Intégration d’une méthode d’actuation électrocinétique sur biocapteur plasmonique

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Intégration d’une méthode d’actuation électrocinétique

sur biocapteur plasmonique

Quentin Avenas

To cite this version:

Quentin Avenas. Intégration d’une méthode d’actuation électrocinétique sur biocapteur plasmonique. Micro et nanotechnologies/Microélectronique. Université de Lyon; Université de Sherbrooke (Québec, Canada), 2018. Français. �NNT : 2018LYSEI122�. �tel-02115316�

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Résumé

Cette thèse porte sur le développement d’un capteur plasmonique intégrant une fonction d’actuation des objets visés. L’objectif est de passer outre la limite de diffusion rencontrée à basse concentration en piégeant les particules sur la surface de détection. La stratégie adoptée est de structurer le film d’or servant à la détection de manière à pouvoir l’utiliser pour mettre en mouvement le fluide et les molécules par le biais de champs électriques. Le transfert de masse est réalisé par diélectrophorèse et électroosmose, deux effets électrocinétiques mis en œuvre par des électrodes servant à la fois d’actuateur et de capteur plasmonique.

Un état de l’art exhaustif et des simulations multiphysiques ont permis de concevoir un prototype de capteur intégré constitué d’électrodes interdigitées en or permettant la détection plasmonique. Le dispositif proposé a été obtenu par microfabrication en salle blanche puis caractérisé avant l’étude de ses performances.

Une première phase de tests sur un système modèle, des billes de polystyrène dans de l’eau, a permis d’apporter la preuve de concept du fonctionnement du capteur, qui est effectivement capable de piéger rapidement les objets visés à sa surface afin de les détecter. Les mécanismes de transfert de masse ont été expliqués et la preuve de l’amélioration de la limite de détection par un facteur supérieur à 100 a été apportée.

Dans un second temps, les performances du capteur appliqué à des objets biologiques ont été évaluées. Celui-ci piège efficacement des levures et des protéines, mais aucune amélioration n’a été observée dans le cas de la détection spécifique de l’hybridation entre deux brins d’acide désoxyribonucléique (ADN). Les causes de ce résultat ont été discutées et comprises et deux solutions différentes ont été explorées : l’adaptation de la fréquence d’opération et l’optimisation de la géométrie des électrodes. Ainsi, cette étude a permis de souligner la problématique de la mise en œuvre d’effets électrocinétiques dans des milieux biologiques et de réfléchir aux pistes pertinentes pour sa résolution.

Mots-clés : Biocapteur ; Résonance de plasmon de surface (SPR) ;

Diélectrophorèse (DEP), Electroosmose (ACEO) ; Limite de détection ; Transfert de masse ; Electrodes interdigitées ; Acide désoxyribonucléique (ADN)

Abstract

Title: Integrating an electrokinetic actuation method on a plasmonic biosensor

This thesis focuses on the development of an integrated plasmonic sensor capable to perform mass transport on targeted objects. The goal is to overcome the diffusion limit by trapping particules directly on the sensing surface. The adopted strategy was to structure the gold layer used for plasmonic detection in order to use the so-fabricated structures to set the fluid and the molecules in motion by applying electric fields in the fluid. The mass transfer is realized through dielectrophoresis and electroosmosis, those two electrokinetic effects being operated by electrodes acting as sensor and actuator at the same time.

An exhaustive state of the art as well as multiphysical simulations allowed us for designing a prototype for an integrated sensor consisting in gold interdigitated electrodes enabling plasmoninc sensing. The proposed device was obtained through microfabrication in clean room facilities and was characterized before the study of its performances.

A first sequence of tests on a model system – polystyrene microbeads in water – brought the proof of concept we needed to validate the correct operation of the sensor, which is indeed capable of quickly trapping targeted objects on its surface and detecting them. The mass transfer mechanisms were explained and we showed the enhancement of the limit of detection by a factor greater than 100.

In a second phase, performances of the sensor applied to biological objects were evaluated. It can effectively trap yeasts and proteins but no enhancement has been observed while detecting DNA hybridization events. Causes for this result were discussed and understood and two different solutions were explored: the adaptation of the operating frequency and the optimization of the electrodes geometry. Thus, this study highlighted the problematic of operating electrokinetic effects in biological media and suggested relevant leads towards its resolution.

Keywords: Biosensor ; Surface plasmon resonance (SPR) ; Dielectrophoresis (DEP)

; Electroosmosis (ACEO) ; Limit of detection : Mass transfer : Interdigitated electrodes : Deoxyribonucleic acid (DNA)

“If we knew what it was we were doing, it would not be called research, would it?” Paroles attribuées à Albert Einstein

REMERCIEMENTS

Rendons-nous à l’évidence, ce travail n’est pas que le mien. Beaucoup de personnes, consciemment ou non, ont porté ce projet avec moi. Préparons-nous donc à un déluge de remerciements.

En premier lieu, je remercie bien évidemment ceux qui sont à l’origine de ce projet. Kader, Paul, Michael : non contents de m’avoir donné l’opportunité de me lancer dans cette aventure, vous m’avez accompagné de son début à sa fin. Chacun de vous a su m’apporter une expertise complémentaire des autres et a œuvré à la réussite de cette thèse.

Une immense partie de ma gratitude va à Julien, sans qui les résultats n’auraient pas été les mêmes. Ta passion pour les sciences (si si, ça se voit) et ton enjouement pour le projet m’auront été d’une aide précieuse, au-delà même de la mise à disposition de certains des équipements du LCF. J’en profite pour remercier Karen : grâce à vous deux, je me suis senti un peu moins itinérant et un peu plus chez moi sur le plateau de Saclay !

Milles mercis à Marie : non seulement tu as accepté de participer à l’encadrement de ce projet en cours de route (chose déjà peu commune), mais en plus tu l’as fait avec brio. Ce fut un réel plaisir de travailler avec toi. Tant que j’y suis, toutes mes excuses pour ma propension à rusher les livrables dans les derniers jours avant les deadlines. Promis, je ferai des efforts à l’avenir. Je te souhaite beaucoup de réussite avec tes prochain(e)s doctorant(e)s (coucou Marion et Marina : ne faites pas comme moi et prenez soin d’elle) et dans ta carrière en général.

Merci à mes collègues de l’INL : Simon et Nicolas, malheureusement partis trop tôt, ainsi que Rémi et Charles qui m’ont accompagné jusqu’à la fin. Le 6ème _{étage du}

bâtiment Blaise Pascal était éclairé de votre présence (on vous avait pourtant bien cachés tout au fond du couloir).

J’adresse un immense merci à toutes les personnes rencontrées au LN2 : Marina pour avoir été une amie formidable et m’avoir fait rencontrer tant de gens, Pierre, François, Cyril et Salim pour votre participation proactive et votre esprit d’initiative quant aux 5a8 et autres réunions scientifiques, Yann pour avoir été un super pote ainsi qu’un conseiller scientifique officieux, Frédéric pour nos sessions d’escalade, Kevin pour m’avoir fait découvrir le plaisir du karaoké, Marine pour avoir été une super prof de chimie, Olivier pour m’avoir fait la surprise de revenir à Sherbrooke après deux ans.

Il me faut aussi remercier l’ensemble du laboratoire Ampère pour m’avoir aussi chaleureusement adopté. Merci à Marie et Julie qui m’ont pris sous leur aile de la

meilleure des façons. Je souhaite plein de bonheur à Cécile, j’en connais une à qui tu as rendu un fier service. Johan, Arbi, Marion, Julien, Seb, Meriem et Anjali : merci à vous d’avoir supporté mes blagues très subtiles toutes ces années (le dab résonant restera à jamais dans les annales).

Je remercie évidemment mes amis lyonnais : Megan, Manon et Léonard, avec qui j’ai redécouvert la BU.

Je ne saurais remercier assez celle qui rend ma vie meilleure chaque jour. Julie, non seulement tu as été ma plus grande source de motivation, mais tu as été d’un soutien indéfectible. En plus d’être docteur, je suis chanceux. Merci.

Gauthier, tu as su me donner de la combattivité et de l’esprit d’initiative. Arthur, tu m’as accueilli à chaque fois qu’il le fallait avec le sourire. Je suis fier de vous avoir comme frères, merci d’être là depuis le tout début.

Enfin, je remercie mes parents. Papa, maman, vous êtes tous les deux des exemples de courage, de persévérance, et vous me donnez tant depuis toujours. Vous m’avez aidé et appris à surmonter les difficultés. Chaque moment avec vous est un bonheur. Merci pour tout.

TABLE DES MATIERES

Résumé ... i

Abstract ... ii

Table des illustrations ... v

Chapitre 0 : Introduction générale ... 1

0.1 De l’importance du développement des biocapteurs ... 1

0.2 L’intérêt du transfert de masse pour les biocapteurs ... 2

0.3 Problématique, objectifs et organisation du manuscrit ... 4

0.4 Les acteurs du projet ... 6

Chapitre 1 : Etat de l’art ... 9

1.1 Principe, applications et limites des biocapteurs plasmoniques... 9

1.1.1 Introduction aux biocapteurs ... 9

1.1.2 Biocapteur à résonance de plasmon de surface ... 11

1.1.3 L’imagerie SPR et ses applications de biodétection ... 13

1.1.4 Pourquoi ajouter une fonction d’actuation ? ... 17

1.2 Comment manipuler les cibles en milieu liquide ? ... 19

1.2.1 Technologies d’actuation sur dispositif microfluidique ... 19

1.2.2 Manipulation directe des cibles par électrophorèse et diélectrophorèse ... 20

1.2.3 Manipulation indirecte par flux électrohydrodynamique ... 25

1.2.4 Application des effets électrocinétiques aux objets biologiques ... 28

1.3 Effet de la polarisation sur la résonance de plasmon de surface ... 34

1.3.1 L’interface solide/liquide et la double-couche ionique ... 34

1.3.3 Les réactions électrochimiques ... 38

1.4 Conclusion ... 39

Chapitre 2 : Conception, modélisation et fabrication du capteur ... 41

2.1 Introduction ... 41

2.2 Conception du dispositif : ... 42

2.2.1 Présentation du banc expérimental ... 42

2.2.2 Choix d’électrodes coplanaires interdigitées ... 45

2.2.3 Principe du capteur-actuateur ... 48

2.2.4 Calculs et simulations : méthodologie ... 49

2.3 Fabrication du dispositif ... 56

2.3.1 Microfabrication ... 56

2.3.2 Caractérisation du dispositif ... 61

2.3.3 Fonctionnalisation de surface ... 65

2.4 Conclusion ... 68

Chapitre 3 : Fonctionnement et performances du capteur sur un système modèle ... 70

3.1 Introduction ... 70

3.2 Utilisation du capteur ... 71

3.2.1 Installation sur le banc expérimental ... 71

3.2.2 Acquisition et traitement des données ... 72

3.2.3 Influence de la polarisation des électrodes sur la résonance plasmonique : précautions d’usage ... 74

3.3 Preuve de concept ... 77

3.3.2 Preuve de concept : concentration des billes sur les électrodes ... 79

3.3.3 Dynamique de l’accumulation des particules ... 80

3.4 Etude des effets électrocinétiques à proximité de la surface ... 83

3.4.1 Influence de la taille des objets ... 83

3.4.2 Déplacement de l’équilibre DEP/ACEO ... 85

3.5 Evaluation des performances ... 91

3.5.1 Etude préliminaire de la limite de détection : efficacité du dispositif dans un fluide au repos ... 92

3.5.2 Optimisation de la quantité d’objets capturés : utilisation du capteur sous flux ... 95

3.5.3 Comparaison des limites de détection sous flux ... 99

3.6 Conclusion ... 101

Chapitre 4 : Application aux objets biologiques ... 102

4.1 Un objet modèle : les levures ... 102

4.1.1 Analyse des images SPR de levures soumises à un champ électrique alternatif ... 103

4.1.2 Interprétation de l’accumulation des levures sur les bords ... 106

4.2 Application à des protéines : BSA ... 109

4.2.1 Protocole expérimental et résultats ... 109

4.2.2 Discussion sur le comportement du dispositif sur des objets biologiques de petite taille ... 112

4.3 Utilisation en tant que biocapteur spécifique : le cas de l’hybridation ADN/ADN ... 114

4.3.2 Évaluation des performances pour l’hybridation ADN/ADN ... 115

4.3.3 Discussion sur les contraintes sur le milieu d’hybridation : l’influence de la conductivité ... 120

4.4 Comment adapter le capteur aux milieux conducteurs ?... 123

4.4.1 Choisir un mode opératoire différent : comment adapter la fréquence pour induire un brassage électroosmotique dans des milieux conducteurs ? ... 123

4.4.2 Optimisation de la géométrie de l’échantillon : influence de la largeur de gap ... 127 4.5 Conclusion ... 133 Chapitre 5 : Conclusion ... 135 5.1 Conclusions générales ... 135 5.2 Perspectives ... 138 Bibliographie ... 141 Annexe A ... I

Table des illustrations

Figure 0.1 : Schéma de principe d’un biocapteur. ... 2 Figure 0.2 [5] : Comparaison de la limite de résolution théorique (en RIU : Refractive Index Units) et

des résultats reportés par différents groupes : a) Stemmler et al. [6], b) Thirstrup et al. [7], c) Piliarik et al. [8], d) Nenninger et al. [9], e) Chinowsky et al. [10], f) Biacore 3000 (GE

Healthcare, USA), g) Wu et al. [11], h) Bardin et al. [12], i) Piliarik et al. [13] ... 5 Figure 1.1 : À gauche : représentation schématique d’un montage de détection SPR. À droite :

illustration du principe de détection d’une interaction. Lorsqu’un analyte interagit avec un ligand en se fixant sur la surface, cela provoque une variation de l’indice optique ο࢔ dans le diélectrique qui conduit à un décalage de l’angle de résonance. ... 12 Figure 1.2 : Utilisation d’un capteur SPR en tant que biocapteur. ... 12 Figure 1.3 : Illustration du procédé expérimental de greffe de nanoparticules d’or sur les brins

d’ADN. ... 17 Figure 1.4 : Schéma de principe des forces électrophorétiques s’appliquant sur une particule chargée.

... 20 Figure 1.5 : À gauche : polarisation d’une particule sphérique. Les charges s’accumulent à l’interface

entre le matériau diélectrique et le milieu liquide. À droite : champ électrique non uniforme et DEP. La particule subit une force dépendant de la distribution spatiale du champ. Dans cet exemple, le matériau est plus facilement polarisable que le liquide et la résultante est dirigée vers le maximum de champ (ici vers la droite). ... 22 Figure 1.6 : Principe de l’induction d’un flux par électro-osmose. (a) Des cations s’accumulent contre

la surface de l’électrode polarisée négativement. De même avec les anions sur la surface polarisée positivement. La composante horizontale du champ électrique induit un mouvement

longitudinal des charges présentes en solution. (b) Ces charges entraînent l’ensemble du fluide par contrainte visqueuse et produisent donc un flux hydrodynamique dans le liquide. ... 25 Figure 1.7 : Utilisation de l’électro-osmose en AC. Lorsque l’orientation du champ change, le signe de

la couche ionique change aussi, ce qui donne un flux qui a toujours la même orientation... 26 Figure 1.8 : À gauche : illustration de la mise en mouvement des particules par électroosmose et du

piégeage par diélectrophorèse. À droite : géométrie des électrodes interdigitées utilisées. ... 27 Figure 1.9 : À gauche : géométrie des électrodes utilisées par Wong et al. À droite : le mouvement

de la double-couche (bleu foncé) entraîne le reste du fluide (bleu clair) vers le centre de l’électrode. Les molécules d’ADN sont alors entraînées vers le centre de l’électrode par le flux, où elles sont piégées par la force DEP (rouge). ... 29 Figure 1.10 : Courbe de vitesse pour différentes positions sur l’électrode (position suivant l’axe x,

dirigé vers le centre d’une électrode et d’origine l’arête), dans un électrolyte de conductivité ૛Ǥ ૚ ή ૚૙ െ ૜ࡿǤ ࢓ െ ૚ ... 30 Figure 1.11 : schéma de principe de la double-couche électrique d’après le modèle de Stern. Les plans

intérieur et extérieur de Helmholtz et le plan de glissement sont notés IH, OH et S

respectivement. La charge du plan de glissement est caractérisée par le potentielNɺ. ... 35 Figure 1.12 : Evolution de l’énergie d’excitation d’un plasmon en fonction du potentiel appliqué à la

Les flèches indiquent PZC pour chaque système. L’électrolyte est une solution de ࡺࢇ࡯࢒ࡻ૝ à 0.5 M. ... 36 Figure 1.13 : Influence de la polarisation de l’électrode en or sur ses propriétés optiques. La différence

de potentiel est indiquée par rapport à une électrode de référence Ag/AgCl. ... 37 Figure 1.14 : Variations angulaires de la SPR dans de l’eau pure : (a) en fonction du temps, V = ±

1.5V (b) en fonction du voltage, V = ± 1.5V, avec oxydation. (c) en fonction du voltage, V = ± 0.8 V, pas d’oxydation. La flèche indique la direction temporelle du processus. ... 38 Figure 1.15 : Variations angulaires de la SPR pour de l’eau pure en fonction du temps, pour

différentes fréquences, à V = ± 1.5 V. ... 39 Figure 2.1 : Représentation schématique d’un capteur SPR (film d’or plan) placé sur le banc

expérimental. ... 42 Figure 2.2 : Photographie du banc d’imagerie SPR expérimental et mise en évidence des principaux

éléments le constituant. ... 43 Figure 2.3 : a) Vue d’ensemble du bloc cuve et détail des différentes pièces le constituant. b) Support

situé en face du prisme (dimensions en mm). c) Feuille de Mylar (90 µm d’épaisseur) plaquée contre la cuve. d) Exemple d’échantillon d’or plan sur lame de verre plaqué contre le Mylar mécaniquement par l’ensemble {prisme ; support} et constituant la cuve fluidique. ... 44 Figure 2.4 : Classification de dispositifs DEP selon la configuration géométrique des électrodes,

d’après Khoshmanesh et al. : (A) Parallèle ou interdigitée (B) Crénelée (C) Oblique (D)

Incurvée (E) Quadripolaire (F) Micropuits (G) Matricielle (H) Extrudée ... 45 Figure 2.5 : a) Design de l’échantillon microstructuré conçu pour cette thèse. Les zones noires

représentent les zones couvertes de métal (Ti/Au), le reste correspond au verre nu. Les 3 zones de couleurs différentes représentent respectivement la zone servant à faire le contact électrique avec le circuit en amont (en jaune), la zone servant au transfert de masse (orange) et une zone structurelle servant de lien entre les deux (en gris). b) Agrandissement de la zone

microstructurée servant au transfert de masse et à la détection : mise en évidence des

branchements électriques et de l’électrode de contrôle ainsi que du sens du flux. ... 47 Figure 2.6 : Modèle géométrique utilisé pour les simulations COMSOL. ... 50 Figure 2.7 : Maillage du modèle généré par COMSOL ... 50 Figure 2.8 : a) Distribution du potentiel et lignes de champ électrique dans le volume modélisé. b)

Gradient de champ électrique calculé sur la base du champ obtenu précédemment... 52 Figure 2.9 : Champ de vitesse induit par électroosmose. Les flèches rouges indiquent la direction du

fluide. ... 54 Figure 2.10 : Schématisation de l’enchaînement des étapes du procédé de microfabrication. A gauche

(flèche bleue) : procédé utilisé pour la quasi-totalité des échantillons. A droite (flèche violette) : procédé utilisé pour la puce multigaps décrite au Chapitre 4. ... 60 Figure 2.11 : Photographie d’un échantillon à la fin du procédé de microfabrication. ... 61 Figure 2.12 : Images prises en microscope optique d’un échantillon à la fin du procédé de

microfabrication par gravure chimique (l’échantillon montré ici a été utilisé pour attirer différents objets d’où les défauts apparents qui sont en fait des dépôts de billes). a) Vue en agrandissement 5X de la zone couverte par les microélectrodes. b) Agrandissement 50X sur le bord d’une électrode. c) Vue en agrandissement 5X sur le coin d’un peigne d’électrodes. d)

Figure 2.13 : Exemple typique de la résonance de plasmon de surface obtenue avec les échantillons fabriqués. ... 63 Figure 2.14 : a) Schématisation de la surface fonctionnalisée. Les brins d’ADN représentés sont

simples. b) Séquences ADN (simple brin) utilisées et lieu d’hybridation. ... 65 Figure 2.15 : Mécanisme réactionnel de la formation d’une SAM de thiols sur or ... 66 Figure 2.16 : Mécanisme réactionnel de la formation d’une liaison covalente entre le thiol et le PDC

... 67 Figure 2.17 : Mécanisme réactionnel de la réticulation de la neutravidine sur un groupement

thiocyanate ... 68 Figure 3.1 : Représentation schématique du dispositif installé sur le banc expérimental. ... 71 Figure 3.2 : Photographies du banc expérimental. a) Echantillon installé et serré mécaniquement

entre le prisme et le support recouvert de la feuille de Mylar. Agrandissement et mise en

évidence de la cuve fluidique. b) Vue d’ensemble du circuit fluidique. ... 72 Figure 3.3 : Evolution du signal SPR lors de la polarisation des électrodes en basses fréquences (0,04

Hz, 0,5 Vpp). ... 74 Figure 3.4 : Fréquence d’opération minimale, en-dessous de laquelle le signal SPR est perturbé par

des modifications de l’état de surface et devient difficilement interprétable, en fonction de l’amplitude de la tension appliquée dans l’eau ultrapure et le PBS 2X. ... 76 Figure 3.5 : Comparaison des résultats observés lors du piégeage de billes de 1 µm sur les électrodes

sous tension (20 Vpp, 5 kHz) a) en microscopie optique et b) en imagerie SPR. ... 79 Figure 3.6 : Observation en SPRI de la dynamique d’accumulation des billes PS 200 nm dans de

l’eau ultrapure sur les électrodes lors de l’imposition d’une tension (1 kHz, 20 Vpp) sur celles-ci. ... 82 Figure 3.7 : Variations de réflectivité sur la largeur d’une électrode (un bord est à 0 µm, l’autre est à

200 µm) après 30 s d’application d’une tension sinusoïdale (1 kHz, 20 Vpp) sur deux solutions de billes PS de tailles différentes (200 nm, 1 µm). ... 84 Figure 3.8 : Comparaison de la force de traînée s’exerçant sur les billes de a) 200 nm et c) 1 µm.

Comparaison de la force diélectrophorétique (échelle log) s’exerçant les billes de b) 200 nm et d) 1 µm. Résultats obtenus par simulations COMSOL, centrés sur une demi-électrode pour voir clairement les variations des forces au voisinage de l’arête. ... 85 Figure 3.9 : Représentation 3D de la position des billes (200 nm) sur la largeur de l’électrode 30 s

après le début de l’application de la tension : les variations d’indice de réfraction sur toute la largeur de l’électrode sont affichées en fonction de l’amplitude appliquée pour 3 fréquences (500 Hz, 1 kHz, 2 kHz). ... 88 Figure 3.10 : Partie réelle du facteur de Clausius-Mossotti des billes de 200 nm dans de l’eau pure, en

fonction de la fréquence (curseur à 1 kHz). ... 89 Figure 3.11 : Vitesse électroosmotique calculée à une distance de 50 µm du bord de l’électrode. ... 90 Figure 3.13 : Profils de distribution des billes (200 nm) sur la largeur d’une électrode après 30 s

d’application de la tension, pour les fréquences 500 Hz, 1 kHz et 2 kHz. ... 91 Figure 3.14 : Exemple de cinétique du signal SPR mesuré pendant l’injection d’une solution de billes

échantillon, pendant la même expérience, au même moment. (1) Injection des billes (2)

Application d’une tension sinusoïdale (2 kHz, 20 Vpp) (3) Coupure de la tension ... 92 Figure 3.15 : Variations de signal mesurées pour les différentes solutions diluées. Le seuil de détection

d’un capteur SPR classique est ajouté en pointillés. ... 94 Figure 3.16 : Séquence d’images illustrant la dynamique de l’accumulation des billes sur une électrode lors de l’application d’une tension (2 kHz, 20 Vpp) sur une solution de billes 200 nm diluée 1000 fois et injectée à un débit de 30 µl/min. ... 96 Figure 3.17 : Bilan des trois forces (diélectrophorèse, force de traînée induite par électroosmose, force

de traînée induite par le flux entrant) s’exerçant sur une bille située de part et d’autres du centre d’une électrode, sous forme de schéma. ... 97 Figure 3.18 : Variations de réflectivité mesurées sur une ROI centrale sur une électrode lors de

tentatives de capture de billes sans flux et sous flux. ... 99 Figure 3.19 : Variations de signal mesurées pour les différentes solutions diluées. Le seuil de détection

d’un capteur SPR classique est ajouté en pointillés. ... 100 Figure 4.1 : Images SPR acquises en présence d’une solution aqueuse contenant des levures sur les

électrodes. a) Image de la puce après injection des levures et application de la tension,

accompagnée d’agrandissements de l’électrode encadrée en bleu : b) Avant injection (t = -1 s) c) Après injection mais avant application de la tension (t = 2 min 9 s) d) Après application de la tension (t = 3 min). ... 103 Figure 4.2 : a) Observation en microscopie optique lors de l’application des effets électrocinétiques

sur une solution d’eau pure contenant des levures. c) Même image mais avec l’éclairage du microscope augmenté pour distinguer les objets présents sur les électrodes. b) et d)

Agrandissements respectifs des zones encadrées sur les images a) et c). ... 105 Figure 4.3 : Évolution de la partie réelle du facteur Clausius-Mossotti en fonction de la fréquence.

Curseur à 5 kHz, la fréquence utilisée pour attirer les levures sur les électrodes. ... 106 Figure 4.4 : Résultats des simulations COMSOL montrant les forces engendrées par l’application

d’une tension sinusoïdale (20 Vpp, 5 kHz) sur une solution de levures dans de l’eau pure. L’électrode est représentée par le rectangle couleur or, les centres des gaps (axes de symétrie en pointillés rouges) se situent à -175 µm et 175 µm sur l’axe horizontal. a) Champ de force de DEP, échelle logarithmique. b) Champ de force de traînée induite par le flux électroosmotique, échelle logarithmique. c) Somme des champs de force engendrés par DEP et ACEO, échelle logarithmique. d) Même résultat que c), mais les régions où la force de DEP est supérieure à la force de traînée ont été mises en évidence (magenta). ... 107 Figure 4.5 : Comparaison des signaux mesurés sur l’électrode de contrôle et les électrodes actives lors

de l’injection de BSA concentrée à 20 µg/ml dans de l’eau, sous application d’une tension (1 kHz, 10 Vpp). ... 111 Figure 4.6 : Images SPR de la puce obtenues a) avant injection de la BSA b) 15 minutes après le

début de l’injection. ... 112 Figure 4.7 : Différence de signal observée sur les électrodes 15 minutes après l’injection de BSA

concentrée à 20 µg/mL, sous l’action des effets électrocinétiques (10 Vpp, 1 kHz). ... 112 Figure 4.8 : Images obtenues par SPR d’un capteur fonctionnalisé et spotté a) avant injection de

Figure 4.9 : Signal SPR mesuré sur les plots complémentaires lors de l’injection d’ADN à t = 0 min. ... 117 Figure 4.10 : Exemple de cinétique d’hybridation ADN/ADN dans du PBS 0.1X. ... 118 Figure 4.11 : Influence de l’application de tensions sur l’hybridation entre les cibles et les sondes

ADN dans du PBS 0.1X : signal mesuré sur l’électrode de contrôle et les électrodes actives pendant l’application de différentes tensions électriques sur celles-ci. ... 119 Figure 4.12 : Vitesse électroosmotique à une distance d = 50 µm du bord de l’électrode, en fonction

de la conductivité (échelle log) du milieu considéré et de la fréquence (échelle log) appliquée, pour une tension de 1 V. ... 125 Figure 4.13 : Fréquence optimale (assurant une vitesse électroosmotique maximale) en fonction de la

conductivité du milieu. ... 127 Figure 4.14 : Design de la puce multigaps, avec zoom sur la zone active du capteur où se trouvent les

peignes d’électrodes servant au transfert de masse et à la détection. ... 128 Figure 4.15 : Variations de signal mesurées en fonction du gap des électrodes concernée lors de

l’application d’une tension sinusoïdale (1 kHz, 10 Vpp) sur une solution de billes PS 200 nm dans de l’eau pure. ... 130 Figure 4.16 : Vitesse électroosmotique dans de l’eau pure à une distance de 30 µm du bord de

l’électrode, avec une tension appliquée de 10 Vpp pour 3 fréquences différentes, en fonction de la largeur du gap interélectrodes. ... 132

CHAPITRE 0 :

_INTRODUCTION

GENERALE

Ce chapitre préliminaire vise à situer le projet de recherche dans le contexte global des biocapteurs, de manière à introduire la problématique de cette thèse. Il détaillera par ailleurs l’organisation du manuscrit ainsi que le cadre dans lequel les travaux présentés ont été réalisés.

0.1

De l’importance du développement des

biocapteurs

Pour le diagnostic de maladies, une des approches les plus employées est la détection de biomarqueurs spécifiques [1]. Le vieillissement de la population dans les sociétés occidentales et l’explosion des flux humains imposant aujourd’hui d’améliorer notre système de prévention des maladies, des efforts de recherche considérables sont déployés afin de proposer des alternatives aux méthodes classiques de détection, qui sont souvent longues et coûteuses. Le test ELISA (de l’anglais enzyme-linked immunosorbent assay) pour le VIH (Virus de l’immunodéficience humaine), par exemple, comprend au moins trois étapes de chimie à effectuer sur l’échantillon de sang avant de pouvoir passer à l’étape finale de détection par fluorescence.

En outre, d’après de récentes études, le marché global des biocapteurs est supposé passer de 15.96 G$ en 2016 à 27.06 G$ en 2022 [2,3]. Les mêmes sources prévoient une croissance du marché des techniques de détection label-free (i.e. sans marquage préalable des molécules cibles) de 1.22 G$ en 2015 à 2.13 G$ en 2020.

Considérons l’exemple du génie génétique : la multiplication des applications de ce domaine fait de la détection des molécules d’acide désoxyribonucléique (ADN) un segment important de ces marchés. Or aujourd’hui, la détection d’ADN doit être précédée d’un procédé long et coûteux de multiplication du matériel génétique (polymerase chain reaction ou PCR) car les capteurs actuels ne sont pas assez sensibles pour détecter une séquence d’ADN à sa concentration initiale dans un échantillon de sang.

Des progrès considérables ont été réalisés ces dernières années sur la sensibilité des biocapteurs utilisés, mais ils sont toujours limités par les problématiques de diffusion des molécules cibles dans l’échantillon. Ce projet de recherche propose d’étudier et d’intégrer une méthode de transfert de masse sur un biocapteur pour surmonter cette difficulté.

0.2

L’intérêt du transfert de masse pour les

biocapteurs

Un biocapteur est une structure tripartite, illustrée sur la Figure 0.1, composée de :

ŶĂůLJƚĞ ůĠŵĞŶƚĚĞƌĞĐŽŶŶĂŝƐƐĂŶĐĞ ŵŽůĠĐƵůĂŝƌĞ;ůŝŐĂŶĚͿ dƌĂŶƐĚƵĐƚĞƵƌ dƌĂŝƚĞŵĞŶƚĚƵƐŝŐŶĂů ŝ ŽĐ ĂƉ ƚĞ Ƶƌ 

- Un élément de reconnaissance moléculaire, ou sonde (parfois appelé ligand), dont le rôle est de réagir avec la molécule cible que l’on veut détecter (l’analyte).

- Un transducteur, sur lequel est fixé le ligand. Il convertit l’évènement d’interaction entre le ligand et l’analyte en un signal physique plus facilement mesurable et interprétable.

- Un système de traitement du signal en sortie du transducteur, permettant l’acquisition et l’enregistrement de la mesure.

Pour pouvoir être détectés, les analytes doivent interagir avec les ligands immobilisés sur le transducteur et, pour cela, doivent se déplacer dans le liquide pour atteindre la surface de détection : c’est le transport de masse. Par analogie avec les transferts thermiques, la diffusion et la convection de matière sont les deux phénomènes classiquement utilisés pour décrire le transfert de masse en mécanique des fluides. Les performances d’un biocapteur sont ainsi régies par (entre autres) :

- La vitesse de diffusion des cibles vers la surface de détection

- La vitesse d’interaction entre les analytes et les ligands

Dans certains cas, le facteur limitant est la vitesse de diffusion des cibles vers la surface de détection ; on parle alors de limite de diffusion [4]. Lorsque la surface de détection est de taille réduite, ce qui est le cas pour beaucoup de biocapteurs actuels, le temps de détection peut ainsi devenir extrêmement long à faibles concentrations.

A cet égard, il est donc particulièrement intéressant d’être capable d’améliorer le transfert des cibles vers les sondes. La caractéristique que l’on cherche à améliorer ici est la limite de détection du capteur : la concentration minimale d’analytes nécessaire pour que le capteur les détecte. Cette caractéristique n’est pas fixe, elle est par nature

associée au temps requis pour que les analytes soient captés. Ce temps est fonction de la distance à parcourir et du coefficient de diffusion des cibles dans l’électrolyte.

0.3

Problématique, objectifs et organisation du

manuscrit

Depuis le début des travaux sur les biocapteurs, le réflexe naturel des chercheurs et ingénieurs a été de s’employer à améliorer la limite de détection et la sensibilité intrinsèques des capteurs en travaillant sur l’élément de transduction. La Figure 0.2 est issue des travaux de Piliarik et Homola [5] et donne, à titre d’exemple, les sensibilités atteintes expérimentalement par différents groupes de recherche (voir références [6–13]) en regard de la limite de résolution théorique qu’ils calculent pour un type de capteurs : les capteurs à résonance de plasmon de surface (SPR).

La SPR est une technique particulièrement adaptée à la détection d’interactions biomoléculaires. C’est une méthode label-free très sensible, versatile et qui permet des analyses en temps réel [14]. En outre, le Laboratoire de biophotonique de l’UdeS a développé une très forte expertise autour de cette technologie. Pour cette raison, c’est la méthode de détection sur laquelle se basent les dispositifs développés pour ce projet de thèse.

Comme la Figure 0.2 le montre, on s’approche aujourd’hui des performances optimales en ce qui concerne le mécanisme de transduction des capteurs SPR. La limite de diffusion est donc devenue l’un des principaux facteurs limitant l’amélioration des capteurs dans les prochaines années. L’une des stratégies émergentes visant à faire tomber cette barrière, et qui devrait permettre un bond technologique dans les

prochaines années, est la manipulation des cibles pour les concentrer sur l’élément de détection.

La problématique centrale de ce projet est donc la suivante : comment intégrer une méthode de transfert de masse à un capteur SPR pour en améliorer la limite de détection ?

Cette problématique donne lieu à plusieurs sous-objectifs que viennent compléter les travaux présentés ici. Dès lors, nous nous attacherons à :

- Déterminer quelle méthode d’actuation est la plus adaptée à la technologie de détection utilisée (SPR). Le Chapitre 1 répond à cette question en présentant un état de l’art des solutions envisageables.

- Démontrer la faisabilité, en termes de fabrication mais aussi d’utilisation, de la solution retenue. Le Chapitre 2, qui détaille la conception et le processus de

Figure 0.2 [5] : Comparaison de la limite de résolution théorique (en RIU : Refractive Index Units) et des résultats reportés par différents groupes : a) Stemmler et al. [6], b) Thirstrup et al. [7], c) Piliarik et al. [8], d) Nenninger et al. [9], e) Chinowsky et al. [10], f) Biacore 3000 (GE Healthcare, USA), g) Wu et al. [11], h) Bardin et al. [12], i) Piliarik et al. [13]

fabrication du prototype proposé, ainsi que le début du Chapitre 3 qui présente ses modalités d’utilisation, remplissent tous deux cet objectif.

- Apporter une preuve de concept de la pertinence du prototype conçu par le biais de l’évaluation de ses performances sur un système modèle. C’est la finalité du Chapitre 3.

- Evaluer l’applicabilité du dispositif proposé à différentes espèces biologiques. C’est l’objet du Chapitre 4.

- Discuter les contraintes limites de l’utilisation des effets électrocinétiques sur un capteur SPR et explorer/proposer des pistes permettant de s’affranchir de ces contraintes. Le Chapitre 4 apportera des éléments de réponse à ces interrogations.

- Comprendre comment les effets de transfert de masse mis en œuvre interagissent dans le cadre des différents systèmes étudiés. Du fait de la multiplicité des paramètres à prendre en compte, cette question sera traitée tout au long du manuscrit.

0.4

Les acteurs du projet

La mise au point d’un biocapteur fait intervenir plusieurs domaines scientifiques : la chimie et la science des matériaux, pour utiliser des matériaux adaptés aux biomolécules que l’on veut détecter, la microfabrication et la microfluidique pour pouvoir réaliser des biopuces, et enfin le domaine physique adapté à la technique de détection : il peut s’agir d’optique, de mécanique, de thermique ou d’électronique suivant la méthode choisie.

Le Laboratoire Nanotechnologies & Nanosystèmes (LN2) est une Unité Mixte Internationale dont les tutelles sont le CNRS, l’Université de Sherbrooke, l’Université de Lyon et l’Université Joseph Fourier de Grenoble. Avec une équipe de recherche

axée notamment sur les BioMEMS (Biomedical MicroElectroMechanical Systems), le LN2 a la chance de rassembler les différentes compétences nécessaires au développement d’un biocapteur.

Les travaux des professeurs Paul Charette et Michael Canva, directeurs de recherche au sein du laboratoire de biophotonique de l’Université de Sherbrooke, se sont focalisés ces dernières années sur la SPR et ses applications aux biotechnologies. Leurs problématiques de recherche sont diverses et vont de la théorie [15] à l’application sur biopuce [16], en passant par l’étude de nouvelles structures plasmoniques [17]. Ainsi, le laboratoire a une très bonne vision d’ensemble du domaine des biocapteurs SPR. Abdelkader Souifi, professeur à l’INSA Lyon et chercheur au sein de l’Institut des Nanotechnologies de Lyon (INL), est aussi co-directeur de ce projet de thèse en cotutelle. Ses activités de recherche dans l’équipe Dispositifs Électroniques lui assurent une expertise certaine dans l’intégration de nouvelles fonctions électroniques sur puce. Marie Frenea-Robin et Julien Marchalot, Maîtres de conférences au laboratoire Ampère, ont apporté leur expérience et leur connaissance des effets électrocinétiques, notamment la diélectrophorèse et l’électroosmose qui constituent comme on le verra plus tard le cœur de ce projet.

Enfin, Julien Moreau, Maître de conférences à l’Institut d’Optique Graduate School dont les travaux portent sur la biophotonique, a accepté d’apporter son aide (qui s’est notamment matérialisée par une mise à disposition de certains équipements du Laboratoire Charles Fabry) et sa précieuse expertise sur les dispositifs plasmoniques et vient donc compléter l’équipe des personnes impliquées dans ce projet.

La collaboration franco-québécoise associant le LN2, l’INL, Ampère et le LCF a ainsi permis le rassemblement des expertises nécessaires à la bonne conduite de ce projet de recherche, qu’il s’agisse de la technique de détection (SPR), de la transformation en

biocapteur (fonctionnalisation de surface) ou de la méthode de concentration des biomolécules (électronique et microfluidique).

CHAPITRE 1 :

_{ETAT DE L’ART}

La problématique de ce projet de thèse fait intervenir plusieurs domaines physiques et les questions soulevées par ce travail combinent des notions liées à l’optique, la microfluidique, la biochimie et l’électromagnétisme. Les connaissances qu’il faut mobiliser pour appréhender le projet dans son ensemble sont donc variées et, à cet égard, la suite de ce chapitre consiste en un état de l’art des technologies existantes qui visera par ailleurs à :

- Démontrer l’intérêt de l’intégration d’une fonction d’actuation sur un biocapteur plasmonique.

- Décrire les méthodes connues de manipulation de biomolécules et justifier le choix de celles qui seront retenues.

- Donner les prérequis scientifiques nécessaires à la compréhension des phénomènes physiques mis en œuvre et étudiés.

1.1

Principe, applications et limites des biocapteurs

plasmoniques

1.1.1

Introduction aux biocapteurs

L’histoire des biocapteurs démarre dans les années 1960 avec les travaux de Leland C. Clark sur la détection du glucose dans le sang. Depuis, de tels dispositifs ont trouvé de multiples applications dans les domaines de la médecine, des biotechnologies, de l’agriculture, de l’agro-alimentaire, du militaire et de l’environnement. Si les utilisations sont désormais variées, la structure tripartite

ligand/transducteur/traitement continue à constituer le schéma classique dans la conception d’un biocapteur.

La diversité des applications et des analytes implique le développement de plusieurs types de biocapteurs [18], qui peuvent être :

- Mécanique : la présence d’analytes sur le transducteur fait varier la masse de celui-ci, ce qui modifie sa fréquence de résonance.

- Électrochimique : la présence d’analytes est détectée par ampérométrie, conductimétrie ou potentiométrie dans la solution.

- Électronique : par contraste avec les méthodes électrochimiques, ici c’est la variation de potentiel électrique à la surface d’un semi-conducteur qui est mesurée.

- Thermique : l’interaction entre l’analyte et le ligand dégage de la chaleur, ce qui change la température du milieu.

- Optique : les analytes peuvent être détectés par fluorescence, microscopie, méthodes interférentielles ou résonance de plasmon de surface.

Parmi les méthodes de détection optique, la SPR offre une excellente sensibilité et la possibilité de mesures en temps réel [19]. En outre, la fabrication d’un dispositif de détection SPR peut être résumée simplement au dépôt d’une couche mince métallique (quelques dizaines de nanomètres d’épaisseur) sur une lame de verre. C’est donc une méthode performante et facile à mettre en œuvre, et par conséquent elle est très largement utilisée pour la détection d’interactions biomoléculaires, que ce soit dans les laboratoires de recherche ou dans les laboratoires médicaux.

1.1.2

Biocapteur à résonance de plasmon de surface

Un plasmon de surface est une excitation collective des électrons se propageant à l’interface entre un diélectrique et un métal. Le vecteur de l’onde est orienté perpendiculairement au plan d’incidence (c’est une onde Transverse-Magnétique (TM)) et sa propagation hors de l’interface est évanescente [20]).

Un plasmon de surface peut être excité en dirigeant le faisceau d’une onde lumineuse sur une surface métallique à travers un dispositif de couplage. Dans le cadre de ce projet, c’est la méthode la plus simple à mettre en place qui est utilisée : celle du prisme. Dans cette configuration, appelée configuration de Kretschmann, l’onde incidente traverse un prisme (qui constitue un milieu optiquement plus dense que l’air) avant d’atteindre le film métallique, de façon à ce que l’onde évanescente à l’interface prisme/métal puisse interagir avec le film et exciter un plasmon de surface à l’interface métal/diélectrique. Ce couplage n’a lieu que dans des conditions bien précises appelées conditions de couplage.

Les conditions de couplage ne peuvent être vérifiées que pour un certain angle Ʌୗ୔ : pour cet angle-là, l’onde incidente excite le plasmon de surface et n’est donc pas réfléchie, d’où la présence d’une raie dans le faisceau réfléchi comme on peut le voir sur la Figure 1.1.

Les plasmons de surface sont extrêmement sensibles aux variations des indices de réfraction du métal ou du diélectrique. Ainsi, un changement d’indice optique du milieu diélectrique ߝௗ ou du métal ߝ௠ induit un changement de la constante de propagation du plasmon ݇ௌ௉, qui conduit lui-même à un changement de la condition de couplage. L’angle pour lequel la résonance a lieu est alors différent.

C’est sur ce principe qu’est basé le fonctionnement d’un dispositif SPR en tant que biocapteur (voir Figure 1.2) : les ligands sont immobilisés à l’interface solide/liquide (métal/diélectrique). Si des analytes interagissent avec ces ligands, alors l’indice de réfraction local dans le diélectrique est modifié, et en effectuant un balayage en angle ou en longueur d’onde, il est possible d’observer cette variation qui se répercute sur la condition de couplage. En effectuant ces mesures en fonction du temps, il est donc possible de suivre des interactions intermoléculaires en temps réel.

L’amplitude de l’onde évanescente diminue exponentiellement dans la direction perpendiculaire à l’interface, restreignant par là-même la profondeur de détection du capteur à quelques centaines de nanomètres d’épaisseur au-dessus du métal pour les longueurs d’onde dans le visible [21]. La condition de couplage n’est par conséquent

ߠௌ௉ 63 'LĠOHFWULTXH 0ĠWDO 3ULVPH )DLVFHDXLQFLGHQW )DLVFHDXUĠIOĠFKL

Figure 1.1 : À gauche : représentation schématique d’un montage de détection SPR. À droite : illustration du principe de détection d’une interaction. Lorsqu’un analyte interagit avec un ligand en se fixant sur la surface, cela provoque une variation de l’indice optique ο࢔ dans le diélectrique qui conduit à

un décalage de l’angle de résonance.

influencée que par les variations qui ont lieu dans cette zone, et seules les interactions proches de la surface du métal sont ainsi détectées. La SPR est donc une méthode d’analyse pertinente pour l’étude d’interactions entre biomolécules, dont beaucoup ont une taille compatible avec cette technique de détection surfacique. Par ailleurs, elle est aussi adaptée à des objets plus gros, comme des cellules de quelques µm de diamètre, notamment pour l’étude de leurs propriétés surfaciques [22,23].

Le biocapteur idéal devrait être capable de détecter des interactions entre des molécules non marquées au préalable. L’utilisation de marqueurs rend en effet le procédé global plus long et plus coûteux. Or, les techniques de détection sans marquage, ou label-free, sont souvent moins sensibles que celles avec marquage. En outre, un capteur idéal devrait aussi être totalement spécifique (c’est-à-dire qu’on veut détecter seulement l’analyte ciblé et pas autre chose), capable de faire des analyses in situ, facile à produire, réutilisable, peu coûteux, et simple à utiliser [24].

De par leur sensibilité, leur structure et leur principe de fonctionnement, les biocapteurs SPR remplissent la plupart de ces critères. Ils restent cependant moins sensibles que la détection par marquage fluorescent pour les très faibles concentrations, d’où l’intérêt de nos travaux qui visent à attirer activement les molécules cibles vers la surface du capteur. La spécificité, quant à elle, dépend de la fonctionnalisation chimique de surface et non de la méthode de transduction.

1.1.3

_{L’imagerie SPR et ses applications de biodétection}

L’imagerie SPR (SPRI) est une technique qui consiste à illuminer toute la surface du capteur plasmonique plutôt qu’un point, à angle et longueur d’onde fixes. Les variations locales d’indice de réfraction dans le diélectrique sont alors visibles sur l’image de l’intensité réfléchie, collectée par une caméra CCD. En permettant de préparer les échantillons sous forme de plots (ou « spots ») constituant des matrices

de quelques dizaines de lignes et colonne, cette technologie a constitué une véritable rupture dans l’utilisation de la SPR en décuplant le rendement de cette technique.

1.1.3.1 Détection et analyse des propriétés des cellules

Outre son utilité pour la simple détection de cellules (les bactéries Salmonella enteritidis et Listeria monocytogenes peuvent être détectées en quelques minutes à des concentrations descendant jusqu’à 106 _{cellules/ml dans du PBS [25]), l’imagerie SPR}

dispose de plusieurs avantages pour l’étude de leurs propriétés physiologiques et surfaciques. D’une part cette technologie offre de bonnes résolutions spatiale et temporelle : dès lors, on peut l’employer pour étudier les interactions entre des cellules et un substrat, et les dynamiques cellulaires qui en découlent, que celles-ci se manifestent spatialement [26,27] ou chimiquement [28]. D’autre part, la SPR est une technique non invasive, ce qui rend possible son utilisation pour la transduction d’événements se produisant à l’intérieur des cellules [29,30] ou même pour le tracking de structures intracellulaires comme les mitochondries [31].

L’imagerie SPR est une des activités principales du Laboratoire de Biophotonique de l’UdeS et a engendré la publication de plusieurs travaux, tous utiles à l’étude des cellules et de leurs mécanismes. L’augmentation de la profondeur de pénétration du plasmon dans le diélectrique [32,22] par exemple, est utile pour le suivi en temps réel de l’activité intracellulaire. L’amélioration de la résolution spatiale, que cela soit fait par post-traitement du signal [33] ou par une modification structurelle du capteur [34], est aussi un axe de travail du laboratoire qui devrait permettre des gains de performance significatifs pour l’imagerie SPR.

Dans le cadre des travaux présentés ici, nous utiliserons la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) en tant que cellule modèle pour évaluer l’efficacité du transport de masse dans les dispositifs étudiés.

1.1.3.2 Détection de protéines

Dans le domaine de la détection et de l’analyse des protéines, la SPR rencontre un intérêt grandissant. D’une part, la sensibilité de la SPR est particulièrement intéressante pour parvenir à détecter les interactions entre ces macromolécules [35], bien plus petites que des cellules. D’autre part, le marquage des protéines cibles, nécessaire pour la détection par fluorescence par exemple, peut entraîner des changements dans la structure de ces molécules, dont la fonctionnalité dépend directement de la conformation [36].

Dès les années 2000, des travaux sur des matrices de plots permettant l’analyse d’interactions complexes entre protéines (sur des ensembles de plus de deux protéines par exemple) ont été réalisés sur des biopuces analysées en SPRI [37–39]. Cette technique est très pertinente pour la découverte de médicaments, puisque la SPR permet des mesures en temps réel, donnant ainsi accès aux constantes cinétiques des réactions étudiées [40,41].

Dans le cadre de ce projet de thèse, l’albumine de sérum bovin (BSA) sera utilisée comme protéine modèle pour attester de la pertinence de la stratégie adoptée. Cette molécule, issue d’un peptide long d’environ 600 acides aminés et dotée d’une masse moléculaire de 66.5 kDa, est détectable par un capteur SPR standard à des concentrations descendant jusqu’à 0.1 ng/ml [42]. En outre, elle présente l’avantage d’être stable, facilement productible et purifiable, ce qui justifie son utilisation comme modèle ou standard dans beaucoup de travaux de recherche, dont ceux présentés ici.

1.1.3.3 Détection d’événements d’hybridation ADN/ADN

L’hybridation d’un brin simple d’acide désoxyribonucléique (ss-ADN) avec son complémentaire (c-ADN) est une réaction très spécifique. Pour détecter une séquence spécifique d’ADN, on utilise donc des brins constitués de la séquence complémentaire

détectée, cela signifie qu’il y a eu hybridation et donc que la séquence initiale d’ADN est présente dans l’échantillon.

Les biocapteurs SPR sont particulièrement adaptés à la détection d’hybridations ADN/ADN : les brins sondes sont immobilisés sur la surface métallique et l’échantillon est ensuite placé sur cette surface. S’il y a hybridation, l’indice de réfraction est localement modifié et cette variation est détectée par le capteur.

Les premiers travaux sur la détection de l’hybridation de brins d’ADN par SPR sont publiés dans les années 1990 [43]. Ils sont motivés par la non-nécessité de marquage préalable des cibles et pour la plupart facilités par l’apparition concomitante des premiers instruments de mesure SPR commerciaux. Ils montrent que la SPR peut être utilisée efficacement pour étudier les interactions entre molécules d’ADN, et plus particulièrement que cette méthode de détection sans prétraitement des cibles est rapide, sensible et spécifique.

Plus récemment, l’imagerie SPR a permis d’étudier ces interactions avec une limite de détection (i.e. concentration minimale en cibles de la solution pour qu’une réaction soit détectable) de 10 nM pour des brins d’une longueur de 16 bases [44] et de 2nM pour des brins constitués de 1500 nucléotides [45] (le temps donné pour l’hybridation dans ces expériences variant de 30 minutes à 1 heure).

1.1.4

Pourquoi ajouter une fonction d’actuation ?

obtenues et abaisser la limite de détection pour l’amener au niveau du pM, He et al. ont greffé des nanoparticules d’or sur les brins sondes d’ADN [46]. Dans leur expérience, ils utilisent une méthode de type « sandwich » en deux étapes d’accroche :

- Une première sonde est fixée à la surface, elle est complémentaire de la première moitié du brin cible.

- La surface ainsi fonctionnalisée est exposée à la solution contenant les cibles, puis rincée de manière à ce que les brins hybridés restent et les autres disparaissent.

- Enfin, ce système est mis en présence d’autres sondes qui, elles sont marquées par des nanoparticules d’or, et sont complémentaires de la deuxième moitié du brin cible.

Ainsi, si les cibles sont présentes dans la solution, elles s’hybrident avec les premières sondes, avant de s’hybrider avec les deuxièmes : la surface est alors fonctionnalisée avec une couche contenant des nanoparticules d’or. Si les cibles ne sont pas présentes en solution, rien ne se passe et seules les premières sondes restent à la surface.

Figure 1.3 : Illustration du procédé expérimental de greffe de nanoparticules d’or sur les brins d’ADN.

La présence de nanoparticules d’or à la surface multiplie par 18 le décalage du pic de SPR puisque, par rapport aux molécules d’ADN, les particules d’or présentent plusieurs avantages :

- Elles sont plus denses

- Elles ont un indice de réfraction plus élevé

- Elles induisent probablement une interaction électromagnétique avec la surface

Les auteurs atteignent alors une limite de détection de 10 pM pour des brins d’une longueur de 24 bases. La limite de détection du biocapteur SPR est ainsi divisée par 100. Cependant, cette méthode nécessite un traitement post-hybridation. Cette étape supplémentaire induit un délai d’attente et un coût plus élevés.

D’autres techniques, similaires à la fois dans la méthode et le résultat, existent et permettent d’améliorer le signal détecté pour augmenter la sensibilité du capteur. La plupart d’entre elles utilisent un pré- ou post-traitement des ligands ou des analytes, comme c’est le cas dans l’expérience de He et al. [46] décrite ci-dessus. En plus de complexifier et de rendre plus coûteux le procédé global de détection, le marquage des molécules peut modifier la cinétique des interactions moléculaires et rendre plus difficile leur analyse.

La solution proposée par notre projet de recherche permet de s’affranchir de ce problème. Elle consiste à utiliser la surface de détection elle-même pour agir à distance sur les molécules cibles et les faire migrer plus rapidement vers la surface à travers l’électrolyte – le transducteur jouant alors le rôle d’actuateur.

1.2

Comment manipuler les cibles en milieu

liquide ?

1.2.1

Technologies d’actuation sur dispositif microfluidique

- L’induction d’ondes acoustiques de surface sur le substrat permet de perturber le flux laminaire habituel des dispositifs microfluidiques et ainsi de fournir un mélange plus rapide [48]. L’efficacité de cette méthode a été démontrée en 2010 par Alan Renaudin au sein du LN2 [16]. Cela nécessite cependant d’intégrer un matériau piézoélectrique au substrat.

- L’utilisation de différences de température entre plusieurs fluides que l’on veut mélanger permet d’améliorer le mélange entre ces deux fluides [49]. Dans le cadre de ce projet, un seul fluide est présent sur le détecteur, mais on pourrait imaginer chauffer différentes zones de la surface pour améliorer la diffusion. L’intégration d’une fonction de contrôle de la température sur le substrat SPR semble cependant compliquée dans la mesure où le signal mesuré par SPR est extrêmement sensible aux variations de température.

- L’application de champs électriques directement sur des cibles chargées ou polarisables permet de manipuler celles-ci via les phénomènes d’électrophorèse [50] et de diélectrophorèse (DEP) [51], dont les principes sont détaillés dans la partie suivante. Ces méthodes sont applicables aux objets biologiques (qui sont tous polarisables, et pour beaucoup, chargés) et à priori intégrables sur un

- L’application de champs électriques sur le fluide – et non sur les cibles – peut mettre celui-ci en mouvement. Les phénomènes mis en jeu sont ainsi qualifiés d’électrohydrodynamiques et sont expliqués dans les parties suivantes. De la même manière que pour l’électrophorèse et la diélectrophorèse, ces méthodes sont intégrables sur un substrat SPR. Pour cette raison, c’est la solution qui a été retenue, avec la diélectrophorèse, pour mener à bien le projet.

1.2.2

Manipulation directe des cibles par électrophorèse et

diélectrophorèse

La manipulation de biomolécules par des champs électriques est connue et pratiquée depuis le milieu des années 1960 et les premiers travaux visant à étudier la mobilité des particules concernées lorsqu’elles sont exposées à un champ électrique [52–54].

1.2.2.1 Électrophorèse

L’électrophorèse désigne le phénomène se produisant lorsqu’une particule chargée est placée dans un champ électrique spatialement uniforme. 3 forces, résumées sur la Figure 1.4 [55], s’exercent alors sur la particule :

- La force électrostatique, donnée par ܨ_௘௟ൌ ݍܧ où q est la charge de la particule et E l’amplitude du champ électrique

- La force de frottement exercée par le fluide sur la particule ܨ_௙

Figure 1.4 : Schéma de principe des forces électrophorétiques s’appliquant sur une particule chargée.

- La force de retard électrophorétique ܨ_௥௘௧ qui est la force s’appliquant sur les ions contenus dans la couche ionique présente à la surface de la particule. Selon la théorie de la double couche de Helmholtz, un solide présentant une charge surfacique que l’on plonge dans un liquide attire des ions de charge opposée à sa surface. Le champ électrique exerce une force sur ces ions, partiellement transmise à la particule par contrainte visqueuse.

La mobilité électrophorétique d’une particule est alors définie par ߤ௘ ൌ_ா௩ où v est la vitesse atteinte par la particule lorsque le champ E lui est appliqué. L’une des applications historiques de l’électrophorèse est la séparation de molécules d’ADN : en les faisant avancer à travers une matrice de gel d’agarose ou polyacrylamide en leur imposant une force électrophorétique, celles-ci vont plus ou moins loin en fonction de leur taille [50].

1.2.2.2 Diélectrophorèse

La diélectrophorèse désigne la mise en mouvement d’une particule polarisable par l’action de l’application externe d’un champ électrique spatialement non uniforme. Ce phénomène dépend des propriétés diélectriques de la particule dans un fluide donné[56]. Il se décompose en deux mécanismes, illustrés sur la Figure 1.5 [56], qui se produisent immédiatement dès l’application du champ électrique :

- La particule est d’abord polarisée sous l’action du champ électrique.

- La non-uniformité spatiale du champ implique que la résultante de son action sur la particule est non nulle.

La force s’exerçant sur une particule sphérique de rayon r s’exprime par :

൏ ࡲሬሬሬሬሬሬሬሬሬሬԦ ൐ൌ ૛࣊ࢿࡰࡱࡼ ࢓࢘૜ࡾࢋሾࢌ࡯ࡹሿસࡱࢋࢌࢌ૛ Équation 1.1 Où ܴ݁ሺ݂஼ெሻ est la partie réelle du facteur de Clausius-Mosotti (qui s’écrit ݂஼ெ ൌ ఌ೛כିఌ೘כ

ఌ_೛כ_ାଶఌ ೘

כ avec ߝ௣כ la permittivité complexe de la particule et ߝ௠כ celle du milieu), r est le

rayon de la particule sphérique et ܧ௘௙௙ la valeur efficace du champ électrique.

La force DEP dépend donc du volume de la particule, de la polarisabilité de l’objet et de celle du milieu, ainsi que du gradient de champ électrique. Cette force peut agir sur la particule de deux manières différentes :

- Si ܴ݁ሺ݂_஼ெሻ൐ Ͳ, la DEP est positive et le mouvement de la particule se fait vers les zones où le champ est plus élevé.

- Si ܴ݁ሺ݂_஼ெሻ ൏ Ͳ , la DEP est négative et le mouvement de la particule se fait vers les zones où le champ est plus faible.

Le principe de la diélectrophorèse repose sur la présence de gradients de champ dans le fluide et fonctionne donc en courant alternatif (AC) ou continu (DC). En effet, le mouvement de la particule ne dépend pas du signe de la polarisation des électrodes.

Figure 1.5 : À gauche : polarisation d’une particule sphérique. Les charges s’accumulent à l’interface entre le matériau diélectrique et le milieu liquide. À droite : champ électrique non uniforme et DEP. La particule subit une force dépendant de la distribution spatiale du champ. Dans cet exemple, le matériau est plus facilement polarisable que le liquide et la résultante est dirigée vers le maximum de champ (ici vers la droite).