A. Dumoulin
introduction
Le diagnostic de laboratoire des maladies infectieuses se base sur deux approches : a) détecter le microbe lui-même (directe ment par microscopie ou après culture) ou l’une de ses structures moléculaires (protéines ou acides nucléiques) ou b) mesurer la réponse immunitaire humorale (anticorps spécifiques) ou cellu- laire (stimu lation lymphocytaire). Le choix de l’approche analytique dépend du questionnement clinique, du type de pathogène et de l’existence de tests de laboratoire pour le pathogène en question.
Si les anticorps et les antigènes sont bien des structures moléculaires, le terme
«diagnostic moléculaire» se réfère à des méthodes de détection et d’analyse du génome d’un organisme. Les premières méthodes d’analyse de l’ADN, comme le Southern blot, existaient déjà dans les années 1970,1 mais c’est le développe- ment de la PCR au milieu des années 1980 qui démocratisa leur utilisation.2,3 Très rapidement, la possibilité d’amplifier l’ADN et l’ARN (acide ribonucléique) fut utilisée pour la détection de pathogènes. Trente ans plus tard, la PCR est une méthode centrale du laboratoire de microbiologie.
Encore récemment limitée, la palette des tests de diagnostic moléculaire s’est fortement étoffée et il est important de connaître quelques règles pour leur bon usage. Cet article vise à donner une vue d’ensemble des tests moléculaires, les réponses qu’ils peuvent apporter au clinicien et leurs limitations.
étapesdel
’
analyse moléculaireL’analyse d’échantillons par les méthodes moléculaires se divise en trois étapes : 1. extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir de l’échantillon primaire ;
2. amplification d’une séquence ADN/ARN cible du pathogène par PCR ; 3. détection de l’amplificat.
Les méthodes couvrant ces trois étapes se sont perfectionnées au cours des années. Une des principales innovations fut le développement de la PCR en temps réel, permettant de combiner les étapes 2 et 3, réduisant considérablement la durée de l’analyse. Ainsi, un résultat est actuellement disponible en 24 heures, alors qu’il fallait plusieurs jours à l’origine.
Molecular diagnostics of infectious diseases for the ambulatory practice Molecular diagnostics methods are not limited to specialized centers anymore. They play an important role for the diagnostic of infections commonly encountered in the clinical practice.
Especially the detection of pathogens difficult to cultivate, such as viruses, has been greatly improved by these methods. Often, PCR has become the gold standard for the diagnostics of these pathogens. However, PCR cannot be used in any case, and it is not fail proof. The- refore, it is important to know when to use mo- lecular methods and what are their strengths and weaknesses, in order to prescribe them rationally. This article reviews the characteris- tics of molecular tests and their main indica- tions in the ambulatory setting.
Rev Med Suisse 2014 ; 10 : 1866-70
Les méthodes moléculaires ne sont plus seulement à disposi
tion des centres spécialisés et jouent désormais un rôle impor
tant pour le diagnostic des infections communes vues en prati
que ambulatoire. C’est surtout pour la détection de pathogènes difficilement cultivables, notamment les virus, que la PCR est devenue la méthode de référence. Si elle a remplacé les métho
des traditionnelles pour certaines indications, la PCR n’est pas applicable dans tous les cas, et elle n’est pas infaillible. Il est donc important de savoir quand employer les méthodes mo
léculaires, quelles sont leurs forces et leurs faiblesses, afin de pouvoir les prescrire de façon rationnelle. Cet article passe en revue les caractéristiques des tests moléculaires et leurs prin
cipales applications en pratique ambulatoire.
Diagnostic moléculaire des
maladies infectieuses pour la pratique ambulatoire
mise au point
Dr Alexis Dumoulin Biologiste adjoint
Service des maladies infectieuses Institut central
Hôpital du Valais
Avenue du Grand-Champsec 86 1950 Sion
alexis.dumoulin@hopitalvs.ch
Hormis leur grande rapidité par rapport à la culture, les méthodes basées sur la PCR sont très spécifiques et sensi- bles, souvent plus que les méthodes traditionnelles. De plus, le développement de tests moléculaires pour un pathogène particulier peut être relativement aisé, pour autant que des séquences génétiques de référence soient disponibles. Ceci permet la mise sur pied des tests moléculaires en quelques semaines et une réaction rapide à l’émergence de nouveaux pathogènes, comme ce fut le cas lors de la pandémie de grippe A/H1N1 en 2009, ou plus récemment avec la grippe A/H7N9 ou le coronavirus MERS (Middle East respiratory syn- drome coronavirus).4
utilisationdesméthodes dediagnostic moléculaire
Fenêtre d’utilisation des méthodes moléculaires
La détection par PCR est souvent opposée à la détec- tion d’anticorps. Les méthodes moléculaires, tout comme la détection d’antigènes, permettent un diagnostic dans la phase aiguë d’une maladie, avant l’apparition d’anticorps (tableau 1). La présence d’anticorps dans le sérum n’est en effet mesurable au plus tôt qu’après quelques jours (ru- béole, varicelle), voire quelques semaines (virus respiratoi- res, maladie de Lyme).5 Dans la phase aiguë, une PCR po- sitive démontre le plus souvent une infection, alors qu’une sérologie négative doit être répétée dans un délai adéquat pour mettre en évidence une séroconversion.5,6 Il faut néan- moins rappeler que pour certaines maladies, par exemple la mononucléose infectieuse, les anticorps spécifiques sont présents au moment des symptômes. La détection d’anti- corps suffit alors pour confirmer un diagnostic.7
Les méthodes moléculaires peuvent servir au diagnostic de pratiquement toutes les infections aiguës rencontrées au cabinet médical (tableau 1). Elles ne sont toutefois pas toujours nécessaires au diagnostic. Ainsi, un état fébrile avec
des symptômes respiratoires en période de grippe ne justi- fie pas nécessairement une PCR. De même, un tableau de varicelle chez un enfant ne requiert pas systématiquement une analyse de laboratoire. Par ailleurs, la PCR n’est pas utile au diagnostic de certaines infections, mais peut être utile dans leur suivi ou dans certaines situations (tableau 2).
Détection de pathogènes
Virus
En permettant la détection de pathogènes pas ou diffi- cilement cultivables, les méthodes moléculaires ont révo- lutionné la microbiologie médicale, principalement pour le diagnostic des maladies virales. En effet, la culture de virus nécessite des lignées de cellules humaines ou animales immortalisées et peut prendre plusieurs semaines. Elle est de moins en moins utilisée et a été largement supplantée par la PCR, qui a également remplacé la sérologie pour de nombreuses indications, telles que l’infection aiguë à Herpès ou à Varicella zoster ou le zona.6,8
Bactéries et champignons
Contrairement aux virus, les techniques moléculaires n’ont pas remplacé les cultures pour les bactéries ou les cham- pignons. Elles ont toutefois pris une place importante pour la détection de pathogènes spécifiques tels que Staphylo- coccus aureus résistant à la méticilline (MRSA) ou Clostridium difficile. De plus, la détection de certaines bactéries à crois- sance lente ou requérant des conditions de cultures très particulières (mycobactéries, Chlamydia) a également été améliorée et simplifiée par le développement de PCR spé- cifiques.
Parasites
La détection par PCR est disponible pour de nombreu ses infections parasitaires comme la toxoplasmose, la leishma- niose, l’amibiase (distinction entre Entamoeba histolytica et
Détection par PCR Détection d’antigènes Sérologie Matériel optimal pour
la PCR
Infections respiratoires aiguës
Influenza (grippe), Recommandée Alternative à la PCR Pas d’utilité diagnostique Expectoration, frottis
RSV, adénovirus (sensibilité moindre) nasopharyngé profond,
aspiration nasale Coqueluche Recommandée dans les Pas d’utilité diagnostique Détection d’anticorps Frottis nasopharyngé (Bordetella pertussis) 3 premières semaines antitoxine utile dans les phases profond, aspiration nasale
tardives12
Legionnella Recommandée en complément Détection d’antigènes urinaire : Pas d’utilité diagnostique Expectoration, frottis pneumophila de la détection d’antigènes méthode de choix pour le nasopharyngé profond
dépistage
Chlamydia Recommandée en phase aiguë ; Pas d’utilité diagnostique Utile en complément, pour Expectoration, frottis
pneumoniae, sensibilité dépendant du type documenter une nasopharyngé profond
Mycoplasma de prélèvement séroconversion13,14
pneumoniae
Infections gastrointestinales virales
Adénovirus, Alternative à la détection Méthode de choix pour le Pas d’utilité diagnostique Selles natives rotavirus d’antigènes dépistage (test rapide)
Norovirus Recommandée Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité diagnostique Selles natives Tableau 1. Exemples de pathogènes fréquents pour lesquels une PCR peut être indiquée pour le diagnostic RSV : respiratory syncitial virus ; EDTA : acide éthylène diamine tetra-acétique ; LCR : liquide céphalorachidien.
dispar) ou la malaria.9 Pour ces maladies, les méthodes tra- ditionnelles (microscopie ou sérologie) restent encore très utilisées, mais il est vraisemblable que les méthodes mo- léculaires gagnent en importance dans les prochaines an- nées.
Quantification de pathogènes
Outre une simple détection, les méthodes moléculaires
modernes permettent également de donner des indications quantitatives, par exemple pour suivre l’évolution de la charge virale des virus VIH ou de l’hépatite C sous thérapie, et de détecter ainsi l’émergence de souches résistantes.
Cette quantification est également utile pour le diagnostic de réactivations de virus latents comme le polyomavirus BK ou le CMV (cytomégalovirus) chez les patients immuno- supprimés.10
Détection par PCR Détection d’antigènes Sérologie Matériel optimal pour
la PCR
Infections gastrointestinales bactériennes
Salmonella, Shigella, Alternative à la culture Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité dans la phase aiguë. Selles natives
Campylobacter, (méthode de choix) Rôle controversé pour le
Yersinia diagnostic des arthrites
réactives15
Clostridium difficile Alternative ou complémentaire Utile pour la détection Pas d’utilité diagnostique Selles natives à la détection d’antigènes et d’antigènes et de toxines,
de toxines sur selles natives ou après
culture
Infections virales communes
Herpès et varicelle Recommandée pour les cas Frottis de lésions à déposer Utile uniquement dans Frottis sur lésions, douteux et les suspicions sur lame : alternative à la PCR l’infection primaire de la LCR
d’infection du système nerveux (sensibilité moindre) varicelle (détection d’IgM)8 central. Pas nécessaire pour
les cas simples
Entérovirus et Recommandée pour les Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité diagnostique LCR coxsackie suspicions de méningite virale.
Pas nécessaire pour les cas simples (pied-main-bouche, angine virale)
Rougeole Utile dans la phase prodromale Pas d’utilité diagnostique Utile à partir du 3e jour16 Frottis de gorge ou pour les cas douteux
Hépatites virales aiguës
Hépatite A Utile dans certains cas Pas d’utilité diagnostique Méthode de choix pour le Plasma, selles natives
d’infection débutante, avant dépistage
que les anticorps ne soient détectables
Hépatite E Utile en complément à la Pas d’utilité diagnostique Sérologie négative à confirmer Plasma, selles natives
sérologie dans les deux par PCR ou suivi sérologique
premières semaines après 2-3 semaines17
Infections sexuellement transmissibles
Chlamydia Recommandée pour Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité dans la phase aiguë. Urine, frottis trachomatis le diagnostic des infections Utile pour la recherche de
aiguës causes infectieuses d’infertilité
ou de fausses couches18
Neisseria Recommandée pour le Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité diagnostique Urine, frottis gonorrheae diagnostic des infections aiguës
Papillomavirus Recommandée pour le Pas d’utilité diagnostique Pas d’utilité diagnostique Frottis (HPV) dépistage et la typisation,
en complément des analyses
cytologiques19
Fièvre au retour de voyage
Dengue, Recommandée en phase aiguë Alternative à la PCR dans Recommandée dans les Plasma, sérum chikungunya (premiers jours des symptômes), les premiers jours (antigène infections avancées
avant que les anticorps ne soient NS1 de la dengue)
détectables20
Malaria Utile pour le typage des Test rapide : utile en Pas d’utilité diagnostique Sang EDTA parasites en complément à la complément à la microscopie
microscopie. Potentiellement (test de choix pour le utile pour le dépistage de dépistage : goutte épaisse cas particuliers9 et frottis)
Tableau 1. (Suite)
Identification et caractérisation par séquençage
Bien que le séquençage de l’ADN ait été développé avant la PCR, toutes les méthodes modernes se basent dé- sormais sur celle-ci. Son application la plus commune en microbiologie est la détection et l’identification de bacté- ries par le séquençage de l’ADN ribosomal. La séquen ce de ce gène étant spécifique à une espèce ou une famille, une identification est rendue possible, aussi lorsque la bac térie n’est pas ou plus cultivable. Cette méthode de PCR eubactérienne n’est cependant utile que pour des prélèvements normalement stériles, comme les implants ou le liquide céphalorachidien. La détection de mutations causant des résistances aux thérapies est une autre appli- cation du séquençage, utilisée par exemple pour la carac- térisation des virus VIH ou CMV.
bonusagedes méthodesmoléculaires
Savoir ce qu’on cherche
Contrairement à la culture, qui permet en principe la mise en évidence de tous les microbes présents dans un prélèvement, les méthodes moléculaires, ainsi que sérolo- giques, doivent être appliquées de façon ciblée. Il n’y a pas de «PCR pour tout». Le médecin doit décider à l’avance ce qu’il veut rechercher (par exemple, le virus de la grippe ou un virus respiratoire syncitial). Il existe cependant pour cer- tains syndromes, tels que les affections respiratoires, de plus en plus de panels moléculaires, permettant de tester des dizaines de pathogènes en une fois. Si l’efficacité analyti- que de ces analyses en multiplex n’est plus à démontrer,
leur coût reste important et leur utilisation devrait se faire de façon différenciée et réfléchie.
Prélever de façon optimale
Un prélèvement adéquat est indispensable pour garan- tir la qualité d’une analyse. Typiquement, un frottis nasopha- ryngé pour la détection du virus de la grippe n’est optimal que s’il est fait de manière correcte (frottis profond). Pour les échantillons sanguins, il est préférable d’éviter les tubes héparinés, qui peuvent causer des inhibitions de la PCR.
Dans le doute, il ne faut pas hésiter à contacter le laboratoire.
Connaître les limites des tests moléculaires
La haute spécificité des méthodes moléculaires est aussi leur point faible. Ainsi, une nouvelle variante d’un virus ou d’une bactérie peut être moins bien détectée, voire même échapper complètement à l’amplification. Ceci fut par exem- ple le cas lors de la pandémie de grippe de 2009, où cer- tains tests ne détectaient pas le nouveau virus. Il incombe au laboratoire de régulièrement passer en revue les carac- téristiques de ses tests, de les comparer aux données géné- tiques disponibles et de les adapter aux nouvelles varian- tes. Ce talon d’Achille des méthodes moléculaires a poussé les fabricants de tests de suivi de charge virale VIH à cibler deux gènes du virus, réduisant ainsi le risque d’une quan- tification inexacte.
Les méthodes sérologiques, ainsi que la détection d’anti- gènes, sont moins sensibles à ces variations génétiques et restent donc recommandées pour le dépistage de certains pathogènes, tel le VIH (tableau 2). Enfin, chaque méthode
Tableau 2. Exemples de pathogènes pour lesquels une PCR n’est généralement pas indiquée pour le diagnostic
*EBV, CMV, VIH, hépatites B et C : PCR quantitative utile pour le suivi d’une infection chronique. EBV : virus d’Epstein-Barr ; CMV : cytomégalovirus.
Détection par PCR Détection d’antigènes Sérologie Mononucléose infectieuse
EBV, CMV, Rarement utile pour cette indication * Pas d’utilité diagnostique Recommandée pour le dépistage,
Toxoplasmose en combinaison avec la détection
d’anticorps hétérophiles et la formule
sanguine (lymphocytose, lymphocytes
atypiques) 7
Dépistage des maladies transmises par le sang
VIH Non recommandée* : certains sous-types Méthode de choix, en complément Méthode de choix, en complément non détectables par les méthodes standards de la détection d’anticorps de la détection d’antigènes (VIH 2)
Hépatite B Non recommandée* : hépatite B chronique Méthode de choix, en complément Méthode de choix, en complément inactive pouvant être négative à la PCR 21 de la détection d’anticorps de la détection d’antigènes Hépatite C Non recommandée* : charge virale négative Potentielle alternative à la PCR Méthode de choix, à confirmer par
par phases 22 Utilité pour le dépistage encore immunoblot
débattue
Dépistage des maladies sexuellement transmissibles
Syphilis Possible sur frottis de lésions, mais utile Pas d’utilité diagnostique Recommandée pour le dépistage 23 seulement en tout début d’infection
Dépistage des maladies transmises par les tiques
Borréliose Non recommandée pour le dépistage Pas d’utilité diagnostique Recommandée pour le dépistage 24 des cas simples. Utile dans certains cas en
complément à la sérologie (PCR sur biopsie de peau ou liquide articulaire)
Encéphalite Utilité limitée à la phase précédant les Pas d’utilité diagnostique Recommandée pour le dépistage 25 à tiques (MEVE) symptômes d’encéphalite
a un seuil de détection au-dessous duquel elle reste néga- tive, signifiant que le pathogène en question n’est pas dé- tectable dans le prélèvement testé, mais n’excluant pas formellement une infection où il n’est présent qu’en faible quantité, comme par exemple Borrelia dans le liquide cé- phalorachidien lors de neuroborréliose.
Comparer ce qui est comparable
Les résultats de PCR quantitatives d’un laboratoire ne sont pas toujours comparables avec ceux d’un autre labo- ratoire. S’il existe depuis quelques années des standards internationaux pour certains paramètres infectieux comme le VIH ou l’hépatite B, ils ne sont pas disponibles pour tous les pathogènes. Le praticien doit en être conscient lorsqu’il compare des résultats de deux laboratoires. Le type d’échan- tillon est également un facteur critique pour la comparaison de résultats. Par exemple, la charge virale CMV mesurée dans le sang total n’est pas équivalente à celle mesurée dans le plasma, typiquement plus faible.11
Connaître la durée d’une analyse
Si les méthodes moléculaires sont rapides par rapport à la culture des micro-organismes, il faut avoir à l’esprit que la durée d’une analyse (turn-around-time) dépend non seule- ment de la méthode (résultat dans la journée pour une PCR à cible unique ; plusieurs jours pour une analyse par sé- quençage), mais également de facteurs organisationnels au laboratoire. Les échantillons ne sont généralement pas trai- tés un par un, mais groupés pour permettre une utilisation rationnelle des automates d’extraction et d’amplification. En cas d’urgence, il vaut la peine de contacter le laboratoire.
conclusion
Les méthodes moléculaires jouent désormais un rôle im-
portant dans le diagnostic des infections, également pour la pratique ambulatoire. Dans certains cas, par exemple le diagnostic des infections respiratoires virales, elles ont supplanté les méthodes sérologiques, en permettant une détection directe des pathogènes impliqués. Dans d’autres cas, elles peuvent être utilisées en complément des mé- thodes traditionnelles, comme les cultures ou la sérologie.
Enfin, elles sont inutiles pour certaines infections. Il con- vient donc d’utiliser ces méthodes de façon différenciée, en connaissant leurs forces et leurs limitations. A l’avenir, de plus en plus de tests moléculaires seront disponibles pour le praticien, permettant notamment de rechercher des grou- pes de pathogènes en utilisant des panels par syndrome (infection respiratoire, gastro-entérite, méningite…). Il est probable que leur coût baisse dans les prochaines années, rendant leur utilisation plus rationnelle dans le contexte ambulatoire.
L’auteur n’a déclaré aucun conflit d’intérêts en relation avec cet article.
Implications pratiques
Les méthodes moléculaires peuvent être utiles dans le con- texte ambulatoire et sont même devenues les méthodes de référence pour certaines infections
La qualité des résultats des méthodes moléculaires dépend beaucoup de la qualité du prélèvement
Comme toutes les méthodes d’analyse, les méthodes mo- léculaires ont leurs faiblesses qu’il faut connaître pour in- terpréter au mieux leurs résultats
Le contact direct avec le laboratoire est indispensable en cas de doute sur la méthode à utiliser, sur le type de maté- riel à prélever ou sur l’interprétation d’un résultat
>
>
>
>
1 Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975;98:503-17.
2 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic ampli- fication of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985;230:1350-4.
3 Mullis K, Faloona F, Scharf S, et al. Specific enzyma- tic amplification of DNA in vitro : The polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986;51:
263-73.
4 Cherpillod P, Thomas Y, Schibler M, et al. Nouveaux virus : mythe, fantasme ou réalité ? Rev Med Suisse 2014;
10:1004-7.
5 ** Péter O. A quoi sert la sérologie en pratique ambulatoire ? Med Hyg 1999;57:747-53.
6 ** Lienhard R. Pièges en sérologie infectieuse. Rev Med Suisse 2011;7:1964-7.
7 * Karrer U. Virus d’Epstein-Barr et mononucléose infectieuse. Forum Med Suisse 2014;14:226-32.
8 * Meylan P. Infections à virus de l’herpès simplex : mise à jour pour le praticien. Rev Med Suisse 2011;7:
886-93.
9 Dormond L, Jaton-Ogay K, de Valliere S, et al. Mul- tiplex real-time PCR for the diagnosis of malaria : Cor- relation with microscopy. Clin Microbiol Infect 2011;
17:469-75.
10 Egli A, Binggeli S, Bodaghi S, et al. Cytomegalovirus and polyomavirus BK posttransplant. Nephrol Dial Transplant 2007;22(Suppl. 8):viii72-82.
11 Razonable RR, Hayden RT. Clinical utility of viral load in management of cytomegalovirus infection after solid organ transplantation. Clin Microbiol Rev 2013;
26:703-27.
12 Guiso N, Berbers G, Fry NK, et al. What to do and what not to do in serological diagnosis of pertussis : Recommendations from EU reference laboratories. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011;30:307-12.
13 Beersma MF, Dirven K, van Dam AP, et al. Evalua- tion of 12 commercial tests and the complement fixa- tion test for Mycoplasma pneumoniae-specific immuno- globulin G (IgG) and IgM antibodies, with PCR used as the «gold standard». J Clin Microbiol 2005;43:2277-85.
14 Basarab M, Macrae MB, Curtis CM. Atypical pneu- monia. Curr Opin Pulm Med 2014;20:247-51.
15 Tuuminen T, Lounamo K, Leirisalo-Repo M. A re- view of serological tests to assist diagnosis of reactive arthritis : Critical appraisal on methodologies. Front Immunol 2013;4:418.
16 Office fédéral de la santé publique. Directive de lutte contre la rougeole et les flambées de rougeole. Berne : Office fédéral de la santé publique, 2013.
17 Hiroz P, Gouttenoire J, Dao Thi VL, et al. Mise à jour sur l’hépatite E. Rev Med Suisse 2013;9:1594-8.
18 Baud D, Regan L, Greub G. Comparison of five commercial serological tests for the detection of anti- Chlamydia trachomatis antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2010;29:669-75.
19 Kroupis C, Vourlidis N. Human papilloma virus (HPV) molecular diagnostics. Clin Chem Lab Med 2011;
49:1783-99.
20 Dumoulin A, Marti H, Panning M, et al. Pan-dengue virus detection by PCR for travelers returning from the tropics. J Clin Microbiol 2008;46:3104-6.
21 Doerig C, Antonino A, Pache I, et al. Prise en charge de l’hépatite B chronique : un défi en évolution constante. Rev Med Suisse 2010;6:168-73.
22 Scott JD, Gretch DR. Molecular diagnostics of he- patitis C virus infection : A systematic review. JAMA 2007;297:724-32.
23 Gayet-Ageron A, Lautenschlager S, Ninet B, et al.
Sensitivity, specificity and likelihood ratios of PCR in the diagnosis of syphilis : A systematic review and meta- analysis. Sex Transm Infect 2013;89:251-6.
24 * Brouqui P, Bacellar F, Baranton G, et al. Guide- lines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 2004;10:1108-32.
25 Lindquist L, Vapalahti O. Tick-borne encephalitis.
Lancet 2008;371:1861-71.
* à lire ; ** à lire absolument
Bibliographie
