ALLAIN Lénaïk et FRESSENON Louis – P2 - 10/11/20 - Y. Augagneur – Biochimie Diapo disponible – Le texte en italique non dit mais à lire
TRADUCTION ET INHIBITEURS DE LA
SYNTHESE PROTEIQUE
Plan :
I- Rappels sur la traduction
II- La traduction procaryote et ses inhibiteurs III- Les inhibiteurs de la traduction eucaryote
I - Rappels sur la traduction
Contexte :
Transcription : transcrire cet ADN sous forme d’ARN → ARNm qui contient une information qui est indispensabilité pour pouvoir synthétiser les protéines.
Traduction : synthétiser quelque chose de nouveau à partir de cet ARNm pour donner des protéines au moyen de d’autres ARN : ARNt et ARNr. Différentes protéines associées ces ARNr. La protéine va se replier sur elle même et va voir une certaine structure → ≠ fonctions biologique. Processus dynamique.
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est la forme de stockage, porteur de l’information génétique, et permet également sa transmission. L’ADN est une double hélice
indispensable. Ce support de l’information génétique est transmis via la réplication de l’ADN. Ces informations génétiques sont codées par l’enchaînement de nucléotides qui comportent 4 bases azotées différentes : Adénine, Cytosine, Thymine et Guanine.
L’expression de cette information génétique nécessite sa transcription en ARN messager en simple brin (acide nucléique simple brin). Lors de la transcription, les ARNm conservent le même alphabet avec ses 4 nucléotides sauf pour la Thymine qui est transcrite en Uracile (U).
Ces ARNm sont ensuite transcrits en chaînes protéiques (par les ribosomes) afin d’assurer de nombreuses fonctions au sein de la cellule ou au sein d’un organisme.
La traduction est un mécanisme universel à tout le règne vivant dans n’importe quel organisme pour synthétiser les protéines (même dans le coronavirus : synthèse de la spine protéine qui va être reconnue par le récepteur à l’angiotensine 2) et qui constitue l’étape ultime de l’expression de l’information génétique contenue dans l’ADN. Elle se fait par l’intermédiaire de ribosomes (ARN ribosomaux) et d’ARN de transfert. La traduction est faite par les ribosomes mais aussi en présence d’ARN de transfert pour avoir une protéine. Cette protéine a une structure, une fonction, une activité.
Exemple : la phosphatase alcaline enlève un phosphate sur le substrat.
Les ARN de transfert sont spécifiques à un codon sur l’ARMm. L’ARNt permet la lecture de l’ARNm en protéine.
Traduction en protéine : C’est un processus par lequel l’information génétique, représentée par l’ordre de la séquence de triplets de nucléotides d'un ARNm ou « codons » est transformée pour produire une séquence d’acides aminés ou polypeptide/protéine.(cf chap protéine : relation structure activité)
A - Le code génétique
1- L'information génétique
Le génome c’est de l’ADN et l’ADN est une forme de stockage et de transmission de l’information génétique qui est codée par enchaînement de nucléotides qui comporte une des bases azotées : Adénine, Cytosine, Thymine ou Guanine. Ce sont des bases purines ou pyrimidines.
Le gène est transcrit en ARNm, toujours le même alphabet à 4 lettres mais 2 différences : la thymine est transcrite en uracile (T en U) et c’est un acide ribonucléique simple brin.
Le cadre de lecture commence par le codon d’initiation de la traduction. On lit sous forme de triplet appelé codon. Ces triplets permettent de passer d’un alphabet de 4 lettres à 20 lettres (les ≠ AA qui sont constitutifs de nos protéines). Cet alphabet à 4 lettres est le support de l’information génétique.
Les triplets codent pour un acide-aminé spécifique ou signal d'arrêt de la traduction : c’est ce qu’on appelle le code génétique qui permet d’établir la correspondance entre le message nucléotidique et polypeptidique. Ces ARNm sont ensuite traduits en chaînes protéiques pour assurer de nombreuses fonctions au sein d’une cellule ou d’un organisme.
4 lettres au départ donc 43 possibilités = 64 codons mais on a pas 64 AA constitutifs de nos protéines, seulement 20 AA naturels. Il y a en fait de nombreux codons synonymes = diffèrent dans leurs séquence, de leur triplet en général c’est la dernière lettre mais qui codent le même AA (même signification). 1 seul AA peut être codé par différent codons. Sur 64 possibilités on a 61 codons qui vont codés pour des AA. Les 3 derniers codons ne codent pas pour des AA mais codons dit « stop » : UAA, UAG et UGA → arrêt de la synthèse protéique qui va se replier et pourra avoir son activité biologique.
=> La traduction passe d’un groupe de 4 lettres (A, T, C et G) en 20 lettres.
2- Les codons d'ARN
La séquence de l’ARNm est lue par codons successifs à partir d’un codon appelé codon d’initiation, les codons d’ARNm sont complémentaires d’un anticodon qui est apporté par l’ARN de transfert et chaque codon et anticodon correspond à un acide aminé particulier.
Les codons stop ne codent pas, sauf pour la sélénocystéine. Ils permettent d’arrêter la synthèse protéique.
Le codon initiateur de la traduction est AUG et code pour la méthionine et la formylméthionine code pour les procaryotes. La méthionine est quasiment toujours le point de départ de la traduction. Mais pour les procaryotes, on peut avoir des codons alternatifs pour la synthèse protéique.
En 5’ on a le codon initiateur (première colonne).
En 3’ du codon stop (dernière colonne).
Par exemple, il y a 6 codons différents qui codent pour la sérine.
3- Les caractéristiques principales du code génétique
Universel : On le retrouve dans n’importe quel mécanisme et fonctionne plus ou moins de la même manière avec quelques petites variations pour quelques micro-organismes. Mais globalement, le code génétique est le même pour tout le monde. Excepté le génome mitochondrial ou la levure candida albicans (non dit).
Dégénéré : Plusieurs codons peuvent coder pour un seul acide aminé. On a en effet 61 codons pour 20 AA et non 61 protéines. En général au niveau des codons, ce sont les 2 premiers acides nucléiques qui sont importants, c’est au niveau du 3ème nucléotide qu’on va avoir un changement pour coder pour un même acide aminé. On appelle ça le flottement ou wobble, cela permet de limiter l’impact des mutations de l’ADN. (Wobble : bancal en anglais → parfois des appariements qui sont bancaux, ne se font pas bien). Le Wobble a été décrit par Watson et Crick comme un appariement imparfait. Une mutation sur la 3è base du codon l’ADN le plus souvent n’aura pas d’impact après sur l’AA qui va être incorporé dans la protéine.
Si on avait pas du tout de dégénérescence, comme on a que 20 acides aminés et 64 codons possibles, on se retrouverait avec 44 possibles codons stop et on aurait une grande probabilité d’avoir des protéines tronquées et des mutations. En revanche si on mute la première ou deuxième base du codon cela peut causer des pathologies telles que la drépanocytose.
Non-ambigu : 1 codon donne toujours le même AA et un codon stop donne toujours un stop à l’exception du codon UGA. En théorie c’est un codon stop mais on peut aussi avoir incorporation d’une sélénocystéine (une cystéine avec un sélénium), c’est une particularité valable uniquement chez E. Coli notamment pour la glutathion peroxydase, pour des sélénoprotéines. Ca ne pose pas de problème car c’est un codon très rare donc pas / peu de
risque d’avoir une ambiguité dans les protéines synthétiser chez E. Coli. Les autres sélénoprotéines ne vont pas contenir ce codon : UAA ou UGA en stop → codon stop au bon endroit pour ces protéines.
Normalement, un codon désigne toujours un acide animé. Mais un acide animé peut être codé par plusieurs codons.
B) Les acteurs de la traduction
ARN messagers : on a une matrice qui va être lue permettre la synthèse protéique ; c’est la matrice de départ. Ils sont issus de la transcription du gène.
R
ibosomes : lieu de la synthèse protéique. Le ribosome est un assemblage macromoléculaire : il y a de l’ARN et de la protéine dans le ribosome.
ARN de transfert : trait d’union entre l’ARNm et la protéine. Pour être chargé, on a besoin de l’aminoacyl ARNt synthétase. Sans eux, il n’y a pas de traduction. Ils amènent les acides aminés.
A
minoacyl ARN t synthétase : elle amène l’acide aminé sur l’ARN de transfert (à l’origine l’ARNt n’est pas couplé à un acide aminé) . Branche AA sur ARNt.
F
acteurs de la traduction : facteurs protéiques qui se lient aux ribosomes. Ils sont essentiels pour les étapes d’initiation, d’élongation ou de libération de la protéine.
1- Les ARNm
a) ARNm procaryote :
La séquence codante (CDS) au milieu est délimitée par un codon initiateur AUG en principe qui code pour la formylméthionine chez les procaryotes (à la différence des eucaryote ou méthionine pas formylée) et est délimitée par un codon stop ( UAA ou UGA ou UAG). Petite particularité chez les procaryotes, on pourra avoir en codon initiateur GUG qui code une valine.
En amont et en aval de la séquence codante on aura de l’ARN : 5' UTR (en amont) et 3 'UTR (en aval).
UTR pour UnTranslated Regions, ce sont des régions transcrites non traduites → ARNm est toujours plus et contient plus d’informations que la séquence codante qui est à l’intérieur de l’ARNm.
Au niveau de 5’UTR, contient une séquence Shine Dalgarno (SD) (ou RBS = ribosome binding site).
Cette séquence est canonique GGAGG (avec des A autour). Elle se situe à 5 nucléotides en amont de l’AUG. Elle est indispensable pour que le ribosome de la bactérie puisse reconnaître cet ARNm et pouvoir initier la traduction au niveau de l’AUG qui va coder dans la majorité des cas pour la formylméthionine.
Il s'agit d'un ARN monobrin orienté 5' → 3'.
Ils possèdent une région codante qui est appelée CDS (= séquence codante), appelé aussi ORF (cadre ouvert de lecture). Différence entre CDS et ORF :
• CDS : séquence codante → pour coder la séquence, il faut le RBS devant
• ORF : cadre ouvert de lecture → AUG ou GUG jusqu’à un stop ; codon d’initiation jusqu’au codon stop Shine Dalgarno (ou RBS = ribosome binding site) est une séquence (GGAGGU avec des A autour) qui se situe 5 ou 6 nucléotides avant l’AUG. Elle permet la reconnaissance par le ribosome bactérien (et uniquement lui).
Chez les procaryotes, on ne trouve pas de queue poly A, ils ne sont pas polyadénylés.
Les ARNm des procaryotes ont 2 grandes particularités :
● ARN polycistroniques = plusieurs séquences codantes au sein d’un même ARN ; plusieurs gènes peuvent être co-transcrits à partir d’un même promoteur (jusqu’à 6, 7 ou 8 gènes traduits). Ainsi plusieurs protéines différentes peuvent être synthétisées à partir du même ARN (simultanément). Dans l’exemple ci-dessus, on a 3 séquences codantes chacune avec un AUG et un codon stop et un SD en amont. Le ribosome va pouvoir se fixer, lancer la traduction puis dissociation du ribosome et un nouveau ribosome va se fixer sur la deuxième SD pour lancer la traduction d’une deuxième protéine et ainsi de suite.
● Ils possèdent des cadres ouverts de lecture chevauchants (sur même brins ou sur brins opposés). AUG se situe au sein de la séquence codante du premier gène pour le deuxième gène.
Avantage : Le chevauchement permet de condenser le génome, l’avantage est que les ARN messagers sont plus courts, qu’ils permettent aux bactéries d’avoir un génome plus petit qui peut donc produire plus de protéines avec plus d’informations → maximum d’informations sur une très petite région.
I nconvénient : si l’on a une mutation au niveau de la zone de chevauchement, il va y avoir 2 protéines qui vont muter (fort risque en fonction du site de la mutation). Avec un peu de chance ça peut être la mutation d’un codon synonyme. Mais c’est mauvais quand on comme dès le début de la protéine, on pourrait avoir un codon stop et donc une perte de la fonction biologique de celle-ci. On a 6 possibilités de trouver une protéine à un point du génome dès qu’on a AUG.
Explication du schéma :
Sur le même brin, sur cet ARN à partir du brin positif on a plusieurs AUG donc plusieurs possibilités de protéines avec des chevauchements.
Il y a 6 phases : 3 phases sur le brin positif et 3 phases sur le brin négatif. Dans l’exemple ci-dessus, on a le droit de lire GGA (trait noir), GAG (trait violet) ou AGG (trait rose), après on continu par triplet. On s’aperçoit que l’AUG correspond a un triplet en noir.
Trait noir : AUG, UUU etc
Au niveau du deuxième AUG pas en phase de triplet avec ces traits noirs : CUA ou UGG. Donc pour lire AUG on est obligé de le lire sur la troisième phase rose. La première phase (noir) : AUG, deuxième phase (violet) : UGU et troisième phase (rose) : GUU. Si on prend GUU on va arriver sur AUG sur un autre cadre ouvert de lecture avec un AUG en amont du stop de la première protéine et avec un SB en amont de ce deuxième AUG qui est à l’intérieur de la séquence codante de la première protéine.
=> En terme de traduction les possibilités sont d’avoir à partir de ce premier AUG un peptide méthionine, phénylalanine etc et le codon stop.
Explication schéma à la main celui de l’année dernière : Le brin positif est en haut sur le schéma. L’AUG correspond à la méthionine, puis on un deuxième acide animé, un troisième, un quatrième (TAU), puis GUG qui code pour une valine. Sur la deuxième partie : on a un AUG, il y a une méthionine et donc un cadre ouvert de lecture (pas forcément une séquence codante) qui permet d’incorporer la méthionine.
Il y a trois phases donc 3 possibilités car on lit 3 lettres.
NB : Un chevauchement peut entraîner un encombrement stérique mais si tout se passe bien on peut synthétiser deux protéines à partir du même ARNm, avec un cadre de lecture différent.
On peut avoir un AUG à l’intérieur de la séquence protéique. Puisque cet AUG n’aura pas de RBS devant, cela ne sera pas une initiation de la traduction. Cela codera juste pour une méthionine.
Mais il peut être le départ d’une nouvelle protéine s’il y a un RBS. Or, dans la même phase, c’est assez rare car cela veut dire qu’il y aurait deux tailles de protéine, avec une partie commune. C’est plus fréquent sur l’ARN avec deux terminators de transcription.
NB : s’il y a deux AUG, on regarde s’il y a un RBS juste devant. Il faut un espace de 5 nucléotides entre le RBS et l’AUG.
b) ARN m eucaryote :
Similitudes avec les procaryotes :
Toujours une séquence codante, ici exon (partie réellement codante du gène), bornée par un codant initiateur AUG qui code pour la méthionine. Pas de codon GUG possible. Et à la fin codon stop.
Organisation en 5’ → 3’. Il y a toujours une région 5’ UTR et 3’ UTR.
Différence avec les procaryotes :
3’ : queue polyadénylée (polyA) : polyadénylation de l’ARNm = queue avec plusieurs A. Cela permet de différencier les ARNm eucaryotes des ARNm procaryotes.
5’
:
• Séquence de Kozak : permet au ribosome de savoir où est le bon AUG pour démarrer la traduction. Il permet de spécifier où va débuter la traduction (il peut y avoir des codons AUG à différents endroits).
• Coiffe : méthylation de la région 5’ UTR. L’ARNm doit être coiffé pour ensuite être traduit. La coiffe est une guanosine méthylée. Elle est importante pour la reconnaissance par le ribosome.
Celui-ci reconnait la coiffe au départ et pas la séquence de Kozak VS pour les procaryotes la reconnaissance se fait au niveau de Shine Dalgarno
/!\ la séquence de Kozak n’est pas l’analogue eucaryote de Shine Dalgarno.
On reconnaît la coiffe, on scanne jusqu’à la séquence de Kozak qui nous dit ou est le bon AUG pour démarrer la traduction. Le ribosome est déjà fixé (pour les procaryotes, la protéine se fixe et ça démarre directement).
Particularité de l’ARNm eucaryote :
– Présence des exons : séquence qui code
– Intron : morceau de la séquence d’ARN qui est entre 2 exons qui ne donne pas naissance à une protéine.
=> ARNm : on a pas une séquence codante d’un bloc mais réparti sur l’ADN. Processus de maturation de cet ARN pour avoir une séquence réellement codante.
Exon 1 + 2 + 3 permettent de synthétiser la protéine.
On peut aussi faire 1 + 2 ou 2 + 3 ou 1 +3 → épissage différentiel / alternatif. Expression différentielle donc protéine différente en fonction des cellules qui expriment le gène, en fonction de la spécialisation des cellules.
L’épissage permet d’enlever les introns donc on compacte le génome et on a plus d’infos pour un petite place dans la protéine. Lorsque l’épissage est effectué, il y a ensuite la traduction.
Un même ARNm peut coder plusieurs protéines.
Chez les eucaryotes, il y a plus de place sur le génome, il n’y a pas besoin de condenser l’information comme chez les procaryotes.
2- Les ribosomes
C’est le site de production des protéines. Assemblage marcomoléculaire d’ARN ribosomaux mais aussi des protéines ribosomales spécifiques (facteurs de traduction) qui vont s’associer à ce ribosome pour aider la traduction. Facteurs qui vont intervenir dans l’initiation, élongation, relargage et de dissociation du ribosome.
Procaryotes : Ribosome plus petit car la partie ARN est plus petite et contient moins de facteurs protéiques.
Lorsque ce ribosome est assemblé, on parle de ribosome de 70S (PM de 2,5 millions de Da) pour les procaryotes et de 80S pour les eucaryotes (PM de 4,2 millions de Da). S = Svedberg → coefficient de sédimentation.
E. Coli : 20 000 ribosomes / cellule (à titre d’information). Sur ces 20 000 ribosomes on a de l’ARN ribosomal 5S, 16S et 23S représente 80% de l’ARN total.
Dans une cellule bactérienne (à peut pres pareil chez les eucaryotes) : 80 % ARN ribosomal, 10 % ARNt, 5 % ARNm.
On a 55 protéines (34+21) alors qu’on a quasiment 4 000 / 5 000 gènes chez E. Coli donc 4 000 / 5 000 protéines différentes dont 10 % seront l’une de ces 55 protéines. Beaucoup de protéines associés à ce ribosome qui prennent une part importante de ce pool de protéines : 55 sur 1100 on est à 1 % au niveau contenu protéique. Ces 1 % des protéines qui sont associées au ribosome comptent pour 10 % total des protéines exprimées à un instant t.
La majeure partie des ARN d’une cellule sont dévolus à faire la synthèse protéique (très coûteux en énergie). Plus de la moitié des antibiotiques utilisés chez l’homme cible les ribosomes.
a) ribosome procaryotes → 2 sous-unités :
• G rande sous-unité : 50 S, contient 2 ARN :
◦ ARN 23S (2900 nucléotides)
◦ ARN 5S (longueur : 120 nucléotides)
◦ 34 protéines associées à ces 2 ARN ribosomaux
• Petite sous-unité : 30S, contient :
◦ ARN ribosomique : 16S (1540 nucléotides)
◦ 21 protéines (S1 à S21 avec S pour Small).
=> Ces 2 sous-unités vont s’associer pour former le ribosome, donc le ribosome qui est le 70S en entier au moment où il va se lier avec l’ARNm.
Pour le procaryote, il n’y a pas de noyau, seulement des chromosomes donc transcription et traduction sont couplés, il y a alors énormément de ribosomes dans la cellule. On retrouve une majorité d’ARNr, puis des ARNt, et en minorité des ARNm. Les ARNm représentent une petite proportion dans les ARN totaux. 80% des ARN de la cellule est de l’ARNr.
b) ribosome eucaryotes → 2 sous-unités :
• G rande sous-unité : 60 S, contient 3 ARN :
◦ ARN 28S (4700 nucléotides)
◦ ARN 5S (120 nucléotides)
◦ ARN 5,8S
◦ 49 protéines associées
• Petite sous-unité : 40S, contient :
◦ ARN ribosomique : 18S
◦ 33 protéines
=> Malgré qu’il y ai des similitudes dans la traduction, au niveau des facteurs protéiques associés on va avoir des différences importantes entre le ribosome procaryote et eucaryote ce qui va permettre de pouvoir désigner des molécules qui vont cibler des ARN procaryotes sans avoir d’effets sur le ribosome eucaryote (vis versa).
Il y a plus de facteurs protéiques chez les eucaryotes.Les ribosomes peuvent traduire en même temps un seul ARNm on parle alors de polysomes.
On a donc notre ARNm avec différents codons et 3 poches, qui sont 3 sites de fixation aux ARNt : A, P, E au sein de la grande sous-unité du ribosome.
Site A : fixe l’aminoacylARNt qui est apporté par 'EFTu : GTP' (le facteur d’élongation Tu GTP). Les ARNt qui est chargé avec un AA vont directement dans le site A, à l’exception de l’ARNt initiateur. Il y a formation de la liaison peptidique.
Site P : C’est l’ARNt lié à la chaîne polypeptidique. Il fait la liaison avec le 'peptidylARNt' ou 'pt ARNt' et qui est porteur du peptide en cours de synthèse. Contient l’ARNt initiateur, qui arrive directement dans le site P, porteur de la formyl méthionine qui va reconnaître le codon d’initiation AUG.
Site E (Exit Site) : par lequel transitent les ARNt déacylés avant d’être totalement expulsés du ribosome (expulsion de l'ARNt déacylé). C’est le site de sortie.
Déroulement : Au tout début on a l'ARN de transfert qui contient la méthionine va se caler dans le site P, on a ensuite dans le site A, l'arrivée d'un ARN de transfert qui contient le deuxième acide aminé et on va avoir un transfert sur l'alanine (au départ, il n'y a rien dans le site E).
Ça va ensuite bouger, l'ARN du site P va aller dans le site E par translocation du ribosome, puis l'ARN du site A va aller dans le site P, ce qui permet de laisser de la place dans le site A pour amener un nouvel ARNt et ainsi de suite avancer, pour continuer l’élongation.
Au début on a donc deux sites occupés et puis après on a tout le temps 3 sites occupés avec un mouvement de va-et-vient entre les ARNt qui arrivent chargés et qui ressortent déchargés. Le ribosome avance au fur et à mesure jusqu'à un codon stop qui marque l'arrêt de la traduction. Au niveau du codon stop on va avoir intégration d’un facteur protéique qui va permettre la dissociation du ribosome.
Le ribosome prend en charge l’ARNm, assure sa traduction par l'intermédiaire des ARNt amino-acylés et catalyse la formation des liaisons peptidiques de la protéine en cours d’élongation.
3- Les ARNt
a) Structure :
C’est ce le trait d’union entre les acides nucléiques et les acides aminés, en apportant les acides aminés aux ribosomes pour permettre la synthèse protéique. Les ARNt reconnaissent les codons sur l’ARNm donc ils participent à cette étape de décodage qui va permettre l’enchaînement d’AA dans le bon ordre pour synthétiser la bonne protéine.
• Structure secondaire plane de l'ARNt est un trèfle, qui rassemble les extrémités 5' et 3'
• Structure tertiaire un peu différente, repliement dans l’espace, en forme de « L » inversé.
A l’origine, lorsque l’ARNt est synthétisé, la partie 5’ est plus longue. L’ARNt n’est alors pas encore mature et il sera clivé par une ribonucléase P pour devenir mature → partie 5’ + courte. La
ribonucléase P est un autre ARN ayant une activité catalytique → libère la région CCA → branchement de l’AA sur cet ARNt.
Cette structure est permise par des appariements canoniques de type Watson et Crick (C avec G, A avec U). Mais aussi des appariements non canoniques de type Wobble comme G et U qui s’associent (le plus souvent au niveau du bras accepteur).
C'est au niveau du bras accepteur que l'on va avoir l'acylation, donc que l'on aura la charge de l'ARN mature.
Dans la lecture anti-horaire : on a le bras accepteur en haut, c'est ici que l'on logera l'AA, puis une tige boucle D avec un appariement sur 4-5 nucléotides, ensuite la tige-boucle anticodon ; c'est ici qu'on a l'anti codon qui est complémentaire du codon, c'est ici que la lecture va se faire. On lit dans le sens 5’
→ 3’ donc condant 5’ → 3’. Puis on a le brin supplémentaire qui est la région la plus variable (ici on a 5 bases mais on peut avoir jusqu'à 20 bases).
Les ARnt ont la capacité de déchiffrer le code génétique (codons de l’ARNm) et d’apporter bon acide aminé au ribosome pour la traduction de la protéine.
Leur taille varie de 75 à 90 nucléotides (taille variable est du au nombre de base dans le brin complémentaire = brin jaune) et ils constituent 10 à 15 % des ARN totaux chez les E-coli. Tout le reste très conservé.
La structure en feuille de trèfle se compose donc en 5 régions :
• Bras accepteur : aussi appelé hélice acceptrice qui comporte justement le CCA (3’) qui contient de l’ARNt en 3’, et la séquence CCA va porter l’acide aminé qui est lié de façon covalente par une liaison ester entre le groupement hydroxyle 3’OH de l’adénine et le groupement carboxyle COOH de l’acide aminé. Le bras accepteur permet la liaison avec l’acide aminé. Ici l’appariement est de 7 à 8 nucléotides, parfois bancal. Il y a un appariement G – U au lieu d’un appariement typique comme G - C. Un appariement G-U n’a que deux liaisons hydrogène au lieu de 3. Cette séquence se fini absolument par CCA pour pouvoir brancher l’AA.
• Tige boucle D : possède appariement de 3 ou 4 paires de bases et une boucle de 4 nucléotides. 2 bases modifiées dihydro-uridine, d’où son appellation tige boucle D.
• Tige boucle anticodon : en bas, qui contient la séquence discriminante anticodon qui est complémentaire du codon trouvé sur l’ARNm (avec une orientation 5’ → 3’ dans les deux cas).
Ici le codon sera UUC lecture dans le sens 5’ → 3’. Elle possède un appariement de 5 paires de bases et la boucle est très conservée autour de l’anticodon. C’est sur cette tige qu’il y a fixation par reconnaissance du codon.
• Tige boucle T : Appariement de 5 nucléotides pour la boucle (légèrement + longue que la D).
Appariement de 5 paires base et 7 paire de nucléotide (14’) pour ribose Thymine et qui contient un résidu pseudo uridine.
• Bras supplémentaire : partie la plus variable sur les ARNt dont la longueur est comprise entre 4 et 24 nucléotides et qui fait 4 ou 5 nucléotides dans la majorité des cas.
Dans la tige boucle anticodon, la tige boucle T et la tige boucle D, on peut avoir des bases qui sont modifiées au niveau post-transcriptionnel ; cela permet l’appariement bacal, témoin de la dégénérescence du code génétique.
D’un point de vue tridimensionnel, les ARNt adoptent une structure tertiaire en forme de L renversé qui leur permet de pouvoir se positionner au niveau de leur emplacement dans le ribosome et donc entrer dans les sites A, P, E du ribosome.
On retrouve un empilement co-axial, la tige-boucle anticodon se relie avec la tige-boucle D et le bras
Cet ARNt est un ARN non chargé, il ne contient pas d'acide aminé. Il va devoir être chargé avec un AA. On va donc avoir des enzymes, les aminoacyl-ARNt synthétases qui vont reconnaître ces ARNt.
Ces enzymes qui réalisent cette liaison ester entre l'AA et l'ARNt isoaccepteurs.
On sait qu’on a des ARNt qui vont pouvoir contenir le même AA puisque on a un code génétique dégénéré. 1 aaRS va reconnaître 1 type d’ARNt. Une aaRS spécialisée dans le branchement de la tyrosine va reconnaître tous les ARNt qui contiennent un anti-codon tyrosine → particularité de l’enzyme. Donc 20 aaRS ≠ pour 20 AA ≠. On a 61 codons synonymes mais pas 61 ARNt.
4- L’aminoacyl-ARNt synthétase = aaRS = ARS
Ces enzymes vont catalyser la réaction d’aminoacylation.
La particularité de ces enzymes c'est qu'une ARS reconnaît un seul acide aminé mais reconnaît tous les ARNt isoaccepteurs qui peuvent lier cet acide aminé (en effet, on a vu que l'on a 64 codons : 3 codons stop et 61 codons qui peuvent signifier 26 AA) donc une ARS peut reconnaître jusqu'à 6 ARNt différents, tous spécifiques d'un seul acide aminé.
En réalité on a bien 20 ARS différents mais pas 64 ARNt différents donc certains ARNt n'existent pas.
Il va y avoir interaction entre l'enzyme (l'ARS) et les éléments de séquences ou de structures de l'ARNt, notamment au niveau du bras accepteur et éventuellement de l’anticodon (attention, on reconnaît la structure générale de la boucle anticodon mais pas l'anticodon en lui-même) car il faut le reconnaître pour être sur qu’on est sur le bon ARNt, il faut aussi reconnaître la branche acceptrice et notamment la queue en 3’ CCA qui est indispensable pour le branchement.
→ donc l’ARS reconnaît spécifiquement un acide animé et se charge de le mettre sur le bon ARN de transfert
Réaction d’aminoacylation : 2 étapes :
Activation de l’acide aminé : Sous-entend énergie. AA, enzyme, consommation ATP. L’aaRS va avoir besoin du magnésium comme cofacteur pour pouvoir fonctionner. Au départ on a notre enzyme spécifique d'un AA (l'ARS) liée à l'acide aminé avec une molécule d'ATP. Une métallo-enzyme va hydrolyser l'ATP pour libérer du pyrophosphate, branchement d’un phosphate, activation de l’AA → liaison acide aminé-AMP : adénylate d’acide aminé lié au site actif de l’enzyme.
Charge de l'ARNt : On peut reconnaître 1 ARNt spécifique de cet AA, donc on peut reconnaître différents ARNt donc différents anticodons. Complexe : enzyme + AA activé + ARNt. Transfère de l’AA sur l’ARNt et libération d’AMP avec toujours nécessité du magnésium en cofacteur. On a arrivée de l'ARNt qui va se lier à un autre site de reconnaissance, on va alors utiliser l'AMP pour créer la liaison ester entre l'acide aminé et l'ARNt au niveau du bras accepteur (en 3'). Une réaction d’activation d’un acide aminé consomme donc 1 molécule d’ATP. L'ARNt est alors chargé car il contient l'acide aminé en question.
La charge de l’acide aminé sur l’ARNt est très contrôlée, ce qui permet d’avoir un taux d’erreur très faible : 1 / 60 000 : car les enzymes ont la capacité de corriger leurs erreurs, même s’il y a des différences minimes dans les chaînes latérales de certains acides aminés. Si on branche le mauvais AA sur l’ARNt on incorpore des mutations.
Certaines aminoacyletransférases possèdent une activité de correction sur erreur (un peu comme les polymérases) c’est-à-dire qu’elles peuvent détecter et hydrolyser les ARNt qui sont mal aminoacylés.
Cette activité est assurée par un domaine indépendant qui peut soit se trouver directement dans le site actif, soit dans un autre site.
5- Les facteurs de la traduction
Facteurs d’origine protéique indispensable aux différentes étapes de la traduction, , qui vont se lier au ribosome que ce soit à la grande ou la petite sous unité . Procaryotes plus d’une cinquante de facteurs, bien plus chez les eucaryotes.
Facteurs d’initiation (IF = initiation factor) :
• IF1 : facteur de dissociation du ribosome 70S (gère l’association et la dissociation). Il se lie avec la sous unité 30S au site A et empêche l’arrivée de la grosse sous-unité = empêche l’entrée d’un tRNA-aminocyclé.
• IF2 : facteur assurant la fidélité de reconnaissance entre ARNt initiateur (qui contient la méthionine formylée chez les procaryotes) et le ribosome. Il y a liaison au site P de la sous unité 30S donc on pourra amener au niveau du site A... Il possède également une activité GTPasique (cad hydrolyse du GTP, car cela coûte de l’énergie de synthétiser les protéines).
• IF 3 : facteur nécessaire à la fixation spécifique de 30S sur l’ARNm (puis association du 50S → 70S contrôle) et de contrôle de l’équilibre entre forme associée et dissociée du ribosome (facteur anti-réassociation) → lié avec le facteur IF1.
Facteurs d’élongation (EF = elongation factor) : EF-Tu ; EF-Ts et EF-G
• EF-Tu : intervient dans l’entrée de l’ARNt d’aminoacylé dans un site libre du ribosome
• EF-Ts : sert de facteur d’échange de guanine pour EF-Tu, catalysant la libération de GDP par EF Tu. 50 % de l’energie de la cellule dépensée est pour la traduction.
• EF-G : catalyse la translocation de l’ARNt et de l’ARNm dans le ribosome à la fin de chaque cycle d’élongation du polypeptide → facteur spécialisé pour le translocation.
• EF-P : stimule la formation de peptides en catalysant la première étape de synthèse entre le premier AA (N-formylméthionine / méthionine) et le deuxième AA.
Facteurs de terminaison RF 1, RF 2 et RF 3 (RF = releasing factor) :
- RF 1 reconnaît UAA et UAG → reconnaît des codons stop, peut se fixer au niveau du site A.
- RF 2 reconnaît UAA et UGA → reconnaît des codons stop
Ces facteurs de terminaison vont reconnaître et se mettre à la place des codons stop.
Quand on a un codon stop, il n’y a pas d’ARNt qui arrive. Ce sont des protéines qui arrivent et qui se logent dans le site A. il n’y a plus de possibilité de faire une liaison peptidique. Le ribosome ne peut plus continuer et cela entraîne la dissociation du complexe et le relargage de l’ARNm et de la protéine.
L’ARNm peut être recyclé pour être traduit à nouveau.
Chez les eucaryotes : eIF (eIF1 à eIF6), eEF (eEF1α, eF1β et eEF2), eRF.
→ Indice « e » lorsqu'on parle des eucaryotes (pour les distinguer des facteurs procaryotes) → différences en terme de nomenclature. Chez les eucaryotes il y a plus de facteurs protéiques
B) Les différentes étapes de la traduction
La traduction est un processus extrêmement dynamique, et continu qui peut se subdiviser en 4 étapes : – L’initiation
– L’élongation – La terminaison
– Le recyclage des ribosomes
La traduction des eucaryotes diffère des procaryotes, principalement au niveau de l’initiation (coiffe, Kosak, également la queue poly A, impliquant davantage de facteurs protéiques chez les eucaryotes).
1- Chez les procaryotes
En présence d'un facteur d'initiation on va avoir reconnaissance de la SU pour l'ARNm via l'interaction avec SD ensuite d'autres facteurs d'initiation vont intervenir pour amener l'ARNt méthylformylé.
La grosse SU ribosomale arrive ensuite et on relargue ces facteurs d'initiation, on commence alors l'élongation grâce aux facteurs d'élongation. Le facteur d’élongation TU amène un ARNt aminoacylé, qui rentre dans le site A. Il y a formation d’une liaison peptidique entre les deux acides aminés. La méthionine est collée au deuxième acide aminé au niveau du site A. il y a ensuite le processus de translocation. Le premier ARNt initiateur se retrouve dans le site E, celui dans le site A va dans le site P avec la chaine polypeptidique naissante. Un nouvel ARNt arrive dans le site A. On incorpore nos différents ARN.
La traduction est sous forme de polysome cad que plusieurs ribosomes sont sur un même ARNm et traduisent en même temps la protéine. Tous les 80 nucléotides, il y a un nouveau ribosome. Si un gène fait 800 nucléotides, il y a alors 10 ribosomes. Donc on peut lancer 10 protéines quasiment en simultané. Ainsi on n’attend pas la fin de la synthèse d’une protéine pour lancer la synthèse d’une copie de cette protéine.
Étape de terminaison : on a une reconnaissance de la séquence stop par les facteurs RF1 et RF2 ; ils vont se lier dans le site A et ce qui va donner l'ordre de terminer. Il y a dissociation du système avec le facteur RRF (facteur de recyclage du ribosome). Il faut recycler le ribosome. La grosse sous-unité s’en va puis il y a dissociation du complexe entre la petite sous unite 30S et l’ARN.
Pour l’ARN, il y a deux possibilités :
- On revient à l’étape de départ et on traduit à nouveau - Il est dégradé
→ la demi-vie d’un ARNm est de 5 minutes, processus non éternel on va devoir retranscrire.
2- Chez les eucaryotes
On a une circularisation de l'ARNm au départ entre 5' et 3' aidé par des facteurs d'initiation qui n'existent pas chez les procaryotes :
L'initiation commence par la reconnaissance de la coiffe par la 4 binding protein et ensuite eif4E qui se lie à eif4G et qui va permettre la circularisation (recourbement) de l’ARNm par la liaison à la poly A binding protein (PABP). On recourbe l’ARN pour former un cercle temporairement , il n’y a pas de liaison covalente entre les parties 5’ et 3’ de l’ARNm. Puis on a une association à l’ARNm circularisé de eiF1, eiF1alA, eiF3 et eiF5 à la petite sous unité 40S du ribosome. Puis la liaison à eiF2 par l’ARNt de la méthionine pour former le complexe de préinitiation de la traduction 43S. Liaison au niveau de la petit sous-unité via la coiffe. Etape de scanning pour trouver le bon codon grâce à la séquence de Kozak, association de la grand sous-unité via différents facteurs d’initiation. Couplage puis dissociation.
Ensuite l’ARNm va se lier pour former le complexe de l’initiation 48S. Il y aura déplacement du complexe 48S, le long de l’ARNm jusqu’au codon d’initiation AUG en consommant de l’ATP. Puis la grande sous unité du ribosome associée à eiF6, va s’ajouter pour former le complexe 80S.
Puis l’étape
➢ d’élongation commence, on a une traduction au sein des polysomes, puis intervention des facteurs de libération du peptide qui entraînent une dissociation du ribosome et du peptide qui est couplée (qui prend plus de temps chez les procaryotes), on a une dissociation de tout le système pour redémarrer la traduction.
3- Autres différences majeures entre procaryotes et eucaryotes
Transcription/traduction couplée chez les procaryotes : Il n’y a pas de compartimentation cellulaire chez les procaryotes donc on transcrit un gène et on traduit juste après. Tout se passe au même endroit. La transcription n’est pas forcément terminée lorsque la traduction commence (si le RBS est
cours de traduction, dépend de la longueur de de la taille de la protéine.
Compartimentation cellulaire chez les eucaryotes : Il n’y a pas de couplage transcription/traduction car il y a cette compartimentation cellulaire. L’ARN est transcrit, il sort du noyau, il doit être modifié (ajout de la coiffe pour être reconnu) après la transcription pour être pris en charge pour la traduction.
Vidéo explicative : https://www.youtube.com/watch?v=5REsGZQGEZ4 : « synthèse des protéines, traduction » Chantal Proulx
=> Dynamique dans la traduction
Sans la traduction, il n’y a pas de synthèse protéique, donc la cellule meurt. L’inhibition de la traduction chez les procaryotes peut avoir un intérêt si le procaryote est indésirable.
Or, certaines bactéries ne sont pas indésirables pour l’Homme. Dans un yaourt, il y a 108 bactéries par gramme.
II - Inhibiteurs de la traduction procaryote
Ce ribosome prend une place très importante dans la cellule : 80 % de l’ARN c’est du ribosome, 10 % des protéines de la cellule sont associées au ribosome, 50 % de l’énergie dépensée par la cellule c’est pour faire de la traduction. Traduction = point névralgique, cible de choix pour des molécules (antibiotiques) qui vont l’inhiber et pour limiter la prolifération de micro-organismes qu’on juge indésirables (pathogènes).
A) Les antibiotiques
Les antibiotiques sont des substances élaborées par des micro-organismes, ou des substances synthétiques, qui sont bactériostatiques (on inhibe la croissance du micro-organisme, arrête le processus, on ne le tue pas) ou bactéricides (on tue) à dose faible. Leurs cibles d’activités sont des structures moléculaires spécifiquement bactériennes. Elles ont donc une toxicité sélective pour les cellules procaryotes et une toxicité faible pour les cellules eucaryotes → différences entre les ribosomes (partie ARN + facteurs protéiques).
On s’intéresse ici aux antibiotiques qui agissent sur la traduction, sur les ribosomes (inhibent la traduction).
On a pas que des antibiotiques qui jouent sur les ribosomes (réplication, transcription, synthèse peptidoglycanes mais on ne s’y intéresse pas dans ce cours) → différents angles d’attaquer pour inhiber la croissance ou tuer.
50% des antibiotiques jouent sur les ribosomes.
Ils peuvent :
- Inhiber la sous-unité 30S - Inhiber la sous-unité 50S - Inhiber le facteur d’élongation
=> agit au niveau de la partie ARN ou au niveau de la partie protéique.
1- Les Aminosides
Sucres aminés reliés au centre par une liaison glycosidique qui inhibent la sous unité 30S. Les principaux exemples, ce sont :
- La Streptomycine, - La Kanamycine, - La Gentamicine - La Néomycine,
Antibiotiques à spectre large : inhibent du Gram + et du Gram -, (différence à la coquille qui protège la
bactérie, couche peptidoglycane). Franchir la barrière (paroi / membrane) pour toucher le ribosome qui est à l’intérieur de la cellule. Gram + (violet), Gram - (rose)
Mécanisme d’action :
- Fixation au niveau du site P (site du milieu) de la sous-unité 30S (petite) - Inhibe la fixation de l’ARNt initiateur, perturbe la lecture de l’ARNm - Pas de relargage des facteurs de traduction
Ils sont extraits de Streptomyces pour la streptomycine et la Kanamycine et de Micromonospora pour la Gentamicine et la Néomycine.
2- Les Tétracyclines ou cyclines
Ce sont aussi des inhibiteurs de la sous unité 30S.
Mécanisme d’action : la tétracycline se fixe à l’ARNr 16S au niveau du site A de la sous unité 30S bloquant ainsi la fixation des ARNt aminoacylés, donc blocage de l’initiation de la traduction.
Ce sont des antibiotiques à spectre large (actifs contre des bactéries gram + ou gram -) : ils agissent sur la brucellose, Neisseria meningitidis, la Pasteurellose, les infections à Chlamydiae, les mycoplasmes, gonocoque…
Mais il y a des résistances naturelles ou acquises observées chez les staphylocoques, streptocoques, pneumocoques ...
Les effets indésirables des tétracyclines sont des troubles digestifs, des
allergies, un néphrotoxicité, hépatotoxicité et de l’hypertension intracrânienne.
3- Les Macrolides
Les macrolides, agissent sur la sous-unité 50S (la grosse sous-unité) du ribosome.
Ils ont également un spectre étroit puisqu’ils peuvent cibler seulement les bactéries à Gram + car la membrane externe des Gram - est imperméable à l’entrée de ces antibiotiques. Parfois on y arrive en labo mais il faut mettre des quantités énorme donc non compatible avec l’humain car il y aurait une toxicité.
L’érythromycine est la molécule de référence des macrolides.
Mécanisme d’action : Elle se lie à la sous-unité 50S : fixation au niveau de l’ARN ribosomal 23S ce qui permet d’inhiber l’activité peptidyl-transférase
(transfert du peptide sur l’AA qui se trouve sur le site A) et bloque la sortie de la protéine néosynthétisée.
4- Les Phénicolés
Ce sont des inhibiteurs de la sous unité 50S. Ce sont des antibiotiques à spectre large, dont anaérobies stricts.
Mécanisme d’action : Les phénicolés, se fixent sur les ARN ribosomiques 23S de la sous-unité 50S. Ils inhibent la fixation de l’ARNt et inhibent l’activité peptidyltransférase. Ils bloquent la traduction au niveau de l’étape d’élongation. Similaire à l’érythromycine ce qui diffère essentiellement c’est la structure chimique de la molécule.
5- Les Oxazolidinones
Ce sont des inhibiteurs de la sous unité 50S et des antibiotiques à spectre étroit qui ciblent les Gram +.
Présentation : Linezolide, ZYVOXIDr, Comprimé 600mg, Pfizer.
Mécanisme d’action : Ils agissent au niveau de la sous-unité 50S. Il y a fixation de la molécule au niveau de l’ARN 23S dans le site A de la sous-unité 50S et inhibition de la fixation des ARNt aminoacylés.
Indications : Infections à bactéries à Gram +. On traite les pneumonies ou les infections cutanées.
6- L’Acide Fusidique
Ce sont des inhibiteurs du facteur d’élongation EF-G.
C’est un antibiotique à spectre large, ils fonctionnent sur les gram + et les gram – mais considéré comme anti-staphylococcique. Cette molécule est indiquée dans les infections à staphylocoques (aureus notamment, car il y a moins de résistances observées).
Mécanisme d’action : Elle se fixe à EF-G (elongation factor) ce qui permet l’inhibition de la translocation et de l’élongation.
Présentation de l’acide fusidique :
- FUCIDINE : cp, sol buv, inj, crème, pommade - FUCITHALMIC : Gel ophtalmique
III - Inhibiteurs de la traduction eucaryote
Pour faire l’analogie avec les inhibiteurs de la traduction procaryote, ici on utilise des inhibiteurs de la traduction eucaryote pour lutter contre les micro-organismes eucaryotes qui pourraient avoir un impact sur notre santé : Anti-fongiques, anti-cancéreux, anti-parasitaires, anti-viraux.
Anti-cancéreux : pour nous protéger contre notre propre système qui se dérégule → prolifération cellulaire → augmentation de la traduction dans les cellules cancéreuses. Molécules qui vont inhiber la traduction dans ces cellules malignes pour traiter des cancers.
A) Inhibiteurs ciblant le ribosome
Étude : Regardé différents inhibiteurs qui ciblent les ribosomes. On a des inhibiteurs spécifiques des eucaryotes et des inhibiteurs dit à spectre large ( /!\ ne pas confondre avec le spectre large des anti- biotiques qui cible à la fois les Gram + et -). Ici, spectre large = fonctionne à la fois chez les procaryotes et les eucaryotes (Geneticin, pactamycine, blasticidine S1)
Les noms de ces molécules sont colorés de manière différentes car ils ont fait de la microscopie électronique et de la structure tridimensionnel du ribosome et de l’association de ces molécules au niveau des ribosomes → ces différentes molécules vont pouvoir se lier à différents endroits par exemple :
• site E : cycloheximide, lactimidomycine et le phyllanthoside
• site P
• site de transfert de peptide PTC.
Avoir un ordre d’idée du nombre de molécules qui peuvent cibler l’ARNr, les différents sites de fixation qu’on peut avoir au niveau du site ribosomal. => Culture G pas à apprendre
Molécules qui fixent globalement le site E.
Anticancéreux → Augmentation de la traduction dans les cellules cancéreuses → criblage de + de 35 000 molécules et détermination de l’activité anti-tumorale (National Cancer Institue).
B) Inhibiteurs ciblant les facteurs de la traduction
1- Inhibiteurs du complexe eIF4F
eIF4F = hétérotrimère
• eIF4E = CBP = Cap Binding Protein
• eIF4G = Liaison à eIF4E et PABP
Favorise la fixation de l’ARNm à la sous-unité 40S.
• EIF4A = ATPase + hélicase
Déstructure la structure secondaire de l’ARNm pour faciliter l’accès à la sous-unité 40S.
Complexe impliqué dans la circularisation de l’ARNm, au tout début de la traduction.
a) Inhibiteurs de eIF4E Malina et al, OncoTarget, 2011.
• Surexpression de eIF4E dans certains de tumeurs (carcinome de la gorge, cou et du sein)
• Corrélée avec une agressivité de la tumeur et avec un mauvais pronostic vital
• Surexpression de la traduction d’ARNm impliqués dans la survie et la prolifération cellulaire (VEGF, PDGF…), dans
le cycle cellulaire (c-myc…), dans l’apoptose (Mcl-1…) et dans les voies de signalisation (mTOR…)
Ribaviron (Bloque la fixation de eIF4E sur l’ARNm) serait efficace dans le traitement d’environ 30 % des cancers sans effets sur le patient.
2- Inhibiteurs de la voie mTOR (mechanistic Target of Rapamycin)
mTor = Protéine kinase
• Phosphorylation de 4E-BP → Dissociation de eIF4E
• Interaction eIF4E-eIF4G → Activation de la traduction d’ARNm → limiter la prolifération cellulaire de ces cellules cancéreuses.
