en comparant les vitesses de libération de groupements -NH 2 en fonction du temps de digestion on se rend compte que l’on retrouve une même pente pour la digestion de chacun des deux substrats. Ce qui signifie qu’au niveau des deux porcelets la vitesse moyenne de libération des groupements -NH 2 est la même, et cela malgré le fait qu’ils aient des quantités en enzymes éloignées comme nous l’a montré la méthode par ACP.

y = 0,3376x + 0,7879 R² = 0,9985

y = 0,3325x + 0,698 R² = 0,9727

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

0 1 2 3 4 5

-N H 2 l ib re s (m M e q .g ly ci n e )

Temps (h)

pt30 pt38

témoin b (193-209)

28

4.2. Dosage des acides aminés libres

Figure 12 : Détermination des acides aminés libres produits lors de la digestion du caséinomacropeptide par les VMBB des porcelets 30 et 38

Figure 13 : Détermination des acides aminés libres produits lors de la digestion du fragment (193-209) par les VMBB des porcelets 30 et 38.

y = 7008,1x + 11307 R² = 1 y = 10110x + 10081

R² = 1

0 5 10 15 20 25

0 1 2 3 4 5

Co n ce n tr ation e n AA L (m M)

Temps (h)

porcelet 30 porcelet 38

y = 575,96x + 1441,8

R² = 1 y = 560,72x + 1406,4

R² = 1

0 1 1 2 2 3 3 4 4 5

0 1 2 3 4 5

Co n ce n tr ation e n AA L (m M )

Temps (h)

Porcelet 30

Porcelet 38

29

Les résultats obtenus avec la libération des acides aminés libres confirment les conclusions

émises avec la détermination des groupements ŔNH 2 libres. En effet les profils de digestion

restent les même c’est-à-dire qu’on a une plus importante libération d’acides aminés libres

avec le caséinomacropeptide et aussi les vitesses moyennes de libération du substrat sont

pareilles et la digestion s’est effectuée très rapidement aussi bien pour les VMBB du porcelet

30 que ceux du porcelet 38.

30

IV. Conclusion

Au cours de notre étude, nous avons utilisé la membrane de bordure en brosse comme un outil de digestion des peptides en contact avec l’intestin grêle. D’après nos résultats, il s’avère que cette membrane présente une très grande quantité d’enzymes mais que celle-ci peut différer d’un porcelet à un autre et cela malgré le fait qu’ils aient le même âge. Et l’on peut affirmer aussi que cette variabilité en enzyme chez ces porcelets n’est pas causée par leur alimentation.

En effet, les porcelets ayant reçus la même alimentation depuis leur naissance ont présenté des quantités en phosphatase alcaline et en dipeptidyl peptidase IV très différentes. D’autre part de par la quantification des groupements -NH 2 et des acides aminés libres, on se rend compte qu’en mettant les VMBB en contact avec un peptide, ce dernier est totalement fragmenté c’est à dire qu’il est digéré ce qui nous confirme la fiabilité de l’utilisation de ces VMBB pour l’étude de la digestion intestinale.

Malgré l’écart en quantité d’enzymes au niveau des VMBB de ces deux porcelets on s’est rendu compte qu’en les mettant en présence des même substrats non seulement ils les ont digérés tous les deux mais aussi que les groupements NH 2 et les acides aminés libres ont été libérés avec la même vitesse. Ce résultat s’explique par le fait que le rapport enzyme/substrat utilisé pour la digestion des substrats par les VMBB est très élevé d’où la disparition complète du substrat en un temps très court.

Dans le cadre de notre étude, le caséinomacropeptide est digéré en trente minutes. En comparaison avec les études faites sur le porc (Boutrou et al, 2008), le fragment caséinomacropeptide a été digéré au bout de 8 heures de temps pour un rapport enzyme/substrat deux fois supérieur à celui utilisé sur notre étude chez le porcelet. Ceci montre que la digestion intestinale chez le porcelet s’effectue à une vitesse beaucoup plus rapide que chez le porc

Cependant, une autre étude pourrait être réalisée sur le model du porcelet en diminuant cette

fois le rapport enzyme/substrat pour pouvoir mieux suivre le processus d’hydrolyse et aussi

identifier les produits de dégradation des substrats par spectrométrie ce qui permettrait de

mieux s’avancer sur la question de la variabilité enzymatique et son effet sur le processus de

digestion intestinale chez les porcelets.

31

Résumé

Les vésicules de la membrane de la bordure en brosse (VMBB) préparées à partir de l’intestin

grêle du porcelet sont considérées comme un outil de digestion. En effet elles ont la

particularité de posséder toutes les enzymes impliquées dans la phase terminale de la

digestion intestinale. Le but de ce travail est d’étudier la variabilité en enzymes au niveau des

VMBB de 14 porcelets en vue d’apporter des réponses sur la digestion intestinale chez le

porcelet. Pour cet effet deux enzymes ont été quantifiées et les cinétiques de digestion de deux

substrats issus de protéine du lait suivis par spectrophotométrie Nos résultats ont révélé la

présence des deux enzymes, la phosphatase alcaline et la dipeptidyl peptidase IV en

concentration différente au niveau des VMBB des porcelets. D’autre part on a remarqué qu’en

mettant les VMBB des porcelets en contact avec le caséinomacropeptide et le fragment (193-

209) ils sont tous les deux hydrolysés à cause du rapport enzyme/substrat élevé utilisé. La

détermination des groupements ŔNH 2 et acides aminés libres a montré que leur digestion s’est

effectuée d’une manière très rapide, beaucoup plus rapide que chez la digestion intestinale du

porc et cela même chez les porcelets possédant une très faible concentration en phosphatase

alcaline et en dipeptidyl peptidase IV au niveau des vésicules de la membrane de la bordure

en brosse d’où la perspective de leur utilisation comme outil de digestion.

32

Conclusion personnelle

Ce stage effectué à l’Unité mixte de recherche « Science et technologie du lait et de l’œuf » a été pour moi une manière d’être en contact direct avec le monde professionnel. J’ai pu mener un projet sur la digestion intestinale chez le porcelet en préparant un outil de digestion à partir de l’intestin grêle, réaliser avec cet outil des dosages d’activités enzymatiques mais aussi des cinétiques de digestion. Grâce à ce projet aussi j’ai acquiert d’une part une très bonne organisation dans le travail, et après traitement de chaque résultat j’ai pu les exposer à ma maître de stage, et en discuter avec elle et d’autre part une maîtrise d’exploitation de grands nombres de données avec l’outil informatique. En plus de l’aspect pratique ce stage a également renforcé mes connaissances théoriques de par une documentation très riche notamment avec des publications et des revus. De même j’ai pu tirer des connaissances dans les domaines du lait et de l’œuf en participant à des séminaires qui se sont déroulés dans le laboratoire et à l’extérieur. Ces séminaires ont aussi été pour moi des moments d’illustrations de projet, de découverte de nouvelles techniques, d’avancées scientifiques qui m’ont montrés les exemples à suivre pour une réussite de ses projets et comment les faire partager.

Ce stage s’est donc passé dans de très bonnes conditions au contact de professionnels qui

m’ont montré les voies de la réussite dans le milieu professionnel de la recherche

33

V. Références bibliographiques

Babusiak; Man Petrak, Vyoral, (2007) Native proteomic analysis of protein complexes in nurine intestinal brush border membranes, Proteomics, 121-129

Boutrou, Jardin, Blais, Tomé, Léonil, (2008). Glycosylations of -casein-derived caseinomacropeptide reduce its accessibility to endo- but not exointestinal brush border membrane peptidases, Journal of Agricultural Food Chemistry 8166-8173

Boutrou, Coirre, Jardin, Leonil, (2010) Phosphorylation and coordination bond of mineral inhibit the hydrolysis of the -Casein (1-25) peptide by intestinal brush-border membrane enzymes, Journal of Agricultural Food Chemistry, 7955-7961

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