Production d'agglutinines anti aeromonas salmonicida par la truite arc-en-ciel. Influence de la température, d'un adjuvant et d'un immunodépresseur

HAL Id: hal-00900899

https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-00900899

Submitted on 1 Jan 1976

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

Production d’agglutinines anti aeromonas salmonicida par la truite arc-en-ciel. Influence de la température,

d’un adjuvant et d’un immunodépresseur

G. Maisse, M. Dorson

To cite this version:

G. Maisse, M. Dorson. Production d’agglutinines anti aeromonas salmonicida par la truite arc-en-

ciel. Influence de la température, d’un adjuvant et d’un immunodépresseur. Annales de Recherches

Vétérinaires, INRA Editions, 1976, 7 (4), pp.307-313. �hal-00900899�

PRODUCTION

D’AGGLUTININES ANTI AEROMONAS SALMONICIDA PAR LA TRUITE ARC-EN-CIEL

INFLUENCE DE LA TEMPÉRATURE,

D’UN ADJUVANT ^ET D’UN IMMUNODÉPRESSEUR

G. MAISSE M. DORSON Laboraioire <!’7cA<yo/ ’ o<Ao&)gM, ^{1. N. R.} A.,

Route de Thiverval 78850 Thiverval Grignon

RÉSUMÉ

Des truites arc-en-ciel ont été immunisées à l’aide d’une suspension de la bactérie Aeron:onas salmonicida inactivée par ^le chloroforme, et les agglutinines produites ^ont été titrées par ^une

microtechnique. ^Les cinétiques ^de production ^des agglutinines sériques ont été établies à trois

températures.

A 5 °C, ^la production d’anticorps ^est possible bien que tardive comparée à celle observée à iooc et 1 6 o C. L’adjuvant complet ^{de Freund} augmente sensiblement le titre des anticorps,

tandis que la cyclophosphamide injectée ^{aux animaux} d’expérience ^à la dose de 500 mg/kg ^de poids ^{vif s’est montrée sans effet.}

INTRODUCTION

La production d’agglutinines sériques ^{contre diverses bactéries} pathogènes

pour les Salmonidés ^a été décrite chez plusieurs espèces appartenant ^{à cette famille} après injection ^de préparations bactériennes inactivées (S MI T H , 194 0; S P E N CE, F

RY E

R et P IL C H E R , I g65 ; FUJIIiA R A ^et NA K ATANI, _{Ig7 I ;} E v EI / VN, 1971 ; HARR EI ., E

TI , IN GE

R et H OD GINS, 1075).

I,e pouvoir protecteur ^{de ces} agglutinines ^n’a été que ^rarement montré (S PENCE ,

F RY E

R et PIOCHER, 19 65 ^{pour Aeromonas} salmonicida, H ARREL , ^{ET LIN GE R et} H

ODGINS

, 1975 pour Vibrio anguillarum), bien que la vaccination des Salmonidés,

tant par injection ^que par voie orale (K I , ON T Z ^{et A ND I; R S ON ,} 1970 ) ^{ait fait} l’objet ^de

nombreux essais. Dans le cas des agglutinines dirigées ^{contre Aeromonas} salmonicida, agent de la furonculose des Salmonidés, ^des cinétiques ^de production ^ont été établies chez la Truite fario (K RAN T Z , ^{RE DDE C LI FF et} HE IS T, i96 3 ), ^{et chez le Saumon coho} (P

A TE R

SON ^et FRYER, 1974 a).

La production ^{de ces} agglutinines ^{constitue un bon} système d’appréciation ^de

l’influence de divers paramètres ^{sur la} production d’anticorps. Cet article rapporte les résultats obtenus pour des truites arc-en-ciel (Salmo gai y dneri) immunisées avec une suspension d’Aeromonas salmonicida, maintenues à trois températures ( 5 , ¹⁰

et 1 6 o C) ^{et soumises}

uniquement ^{à 1 6 o C}

^{à un} traitement soit _par l’adjuvant complet de Freund soit _par la cyclophosphamide.

Pour ce travail préliminaire nous avons utilisé une microtechnique d’agglutina-

tion largement répandue ^et déjà ^décrite pour notre système par P A TE R SO N et F RY E R

( 1974 b)!

MATÉRIEL ET TECHNIQUES

Suspensions bactériennes

La souche d’A eromonas salmonicida (forme ^{n Smooth} n) utilisée ^a été isolée en pisciculture ^à partir ^de truitelles Fario mourantes (isolement 8 4 j 74 ). ^La suspension immunisante a été préparée

suivant un protocole inspiré ^{de D UFF} (ig 4 z). Après ^{culture en} fermenteur à 2 6°C en bouillon

Trypticase-soja (B. ^D. Mérieux), les bactéries concentrées _par décantation à ro l$ germes par ml environ ont été tuées par addition de chloroforme à 7 p. ¹⁰⁰ puis lyophilisées.

L’antigène utilisé pour les titrages ^était préparé ^{de la} façon suivante : une culture pure de la bactérie

bouillon Trypticase-soja ( 1 8 ^{h à} 2 6°C), ^{réalisée à} partir d’une colonie isolée sur boîte de Petri a permis l’ensemencement de boîtes de Roux contenant un milieu nutritif gélosé (gélose Trypticase-soja, ^{B. D.} Mérieux). Après ^une incubation de 4 8 ^{heures à} 2 6°C, les bactéries ont été récoltées dans une solution de chlorure de sodium 6 p. ^{i ooo,} formol 3 , 5 p. ¹

^{en eau} distillée, et lavées par 3 centrifugations successives suivies d’une remise en suspension dans la solution

précédente. Au moment de l’emploi ^cette suspension était diluée dans une solution de chlorure de sodium à 6 p. rooo en eau distillée de façon ^{à obtenir une densité} optique ^de o,6o à la longueur

d’onde de 525 ^nm. Pour des germes vivants cette densité optique correspond ^{à environ} 5 X ro 8 ger-

mes par ^ml.

Animaux d’expérience : traitements et immunisation

Les truites arc-en-ciel (poids moyen ²⁰⁰ g) provenant ^d’une exploitation ^sous surveillance sanitaire dans laquelle ^{aucun cas} de furonculose n’avait été enregistré ^{avaient été} préalablement

acclimatées pendant 15 jours dans des bacs de 120 1 alimentés par ^{une eau} déchlorée, recyclée

et filtrée, et maintenue à la température voulue par des groupes réfrigérants. Toutes les injec-

tions : cyclophosphamide (Endoxan Asta), 0 , 5 ml d’une solution à ¹⁰⁰ mg/ml, ^et préparation

immunisante ( 0 , 5 ^{ml d’une} suspension ^{à 10} mg/ml de bactéries lyophilisées ^{soit environ} 5 ^X ro 1o

germes) ^{avec ou sans} adjuvant complet ^{de Freund} ( 0 , 2 ml) ^ont été effectuées _par voie intrapéri-

tonéale. Les animaux étaient saignés par ponction cardiaque, les sérums récoltés après coagula-

tion ( 3 ^{h à 20 °C, i nuit à -!-} 4 °C) ^et centrifugation ( 5 ⁰⁰⁰ g ^ro mn), puis conservés à

20 °C.

Titvage ^des anticorps par agglutination

Un système ^de microplaques ^{en matière} plastique ^{à fond} hémisphérique (Cooke engineering Co.) ^{a été utilisé. Les sérums} ( 50 yl ^au départ) étaient dilués de 2 en 2 dans une solution de NaCl 6 p. ^{i ooo} à l’aide d’un microdiluteur manuel (Cooke microtiter) avant addition de ₇₅ N .1 ^{de la} suspension antigénique ^dans chaque puits. Après agitation manuelle et incubation ( 2 ^{h à} 37 °C

et 1 6 h à + 4 0 C) ^les plaques ^{étaient observées sur} fond noir et sous éclairage oblique. ^Une agglu-

tination négative correspondait ^{à un} culot de corps bactériens net et limité ^au fond du puits

(diamètre ^{inférieur à i} mm) ^tandis qu’un tapis ^cohérent occupant tout le fond hémisphérique

(diamètre 5 à 6 mm) ^{était considéré comme} agglutination positive. Le titre d’un sérum était

exprimé par la dernière dilution provoquant ^une agglutination ^nette. Chaque ^{série de} titrages comprenait ^un échantillon d’antigène ^{en eau} physiologique (contrôle négatif) ^{et en} présence ^d’une

série de dilutions d’un sérum de titre déjà ^connu (sérum ^de lapin immunisé contre A. salmonicida).

Chromatographie d’exclusion

La purification ^des Immunoglobulines ^M de la Truite par chromatographie d’exclusion sur

gel d’Agarose ^a été décrite (D ORSON , 1972 ) et les conditions sont rappelées ^{dans la} légende ^de

la figure ^{2 .} L’enregistrement automatique ^de la densité optique était effectué _par un absorptio-

mètre UA, (ISCO).

RÉSULTATS

Une première ^{série de io} poissons ^immunisés par ^une injection intrapéritonéale

de 5 mg (poids sec) ^de bactéries inactivées par le chloroforme ^et maintenus au cours

de l’expérience ^{à une} température moyenne de 1 6 o C (températures extrêmes 14 ^et

1 8

°

C) ^a permis de suivre la cinétique ^de production ^des anticorps jusqu’à 5 mois chez certains individus (fig. i). ^{I,e titre en} agglutinines ^{de ces animaux} saignés ^avant

immunisation, ^{de même} que celui de 10 poissons ^{non immunisés et} saignés ^{tout au} long ^de l’expérience ^ne dépassait ^{pas 6 en} logarithme ^{de base 2 , soit une dilution de} i/6

4

. ^Au 30e jour ^{ont été} enregistrés les titres les plus ^élevés (jusqu’à 17 log $ ^soit i/i

3

i o72). ^{Le retour au titre de base} était effectué au 150 e jour pour ^{les 2} poissons

survivants. Le titrage ^des agglutinines ^{sur les fractions obtenues} après ^chromato- graphie d’exclusion sur colonne de Sepharose 4 B ^de pools ^{de sérums} prélevés ^au

30

e ^et 8oe jours ^a permis de contrôler que l’activité anticorps était associée au premier pic ^exclu (fig. 2 ). ^{Dans ces} conditions de chromatographie ^ce pic ^{est constitué exclu-}

sivement des IgM (DoRsoN, ig 7 2). ^D’autre part ^sa surface était 3 à 4 ^fois supérieure

à celle qui ^est obtenue dans des conditions strictement identiques lors de la purifica-

tion de routine des IgM ^à partir ^{de sérums non} immuns, ^{dénotant une} augmentation

sensible de la concentration relative des IgM. ^Une seconde série d’expériences ^{a été}

conduite pour suivre la cinétique ^de production ^des anticorps ^{à trois} températures

différentes ( 5 , ^{10 ,} 1 6 o C) ^et apprécier l’influence d’un adjuvant (adjuvant complet

de Freund) ^{et d’un} immunodépresseur classique pour ^les homéothermes (la cyclo- phosphamide) administrés aux animaux maintenus à 1 6oC. Les résultats individuels font l’objet ^{de la} figure 3 qui comprend l’enregistrement ^des températures

(5, 2

± o,8°C, ^{10 , I ::1:} o,7&dquo;C ^{et i6,o !} 2 ,5°C respectivement). ^Les poissons ^de chaque

lot ont tous été saignés ^aux jours 1 8, 30 ^et 52 ^et étaient individualisés par marquage

Cependant ^les cinétiques individuelles n’ont _{pu être} représentées pour des raisons de

surcharge ^{de la} figure. L’expérience ^n’a pu ^être prolongée ^{au-delà du} 50 e jour pour les lots maintenus à 1 6 o , ^tandis que tous les individus des lots « 50

^{et « ioo}

^ont pu

être saignés ^{au jooe} jour. ^Les titres moyens étaient ^alors pratiquement identiques ^à

ceux enregistrés ^au jour 5 0 : ^à 5 °C 8,7 ! 2 ,5 log : ^{à 10 0} jours ^contre 9,2 ! 3 ^à 5 0 jours,

à iooc I I ,8 + 5 à 1 00 jours ^contre m,5 ! 5 , 5 ^à 5 o jours. Les cinétiques ^{établies sur}

les moyennes ^ont été regroupées ^{dans la} figure ^{4 pour} comparaison. Afin de ^mieux apprécier ^{l’effet de} l’adjuvant, ^{un test} d’analyse de variance a été effectué sur les résultats individuels obtenus lors ^{de la} saignée ^du 30e jour (fig. ^{3 C et} D) : l’augmen-

tation des titres due à l’adjuvant ^est significative ^{avec un} risque ^{inférieur à i} p. ^ioo

d’après ^{la table F de F I S CHER .}

DISCUSSION ET CONCLUSION

Comme cela ^a été décrit (K RA rrT Z , ^{R EDD E CLIFF et} HF IST , 19 6 3 ) ^une injection intrapéritonéale d’une suspension d’Aeromonas salmorcicida tués entraîne une vigou-

reuse synthèse d’agglutinines (titre ^maximum 1/131 o!z), ^{chez la} Truite arc-en-ciel

!fig. i). ^Les immunoglobulines ^M déjà caractérisées chez ce poisson (DO R S ON , 197 2)

et chez le Saumon coho (C ISAR ^et F RYER , ig 74 ) ^sont responsables ^{de cette activité} (fig. 2 ). ^On dispose ainsi d’un système pratique pour l’étude de divers paramètres

sur la réponse immunitaire humorale de la Truite. Malgré l’hétérogénéité individuelle

rencontrée, ^une première approximation de l’influence de la température ^a pu être

obtenue (fig. 3 ^et 4 ). ^A 5° C ^des agglutinines détectables n’apparaissent guère ^{avant le}

30e jour, le titre maximum étant atteint entre 50 ^{et 100} jours. ^{Les dates de} saignée

ne permettent pas de déterminer si ^ce titre maximum était aussi élevé que le titre obtenu aux températures supérieures. ^{A 10 ° la} synthèse ^des anticorps ^est plus précoce d’environ ₃₀ jours que celle qui ^{est observée à} 5°, tandis que la cinétique ^{obtenue à}

1

6° ne présente qu’une accélération modeste

qui ^{aurait été mieux} appréciée grâce

à une saignée supplémentaire ^{au zoe} jour

par rapport à iooc. Ces cinétiques ^sont comparables ^à celles obtenues par ^{P A TE RSON et} F RYER ( 1974 a) chez le Saumon coho à des températures ^de 6, 7 °C, 12 , 2 0 C, ^et y,8!C. ^{Il est} intéressant de noter que la

synthèse d’anticorps est tout à fait possible ^à 5° C, ^{et il faudra descendre en dessous}

de cette température pour ^{mettre en} évidence l’existence éventuelle d’une tempéra-

ture ^« non permissive » pour la production d’anticorps sériques, ^{comme cela a été}

décrit chez la Carpe (AvTALIoN et al., z 973 ). ^{Sur le} plan pratique les basses tempé-

ratures ne représentent pas un écueil _pour une vaccination.

On peut ^{noter ici} que le titre _moyen en agglutinines

naturelles » (titre ^des

sérums au temps o) ^{est nettement} plus élevé chez les animaux maintenus à 1 6 o que chez ^ceux maintenus à 5 ^{et I o ° .} Ces agglutinines ^« naturelles » dont le titre reste modeste par rapport ^à celui des anticorps ^obtenus après immunisation, ^{semblent ne} pas avoir la même nature moléculaire que ^ces derniers (E LLI S, communication _person-

nelle).

Sans être aussi nette pour ^cet antigène ^et pour la dose considérée que celle qui ^a

été rapportée ^{pour le} Dinitrophénol couplé ^à l’Hémocyanine (DoRsoN, 1972 ), ^l’in-

fluence de l’adjuvant complet ^{de Freund est} sensible, ^et les titres obtenus avec ce

dernier significativement supérieurs ^de plusieurs ^{unités à ceux des} poissons ^immunisés

avec la bactérie seule. Il sera intéressant d’observer l’influence de l’adjuvant ^{sur des} cinétiques ^{réalisées à} 50 C ^{et en} dessous de cette température, ^{et pour} lesquelles ^son

influence pourrait ^être plus nette. Par contre la cyclophosphamide administrée à raison de 5 00 mg/kg ^de poids ^{vif en 10} injections ^de 5 0 mg réparties ^{entre le i2 e} jour précédant l’immunisation et le 3 8e jour ^{suivant celle-ci, n’a eu aucune influence sur}

la production ^des agglutinines sériques. ^{La dose} employée correspond ^{à une dose}

létale _pour la Souris, ^une dose de 50 mg/kg entraînant chez cet animal une immuno- suppression marquée (BERENBA UM ^{et BROWN,} 1964).

Ce résultat est à rapprocher

^avec prudence

des observations de S AN T OS

et OwENS ( 19 66) qui ^ont montré que l’action de la cyclophosphamide ^{est chez la}

Souris limitée à la production ^des IgG ^{et n’affecte} guère celle des IgM. ^{De toute} façon ^aucune conclusion ^ne pourra être tirée tant que des doses variées

allant

jusqu’à la dose létale _pour la Truite

n’auront _pas été utilisées.

Reçu pour publication ^en juin ^1976.

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé grâce ^{à un} contrat du Conseil supérieur de la Pêche.

Nous remercions le docteur B ERSON (R. B ELLON ) pour la préparation ^en fermenteur de la

.culture bactérienne utilisée pour ^les immunisations, et C. CARRAT pour les calculs statistiques.

SUMMARY

THE AGGLUTININ RESPONSE

OF RAINBOW TROUT TO AEROMONAS SALMONICIDA

EFFECT OF TEMPERATURE, ADJUVANT ^{AND AN} IMMUNOSUPPRESSIVE AGENT Adult rainbow trout were immunized intraperitoneally ^{with a} chloroform killed Aeromonas salmonicida suspension. Agglutinating antibodies were titrated using ^a microtiter system. ^Anti- body activity ^was associated with IgM fraction obtained from Sepharose q B gel filtration. The kinetics of antibody ^{formation were} established at three temperatures. ^At 5 °C detectable anti- Lodies were found at day 50 post immunization. At io o c and 1 6°C the agglutinin ^{titer rose before} day ^{20 . The} antibody ^{titer was} significantly ^raised by ^Freund’s complete adjuvant, ^but cyclo- phosphamide ^{at a} total dose of 500 mg/kg ^of body weight administred in 10 injections ^before

and after immunization had

effect.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

A

V’fALION R. R., W OJDANI A., ^MALIK Z., ^{S HAHRABANI} R., ^{D UCZY Af INER} M., 1973 . Influence of environmental temperature

the immune response ^{in Fish. Current} Topics ⁱⁿ Microbiology ^and Immunology, 61, 1-35.

B

ERENBAUM 1B1. C., ^{B R owN I.} N., 19 6 4 . Dose-response relationships ^for agents inhibiting ^{the immune} response. Immunology, 7, 6 5 - 71 .

CC

SAR J. O., F RVER J. L., 1974 . Characterization of anti Aeromonas salmonicida antibodies from Coho Salmon. Infect. Immunity, 9, 23 6- 43 .

Do R S

ON M., 1972 . ^La réponse immunitaire chez la Truite arc-en-ciel (Salmo gairdneri) : quelques ^carac téristiqces ^des immunoglobulines produites lors d’une réaction primaire. Ann. Rech. Vétér., 3, 93 - 107 D

UFF D. C. B., 1942 . The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida. J. Immunol., 44, 87-94.

E

VELYN T. P. T., 1971 . The agglutinin response in sockeye salmon vaccinated intraperitoneally ^{with a} heat-killed preparation of the bacterium responsible for salmonid kidney ^disease. J. ^Wildl. Dis., 7, 32 8- 335.

F

UJIHARA ^M. P., ^{N AKATANI R.} E., 1971 . Antibody Production and immune responses of Rainbow Trout and Coho Salmon to Chondrococcus columnaris. J. ^{Fish. Res. Bd.} Canada, 28, 1253 - 125 6.

H

ARREL L. W., ^{E TLINCFR H.} BIL, H ODG INs H. O., 1975 . Humoral factors important ⁱⁿ resistance of salmonid fish to bacterial disease. 1 Serum antibody protection of rainbow trout (Salmo gairdneri) against Vibriosis. Aquaculture, 6, 211 - 219 .

K

RANTZ G. E., ^{R EDDECLIFF} J. M., ^{H EIST C.} E., 19 6 3 . Development of antibodies against ^Aeromonas salf1:onicida in trout. J. Immun., 91, 7 57 -760.

K

LONTZ G. W., A NDERSON D. P., xggo. ^Oral immunization of Salmonids : a review. In: a symposi2sm on diseases of Fishes and Shellfishes, 52 6 p., Special Publication n° 5 , American Fisheries Society, Washing- ton, ^{D. C.}

P

ATERSON W. D., ^{F RYER} J. L., 1974

Effect of temperature ^and antigen ^dose

^the antibody

ponse of juvenile ^{Coho Salmon} (Oncorhyuchus hisutch) ^to Aeromonas salmonicida endotoxin. J. ^Fish.

Res. Bd. Canada, 31, x7 43 - 49 . P

ATERSON W. D., ^{F RYER} J. L., 1974 b. Immune response of juvenile Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch) ^to Aeromonas salmonicida cells administered intraperitoneally in Freund’s complete adjuvant.

J. Fish. Res. Bd. Can., 31, 1751 - 1755 . S

ANTOS W., OwE N S ^A. H., xg66. 19 S and 7 S Antibody production ^{in the} cyclophosphamide ^{of Metho-}

trexate-treated rat. Nature, 209, 6 22 -6 24 . S

MITH W. W., 1940 . Production of Antibacterial Agglutinins by Carp ^{and Trout at 10 °C. Proc. Soc.}

Exper. ^Biol. Med., 45, 7 2 6-7 29 . S

PENCE K. D., ^{F RYER} J. L., ^{P ILCHER K.} S., 19 6 5 . Active and passive immunization of certain Sal-

monid fishes against Aeromonas salmonicida. Canad. J. Microbiol., 11, 397 - 405 .