Les glutathion peroxydases et protéine disulfure isomérases de peuplier : potentialités du repliement thiorédoxine pour la catalyse des réactions redox

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Submitted on 29 Mar 2018

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isomérases de peuplier : potentialités du repliement thiorédoxine pour la catalyse des réactions redox

Benjamin Selles

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Benjamin Selles. Les glutathion peroxydases et protéine disulfure isomérases de peuplier : potentialités du repliement thiorédoxine pour la catalyse des réactions redox. Biologie végétale. Université Henri Poincaré - Nancy 1, 2011. Français. �NNT : 2011NAN10028�. �tel-01746183�

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BiologieVégétaleetForestière Interactionsarbres!microorganismes

Thèse

présentéepour l’obtentiondugradede

Docteurdel’UniversitéHenriPoincaré,NancyI enBiologieForestière

parBenjaminSELLES

Les glutathion peroxydases et protéine disul- fure isomérases de peuplier : potentialités du

repliement thiorédoxine pour la catalyse des réactions redox

JURY:

PierreLEROY,ProfesseurFacultéSciencesPharmaceutiquesetBiologiquesNancy

Jean!FrançoisCOLLET,ProfesseurUniversitéCatholiquedeLouvain Rapporteur PascalREY,Ingénieur!Chercheur,CEACadarache Rapporteur FlorenceVIGNOLS,ChargéedeRechercheCNRSMontpellier

NicolasROUHIER,MaîtredeConférencesNancyI Co!directeurdethèse Jean!PierreJACQUOT,ProfesseurNancyI Co!directeurdethèse

Résumé

La formation de ponts disulfure constitue unemodification post!traductionnelle des protéines importante pour de nombreux processus physiologiques,jouant unrôle particulier dans le re! pliement, la catalyseet la régulation de leur activité. Ce travail concerne l’étude des relations structure!fonctiond’oxydoréductasesdepeuplierappartenantàdeuxfamillesdelasuperfamille desthiorédoxines,lesglutathionperoxydases(Gpxs)etlesprotéinedisulfureisomérases(PDIs).

L’étudebiochimiquefinedelaGpx5apermisdemontrerquecetteperoxydaseréduitleperoxy! nitrite, propriété inconnuepourcetype de Gpxet de détailler plusieursétapesdu mécanisme catalytique (formation de l’acide sulfénique, changement structural entre formes réduites et oxydées,régénérationparlesTrxs).LadimérisationdelaGpx5n’estpasrequisepoursonactivi! témaispourraitjouerunrôledanslareconnaissancedecertainssubstrats. Enfin,l’inactivation delacystéineperoxydatiquepar suroxydationsuggèrequelesGpxspourraientégalementavoir unefonctiondanslasignalisationenréponseauxperoxydes.

ConcernantlesPDIs,suiteàuneanalysephylogénétiquedétailléeamenantàproposerunenou! velleclassificationen9classeschezlesorganismesphotosynthétiques,lacaractérisationbiochi! mique de plusieurs isoformes présentant des organisations modulaires distinctes et apparte! nantàtroisclassesdePDIsaétéentreprise.Aucuneactivitéenzymatiquetypiquen’aétéidenti! fiéepourlaPDI!A,alorsquelesPDI!L1aet !Mpossèdentàlafoisuneactivitéoxydaseetréduc! tase. Les deux modules a de la PDI!M catalysent des réactions spécifiques, de réduction ou d’oxydation.

Mots clés: Protéine disulfure isomérase, glutathion peroxydase, thiorédoxine, stress oxydant, oxydation,réduction.

Abstract

Proteinactivityandfoldingcanberegulatedbypost!translationalmodificationsthatcanimpact on their physiological functions. One of these is the formation/reduction of disulfide bridges.

Theaimofthepresentworkis tostudythestructure!functionrelationshipofproteinmembers ofthe thioredoxinsuperfamily,the proteindisulfide isomerases(PDI) and the glutathioneper! oxidases(Gpx).

Aprecisebiochemicalstudyhasallowedustodemonstratethatthisenzymeisanefficientper! oxynitrite scavenger, a new finding for this type of protein and allowed investigating several stepsoftheGpx5catalyticmechanism(i.e.sulfenicacidformation,structuralchangesbetween reducedandoxidizedforms,Trx!mediatedrecycling).Wealsodemonstratethatthedimerform of Gpx5 is not absolutely required for peroxide reduction but probably involved in peroxide specificity.Finally,thecapabilityoftheperoxidaticcysteinetobeoveroxidizedbringssomenew cluesinfavorofanadditionalsignalingfunctionforGpx5.

Concerning PDIs, a detailed phylogenetic analysis of photosynthetic organisms allowed us to identify9classesofPDIsandtoproposeanewnomenclaturethatfitsallthese organisms.The biochemicalcharacterizationofisoforms ofinteresthasallowedustohighlightsomespecificity ofPDI!L1aandPDI!Mintermsofreductionoroxidationreactionscatalyzed.Adetailedanalysis ofPDI!MisoformalsoindicatesthatthetwoTrxmodulesofthisproteinshowdifferentialoxida! tionor reductioncapacities.We couldnot detectany activityfor PDI!A isoforms, leavingus to wonderwhetherthisenzymeissimplyactiveorpossesseshighlyspecificproteinpartners.

Key words: Protein disulfide isomerase, glutathione peroxidase, thioredoxin, oxidative stress, oxidation,reduction.

ADN,Acidedésoxyribonucléique ADNc,ADNcomplémentaire APX,Ascorbateperoxydase ARN,Acideribonucléique ARNm,ARNmessager ATP,Adénosinetri!phosphate

CDSP32,pour“Chloroplasticdrought!inducedstress proteinof32kDa”

CysC,CytochromeC

DHA/MDHA,Déhydroascorbate/Monodéhydroascor! bate

dNTPDésoxyribonucléotidetriphosphate Dsb,pour“Disulfidebondprotein”

DTT,Dithiothréitol

EAO,Espècesactivéesdel’oxygène

ERAD,pour“Endoplasmicreticulumassociateddegrada! tion”

ERO,pour“Endoplasmicreticulumoxidoreductase”

ERp,pour“Endoplasmicreticulumprotein”

ERQC,pour“Endoplasmicreticulumqualitycontrol”

Erv/Alr,pour“Essentialforrespirationandviability/

Augmenterofliverregeneration”

FAD,Flavineadeninedinucléotide FBPase,Fructose!1,6!bisphophatase Fdx,Ferrédoxine

FF,pour“Fullyfolded”

FNR,Ferrédoxine!NADP⁺oxydoréductase

GADPH,Glycéraldéhyde!3!phosphatedéshydrogénase Gpx,Glutathionperoxydase

GR,GlutathionréductaseNADPH!dépendante Grx,Glutarédoxine

GSH/GSSG,Glutathionréduitetglutathiondisulfure GST,Glutathiontransférase

kDa,Kilodalton

LU,pour“locallyunfolded”

MDH!NADP,MalatedéshydrogénaseàNADP MSR,Méthioninesulfoxyderéductase mV,Millivolts

NADP(H)Nicotinamideadéninedinucléotidephosphate (réduite)

NRX, pour“Nucleoredoxin”

NTR,ThiorédoxineréductaseNADPH!dépendante PAGE,pour“Polyacrylamidegelelectrophoresis”

PAPSréductase,3’!phosphoadénosylsulfateréductase PBS,pour“Phosphatebuffersaline”

PCR,pour“Polymerasechainreaction”

PDB,pour“Proteindatabank”

PDI,Protéinedisulfureisomérase Prx,Peroxyrédoxine

PS,Photosystème

QSOX,pour“Quiescinsulfhydryloxydase”

RNR,Ribonucléotideréductase

RuBisCO,Ribulose!1,5!bisphosphatecarboxylaseoxygé! nase

SDS,Sodiumdodecylsulfate SOX,Sulfhydryleoxydase

TDX,pour«Tetratricopeptidedomain!containingthiore! doxin»

Trx,Thiorédoxine

Tpx,Peroxydasethioldépendante UPR,pour“Unfoldedproteinresponse”

Table des matières

Introduction

Synthèse bibliographique

I. Généralités

I.1. Modificationdel’activitédesprotéines………..16

I.2. Originedelaformationdespontsdisulfure……….……….16

I.3. Importancedespontsdisulfuredanslesprotéines………18

I.4. Acteursdeséchangesdithiol/disulfure………...18

II. La superfamille des thiorédoxines

II.1.Unrepliementtridimensionnelspécifique………...…….19

II.2.Caractéristiquesstructurales………...…….19

II.3.Caractéristiquesoxydoréductrices……….…….22

II.3.a.LepKadelacystéinecatalytique……….22

II.3.b.Lepotentield’oxydoréductiondupontdisulfureentrelaCyscatalyti! queet laCysderecyclage……….………...23

II.3.c.Impactdesstructuresprimaire,secondaireettertiairesurlescarac! téristiquesredox………...24

II.4.Lesréactionscatalysées……….25

III. Les systèmes réducteurs impliquant des protéines à repliement thiorédoxine, exemple du système thiorédoxine

III.1Unefamillemultigénique………..…..27

III.2Sourcesdepouvoirsréducteurs………...….28

III.3Partenaires,fonctionsetsystèmesderégulationauseindelacellule.31

IV. Rôle des thiol ! peroxydases, protéines à repliement thiorédoxi ! ne, dans la réponse au stress oxydant

IV.1.Définitiond’unstressoxydant………...34

IV.2.Les EAOs,natureetsitesdeproduction………..35

IV.3.LadétoxicationdesEAOs………..…..37

IV.3.a.Lessystèmesdedétoxicationnonenzymatiques………..……..37

IV.3.a.1.L’acidelipoïqueetdihydrolipoïque………..……….37

IV.3.a.2.Lescaroténoïdes………..………..38

IV.3.a.3.Lesflavonoïdes………..……….…….38

IV.3.a.4.Leglutathion……….….………...38

IV.3.a.5.LesvitaminesC(acideascorbique)etE(!"tocophérolettoco" triénols)………...……..………..40

IV.3.b.Lessystèmesdedétoxicationenzymatiquesimpliquantdesprotéi!

nesàrepliementthiorédoxine………...………...40

IV.3.b.1.Diversitédesthiol"peroxydasesetlocalisationsubcellulai" re……….41

IV.3.b.2.Lesmécanismescatalytiquesdesthiol"peroxydasesunebase communeetdesmodalitésvariées……….44

IV.3.b.1.CaractéristiquesbiochimiquesetstructuralesdesTpxs……..45

IV.3.b.2.Rôlesphysiologiquesdesthiol!peroxydases,plusquedesimples enzymesdedétoxication?...48

V. Les systèmes d’introduction et d’isomérisation des ponts disul ! fure

V.1.Lerepliementredoxdépendantauseindupériplasmedesbactéries,le système Dsb………....50

V.1.a.Lavoied’introductiondespontsdisulfure……….……….52

V.1.b.Lavoied’isomérisationdespontsdisulfure………...53

V.1.c.Letrajetdesélectrons,illustrationd’unparadoxethermodynami! que………...…..54

V.1.d.LesystèmeDsb,conservationetvariationchezlesorganismesproca! ryotiques………..……….………….55

V.1.e.Rôlesphysiologiques………..……….56

V.1.e.1.Lamaturationdescytochromesc………...56

V.1.e.2.SystèmeDsbetvirulencesbactériennes………..……..57

V.2. Lerepliementdesprotéinesredox!dépendantdansleréticulumendo! plasmiquedesorganismeseucaryotiques………...58

V.2.a.Lessulfhydryloxydasesetlaformationdespontsdisulfu! re………...………..59

V.2.a.1.LesprotéinesdetypeErv/Alr………..……….60

V.2.a.2.LesprotéinesdetypeQsox……….…..61

V.2.a.2.!.Organisationmodulaireettrajetdesélectronsauseinde laprotéine………62

V.2.a.2.#.Localisationsubcellulaireetrôlephysiologiquedesprotéi" nesQsox………...……….65

V.2.a.3.LesprotéinesdetypeERO………...66

V.2.a.3.!.CaractéristiquesbiochimiquesetstructuralesdesEROs..67

V.2.a.3.#.Régulationredoxdépendantedel’activitédes EROs………..70

V.2.a.4.RedéfinitiondustatutredoxduRE………..71

V.2.a.5.Lessulfhydryloxydases:sourcesdemoléculesoxydantes…..72

V.2.b.Lesprotéinedisulfureisomérases,protéinesresponsablesdelafor! mationetdel’isomérisationdespontsdisulfure……….……….73

V.2.b.1.CaractéristiquesdesPDIschezlesorganismesphotosynthéti"

ques(Article1.Comparativegenomicstudyofproteindisulfideisom"

erasesfromphotosyntheticorganisms)……….………….………..74 V.2.b.2.LesPDIs:oxydoréductases«àtoutfaire»….……….……….90 V.2.b.3.ImplicationdesdifférentsmodulesdelaPDIdanslesréac"

tionsredox………..……….91 V.2.c.Interactiondesprotéinesresponsablesdelamaturationauseindu RE……….………...92

V.3. Lerepliementdesprotéinesdansl’espaceinter!membranairedesmi! tochondries………..………95

V.3.a.L’adressageauseindelamatrice………..95 V.3.b.L’adressageauseindel’IMS………..95 V.3.c.LerepliementredoxdépendantdesprotéinesdeclasseIIestnéces! saireàleurlocalisationdansl’IMS……….………..96 V.3.d.LesciblesdusystèmeMia40!Erv1etleursrôlesphysiologiques…….97

VI. Problématiques et Objectifs

Résultats

I. Article 2: Catalytic mechanism and oxidative inactivation of the poplar thioredoxin ! dependent glutathione peroxidase 5

II. Article 3: Biochemical characterization of three poplar PDI isoforms with different domain organizations: emphasis on the oxidoreductase properties of PDI ! M

Discussion et perspectives

I. Dissection des caractéristiques mécanistiques et biochimiques de la Gpx5 de peuplier

I.1. Latétrade catalytiquedesGpxs,plusqu’unmodulateurdupKade la CysP……….176

I.2. LadualitédefonctiondelaCysP……….……...177

I.2.b.L’étatd’oxydationdelaCysP,unindiceenfaveurd’unemulti! plicitédefonctionsdesGpxsdeplantes?...179

I.3. Lesmodalitésd’interactionentrelaGpx5etlaTrxh1……….……..182

I.4. LesrôlesphysiologiquesdesGpxsdanslaréponseaustressoxy!

dant……….183

II. Les PDIs chez les organismes photosynthétiques

II.1.Analysephylogénétiqueetclassification………..185

II.2.CaractérisationbiochimiquedetroisisoformesdePDIsde peu!

plier……….186 II.2.a.Propriétésdesprotéinessauvagesvis!à!visdetestsclassiques d’activitéPDI………..……….187 II.2.b.RecherchedesspécificitésdesdeuxmodulesTrxa°etadela protéinePtPDI!M………..………...189

II.2.c.LaversatilitédesréactionscatalyséesinvitroparlesPDIs,un aperçudeleuractivitéinplanta?...191

Annexes

Références

Communications scientifiques et distinctions

Introduction

L’uniformisation de la recherche scientifique a depuis de nombreuses années abouti à la sélection de certains organismes qualifiés « d’organismes modèles ». Ceux!ci sont sélectionnés suivant certains critères objectifs. Ainsi le peuplier a été choisi comme espèce modèle pour les organismes ligneux du fait de la taille de son génome (485 ±10 mégabases), de la relative rapidité de son cycle de croissance (environ 5 mètres par an), de la disponibilité de bases de données gé!

nomiques ainsi que d’outils de transformation génétique. De plus, par rapport aux espèces non pérennes, type Arabidopsis thaliana, l’étude du peuplier peut apporter des informations essen!

tielles sur les processus de formation du bois, des variations phénotypiques saisonnières, ou lors d’interactions pathogènes ou mutualistes.

Le peuplier est le système biologique d’étude de l’unité « Interaction Arbres!

Microorganismes » au sein de laquelle se sont déroulés mes travaux de thèse. Mon équipe d’ac!

cueil, « Réponse aux stress et régulation redox » a pour principal objectif la caractérisation

« systématique » de protéines de peuplier impliquées dans des mécanismes d’oxydoréduction et appartenant à la grande famille des thiorédoxines (Trx). Ces protéines ubiquitaires présentes des procaryotes aux eucaryotes, sont généralement de petite taille (aux alentours de 15 kDa) et pos!

sèdent des caractéristiques structurales et/ou fonctionnelles communes. La principale caractéris!

tique est la présence de résidus cystéine (Cys) généralement conservés. Ce résidu, constitué d’u!

ne chaîne latérale possédant un atome de soufre a la particularité de former dans certains cas des liaisons covalentes avec d’autres atomes (soufre ou oxygène notamment). Ainsi, grâce à cette propriété, des échanges d’électrons peuvent être réalisés par les protéines de la superfamille des Trx suivant des réactions de réduction/formation de ponts disulfure entre deux résidus Cys. La superfamille des Trx regroupe, de façon non exhaustive, les Trx, les glutarédoxines (Grx), les thiol

!peroxydases (Tpx) et les protéine disulfure isomérases (PDI). Au cours de mon travail de thèse, je me suis particulièrement intéressé à deux processus nécessitant l’intervention de protéines de la superfamille des Trx chez le peuplier, la réduction des espèces réactives de l’oxygène (ROS), et la formation et l’isomérisation des ponts disulfure à travers la caractérisation biochimique de certai!

nes membres de la famille des Tpx (les glutathion peroxydases ; Gpx) et des PDI.

Synthèse bibliographique

I. Généralités

I.1. Modificationdel’activitédesprotéines

Parmilesprocessusmisenœuvredanslaréponsedesplantesauxfluctuationsenvironne! mentales figurent les modifications post!traductionnelles ayant pour but de changer et/ou de régulerlafonctiondesprotéines.Denombreusesmodificationspost!traductionnellesdesprotéi! nesontétérecenséesdontnotammentlesphosphorylations,glycosylations,acétylations,méthy! lations,sumoylations,isoprénylations, ubiquitinations,citrullinations,etc….Certainesde cesmo! dificationsontpotentiellementunfortimpactsurlastructuretridimensionnelledesprotéines,en particulier la formation/réduction de ponts disulfure. Nous allons approfondir les mécanismes responsablesdecesmodificationspost!traductionnellesdetyperedoxdanslasuitedecettesyn! thèsebibliographique.

I.2. Originedelaformationdespontsdisulfure

Lesponts disulfure sontdes liaisonscovalentesentredeuxatomesdesoufre, résultantd’un processus oxydoréducteur impliquant des transferts d’électrons et de protons. Au niveau des protéines,lesacidesaminésresponsablesdelaformationdetellesliaisonssontlesrésiduscystéi! nyls(Cys).Cesacidesaminésprésentent surleurchaînelatérale,unatomedesoufre,quiàl’état réduitestsousformedethiol(S!H)oudethiolate(S^-)(Figure1A).Cetatomedesoufreestunélé! mentdéterminantdanslesréactionsd’oxydoréduction,aumêmetitrequel’oxygène,leferoule cuivre,deparsapropensionàsubirdesréactionsderéductionetd’oxydation(Figure1B).Ilexis! tedeuxvoiesprincipalesdeformationdespontsdisulfure:

Une voie de réponse à des molécules oxydantes qui peuvent oxyder l’atome de soufre sousdifférentesformes(Figure2).L’unedecesformesoxydées,l’acidesulfénique (R!SOH),peut êtredirectementattaquépar unautreatome desoufresousformethiolate(R!S^-, Figure2),libé!

Figure 1. Le résidu cystéinyl

A. Formule chimique de l’acide aminé cystéine. B. Mécanisme schématique de la formation d’un pont disulfure entre deux résidus cystéines.

rantunemoléculed’eauetformantuneliaisoncovalenteouliaisoncystineentrelesdeuxrésidus Cysvialeursatomesdesoufrerespectifs(Figure2).

Unevoiede formationpartransfertdirect consistanten unéchangedepont disulfure s’effectuant entre une protéinedonneuse d’électrons dont les cystéines sont sous la forme de thiolsetuneprotéineacceptricedontlesrésiduscystéinylssontsouslaformecystine(Figure3).

Cephénomèneestappelé«échangedithiol/disulfure».

Figure 2. L’oxydation du résidu cystéinyl Schéma récapitulatif de l’oxydation des résidus cystéine par des composés oxygénés (EAO) ou azotés (RNS). Les éléments XH2 représentent des réducteurs chimiques ou biologiques tels que le DTT, le glutathion ou des protéines contenant des résidus cystéinyls (Poole et al.

2004).

Figure 3. Echange dithiol/disulfure

Représentation schématique d’un échange dithiol/disulfure entre une protéine donneuse (forme ova- le) et une protéine acceptrice (rectangulaire) d’électrons.

I.3. Importancedespontsdisulfuredanslesprotéines

Suivant le rôle que jouentles ponts disulfure au seindes protéines, ceux!cipeuvent être classésentroisgrandstypes(Woutersetal.2010):

.Lespontsdisulfurestructuraux,quiassurentlastabilitédesprotéines,

.Les ponts disulfure allostériques, dont la formation/réduction modifie la conformation tridimensionnelledelaprotéineetmodifieainsisesfonctionsenzymatiques,sanstoutefoisinter! venirdirectementdanslemécanismeenzymatiquedecelle!ci,

.Les ponts disulfure catalytiques, qui jouent un rôle dans le mécanisme catalytique de l’enzyme.

I.4. Acteursdeséchangesdithiol/disulfure

Les échanges dithiol/disulfure sont réalisés par des protéines appelées «thiol! oxydoréductases». La grande majorité des thiol!oxydoréductases appartient à la superfamille des thiorédoxines (Trxs). Néanmoins, certaines enzymes appartiennent à d’autres familles de protéines (Ritz & Beckwith 2001; Collet & Bardwell 2002; Ortenberg& Beckwith 2003). C’est le casdessulfhydryloxydases,protéinesimpliquéesdanslaformationdespontsdisulfuredansl’es! pace inter!membranaire des mitochondries (Herrmann & Köhl 2007). Bien que ces protéines contiennent égalementdes résidusCys impliquésdansleséchangesdithiol/disulfure,leur motif catalytique et surtout leur repliement tridimensionnel sont différents. Ainsi, le fonctionnement decesprotéinesestleplussouventcoupléàdepetitesmoléculesacceptricesoudonneusesd’é! lectronstellesqueleNADPH,leNADH,lesflavines(FADouFMN),lesquinonesoul’acidelipoïque (Ortenberg & Beckwith 2003). Enfin, notons que dans un grand nombre de cas, ces thiol! oxydoréductases sont susceptibles d’interagir avec des protéines de la superfamille des Trxs, commecelaestlecasdansleréticulumendoplasmique(RE),oudanslepériplasmedesprocaryo! tes(voirparagrapheV.2.c.)(Frand&Kaiser1998;Frand&Kaiser1999;Frandetal.2000).

II. La superfamille des thiorédoxines

Danscechapitrenous détaillonscertainsaspectsstructurauxmaiségalementfonctionnels des protéinesàrepliementTrx,unepartiedecesinformationsaétéprésentéedans unchapitre d’ouvrage«Glutaredoxin:TheMissingLinkBetweenThiol!DisulfideOxidoreductasesandIronSul! furEnzymes»fournienannexe(Article5,Sellesetal.2009).

II.1.Unrepliementtridimensionnelspécifique

Par définition,les protéinesappartenant àlasuperfamilledes Trxspossèdent unouplu! sieursmodulesayantunrepliementdetypeTrx(Figure4)(Carvalhoetal.2006;Pan& Bardwell 2006). Cette superfamille regroupe entreautres les Trxs, les glutarédoxines (Grxs),les protéine disulfureisomérases(PDIs),lesthiol!peroxydases(Tpxs),lesDsbprocaryotiques,lesglutathion!S! transférases(GSTs)etlesméthioninesulfoxyderéductases(MSR)(Pan&Bardwell2006;Collet&

Messens2010). Lafigure4 nouspermet d’illustrerle paradigmede l’appartenanceàlasuperfa! mille des Trxs. En effet, y sont représentées les structures tridimensionnelles de la Trxh1 (Arabidopsisthaliana),delaDsbA (Escherichiacoli),de laGrxC1(peuplier), delaGpx5(membre de la famille des Tpxs, peuplier), ainsi que de laPDI «classique» (Saccharomyces cerevisiae).Il estimportantdementionnerquelesdifférentesprotéinespossèdentdes similaritésstructurales alorsquelesséquencesprimairespeuventprésenter untrèsfaibletauxd’identité(Figure4).Les deuxseulsacidesaminés strictementconservéssontlaCyscatalytiqueen amontd’unehélice!"

etuneprolineenconfigurationcisenamontd’unbrin!#.

II.2.Caractéristiquesstructurales

La configuration minimale du repliement Trx consiste en un arrangement de quatre brin!#

antiparallèles, formant le «cœur» de la protéine, entourés de trois hélices!" (Holmgren et al.

1975; Capitani et al. 2000; Peterson et al. 2005; Gruber et al. 2006; Collet & Messens 2010) (Figure5).LecentreactifdesprotéinesdelasuperfamilledesTrxsestlocaliséaudébutdel’héli! ce!"1 (Renetal.2009; Pan &Bardwell 2006)(Figures 5).Ilest généralementconstituéde deux résidusCysséparéspardeuxacidesaminésvariablesetcommunémentreprésentésouslaforme CxxC(Holmgren1968; Shietal.1999;Kadokura etal.2003). Commenouspouvonsleconstater sur lafigure5,danscette configuration, laCys en positionN!terminale (cystéinecatalytique ou CysC)estexposéeausolvantetestsusceptiblederéaliserdesattaquesnucléophiles(Kelley&Ri! chards1987;Petersonetal.2005;Tianetal.2006;Kohetal.2007).LasecondeCysenpositionC! terminaleest appeléecystéinede recyclage(CysR) etsetrouve en généralplusenfouie,toutdu