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Optimisation de la base aromatique dans le cadre du
projet From’Innov
Gloria Arias Fragas
To cite this version:
Gloria Arias Fragas. Optimisation de la base aromatique dans le cadre du projet From’Innov. Sciences du Vivant [q-bio]. 2020. �hal-02926782�
Optimisation de la base aromatique dans le
cadre du projet From’Innov
Par : Gloria ARIAS FRAGA
Soutenu à Rennes, le 8 juillet 2020
Devant le jury composé de : Président : Romain JEANTET Maître de stage : Anne THIERRY
Enseignant référent : Thomas CROGUENNEC
Les analyses et les conclusions de ce travail d'étudiant n'engagent que la responsabilité de son auteur et non celle d’AGROCAMPUS OUEST
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Spécialisation (et option éventuelle) : Master en Science et Transformation du Lait
Mémoire de fin d’études
☐ d'ingénieur de l'École nationale supérieure des sciences agronomiques, agroalimentaires, horticoles et du paysage (AGROCAMPUS OUEST), école interne de l'institut national d'enseignement supérieur pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement
X de master de l'École nationale supérieure des sciences agronomiques,
agroalimentaires, horticoles et du paysage (AGROCAMPUS OUEST), école interne de l'institut national d'enseignement supérieur pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement
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(4) La référence bibliographique (= Nom de l’auteur, titre du mémoire, année de soutenance, diplôme, spécialité et spécialisation/Option)) sera signalée dans les bases de données documentaires sans le résumé
REMERCIEMENTS
Tout d'abord, je tiens à remercier Hélène Lucas, Présidente du centre INRAE Bretagne-Normandie, et Yves Le Loir, Directeur de l’UMR STLO, de m'avoir permis de réaliser mon stage au sein d’INRAE. Je tiens également à remercier Romain Jeantet, Gilles Garric et Sergio Martínez pour leur accueil au sein du projet From'Innov Quescrem.
Je remercie ma maître de stage Anne Thierry, scientifique microbiologiste INRAE, de m'avoir guidée pendant ces mois de stage, de m'avoir motivée et, en outre, de m'avoir fait confiance, me permettant de m'organiser de manière autonome. Merci pour toutes ses connaissances partagées avec moi et pour sa bonne humeur.
Je tiens également à remercier Elisa Embareck, coordinatrice du projet From’Innov Quescrem à INRAE, pour toute son aide, pour sa patience, son accompagnement et son optimisme.
Et enfin, un grand merci aussi à toutes les personnes que j'ai rencontrées au STLO pendant ce stage, qui ont été disponibles à tout moment pour m'aider et contribuent à créer un bon environnement de travail.
SOMMAIRE DETAILLE Remerciements Sommaire détaillé Glossaire Liste de abréviations Liste de illustrations Liste de tableaux Avant-propos Introduction……… 1 1 Bibliographie ... 3
1.1 La fabrication conventionnelle du fromage ... 3
Principales étapes de la fabrication conventionnelle du fromage... 3
Classification des fromages ... 3
L’affinage ... 3
1.1.3.1 Importance des agents d’affinage ... 3
1.1.3.2 Voies générales de formation des composés d’arôme du fromage ... 4
1.2 Le procédé MMV ... 6
1.3 La technologie From’Innov ... 7
Généralités de la technologie From’Innov ... 7
La matrice de texture ... 7
La(des) matrice(s) aromatique(s)... 8
L’étape de mélange et l’étape de texturation ... 8
1.4 Microorganismes ciblés pour la production des matrices aromatiques du brevet From’Innov ... 8
2 Matériels et méthodes... 9
2.1 Matériel biologique ... 9
2.2 Préparation du rétentat et du perméat ... 9
2.3 Milieux et conditions de préculture ... 9
2.4 Suivi de la croissance des microorganismes ... 9
2.5 Milieux de culture pour les matrices aromatiques ... 9
2.6 Préparation des matrices aromatiques ... 9
2.7 Fabrications fromagères ... 9
2.8 Suivi de la stabilité du fromage lors du stockage ... 11
2.9 Analyse des composés d’arôme ... 12
3.1 Optimisation des milieux de préculture ... 12
P. freudenreichii ... 12
Y. lipolytica ... 13
H. alvei ... 13
3.2 Etude du comportement de rétentats acides à différentes concentrations (FRV) ………...14
3.3 Suivi des indicateurs de l’activité des microorganismes ... 14
Conclusion ... 15 Références bibliographiques
Références sitographiques Résumé
GLOSSAIRE
Agents d’affinage : enzymes et/ou microorganismes endogènes du lait ou ajoutés comme levain qui catalysent les réactions biochimiques pendant l’affinage.
Affinage : phase de transformation biochimique complexe du caillé jusqu’à l’obtention de l’aspect, la composition, la structure, la texture et la flaveur du fromage final.
Coagulation : passage du lait de l'état liquide à l'état de gel, appelé coagulum ou caillé. Coagulum ou caillé : lait en état de gel, grâce à l’action de la présure et/ou à l'acidification. Composés d’arôme : composés impliqués dans la flaveur d’un produit.
Égouttage : étape d’expulsion du lactosérum permettant de concentrer les caséines et la matière grasse du lait gélifié.
Ferments (ou levains) : microorganismes introduits délibérément dans le fromage. Flaveur : ensemble des sensations gustatives et olfactives perçues lorsqu'un aliment est en bouche.
Fromage : produit fermenté ou non, affiné ou non, obtenu à partir des matières exclusivement d’origine laitière (lait, lait écrémé, crème, matière grasse, babeurre) utilisées seules ou en mélange et coagulées en tout ou en partie avant égouttage ou après élimination partielle de la partie aqueuse.
Levains : voir ferments.
Lipolyse : hydrolyse des triglycérides, qui forment 98% de la matière grasse du lait, en diglycérides, monoglycérides, glycérol et acides gras libres.
Matrice aromatique (From’Innov) : partie destinée à apporter la flaveur désirée au produit final.
Matrice de texture (From’Innov) : rétentat produit par ultrafiltration de lait, additionnée de présure, sel, GDL afin d’atteindre les propriétés technologiques désirées.
Perméat : phase aqueuse du lait produit de l’ultrafiltration, qui contient toutes les petites molécules, essentiellement du lactose, des sels minéraux solubles, des composés azotés non protéiques et des vitamines
Protéolyse : hydrolyse des caséines en peptides de plus en plus petits et en acides aminés libres.
Rétentat : phase du lait retenue par les membranes pendant l’ultrafiltration qui contient les macromolécules du lait, les globules gras et les protéines, conduisant à un lait concentré.
Technologie From’Innov : procédé breveté de fabrication de fromage qui se caractérise par la préparation, séparément, d'une matrice de texture et une ou plusieurs matrices aromatiques, qui sont ensuite assemblées pour obtenir le fromage.
Ultrafiltration : technique de filtration tangentielle sur membrane qui permet de séparer des molécules de différentes tailles en suspension ou solution dans un liquide, en donnant d’un côté du perméat et d’autre du rétentat.
LISTE DES ABREVIATIONS
AAL : acides aminés libres AGL : acides gras libres BHI : brain heart infusion BL : bactéries lactiques
BL Cit+ : bactéries lactiques citrate lyase positives
CPG-SM : chromatographie en phase gazeuse couplée avec la spectrométrie de masse DMDS : dimethyl disulfide (anglais) ou disulfure de diméthyle (français)
DMDT : dimethyl trisulfide (anglais) ou trisulfure de diméthyle (français) DO : densité optique
EST : extrait sec total
FRV : facteur de réduction volumique GDL : glucono-delta-lactone
HPLC : high performance liquid chromatography (anglais) ou chromatographie en phase liquide à haute performance
INRAE : Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement
NSLAB : non-starter lactic acid bacteria (anglais) ou bactéries lactiques non-levains PSM : poste de sécurité microbiologique
PUF : perméat d’ultrafiltration de lait
STLO : Science et Technologie du Lait et de l'Œuf UF : ultrafiltration
UV : ultraviolet Ye : extrait de levure YEL : yeast extract lactate
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Classification des fromages proposée par Lenoir et al. (1985). ... p. 3 Figure 2. Voies métaboliques de transformation du lactate par différents microorganismes. ... p. 5
Figure 3. Voies du métabolisme du citrate par les bactéries lactiques citrate-positives. ....p. 5
Figure 4. Voies du catabolisme des acides aminés. ... p. 5 Figure 5. Voies de catabolisme des lipides en composés d'arôme. ... p. 6 Figure 6. Schéma du principe de séparation par ultrafiltration tangentielle sur membrane ... p. 6 Figure 7. Diagrammes de comparaison entre la fabrication conventionnelle de fromage (A) et le procédé MMV (B). ... p. 7 Figure 8. Diagramme de production de fromage selon la technologie From’Innov. ... p. 7 Figure 9. Voies générales de formation des composés d’arôme par des microorganismes utilisés dans le procédé From'Innov. ... p. 8 Figure 10. Équations pour le calcul des masses de rétentat et perméat nécessaires pour fabriquer des matrices à différents facteurs de réduction volumique à partir de rétentat FRV 5,5. ... p. 10 Figure 11. Cinétique de croissance de P. freudenreichii dans du perméat de lait supplémenté avec 5g/L de tryptone, pour chaque concentration d’extrait de levure ajouté. ... p. 12 Figure 12. Variation de la densité optique de P. freudenreichii en fonction de la concentration en extrait de levure du milieu, à différents temps de culture sur un milieu perméat de lait ultrafiltré supplémenté avec 5g/L de tryptone ... p. 13 Figure 13. Cinétique de croissance de Y. lipolytica dans du perméat de lait incubée en fioles Erlenmeyer (volume utile 10 mL/erlenmeyer de 100 mL), pour chaque concentration de tryptone ajouté... p. 13 Figure 14. Cinétique de croissance de Y. lipolytica incubée en tubes. ... p. 13 Figure 15. Cinétique de croissance de H. alvei en fonction du temps de culture pour chaque concentration d’extrait de levure (Ye) supplémenté. ... p. 13 Figure 16. Variation de la densité optique (DO) de H. alvei aux différents temps en fonction de la concentration en extrait de levure (Ye) sur un milieu perméat de lait ultrafiltré supplémenté avec 5g/L de tryptone. ... p. 14 Figure 17. Cinétique d’acidification de rétentat d’ultrafiltration de lait à facteur de concentration volumique FRV 3, selon le pourcentage de GDL ajoutée. ... p. 14 Figure 18. Cinétique d’acidification de rétentat d’ultrafiltration de lait à facteur de concentration volumique FRV 4, selon le pourcentage de glucono-delta-lactone (GDL) ajoutée. ... p. 14
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Les espèces microbiennes sélectionnées pour l'obtention de la matrice aromatique utilisée dans la production de fromage selon la technologie From'Innov (Garric et al., 2016) et les composés d’arôme et notes de flaveur associées (Irlinger et al., 2019). ... p. 9 Tableau 2. Masses d’extrait sec attendues des rétentats à FRVs 3, 4 et 5,5, pour un lait avec un extrait sec total de 13% (m/m). ... p. 10 Tableau 3. Composition des fromages fabriqués pour le suivi de stabilité. ... p. 11
Tableau 4. Quantités de matrice(s) aromatique(s) ajoutées à chaque type de fromage (en grammes par 100 grammes de fromage) ... p. 11 Tableau 5. Concentrations des acides organiques dans les fromages flaveur propionique (F2), flaveur fromagère piquante (F3) et l'assemblage des 4 matrices aromatiques (F5), à jour 1 (J1) et jour 6 (J6) après fabrication. ... p. 15
AVANT-PROPOS
Née en Galice (Espagne), j'ai étudié la médecine vétérinaire à l'université de Saint-Jacques-de-Compostelle. Pendant mes années d'études, ma passion pour la clinique vétérinaire a évolué lorsque j'ai découvert des sujets liés à la technologie alimentaire et à l'hygiène et l'inspection des aliments, et j’ai envisagé de changer le cours de mes études. Quelques mois après avoir obtenu mon diplôme, j'ai commencé un master en innovation en nutrition, sécurité et technologie alimentaires, également à l'université de Saint-Jacques-de-Compostelle. Avant de terminer ce master, j'ai eu le plaisir de rencontrer Sergio Martínez Alonso, responsable de la R&D de l’entreprise Quescrem, qui m'a montré le grand essor du secteur laitier en Galice et la grande opportunité de travail qu'il offre dans cette région. Monsieur Martínez m'a parlé du Master en Sciences et Transformation du Lait d'Agrocampus et j'ai vu l'opportunité de me spécialiser dans le monde des produits laitiers. Pour la réalisation de mon stage de fin d'études, j'ai choisi l’UMR STLO (Science et Technologie du Lait et de l'Œuf) d’INRAE (Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement) et ACO (Agrocampus Ouest), centre de référence d'étude du lait et des produits laitiers. Après ces mois d'étude dans le cadre du projet From'Innov Quescrem appliqué aux besoins de la société galicienne Quescrem en collaboration avec INRAE, le rapport "Optimisation de la base aromatique dans le cadre du projet From’Innov" vous est présenté aujourd'hui.
INTRODUCTION
Le fromage est défini comme le produit fermenté ou non, affiné ou non, obtenu à partir des matières exclusivement d’origine laitière (lait, lait écrémé, crème, matière grasse, babeurre) utilisées seules ou en mélange et coagulées en tout ou en partie avant égouttage ou après élimination partielle de la partie aqueuse (Décret n°2007-628 du 27 avril 2007 relatif aux fromages et spécialités fromagères, 2007).
À l’origine, le fromage est né du besoin de conservation du lait, qui est une denrée alimentaire périssable. Au fil des siècles, une multitude de technologies différentes ont été développées pour préparer des laits à l’affinage pour sa meilleure conservation. Ces technologies ont permis d’obtenir un grand nombre de fromages aux caractéristiques biochimiques et organoleptiques distinctes. Par la suite, la technologie fromagère est devenue une activité économique qui génère de la valeur ajoutée au lait (Mietton & Chablain, 2018).
Depuis que la production de fromage est une activité industrielle, les efforts visant à améliorer l'économie de ces entreprises ont conduit au développement de techniques de production permettant d'augmenter le rendement fromager ou de réduire le temps d'affinage.
La technologie From’Innov a été créée et brevetée (Garric et al., 2016) au sein du laboratoire UMR STLO, afin de réduire de manière significative le temps d’affinage dans la production de fromage. Son principe repose sur l’assemblage d'une matrice de texture et d'une matrice aromatique préparées séparément. Le projet From'Innov Quescrem est né ensuite de la collaboration entre la société galicienne Quescrem et INRAE pour adapter cette technique à la fabrication de fromages à pâte pressée.
Quescrem est une entreprise galicienne consacrée à l'élaboration de produits laitiers, principalement pour les secteurs foodservice, de l'hôtellerie et des restaurants, et à l'innovation et au développement de nouveaux produits (Quiénes somos – INNOLACT, 2020). L'objectif de Quescrem avec le projet From’Innov est d'éliminer le temps d’affinage de la production de fromage conventionnelle et de satisfaire la demande du marché "juste à temps", c'est-à-dire produire en fonction de la demande des clients dans un court délai.
Le projet From'Innov Quescrem vise à concevoir et à développer de nouveaux procédés pour l'obtention de fromages à pâte pressée à haut extrait sec, tels que l'emmental, l'edam, le cheddar et la mozzarella. En plus, le projet vise à optimiser la texture, la flaveur, la durée de conservation et à obtenir des propriétés fonctionnelles améliorées par rapport à ces fromages.
C'est dans ce contexte que mon projet de stage naît de la nécessité d'approfondir l'étude de la matrice aromatique et de l'adapter aux spécifications des fromages produits. Dans un premier temps, Chassagnard (2019) a étudié l'optimisation de la gamme de matrices aromatiques du brevet From'Innov, en utilisant de nouvelles espèces et souches de microorganismes et en optimisant les conditions de culture. Il a été observé pour les espèces initiales utilisées dans le brevet, que pour Propionibacterium freudenreichii et pour Hafnia alvei il y a une amélioration de la production des composés d’arôme lorsqu'ils sont cultivés dans un milieu laitier avec un pourcentage d’extrait sec supérieur à celui utilisé dans le brevet (Chassagnard, 2019).
Les objectifs de mon stage ont été d'optimiser les milieux de préculture des microorganismes et la préparation des matrices aromatiques utilisables pour fabriquer des fromages ciblés par le projet From’Innov, à savoir : i) des fromages à extrait sec élevé, correspondant à des pâtes pressées cuites ou non cuites, ii) avec un arôme correspondant à celui de l’emmental, l’edam, le cheddar ou la mozzarella, et iii) qui puissent être conservés au moins 6 mois à une température de réfrigération positive.
La stratégie suivie a été : i) de comparer la croissance des microorganismes ciblés dans les milieux de préculture à différentes concentrations de suppléments nutritionnels ; ii) de définir un milieu de culture alimentaire avec une teneur élevée en extrait sec afin de permettre le développement des microorganismes sélectionnés et la production des composés d’arôme, et iii) d’étudier l’évolution au cours du stockage de fromages préparés avec différentes matrices aromatiques et soumis à des traitements thermiques d'intensité différente.
Pour ce travail, une revue bibliographique a été réalisée sur la fabrication conventionnelle du fromage et les principales voies de formation de l'arôme par les microorganismes, ainsi que sur la technique de concentration du lait par filtration sur membrane, avant de décrire les bases de la technologie From'Innov. Puis l’ensemble du matériel et des méthodes mis en place pour mener à bien les missions seront décrites avant de détailler et discuter les résultats obtenus.
Figure 1. Classification des fromages proposée par Lenoir et al. (1985).
En bas, les intervalles typiques de composition en extrait sec total (EST), de calcium (Ca), l’humidité dans le fromage dégraissé (HFD) et pour le ratio de la teneur de calcium et de l’extrait sec dégraissé (Ca/ESD) pour chaque famille de fromages.
1 BIBLIOGRAPHIE
1.1 La fabrication conventionnelle du fromage
Principales étapes de la fabrication conventionnelle du fromage
La fabrication conventionnelle du fromage comprend 3 étapes clés successives qui déterminent le type de fromage (Mietton & Chablain, 2018). La première, la coagulation, est le passage de l'état liquide à l'état de gel (coagulum ou caillé) grâce à l’action de la présure et/ou à l'acidification par des bactéries lactiques ajoutées au lait. La seconde, l'égouttage, est l’étape d’expulsion du lactosérum permettant de concentrer les caséines et la matière grasse du lait gélifié. La sortie du lactosérum du caillé est également favorisée lors du moulage et lors du pressage, dans les fromages où ce dernier est réalisé. La troisième étape clé, l’affinage, correspond à une phase de transformation biochimique complexe du caillé, où les microorganismes ont un rôle clé, jusqu’à l’obtention de l’aspect, la composition, la structure, la texture et la flaveur du fromage final. La flaveur est définie comme l’ensemble des sensations gustatives et olfactives perçues lorsqu'un aliment est en bouche. Dans le fromage, la flaveur dépend essentiellement des composés sapides et odorants produits au long de l’affinage.
Ces trois étapes sont indispensables dans la fabrication conventionnelle de fromage. De plus pour une bonne maîtrise technologique, il est courant de standardiser la composition du lait (matière grasse, protéines, minéraux...) et le traiter thermiquement pour réduire la charge microbienne avant la fabrication et pour augmenter le rendement en fabrication conventionnelle. Enfin, la phase de salage a une action directe sur le goût, ainsi que sur l'activité de l'eau du fromage. Elle est le plus souvent réalisée après le démoulage, mais peut être effectuée à des moments différents selon la technique d’élaboration.
Classification des fromages
La classification proposée par Lenoir et al. (1985) (Figure 1) montre la diversité des fromages, différenciés par les modalités de coagulation, d’égouttage et d’affinage. La technologie utilisée permet d’obtenir une très grande variété de fromages selon que i) la coagulation est induite par action enzymatique et/ou acidification, et que ii) la cinétique d’égouttage, lente ou forcée par découpage, par action mécanique et/ou thermique, conditionne l’extrait sec total (EST).
D'après ces modalités de coagulation et d’égouttage, les pâtes obtenues sont classées selon leur teneur en EST comme pâtes fraiches (25-30 %), pâtes molles (45-50 %), pâtes pressées non cuites (50-55 %) et pâtes pressées cuites (62-65 %). Ensuite, elles sont soumises à une période d'affinage, sauf pour les pâtes fraîches qui sont prêtes à la consommation après l'égouttage. L’affinage peut durer de quelques semaines à des mois ou des années, ce qui influencera l'EST final du fromage en fabrication conventionnelle.
L’affinage
1.1.3.1 Importance des agents d’affinage
L'affinage est une étape cruciale pour obtenir les attributs sensoriels caractéristiques d'un fromage, ainsi que l’aspect et la composition finaux. Au cours du processus d’affinage, le caillé subit des transformations plus ou moins profondes, en particulier du lactose, du citrate, des protéines et des lipides (Gagnaire et al., 2018). Plus le temps est long, plus les réactions biochimiques sont complexes et plus les changements de composition et de caractéristiques sensorielles sont prononcés. Pour que les modifications puissent être
effectuées, trois éléments indispensables doivent être présents pendant l’étape d'affinage : i) les agents d'affinage (enzymes et/ou microorganismes endogènes du lait ou ajoutés), ii) le substrat (support et lieu d'action des agents) et iii) l'environnement (température, humidité relative, atmosphère, etc.). Ces éléments forment un écosystème pendant l’affinage, que Lenoir et al. (1985) appelle le « bioréacteur » fromage.
Les agents d’affinage catalysent les réactions biochimiques. Les enzymes peuvent provenir du lait, comme la lipoprotéine lipase et la plasmine, être des enzymes protéolytiques ajoutées comme coagulants, comme la chymosine, la pepsine et la trypsine, ou des enzymes excrétées par les microorganismes, ajoutés ou non (Jeantet et al., 2017). Les microorganismes qui contribuent à l’affinage peuvent être classés selon le groupe microbien auquel ils appartiennent (des bactéries, des levures et des moisissures) (Desmasures & Irlinger, 2018), selon leur fonctionnalité principale au sein du fromage (acidification ou affinage) (Canteri & Monnet, 2018; Desmasures & Irlinger, 2018) ou selon leur origine, c’est-à-dire, qu'ils soient délibérément introduits dans le fromage (ferments, également appelés levains) ou non (Canteri & Monnet, 2018; Montel & Beuvier, 2018).
Le classement selon leur fonctionnalité principale sépare les ferments acidifiants et les ferments d'affinage, bien que tous deux jouent leur rôle dans l'affinage du fromage. Les levains acidifiants sont des bactéries lactiques (BL, ou starters en anglais) qui fermentent le lactose en acide lactique, provoquant l'acidification du milieu, mais ils sont aussi capables d’hydrolyser les protéines et les peptides pour leur nutrition azotée. Ces bactéries jouent un rôle essentiel dans la production des fromages dont elles constituent la communauté microbienne de base. Parmi ce groupe, nous retrouvons les genres Lactococcus spp. (principalement l’espèce Lactococcus lactis), Leuconostoc spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp. et Pediococcus spp. (Canteri & Monnet, 2018). Les levains utilisés pendant l’affinage sont appelés ferments secondaires (Thierry, 2017). Parmi ceux-ci figurent des levures (Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Geotrichum candidum…), des moisissures (Penicillium roqueforti, Penicillium camemberti…), des bactéries du phylum des Firmicutes (Staphylococci et bactéries lactiques non-levains [non-starter lactic acid bacteria ou NSLAB en anglais]), des Actinobactéries (P. freudenreichii, Brevibacterium spp., Corynebacterium spp., Arthrobacter spp. …) et des Protéobactéries (H. alvei, Halomonas spp., Pseudomonas spp. …) (Desmasures & Irlinger, 2018).
1.1.3.2 Voies générales de formation des composés d’arôme du fromage
Le degré d’affinage détermine les composés d’arôme produits dans le fromage. Plus de 600 composés volatils ont été identifiés dans le fromage (Maarse & Visscher, 1989), mais seule une petite fraction d'entre eux (<3%) sont des composés d’arôme, c’est-à-dire des composés impliqués dans la flaveur de ces produits (Dunkel et al., 2014). Dans les cas des fromages affinés, la communauté de microorganismes qui se développe dans le caillé et/ou en surface sur la croûte provoque une cascade de réactions biochimiques qui génèrent des composés d’arôme (Khattab et al., 2019). Ces composés d’arôme appartiennent à différentes classes chimiques telles que des acides, des alcools, des cétones, des esters, des lactones, des furanes, des composés azotés, des composés soufrés et des terpènes (Curioni & Bosset, 2002).
La connaissance sur les voies de formation d’arômes et sur les microorganismes et enzymes impliqués permet de choisir des espèces et des souches ayant le potentiel de produire des composés d’arôme désirés et éventuellement des précurseurs d’arôme.
Figure 2. Voies métaboliques de transformation du lactate par différents microorganismes.
Précurseurs de composés d’arôme = encadré vert; composés d’arôme = encadré bleu ; microorganismes = rectangles jaune; NSLAB = bactéries lactiques non-levains (tiré de McSweeney & Fox, 2017).
Figure 3. Voies du métabolisme du citrate par les bactéries lactiques citrate-positives.
Précurseurs de composés d’arôme = encadré vert; composés d’arôme = encadré bleu ; enzymes = italique rouge; microorganismes = rectangle jaune ; BL Cit+ = bactéries lactiques citrate lyase positives (tiré de McSweeney & Fox, 2017).
Figure 4. Voies du catabolisme des acides aminés.
Réactions principales des vois du catabolisme des acides aminés = rectangle rose; précurseurs de composés d’arôme = encadré vert; composés d’arôme = encadré bleu ; DMDS = diméthyldisulfure ; DMTS = diméthyltrisulfure (tiré de Yvon & Rijnen, 2001).
Il y a trois voies principales de formation des composés d’arôme (Gagnaire et al., 2018): I) Métabolisme du lactose, du lactate et du citrate
Les bactéries lactiques homofermentaires métabolisent le lactose via les voies de fermentation homolactique, en donnant le lactate (ou acide lactique). D'autre part, il y a des bactéries lactiques hétérofermentaires qui produisent en plus du lactate, de l’éthanol, du formate, de l’acétate et du gaz carbonique (CO2).
Le lactate résultant de la fermentation du lactose peut être transformé par différentes voies métaboliques, mais toutes n'entraînent pas la formation des composés d’arôme (Figure 2) (McSweeney & Fox, 2017). Certains microorganismes, comme Propionibacterium spp., utilisé principalement dans la fabrication de l'emmental, métabolisent le lactate en acétate, propionate, CO2 et H2O. Quelques NSLAB peuvent également consommer du lactate pendant la phase d’affinage en donnant du formate et de l’acétate.
Certaines souches de BL, par exemple L. lactis biovar diacetylactis ou Leuconostoc spp., métabolisent le citrate grâce à la production de citrate lyase. Les principaux composés d’arôme formés sont l’acétate, le diacétyle (2,3-butanedione) et l’acétoïne (2-hydroxy-3-butanone) (Figure 3), ces deux derniers donnent l'arôme caractéristique du beurre.
II) Protéolyse et catabolisme des acides aminés
La protéolyse implique l'hydrolyse des caséines en peptides de plus en plus petits et en acides aminés libres par certaines enzymes protéolytiques ou des enzymes des microorganismes comme les BL. Outre la formation des composés d’arôme, la protéolyse a une grande importance dans les changements de texture du fromage (Gagnaire et al., 2018).
Certains peptides et acides aminés sont sapides et participent à la flaveur du fromage, mais ils sont aussi des précurseurs d'arôme. Tout au long du processus d’affinage, certains microorganismes produisent des composés d’arôme par le catabolisme des acides aminés, principalement de trois types : i) les acides aminés à chaîne ramifiée (leucine, isoleucine, valine), ii) les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryptophane), et iii) les acides aminés soufrés (méthionine). Suivant les espèces microbiennes présentes dans les fromages, à partir d’un même acide aminé, les molécules finales seront différentes. En général, le catabolisme des acides aminés se fait par deux voies différentes (Figure 4). La première voie est généralement initiée par des transaminases microbiennes et constitue la principale voie de dégradation des acides aminés aromatiques et les acides aminés à chaîne ramifiée par les BL et les bactéries propioniques. Après la réaction de transamination, ces composés continuent leur transformation grâce à l'action de différentes enzymes donnant naissance à des alcools, des aldéhydes, des acides et des esters. La seconde voie, principalement observée pour la méthionine, bien qu'elle ne soit pas exclusive à cet acide aminé, est initiée par une réaction d'élimination et conduit à des composés d’arôme soufrés majeurs comme le disulfure de diméthyle (DMDS ou dimethyl disulfide en anglais) et le trisulfure de diméthyle (DMTS ou dimethyl trisulfide en anglais) (Yvon & Rijnen, 2001). Cette voie de formation des composés soufrés est plus typique des microorganismes de la croûte ou d'autres microorganismes, tels que H. alvei, qui est capable de produire de grandes quantités des composés volatils soufrés (Pogačić et al., 2015), notamment lorsqu'elle est en coculture avec Psychrobacter celer (Irlinger et al., 2012).
Figure 5. Voies de catabolisme des lipides en composés d'arôme.
Réactions principales des vois du catabolisme des acides aminés = rectangle rose; précurseurs de composés d’arôme = encadré vert; composés d’arôme = encadré bleu ; enzymes = italique rouge (tiré de Spinnler, 2011).
Figure 6. Schéma du principe de séparation par ultrafiltration tangentielle sur membrane
Le schéma 6A montre une membrane d'ultrafiltration où le lait entre et le rétentat et le perméat sortent. Comme nous le voyons plus en détail en 6B, les molécules plus petites que les pores de la membrane passent librement à travers elle, en raison de la pression transmembranaire exercée, et le flux tangentiel permet de limiter le colmatage lié au dépôt des molécules retenues dans le rétentat.
III) Lipolyse et catabolisme des acides gras libres
La lipolyse est l'hydrolyse des triglycérides, qui forment 98% de la matière grasse du lait, en diglycérides, monoglycérides, glycérol et acides gras libres (AGL). Cette réaction est catalysée par des lipases, en particulier celles provenant de microorganismes tels que des moisissures comme le genre Geotrichum. La lipolyse est essentielle pour le développement de la flaveur du fromage surtout dans les fromages bleus ou à pâte persillée où le degré de lipolyse est du 10-20% m/m (proportion d’acides gras libres par rapport à la matière grasse). Autres fromages comme l’edam ou le cheddar ont un degré de lipolyse de 0,4-0,5%, à peine supérieur à celui du lait de fabrication. Malgré tout, une faible taux de lipolyse des AGL joue un rôle dans la flaveur quand même (Thierry et al., 2017).
Les acides gras à chaîne courte contribuent directement à la flaveur et sont également des précurseurs d'autres composés d’arôme, tels que les esters, les lactones, méthylcétones, alcools méthyliques secondaires et des aldéhydes (Spinnler, 2011).
La Figure 5 montre les principales voies de formation des composés d’arôme du catabolisme des lipides dans le fromage. D’une part, la réaction d’estérification produit des esters à partir d’acides carboxyliques avec les alcools, qui contribuent à la flaveur fruitée des fromages (Liu et al., 2004). L'alcool le plus courant dans les fromages est l'éthanol, qui provient de la fermentation du lactose ou du citrate et est le facteur limitant dans la synthèse des esters éthyliques dans certains fromages comme cheddar et emmental (Thierry et al., 2006). Ces esters peuvent également être produits par alcoolyse à partir d'alcools et d'acylglycérols dérivés du métabolisme des acides gras ou d'alcools et des acides carboxyliques (Liu et al., 2004). D’autre part, par des réactions d’oxydation, effectuées par des moisissures comme P. camemberti et P. roqueforti, les acides gras saturés forment les méthylcétones, qui donnent aux fromages à pâte persillée leur flaveur typique de bleu. Les méthylcétones peuvent donner naissance à des alcools secondaires dont certains sont associés à une flaveur caractéristique de champignon. D'autres réactions chimiques sont responsables de la transformation des acides gras insaturés en lactones, alcools, aldéhydes et acides.
À l'exception des BL, qui sont faiblement lipolytiques en comparaison aux autres microorganismes, tous les groupes microbiens ont une activité lipolytique significative, qui dépend des espèces et des souches (Desmasures & Irlinger, 2018). C'est pourquoi des microorganismes secondaires à forte activité lipolytique sont ajoutés dans les fromages où la lipolyse est souhaitée.
1.2 Le procédé MMV
L’avènement des technologies à membrane utilisées dans le procédé MMV (du nom de ses inventeurs Maubois-Mocquot-Vassal) (Maubois et al., 1971), a permis de modifier l’ordre conventionnel des étapes de fabrication en égouttage puis coagulation et affinage. Le procédé MMV utilise l'ultrafiltration (UF), une technique de filtration tangentielle sur membrane qui permet de séparer des molécules de différentes tailles en suspension ou solution dans un liquide. Comme nous pouvons voir dans la Figure 6, d’une part, ces membranes permettent le passage du perméat, c’est-à-dire, la phase aqueuse du lait, qui contient toutes les petites molécules, essentiellement du lactose, des sels minéraux solubles, des composés azotés non protéiques et des vitamines. D’autre part, elles permettent de retenir des macromolécules du lait (les globules gras et les protéines), conduisant à un lait concentré en protéines et matières grasses (MG), appelé rétentat ou
Figure 7. Diagrammes de comparaison entre la fabrication conventionnelle de fromage (A) et le procédé MMV (B). La couleur bleue représente les étapes où la phase aqueuse du lait (sérum en A et perméat en B) est libérée. La couleur verte représente les étapes liées à la texturation, dans ces processus, la coagulation et le salage. La couleur rose saumon représente l'affinage
Figure 8. Diagramme de production de fromage selon la technologie From’Innov.
La matrice de texture et la ou les matrice(s) aromatique(s) sont produits séparément. La couleur bleue représente l’étape où la phase aqueuse du lait est éliminée. La couleur verte représente les étapes liées à la texturation (salage, acidification et coagulation). La couleur rose saumon représente la production de la ou des matrice(s) aromatique(s). L’ensemble de la procédure de fabrication du fromage peut être effectuée en 2 ou 3 jours.
préfromage liquide (Maubois, 2018). En bref, l’emploi de l’UF permet de concentrer spécifiquement la matière grasse et les protéines du lait dans une phase aqueuse non modifiée.
Grâce à l’UF, le lait peut être concentré à différents FRVs (facteurs de réduction volumique), c’est-à-dire différents niveaux de concentration, ce qui permet d’augmenter sa teneur en extrait sec jusqu’à 48% (FRV 6). Le procédé MMV cherche à obtenir, avant de réaliser la phase de coagulation, un rétentat de même composition que le fromage final, c'est-à-dire celui qui serait obtenu dans le fromage égoutté selon une technologie traditionnelle (Maubois & Mocquot, 1975). Ainsi, comme nous pouvons le voir sur la Figure 7, l’opération d’UF se substitue aux phases où il y a de la perte de sérum (l’égouttage, le moulage et le pressage) dans les technologies fromagères conventionnelles. L'inconvénient de la phase d'égouttage est qu’une partie des protéines du sérum sont évacuées dans le sérum. L’UF permet de récupérer plus de protéines dans le fromage (plus de 98%) et de cette manière d’augmenter le rendement fromager (Maubois et al., 1971).
1.3 La technologie From’Innov
Généralités de la technologie From’Innov
La technologie From'Innov est un procédé breveté de fabrication de fromage qui se caractérise par la préparation, séparément, d'une matrice de texture et une ou plusieurs matrices aromatiques, qui sont ensuite assemblées pour obtenir un fromage présentant les caractéristiques rhéologiques et organoleptiques souhaitées (Garric et al., 2016).
Pour préparer la matrice de texture, From’Innov utilise l’UF pour concentrer le lait, selon le procédé MMV. Dans ce dernier, comme dans la fabrication conventionnelle, les fromages passent par une phase d'affinage de plusieurs semaines à plusieurs mois pour laisser aux microorganismes le temps de produire les arômes caractéristiques attendus (Figure 7B). Le procédé From'Innov a été développé pour raccourcir l’affinage en construisant séparément la texture et l'arôme du fromage (Garric et al., 2016). Selon From’Innov, des matrices aromatiques sont préparées par fermentation de différents milieux laitiers par des microorganismes traditionnels d’affinage du fromage. Ces matrices aromatiques sont ajoutées à la matrice de texture liquide avant la coagulation (Figure 8). Comme les composés d’arôme sont déjà présents, le temps d’affinage est partiellement ou totalement réduit, selon le type de fromage produit (Chamberland et al., 2019).
La technologie From'Innov offre ainsi des possibilités pour améliorer l'efficacité de la fabrication du fromage. Comme nous l'avons vu, ce processus augmente le rendement en fromage, en raison du taux de récupération des protéines plus élevé, et réduit considérablement le temps d'affinage. En outre, l’étude de Chamberland et al. a montré le potentiel du procédé From'Innov pour réduire la consommation d'eau et d'énergie lors de la fabrication de camembert, par rapport à un procédé de fabrication traditionnel et au procédé MMV (Chamberland et al., 2019).
La matrice de texture
La matrice de texture est un rétentat produit par ultrafiltration de lait préalablement pasteurisé (selon la méthode MMV). Le FRV auquel le lait est soumis dépend du type de fromage à fabriquer. Ainsi, le rétentat utilisé pour obtenir des fromages à pâte molle aura
Figure 9. Voies générales de formation des composés d’arôme par des microorganismes utilisés dans le procédé From'Innov.
Précurseurs de composés d’arôme = encadré vert ; composés d’arôme = encadré bleu ; enzymes = italique rouge ; microorganismes = rectangles jaunes ; BL = bactéries lactiques ; Ll = Lactococcus lactis ; Pf = Propionibacterium freudenreichii ; Ha = Hafnia alvei ; Yl = Yarrowia lipolytica ; AAL = acides aminés libres ; Leu = leucine ; Iso = isoleucine ; Val = valine ; Try = tryptophane ; Phe = phénylalanine ; Tyr = tyrosine ; Met = méthionine ; AGL = acides gras libres.
un FRV plus faible que celui produit pour obtenir des fromages à pâte pressée (Garric et al., 2016).
La(les) matrice(s) aromatique(s)
La matrice aromatique constitue la partie destinée à apporter la flaveur désirée au produit final. Sa consistance peut varier de liquide à épaisse et dépend de la quantité ajoutée au mélange et de l'extrait sec final du fromage désiré. La matrice aromatique résulte de la fermentation d'un milieu laitier par au moins un microorganisme parmi ceux utilisés habituellement pour l’affinage des fromages fabriqués selon une technologie conventionnelle. Ce milieu laitier peut être soit du lait, de la crème, du lactosérum ou du rétentat, supplémentés ou non (Garric et al., 2016).
L’étape de mélange et l’étape de texturation
Après la fabrication en parallèle de la matrice de texture et de la(les) matrice(s) aromatique(s), celles-ci sont assemblées et passent à l’étape de texturation. Le salage, l'ajustement du pH, en utilisant comme additif de la GDL (glucono-delta-lactone), et la coagulation, en utilisant de la présure, sont effectués (Figure 8). La texture finale du fromage produit dépend des conditions physico-chimiques telles que la température, le pH, la dose de coagulant, la concentration en sel et éventuellement, s'ils sont utilisés, la concentration et la nature des agents gélifiants ou épaississants (Garric et al., 2016).
1.4 Microorganismes ciblés pour la production des matrices aromatiques du brevet From’Innov
Le brevet From'Innov décrit divers microorganismes qui peuvent être cultivés pour obtenir les composés d’arôme souhaités, principalement les microorganismes d’affinage. Dans le brevet From'Innov, quatre espèces de microorganismes ont été utilisées pour la préparation de la matrice aromatique : L. lactis (ssp. lactis, ssp. cremoris et biovar diacetylactis), Propionibacterium spp., H. alvei et Y. lipolytica.
Les espèces choisies interviennent dans les différentes voies métaboliques, et sont cultivées de façon qu'elles produisent en grande quantité les composés d’arôme qui doivent être perceptibles sensoriellement même après l’insertion de la matrice aromatique dans la matrice de texture. La Figure 9 montre les différentes voies métaboliques suivies lors de l’affinage du fromage et où les microorganismes visés par le brevet sont impliqués. L. lactis est une BL essentielle pour l’acidification du milieu et le développement de la flaveur du fromage. Les souches de L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis transforment le lactose en lactate, mais peuvent aussi métaboliser le citrate en produisant du diacétyle (flaveur du beurre), de l’acétoïne (beurre) et de l’acétaldéhyde (piquant, fruité), qui sont leurs principales contributions à la flaveur des produits laitiers. Lorsque ces bactéries meurent et sont lysées, certaines de leurs enzymes sont libérées dans l'environnement dont les peptidases, qui participent à la formation de peptides et d'acides aminés libres tels que la méthionine, l'histidine, la glycine, la sérine et l'acide glutamique, qui forment des substrats pour la microflore secondaire (Urbach, 1995) et des précurseurs de composés d’arôme.
P. freudenreichii est connue pour former de l’acide propionique, de l’acide acétique et du CO2 à partir de la fermentation du lactate, qui donnent la flaveur et l’apparence typiques de l’emmental. En outre, P. freudenreichii est impliqué dans la lipolyse qui conduit à la formation d'acides gras libres et dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée (Thierry, 2004).
Tableau 1. Les espèces microbiennes sélectionnées pour l'obtention de la matrice aromatique utilisée dans la production de fromage selon la technologie From'Innov (Garric et al., 2016) et les composés d’arôme et notes de flaveur associées (Irlinger et al., 2019).
Microorganismes Voie d’activité Composés d’arôme produits Flaveur associée
Lactococcus lactis
subsp. lactis var. diacetylactis Fermentation du lactose Fermentation du citrate Acide lactique Acétoïne Diacétyle Acétaldéhyde Acide acétique Lactique Beurre Beurre Piquant, fruité Vinaigre Propionibacterium freudenreichii Fermentation du lactate
Catabolisme des acides aminés ramifiés Lipolyse Acide propionique Acide acétique Acides 2-methyl- et 3-méthylbutanoique
Acides gras libres
Emmental Vinaigre
Vieux fromage
Acide, fromage, rance
Hafnia alvei Catabolisme de la méthionine Méthanethiol et autres composés
soufrés volatils
Soufré, aillé, chou, …
Yarrowia lipolytica
Lipolyse Acide butanoïque et autres acides
gras (nombre C < 12)
Le genre Hafnia fait partie de la famille des entérobactéries. L'espèce H. alvei a été isolée à partir de lait de vache cru et est commercialisée comme ferment de maturation (Desmasures & Irlinger, 2018). H. alvei se caractérise par la production de composés soufrés (méthanethiol, DMDS et DMTS) (Pogačić et al., 2015).
Y. lipolytica est une levure rarement utilisée comme ferment d’affinage. Elle se développe dans certains fromages, généralement de manière spontanée, puisqu'elle est présente dans l'environnement des fromageries. Y. lipolytica se caractérise par une activité lipolytique extracellulaire. Y. lipolytica est associée à la production d’acides gras libres dont l’acide butanoïque, aussi appelé acide butyrique qui confèrent au fromage de notes piquantes ou rances, selon leur concentration, et des esters contribuant à l’arôme fruité (Desmasures & Irlinger, 2018).
Le Tableau 1 résume les voies d'activité des microorganismes décrits dans le brevet From'Innov, les composés d’arôme produits dans chacune des voies et la flaveur associée à ces composés. Les différentes notes aromatiques sont désirables ou indésirables selon leur intensité et le type de fromage. En d’autres termes, un composé d’arôme donné peut être recherchés dans un fromage, mais s’il est en excès, il peut être responsable de défauts de flaveur.
2 MATERIELS ET METHODES 2.1 Matériel biologique
Les souches utilisées sont Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA1T, Hafnia alvei CIRM-BIA1823, Yarrowia lipolytica CLIB183T.
Les microorganismes ont été fournis par le CIRM et ont été conservés dans un stockage cryogénique à -80°C. Pour revivifier les microorganismes, il a été utilisé comme premier milieu de préculture le YEL ("yeast extract lactate" ou extrait de levure lactate) à 30°C pour P. freudenreichii et le BHI ("brain heart infusion" ou infusion cœur-cervelle) à 30°C incubé de façon statique pour H. alvei et à 27°C en agitation (130 rpm) pour Y. lipolytica. Les microorganismes ont été inoculés à 5% dans le milieu de préculture.
2.2 Préparation du rétentat et du perméat
Le rétentat et le perméat de lait ont été obtenus par UF à la Plateforme Lait du STLO via un pilote avec 3 membranes en céramique de 19 canaux de 6 mm de diamètre interne. La surface membranaire de 1,08 m2. Le seuil de coupure est de 15 kDa.
2.3 Milieux et conditions de préculture
Les précultures des microorganismes utilisées pour la fabrication des fromages ont été réalisées dans du PUF (perméat de lait ultrafiltré) supplémenté en peptone de caséine (tryptone, Biokar) 5 g/L et en extrait de levure (Ye, Biokar ) 2 g/L pour P. freudenreichii (incubation statique en tubes 3 j à 30°C) et pour H. alvei (incubation statique en tubes 2 j à 30°C) ; et dans du PUF supplémenté en tryptone 5 g/L pour Y. lipolytica (incubation en tubes 2 j à 27°C sous agitation à 130 rpm).
Une optimisation des milieux de préculture a été réalisée dans du PUF supplémenté en tryptone 5 g/L et Ye à des concentrations de 0, 0,1, 0,3, 0,5, 1 et 2 g/L pour P. freudenreichii (incubation statique en tubes pendant 6 j à 30°C) et pour H. alvei (incubation statique en tubes 2 j à 30°C) ; et dans du PUF supplémenté en tryptone à des
Tableau 2. Masses d’extrait sec attendues des rétentats à FRVs 3, 4 et 5,5, pour un lait avec un extrait sec total de 13% (m/m).
Figure 10. Équations pour le calcul des masses de rétentat et perméat nécessaires pour fabriquer des matrices à différents facteurs de réduction volumique à partir de rétentat FRV 5,5.
concentrations de 0, 0,5, 1, 2,5 et 5 g/L pour Y. lipolytica (incubation sous agitation à 130 rpm 4 j à 27°C, en tubes (10 mL / tube de 20 mL) et en fioles Erlenmeyer remplies à 10 % du volume total.
Les milieux de préculture ont été stérilisés par filtration sur filtres-seringues de diamètre de pores 0,2 µm (Minisart®). La préparation des milieux et l’ensemencement des microorganismes ont été faits sous poste de sécurité microbiologique (PSM). Tous les ensemencements ont été faits à 1% à partir d’une culture de 24 à 48 h.
2.4 Suivi de la croissance des microorganismes
La croissance des microorganismes a été déterminé de manière indirecte par spectrophotométrie, en mesurant la densité optique (DO) du milieu à une longueur d'onde de 650 nm.
2.5 Milieux de culture pour les matrices aromatiques
Deux concentrations de rétentat d’ultrafiltration de lait entier de vache, FRV 3 et FRV 4, ont été comparées pour sélectionner la plus pertinente pour la production des matrices aromatiques. Ces rétentats ont été préparés en diluant du rétentat frais FRV 5,5 (extrait sec du 45,16%) et du perméat issu d’un stock congelé.
Le Tableau 2 montre les masses d’EST attendues pour les rétentats à FRV 3, 4 et 5. Connaissant l'extrait sec de rétentat (ESTRET5) et de perméat (ESTPER5) à FRV 5,5, l'extrait sec (ESTFRV) et la masse de milieu que l'on veut obtenir (mFRV), nous pouvons calculer par les équations de la Figure 10 les masses de rétentat (mRET5) et de perméat (mPER5) à FRV 5,5 nécessaires pour fabriquer les matrices à FRV 3 et 4.
Pour étudier le comportement d'acidification de ces milieux, la GDL a été utilisée comme acidifiant. À cette fin, de la GDL a été ajoutée aux rétentats FRV 3 et 4, à des pourcentages de 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 3 % et 4 %, à une température de 35ºC.
2.6 Préparation des matrices aromatiques
Des matrices aromatiques correspondant aux flaveurs propionique, piquante et soufrée ont été préparées en rétentat de lait entier à FRV 3. Les rétentats supplémentés ont été stérilisés à l’autoclave 30 min à 110°C.
Pour préparer la matrice flaveur propionique, P. freudenreichii a été cultivé en rétentat supplémenté en tryptone 5 g/L et en Ye 2 g/L et a été incubé 6 j à 30°C. Pour la flaveur fromagère piquante, Y. lipolytica a été cultivé en rétentat à 27°C pendant 3 j sous agitation (130 rpm, volume utile 200 mL/erlenmeyer de 2 L). La matrice pour produire la flaveur soufrée a été réalisée par culture de H. alvei en rétentat supplémenté en méthionine 5 g/L, incubé 3 j à 30°C.
Les ensemencements ont été faits sous PSM.
La flaveur diacétyle est apportée par une matrice aromatique « NIZO », fournie par la Laiterie Coralis.
2.7 Fabrications fromagères
Pour la fabrication de la matrice de texture des fromages, le lait entier cru a subi un traitement thermique de pasteurisation à 72ºC pendant 20 s. Ensuite, le lait a été ultrafiltré
Tableau 3. Composition des fromages fabriqués pour le suivi de stabilité.
Tableau 4. Quantités de matrice(s) aromatique(s) ajoutées à chaque type de fromage (en grammes par 100 grammes de fromage).
Quatre fromages ont été fabriqués pour chacune des quatre matrices aromatiques (à une concentration de 8 grammes pour 100 grammes de fromage) ; un autre fromage a été fabriqué avec les quatre matrices aromatiques ensemble (à raison de 2 grammes de chaque matrice aromatique pour 100 grammes de fromage).
jusqu’à un FRV de 5,5. Le rétentat obtenu a été congelé à -18°C. En parallèle, la matrice aromatique a été préparée comme indiqué en 2.6. Préparation des matrices aromatiques. Le rétentat FRV 5,5 a été décongelé lentement pendant 24 h en chambre froide (4°C). Pour la production de fromage, ce dernier a été chauffé dans un bain-marie à 50°C. La matrice de texture a été mélangée à la matrice aromatique, préparée en amont dans les proportions indiquées dans les Tableau 3 et mélangée dans un Thermomix® TM6 Vorwerk (vitesse 3, 30 s à 50°C) afin de former le pré-fromage. 5 types de fromages ont été produits (Tableau 4) : F1 correspondant à la flaveur diacétyle, F2 flaveur propionique, F3 flaveur fromagère piquante, F4 flaveur soufrée et F5 les quatre flaveurs.
Trois types de traitement thermique ont été effectués : i) aucun traitement thermique, ii) un traitement thermique à 60°C pendant 30 s, et iii) un traitement thermique à 72°C pendant 30 s. Le pré-fromage a ensuite été refroidi à 35°C dans un bain d'eau glacée (environ 10-15 min pour les fromages sans traitement thermique, 15-20 min pour un traitement à 60°C et 25-30 min pour un traitement à 72°C). Ensuite, le sel (préalablement stérilisé au four Pasteur 180°C/2 h) et la GDL ont été ajoutés, selon les quantités définies dans le Tableau 3 et mélangés dans le Thermomix (vitesse 3, 15 min à 35°C). La présure (extrait de présure CarlinaTM 145/80) a été diluée en eau distillée (1 :10) et ajoutée à 0,3 mL/kg au pré-fromage (mélange à vitesse 3, pendant 10 s à 35°C). Les produits ont été conditionnés dans des flacons plastique de 30 g. Les fromages ont été étuvés (2 h à 35°C) puis réfrigérés à 4°C.
2.8 Suivi de la stabilité du fromage lors du stockage
Deux suivis ont été effectués pendant la durée de vie prévue du produit (6 mois).
Tout d'abord, les indicateurs de l'activité des microorganismes utilisés pour la production des matrices aromatiques ont été suivis : diacétyle et acétoïne (fromages à flaveur diacétyle), acide propionique (fromages à flaveur propionique), acide butanoïque (fromages à flaveur fromagère piquante), composés soufrés DMDS et DMTS (fromages à flaveur soufrée). Le diacétyle, acetoïne et les composés soufrés ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée avec un spectromètre de masse (CPG-SM) et les acides propionique et butanoïque par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC ou high performance liquid chromatography) (voir 2.9. Analyse des composés d’arôme). Les analyses se poursuivront pendant 4 mois (J1, J6, S2, S4, S8, S12 et S16).
Pour établir la date de durabilité minimale (DDM) 3 tests ont été réalisés :
1) suivi pendant 6 mois du produit stocké au froid à 4ºC : analyse de microorganismes thermorésistants et de microorganismes d'altération (une fois par mois pendant 6 mois) et contrôle des pathogènes en début et en fin de vie ;
2) suivi pendant 6 mois, avec un stockage de 2 mois à 4°C, puis décrochage de température à 20°C pendant 2 h, puis stockage à 8°C pendant 4 mois : même analyse que ci-dessus ;
3) suivi d’un vieillissement accéléré 7 j à 4°C puis 72 h à 11°C puis stockage à 4°C jusqu’à J25 : analyse de Pseudomonas, levures/moisissures et E. coli à J3/J7 et J/25.
Figure 11. Cinétique de croissance de P. freudenreichii dans du perméat de lait supplémenté avec 5g/L de tryptone, pour chaque concentration d’extrait de levure ajouté.
0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 120 140 160 DO Temps (h) Ye 2 Ye 1 Ye 0.5 Ye 0.1 Ye 0
2.9 Analyse des composés d’arôme
Les acides organiques (acides lactique, acétique, propionique, butanoïque et citrique) ont été extraits dans l’eau selon (Kuchroo & Fox, 1982). L’objectif de cette extraction est d’isoler la phase aqueuse de l’échantillon, qui contient les composés hydrophiles (acides organiques, sucres) des protéines, microorganismes et matières grasses. Pour cela, l’échantillon est dilué dans de l’eau distillée chauffée à 50°C (1 poids de fromage par 2 poids de l’eau distillée), puis il est broyé à l’ultraturrax (2 min à 20400 rpm) et est centrifugé (12 g du mélange, 15 min à une force de centrifugation relative (FCR) de 3000 g, 4ºC) se séparant en trois phases : i) phase de matière grasse, en surface ; ii) phase aqueuse ; iii) culot contenant des protéines et les microorganismes. La phase aqueuse obtenue est diluée dans une solution d’H2SO4 0,01M (1 volume de phase aqueuse par 1 volume de H2SO4 0,01M). Les échantillons ont été congelés en tubes Eppendorf de 2 mL. Ensuite, ils ont été décongelés et centrifugés (20 min à une accélération de 8000 g, 4ºC). Les échantillons ont été filtrés sur des unités Vivaspin® Sartorius (polyethersulfone, seuil de coupure de 10 kDas) puis centrifugés (20 min 8000 g, 4ºC). La phase aqueuse a été récupérée et mise en vial. L’échantillon ainsi préparé est injecté dans une colonne échangeuse d’ions afin d’y être analysé par HPLC selon Le Boucher et al. (2016). La détection s’effectue par réfractométrie et par UV à 210 nm. Le traitement des données est réalisé avec le logiciel ChromeleonTM.
Pour l’analyse des composés volatils, les fromages ont été découpés au couteau en cubes de 2-5 mm de côté et 2,5 g ont été transférés dans des flacons Perkin Elmer de 22 mL et conservés à -80 °C jusqu'à l'analyse. Le principe de l’extraction est de créer un équilibre de concentration des composés volatils entre l’échantillon, solide, et l’espace de tête ou « headspace », de transférer les composés volatils de l’espace de tête sur un piège adsorbant, puis de les désorber par chauffage du piège pour l’injection. L’analyse a été faite par CPG-SM selon Pogačić et al. (2015), avec quelques modifications (Leyva Salas et al., 2019). Les composés volatils ont été séparés sur une colonne capillaire Elite-WAX ETR (30m×0,25mm×0,25 μm ; PerkinElmer®), avec de l'hélium comme phase mobile, dans les conditions suivantes : température initiale de 35°C maintenue pendant 10 min, puis augmentée à 5 °C/min jusqu'à 230 °C. Les composés ont été ionisés par impact électronique à 70 eV et l’acquisition des spectres de masse a été faite dans une gamme de masse de m/z de 29 à 206.
3 RESULTATS ET DISCUSSION
3.1 Optimisation des milieux de préculture
L'objectif de cette première partie était d’optimiser la supplémentation des milieux de précultures des microorganismes utilisés dans le projet From’Innov Quescrem (P. freudenreichii, Y. lipolytica et H. alvei). Pour cela, la croissance de ces microorganismes a été comparée en fonction de la concentration de suppléments dans le milieu et du temps de culture, par rapport au milieu de référence préalablement utilisé (Chassagnard, 2019).
P. freudenreichii
La Figure 11 montre la cinétique de croissance de P. freudenreichii pour différentes concentrations de supplémentation en Ye (0, 0,1, 0,5, 1 et 2 g/L). La culture avec une supplémentation en 0,3 g/L n'a pas été prise en compte dans l'analyse car les résultats sont incohérents. La cinétique montre qu’il y a eu croissance bactérienne même sans ajout de Ye. Les mesures de DO indiquent que plus la concentration en Ye du milieu de culture
Figure 12. Variation de la densité optique de P. freudenreichii en fonction de la concentration en extrait de levure du milieu, à différents temps de culture sur un milieu perméat de lait ultrafiltré supplémenté avec 5g/L de tryptone
Figure 13. Cinétique de croissance de Y. lipolytica dans du perméat de lait incubée en fioles Erlenmeyer (volume utile 10 mL/erlenmeyer de 100 mL), pour chaque concentration de tryptone ajouté.
Figure 14. Cinétique de croissance de Y. lipolytica incubée en tubes.
Figure 15. Cinétique de croissance de H. alvei en fonction du temps de culture pour chaque concentration d’extrait de levure (Ye) supplémenté.
R² = 0,9828 R² = 0,9953 R² = 0,9933 0 2 4 6 8 10 12 0 0,5 1 1,5 2 2,5 DO Ye (g/L) DO 48h DO 96h DO 144h 0 1 2 3 4 5 6 7 0 20 40 60 80 100 DO Temps (h) erlen T 5 erlen T 2,5 erlen T 1 erlen T 0,5 erlen T 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 20 40 60 80 100 DO Temps (h) tubes T 5 tubes T 2,5 tubes T 1 tubes T 0,5 tubes T 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 10 20 30 40 50 DO Temps (h) Ye 2 Ye 1 Ye 0.5 Ye 0.3 Ye 0.1 Ye 0
est élevée, plus la croissance est rapide et plus la population maximale est élevée. En termes de cinétique, on constate que la population maximale est atteinte à ~96 h. Des mesures intermédiaires seraient nécessaires entre 0 et 96 h (lignes pointillées) pour connaître plus en détail la cinétique de croissance et si la population maximale est obtenue avant 96 h.
L’analyse de la DO en fonction de la concentration de Ye dans le milieu (Figure 12) montre que la courbe de tendance est de type polynomial. Si la différence de DO est évaluée à intervalles de concentration de Ye (ΔDO/Δ[Ye]), il y a un ralentissement de l'augmentation de la DO à mesure qu’augmente le Ye au milieu. Par exemple, à 96 h, dans l'intervalle compris entre 0 et 0,1 g/L, la DO augmente de 6,20 points pour chaque gramme d’Ye ajouté, alors que dans l'intervalle de 1 et 2 g/L, l'augmentation de la DO est de 1,32. Cela signifie que le taux d’augmentation de la population ralentit à mesure que la concentration de Ye augmente. Aussi, à la concentration la plus élevée testée (2 g/L de Ye, concentration de référence appliquée antérieurement), on est proche de la population totale maximale dans le milieu.
Le choix de la concentration de Ye ajouté doit prendre en compte tous les coûts de production (coût des suppléments, mais aussi coûts d'immobilisation de matériel et des équipements, etc.).
Y. lipolytica
Pour optimiser la croissance de Y. lipolytica, les cultures ont été faites à différentes concentrations de tryptone et différentes conditions d’aération : culture sous agitation dans deux types de récipients : des erlenmeyers et des tubes. La cinétique de croissance de Y. lipolytica a varié beaucoup selon le type d’agitation. La croissance observée dans les erlenmeyers est régulière et rapide, alors que la croissance en tube est lente et très irrégulière.
En erlenmeyer (Figure 13), l’allure des courbes de croissance est similaire pour les différentes concentrations de tryptone, avec une population maximale atteinte autour de 24 h. En revanche, la cinétique montre qu’il y a eu croissance bactérienne même sans ajout de tryptone et l’augmentation de la concentration en tryptone augmente la population finale. D'autres mesures intermédiaires de DO seraient nécessaires entre 0 et 24 h (lignes pointillées) pour établir précisément la cinétique de croissance de Y. lipolytica en erlenmeyers et déterminer le moment où la population maximale est atteinte.
En tubes, la croissance a été très irrégulière (Figure 14) et plus lente que celle en erlenmeyer (pour le milieu à tryptone 5 g/l, la DO maximale obtenue est de 6,1 en erlenmeyer et de 3,6 en tubes). La population maximale n'a pas été atteinte en 96 h, de sorte que la durée de la culture devrait être prolongée pour l'observer.
Cette hétérogénéité de la cinétique de croissance des deux méthodes est très vraisemblablement due à des différences dans l'agitation du milieu en raison de la forme du récipient et de la taille de la surface, qui facilite l'aération du milieu, qui est une condition indispensable à la croissance de Y. lipolytica.
H. alvei
La cinétique de croissance de H. alvei (Figure 15) montre que plus la concentration en extrait de levure du milieu de culture est élevée, plus la croissance est rapide et plus la population maximale est élevée. Le graphique montre que la population maximale devrait se situer autour de 24 h, mais d'autres mesures intermédiaires de la DO seraient
