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Caractérisation de voies de régulation paracrine
potentiellement impliquées dans le devenir des cellules
souches spermatogoniales chez la truite arc-en-ciel
(Oncorhynchus mykiss)
Ahmed Maouche
To cite this version:
Ahmed Maouche. Caractérisation de voies de régulation paracrine potentiellement impliquées dans le devenir des cellules souches spermatogoniales chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss). Sciences du Vivant [q-bio]. Agrocampus Ouest, 2018. Français. �NNT : 2018NSARA083�. �tel-02790202�
T
HESE DE DOCTORAT DE
AGROCAMPUS
OUEST
COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE
ECOLE DOCTORALE N°600
Ecole doctorale Ecologie, Géosciences, Agronomie et Alimentation Spécialité : « Ecologie et évolution »
« Caractérisation de voies de régulation paracrine potentiellement
impliquées dans le devenir des cellules souches spermatogoniales chez
la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) »
Thèse présentée et soutenue à Rennes, le 17 décembre 2018
Unité de recherche : INRA UR 1037 Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons (LPGP) Thèse N° : A83-2018-29
Par
« Ahmed MAOUCHE »
Rapporteurs avant soutenance :
Charles PINEAU DR INSERM U1085 IRSET, Rennes
Bertrand PAIN DR UMRS 1208 INSERM, UCBL, INRA, Lyon Composition du Jury :
Président : Pierre-Guy MARNET Professeur, UMR PEGASE, AGROCAMPUS OUEST, Rennes Examinateurs : Pascal SOURDAINE Professeur, UMR BOREA Universités de Caen
Nathalie RIVES Professeur EA 4308, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Rouen Dir. de thèse : Jean-Jacques LAREYRE Directeur de Recherche INRA UR1037 LPGP, Rennes
« I don't know anything, but I do know that everything is interesting if you go into it deeply enough»
Remerciements
Je tiens tout d’abord à avoir une pensée particulière à ma directrice de thèse, la regrettée Florence LE GAC, qui nous a quittés durant le mois de juillet de cette année (paix à son âme). Je la remercie de m’avoir donné l’opportunité de réaliser une thèse au sein du laboratoire, mais aussi pour toutes les discussions que nous avons eues durant ma première année de thèse. Ce fut un immense honneur de côtoyer une aussi brillante scientifique et un des grands noms de notre domaine.
Je remercie Jean-Jacques LAREYRE qui a pris la relève de Florence Le Gac en devenant mon directeur de thèse à ma deuxième année, il a su m’encadrer, me guider d’une manière très pédagogique tant au niveau des manips qu’au niveau de la réflexion sur les résultats obtenus.
Je remercie Anne-Sophie, pour tout le temps qu’elle a consacré à me former aux différentes techniques et à toutes les manips qu’elle a fait à ma place faute de temps. Grâce à sa très précieuse aide et son organisation, travailler avec elle fut un vrai plaisir.
Je remercie également Élisabeth, la personne la plus souriante au monde, qui m’a
donné de son temps pour discuter de mes résultats et m’a encadré pour la réalisation des Crispr. Mais aussi pour toutes les corrections apportées au poster et au manuscrit.
Merci aussi à tous les autres membres de l’équipe Maré pour les conseils avisés. Plus particulièrement ceux de Catherine qui voit toujours le bon côté des choses.
J’exprime tous mes remerciements aux membres de mon comité de thèse, Bertrand PAIN, Pascal SOURDAINE, Isabelle Allemand, Aude GAUTIER, Amaury HERPIN et Jean-Charles GABILLARD pour leurs conseils lors des réunions de comité.
J’adresse toute ma gratitude à Bertrand PAIN et Charles PINEAU d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse, à Pascale SOURDAINE et Nathalie RIVES d’être examinateurs et enfin à Pierre-Guy MARNET de tenir le rôle de président du jury.
Merci à Julien BOBE directeur du laboratoire INRA LPGP de m’avoir accueilli dans cette structure. Merci aussi à tous les autres membres de l’unité pour leur aide que ce soit d’un point de vue technique (Béatrice pour l’histo et Sandrine pour les qPCR) ou administratif (Guylène, Céline, Patricia, Nathalie).
Merci aussi au personnel des installations expérimentales en incluant Fred et tout particulièrement Amélie pour les pontes de poisson-zèbre, Cecile pour les truites. Merci aussi à Lionel et Erwan de la PEIMA pour la production de truites et leur élevage.
Merci à Sophie JUNG (stagiaire Master 1), et Thomas DESVALEE (stagiaire L3) pour leur attention, leur sérieux et l’aide qu’ils nous ont apportée dans la préparation et la réalisation d’expériences de qPCR et du clonage du vecteur à l’endothéline.
Mention spéciale aux nombreux non-titulaires, anciens et nouveaux, que j’ai pu rencontrer durant ces trois années. Je pense à Amine, qui m'a accueilli chez lui, m’a aidé à trouver rapidement mes marques et avec qui j’ai passé des soirées mémorables. Sans oublier Benji, toujours le sourire aux lèvres et la vanne qui tue, le roi sans couronne du ping-pong. Je remercie aussi Édouard pour ces encouragements et son aide, merci pour toutes ces discussions et de m’avoir laissé dormir dans ton bureau. Merci aussi à Boudj pour les discussions sérieuses que l’on a eues et pour tes encouragements et ton soutien. Merci pour les soirées où vous m’avez invité et pour lesquelles je suis toujours arrivé en retard (j’arrive comme un éclair #Ferhat). Merci à Dani avec laquelle j’ai partagé de très bons moments et qui m’a permis de connaître plusieurs personnes de divers horizons, merci à Sab (blondie) qui m’a toujours fait rire avec ses Sabrinettes et Steph avec toujours un mot gentil.
J’ai passé d’agréables moments avec toutes ces personnes. Elles ont rendu la réalisation de ma thèse fort sympathique et j’espère retrouver cette ambiance ailleurs, mais ça va être dur j’en suis conscient !
Merci à toute ma famille et plus particulièrement à mes parents et à ma sœur qui ne m’ont jamais rien refusé dans la vie, m’ont toujours encouragé dans la voie que j’ai décidé de suivre et grâce à qui j’ai pu venir en France et me consacrer totalement à mes études. Merci d’être présents à mes côtés et de croire en moi. Merci à mes oncles Karim, Samir et Yacine, à ma tante Feriel et mémé (ma chère grand-mère), qui ont toujours été présents et qui m’ont soutenu et aidé.
Merci à mes amis de toujours, Nassim, Yanis, Menand et Farid avec qui j’ai fait les 400 coups et partagé des souvenirs inoubliables. Merci d’avoir répondu présents quand j’en avais besoin.
Je tiens aussi à avoir une pensée particulière pour ma grand-mère paternelle et mon oncle Omar, qu’on a perdus ces deux dernières années, je garderai leur souvenir gravé dans mon cœur à jamais (paix à leurs âmes).
ABREVIATIONS
Termes généraux
Aal (spermatogonie) A aligned
Adiff (spermatogonie) A differentiated
Aint (spermatogonie) A intermédiaires
Apr (spermatogonie) A paired
As (spermatogonie) A single
Aund (spermatogonie) A undifferentiated
BrdU BromodéoxyUridine
FACS Fluorescence Activated Cell-Sorting
GFP Green Fluorescent Protein
HPG HyPoGonadal (mouse)
jpc jour(s) post-coït
jpf jour(s) post-fécondation
jpp jour(s) post-partum
KO Knock Out
MACS Magnetic Activated Cell Sorting
PCR Polymerase Chain Reaction
qPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction
SSC Spermatogonial Stem Cell
Noms complets des protéines
11-KT 11-KetoTestosterone
17a20b 17 alpha, 20 beta-dihydroxyprogesterone
Adgrd2 Adhesion G Protein-Coupled Receptor D2
Acvr2b Activin A Receptor Type 2B
AMH Anti-Mullerian Hormone
BMP4 Bone Morphogenetic Protein 4
CD90 (THY1) Cluster Differentation 90 ( = Thymus cell antigen 1)
C-KIT KIT Receptor
Ccr6a C-C Motif Chemokine Receptor 6 a
CSF1 Colony Stimulating Factor 1
CSF1R Colony Stimulating Factor 1 Receptor
CXCL12 (SDF1) Chemokine (C-X-C motif) Ligand 12a
CXCR4 C-X-C chemokine receptor type 4
DAZL Deleted in azoospermia-like
E2 17beta-estradiol
ER-β Estrogen receptor beta
ERαKO Estrogen receptor-α knockout
Edn1 Endothelin 1
Edn2 Endothelin 2
Edn3 Endothelin 3
Edn4 Endothelin 4
Ednra Endothelin receptor type A
Ednrb Endothelin receptor type b
ETV5 ETS Variant 5
FGF Fibroblast Growth Factor
FSH Follicle Stimulating Hormone
FSHβKO Follicle-stimulating hormone β knockout
FSHRKO follicle-stimulating hormone receptor knockout
GDNF Glial cell line derived neurotrophic factor
GFRA1 GDNF family receptor alpha 1
Gpr37a G Protein-Coupled Receptor 37a
GSDF Gonadal Somatic cell Derived Factor
ID4 Inhibitor of DNA binding 4
IGF1 Insulin-like Growth Factor
KITL (=SCF) KIT Ligand
KITlg KIT Ligand
Kitr KIT Receptor
LH Luteinizing Hormone
LIF Leukemia Inhibitory Factor
MLC2 Myosin light chain 2
Nanos2 Nanos C2HC-Type Zinc Finger 2
NGN3 Neurogenine 3
PDGF Platelet-Derived Growth Factor
PI3k PhosphoInositide 3-Kinase
PLZF Promyelocytic leukaemia zinc-finger
POU5F1 (OCT4) POU domain, class 5, transcription Factor 1
SALL4 Spalt-like 4
SCF (KITL) Stem Cell Factor
SDF1A (CXCL12) Stromal cell-Derived Factor 1a
SDY sexually dimorphic on the Y chromosome
SOX9 SRY (sex determining region Y)-BOX 9
STRA8 Stimulated by retinoic acid 8
TGF Transforming Growth Factor
Règles adoptées dans le manuscrit pour la nomenclature des protéines et des gènes :
Gènes de mammifère : en italique et lettres majuscules (GENE) Protéines de mammifère : en lettres majuscules (PROT)
Gènes de rongeur : en italique, avec la première lettre en majuscule (Gene) Protéines de rongeur : en lettres majuscules (PROT)
Gènes de poisson : en italique et en lettres minuscules (gene) Protéines de poisson : première lettre en majuscule (Prot)
SOMMAIRE
Introduction ... 1
Introduction ... 2
1. La spermatogenèse ... 3
1.1. Généralités ... 3
1.2. La spermatogenèse chez les mammifères ... 4
1.3. Spermatogenèse chez les poissons ... 5
2. Les cellules souches germinales ... 6
2.1. Spécification et maturation des cellules souches germinales au cours de l’ontogenèse ... 6
2.2. Modèles d’auto-renouvèlement et de différenciation progressive des SCC chez l’adulte ... 11
2.3. Mode de division des cellules souches germinales ... 14
2.4. La niche germinale chez l’adulte ... 15
2.5. Marqueurs de surface des cellules souches germinales ... 19
2.6. Facteurs impliqués dans le renouvellement ou la différenciation des cellules souches germinales embryonnaires et/ou adultes ... 21
2.7. Contrôle endocrine du stock ou de la destinée des cellules souches germinales ... 30
3. La Truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ... 35
3.1. Une espèce d’intérêt aquacole ... 35
3.2. Positionnement de la truite au sein du groupe paraphylétique des poissons ... 35
3.3 Évolution complexe du génome ... 36
3.4 Le cycle de reproduction chez la truite arc-en-ciel : ... 37
PROJET DE THÈSE ... 40
Matériels et Méthodes ... 45
1.Animaux et échantillons ... 46
1.1. Origine et élevage des truites arc–en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ... 46
1.2. Origine et élevage des poissons-zèbres (Danio rerio) ... 47
2. Analyses histologiques ... 47
3. Séparation des cellules germinales à l'aide d'une élutriation centrifuge ... 48
4. Incubation d’explants testiculaires en présence d’hormones ... 49
5. Analyse des relations de l’histoire évolutive des gènes d’intérêt ... 49
5.1.Analyses phylogénétiques ... 49
6. Analyse de l’expression des gènes ... 50
6.1. Extraction de l’ARN total ... 50
6.2. Rétro-transcription (RT) ... 50
6.3. Choix des amorces spécifiques ... 50
6.4. PCR quantitative (qPCR) ... 51
7. Etude fonctionnelle de l’endothéline ... 51
7.1. Etude in vitro des interactions entre le ligand Edn2a1 et son récepteur Ednrba2 ... 51
7.2. Etude in vivo de la fonction des gènes edn2a et ednrba chez le poisson-zèbre ... 55
8. Technique de transplantation ... 57
8.1. Introduction ... 57
8.1.1. Transplantation des cellules spermatogoniales souches ... 57
8.1.2. Techniques de transplantation des cellules souches germinales chez les poissons ... 57
8.1.3. Transplantation interespèces ou xénogénique ... 58
8.2. Production des donneurs isogéniques ... 59
8.3. Production des receveurs triploïdes de la souche de truite « golden » ... 60
8.4. Transplantation des embryons ... 61
8.5. Fécondation des œufs ... 63
8.6. Régénération de la lignée donneuse ... 63
RESULTATS ... 65
Chapitre 1« Étude de deux voies de signalisation candidates connues pour être impliquées dans le contrôle des cellules souches germinales chez les mammifères » ... 66
2.« New insights into the evolution, hormonal regulation, and spatiotemporal expression profiles of genes involved in the Gfra1/Gdnf and Kit/Kitlg regulatory pathways in rainbow trout testis » - Article. 67 Chapitre 2« Identification de nouvelles voies de régulation paracrine » ... 72
1.Introduction ... 73
2.Résultats ... 73
2.1.Identification de gènes codant pour des récepteurs membranaires potentiellement exprimés par les cellules souches germinales adultes chez le poisson-zèbre. ... 73
2.2. Analyse d’un panel de 6 gènes candidats chez la truite arc-en-ciel ... 74
2.3.Étude approfondie de la voie de régulation Ednrba/Edn2a ... 79
3. Discussion des résultats... 90
Chapitre 3« Simplification de la technique de transplantation de cellules souches spermatogoniales chez la truite arc-en-ciel » ... 93
2. Contexte et objectifs des travaux... 94
3. Résultats ... 96
3.1. Stérilisation et choix de la souche des embryons receveurs ... 96
3.2. Etude du degré de pureté nécessaire pour la colonisation des gonades des embryons receveurs ... 97
3.3. Etude des performances des animaux receveurs mâles transplantés avec succès ... 98
3.4. Etude des performances de reproduction des animaux receveurs triploïdes de sexe femelle ... 99
3.5. Validation de l’isogénicité des gamètes et de la descendance issue des animaux transplantés . 100 4.Discussion des résultats ... 101
DISCUSSION GENERALE ... 107
1. Histoires évolutives des voies de signalisation candidates ... 108
1.1. Évolution des voies de signalisation du Kitlg/kitr et Gdnf/Gfra1 chez la truite arc-en-ciel ... 108
1.2. Évolution de la famille des endothélines ... 111
2. Analyse des voies de signalisation candidates au cours de l’ontogenèse ... 114
2.1. Voies de signalisation du kitlg/kitr ... 114
2.2. Voie de signalisation du gfra1/gdnf ... 115
2.3. Voies de signalisation edn2a1/ednrba2 ... 116
2.4. Les changements de la signature moléculaire des cellules souches germinales au cours de l’ontogenèse coïncident avec des variations des voies de signalisation ... 117
3. Influence des hormones sexuelles sur les voies de signalisation ... 118
3.1. Effet de l’hormone gonadotrope Fsh ... 118
3.2. Effet des stéroïdes sexuels ... 120
4. Simplification de la technique de transplantation de cellules souches spermatogoniales chez la truite arc-en-ciel ... 121
Conclusions et perspectives ... 125
Références bibliographiques ... 128
Annexes ... 156
Annexe 1 ... 157
Annexe 2 : Résumé présentation 6th International Workshop on the Biology of Fish Gametes ... 158
Annexe 3 : Poster présenté aux « Journées d’animation scientifiques du département Phase ... 159 Annexe 4 : Poster présenté au « 11th International Symposium on Reproductive Physiology of Fish » 160
1
2
Introduction
Le domaine de l’aquaculture a connu un développement fulgurant ces dernières années en raison de la consommation humaine de poissons qui ne cesse d’augmenter à travers le monde et de la raréfaction des ressources halieutiques causée par les surpêches. L’industrie de la pisciculture doit cependant faire face à des enjeux comme la maitrise de la maturation sexuelle des poissons d’élevage pour permettre la reproduction de nouvelles espèces en cours de domestication, ou le développement de biotechnologies qui permettraient de stériliser les poissons d’élevage pour limiter l’impact écologique des poissons échappés.
Différents facteurs exogènes peuvent influencer la production et le développement des poissons en élevage tels que la qualité de l’eau, la température ou la photopériode. Ces facteurs influencent la maturation précoce qui, chez certaines espèces comme les salmonidés, entraine un arrêt de la croissance, impacte la qualité de la chair, et augmente la susceptibilité des animaux aux maladies. Pour s’affranchir des problèmes de la maturation sexuelle précoce, les piscicultures ont recours soit à la production de populations monosexes femelles diploïdes qui ont l’avantage de finir leur maturation sexuelle plus tardivement que les mâles, soit à la production de femelles triploïdes qui demeurent stériles. La production de populations monosexes femelles repose d’abord sur la masculinisation de femelles par l’hormone 17-alpha méthyltestostérone qui permet d’obtenir des mâles phénotypiques appelés néomâles. Les populations monosexes femelles sont générées en fécondant des ovocytes avec le sperme de génotype X des néomales. Bien que réglementaire, l’utilisation de l’hormone 17-alpha méthyltestostérone s’accompagne de rejets de ce perturbateur endocrinien dans l’environnement. Son utilisation massive et régulière représente un risque environnemental ainsi qu’un risque de santé publique pour les personnels des piscicultures et pour les citoyens au contact des eaux contaminées.
La production d’animaux triploïdes entraine des problèmes de santé animale. Les animaux produits peuvent présenter dans des conditions de qualité d’eau altérée des fragilités du squelette au niveau des vertèbres, des malformations cardiaques et des cataractes notamment. Les malformations et le taux de morbidité plus élevé des poissons triploïdes posent un problème d’ordre éthique.
Figure 1 : Schéma général de la différenciation des cellules germinales au sein du testicule prépubère et adulte de souris. (A) La prolifération et la différenciation des spermatogonies (axe ascendant), les deux divisons de méiose (axe horizontal et descendant), la spermiogenèse qui aboutit à la formation des spermatozoïdes (axe descendant). (B) Architecture d’un tube séminifère de souris (Bellve et al., 1977, Yoshida, 2012).
A
3
En conclusion, la maitrise et la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le contrôle de la maturation sexuelle restent un enjeu essentiel pour développer de nouvelles pratiques efficaces plus respectueuses de l’environnement et du statut de l’animal.
1. La spermatogenèse
1.1. GénéralitésChez les animaux, la spermatogenèse est un processus saisonnier ou continu qui se déroule de la puberté à la sénescence et au cours duquel les spermatozoïdes sont formés à partir de cellules indifférenciées, les cellules souches germinales (SSC : spermatogonial stem cell). Les SSC transmettent le matériel génétique parental aux générations futures (Hess and de Franca, 2008; Schulz et al., 2010). La spermatogenèse regroupe l’ensemble des événements cellulaires qui se déroulent au sein des tubes séminifères. On distingue trois étapes principales qui, à partir des cellules souches germinales diploïdes, vont aboutir à la production de gamètes matures haploïdes, les spermatozoïdes : (i) la prolifération par mitoses successives et la différenciation des spermatogonies diploïdes (2n1C), (ii) la méiose qui implique une première division réductionnelle des spermatocytes primaires (2n2C) en spermatocytes secondaires (1n2C) et une division équationnelle de ces derniers pour former les spermatides rondes (1n1C) et (iii) la spermiogenèse, phase de différenciation et de maturation cellulaire des spermatides rondes en spermatozoïdes. Les premières entrées en méiose débutent, entre 8 et 10 jours post-partum (jpp) chez la souris (Bellve et al., 1977) (Figure 1).
La spermatogenèse est un processus biologique organisé et dont la régulation complexe dépasse le simple contrôle endocrinien exercé par l’axe hypothalomo-hypophyso-gonadique, qui impliquent les deux hormones gonadotropes folliculo-stimulante (Fsh) et l'hormone lutéinisante (LH). La LH agit de manière indirecte en stimulant la production de stéroïdes sexuels qui auront une action paracrine et endocrine. La spermatogenèse implique également un système de régulation locale entre les cellules somatiques et les cellules germinales qui met en jeu des régulations par contacts cellulaires, mais aussi des facteurs extracellulaires à action paracrine ou autocrine (Pointis et al., 2005).
Figure 2 : Représentation du développement clonal des cellules germinales chez la souris basée sur le modèle de Huckins et Oakberg de 1978. Ce schéma regroupe les catégories de spermatogonies: les spermatogonies A indifférenciées : A single (As), A paired (Apr) et les A aligned (Aal), les spermatogonies A différenciées : A1, A2, A3 et A4 et les spermatogonies A intermédiaires: Aint. Le chiffre en dessous des appellations représente le nombre de cellules après division. Adapté de (Fayomi & Orwig, 2018).
4 1.2. La spermatogenèse chez les mammifères
Les spermatogonies sont des cellules diploïdes qui se divisent par mitoses successives. Elles sont disposées à la base de l’épithélium séminifère. Ce sont des cellules plutôt arrondies, d’un diamètre de 10 à 15 μm, avec un cytoplasme clair et un noyau ovoïde (Clermont and Perey, 1957). Différentes populations de spermatogonies se succèdent au cours de la différenciation spermatique chez les mammifères (De Rooij and Russell, 2000).
Les spermatogonies indifférenciées de type A sont des cellules dont l’hétérochromatine nucléaire est peu visible. Elles sont retrouvées au début de la spermatogenèse et on en distingue différentes sous-populations. Les spermatogonies A indifférenciées isolées appelées
As (A single) ou SSC (spermatogonial stem cell) représentent la catégorie de cellules souches
germinales les plus primitives présentes dans le testicule des animaux adultes. Ces dernières sont des cellules ayant la capacité de s’autorenouveler ou de se différencier (Kubota et al., 2004a) (Figure 2). Deux autres sous-populations distinctes de spermatogonies se succèdent :
les spermatogonies en paires ou en doublet (Apr : A paired) issues de la division des
spermatogonies As. Cette population de spermatogonies Apr est caractérisée par la présence
d’un pont cytoplasmique entre les deux cellules filles. Les cellules Apr se divisent à leur tour
pour donner naissance aux spermatogonies alignées (Aal : aligned) que l’on retrouve sous
forme de chainettes de 4, 8 ou 16 cellules interconnectées par un pont cytoplasmique (De Rooij and Russell, 2000; Helsel et al., 2017) (Figure 2). Les populations de spermatogonies Apr et Aal 4-8 sont aussi appelées progéniteurs capables d’interconversion en As après la rupture
du pont cytoplasmique qui relie les doublets ou les chaines de 8 cellules alignées. Les spermatogonies alignées formant les chaines de 16 cellules se différencient en spermatogonies A appelées aussi les spermatogonies A en différenciation. Elles sont subdivisées en spermatogonies A1, A2, A3 et A4. Elles représentent les précurseurs des spermatogonies de type intermédiaire. Elles ne se distinguent pas morphologiquement et la seule distinction se fait par extrapolation par rapport au stade de la spermatogenèse identifiée (Clermont, 1962; De Rooij and Russell, 2000) (Figure 2).
Les spermatogonies A intermédiaires (Aint) qui possèdent une quantité d’hétérochromatine intermédiaire dans le noyau se divisent et se différencient pour donner naissance aux spermatogonies de type B qui possèdent une quantité d’hétérochromatine encore plus importante dans le noyau. La différenciation des cellules spermatogoniales de type B va
5
permettre l’apparition de cellules méiotiques appelées spermatocytes primaires (Dym, 1994a). La méiose implique une première division dite réductionnelle qui va induire la formation de spermatocytes secondaires doubles haploïdes. La deuxième division de la méiose dite équationnelle produit des spermatides allongées haploïdes. L'un des objectifs de la méiose est de générer de la diversité génétique par le biais de deux événements : la recombinaison entre chromosomes homologues et la ségrégation des chromosomes homologues dans les cellules filles générées. À ce stade, on entre dans la 3ème phase de la spermatogenèse qui est la spermiogenèse. Durant cette phase, la cellule germinale est profondément remodelée avec un noyau qui se condense, la réduction du cytoplasme, la formation d’un acrosome, et la formation d’un flagelle. Cette différenciation aboutit à la formation des spermatozoïdes (Clermont, 1972).
1.3. Spermatogenèse chez les poissons
Chez les poissons ce processus n’est documenté que chez quelques espèces modèles pour la recherche fondamentale poisson-zèbre (Schulz et al., 2010), médaka, poisson rouge (Billard, 1986)), des espèces d’intérêt agronomique truite et saumon (Billard, 1979), anguille (Miura and Miura, 2001), tilapia (Vilela et al., 2003), morue (Almeida et al., 2008) ou des espèces d’intérêt écologique (requins) (Dubois and Callard, 1990).
Les nomenclatures utilisées pour décrire les différentes populations de cellules germinales qui se succèdent au cours de la première phase de divisions mitotiques sont très variables d’une espèce à l’autre. En général, deux catégories de spermatogonies de type A sont présentes. La première catégorie regroupe les spermatogonies A indifférenciées (A und) comprenant les SSC et la deuxième catégorie est celle des spermatogonies A différenciées (Adiff) qui se transforment rapidement en spermatogonies de type B (Schulz et al., 2010). La deuxième étape appelée méiose est très conservée. La dernière étape appelée spermiogenèse aboutit à des différences structurales et morphologiques très importantes des spermatozoïdes par rapport aux mammifères et entre les différentes espèces de poissons. Les spermatozoïdes des poissons téléostéens n’ont pas d’acrosome et certaines espèces ont des spermatozoïdes biflagellés (Mattei and Mattei, 1976).
Les étapes de la spermatogenèse chez les poissons sont globalement identiques à celles observées chez les mammifères bien que les poissons montrent une grande diversité d’habitats avec des facteurs environnementaux pouvant influencer fortement le processus de
6
spermatogenèse (De Siqueira-Silva et al . 2018). Il existe cependant des différences notables comme la durée de ce processus chez les espèces téléostéens (Nóbrega et al., 2009).
2. Les cellules souches germinales
Pour les organismes qui se reproduisent par reproduction sexuée, les cellules souches germinales jouent un rôle essentiel dans la transmission de l'information génétique d'une génération à l'autre. Ces cellules sont donc spécialisées ou déterminées dans la transmission de l'information génétique à la descendance.
Les cellules souches germinales sont un sous-ensemble de cellules qui ont la capacité unique de rester quiescentes, de s'autorenouveler, de se différencier et de se multiplier successivement en différents types de cellules matures (Li and Xie, 2005).
Les cellules souches primordiales (PGC) constituent la première population de cellules souches germinales qui, en atteignant et colonisant la gonade, initient une transition en gonocytes. Ces dernières seront à l’origine des cellules souches germinales adultes (SSC) (De Rooij and Russell, 2000a).
2.1. Spécification et maturation des cellules souches germinales au cours de l’ontogenèse 2.1.1. Les cellules germinales primordiales (PGC)
Les cellules germinales primordiales (PGC : Primordial Germ Cells) sont les premières cellules souches germinales embryonnaires déterminées. Elles n’ont pas d’autre destinée possible que de générer des cellules du lignage germinal (Oatley and Brinster, 2008). Leur spécification et leur migration vers les gonades au cours du dévelopement embryonnaire précoce ont été étudiées chez différentes espèces modèles ou d’intérêt agronomique :
• Connaissances acquises chez les mammifères :
Chez les mammifères comme la souris, elles ont été initialement identifiées chez des embryons de 8.5 jours post coitum (E8.5) par leur forte activité phosphatase alcaline (Chiquoine, 1954). Elles sont cependant détectables à partir de 7.5 jours post coitum (Ginsburg et al., 1990).
Les PGC sont formées sous l’influence des protéines BMP4 et BMP8b qui sont des facteurs de la famille des TGFb sécrétés par l’ectoderme extra-embryonnaire (Ying et al., 2000). Ces
A
B
Figure 3 : Schéma représentant la migration des cellules germinales primordiales (PGC) chez la souris. (A) Les PGCs en vert vont initier leur migration depuis le feuillet embryonnaire vers les futures gonades à partir de 7,5 jours.. Al: allantoïde , sm: somite. (B) la migration s’effectue sous l’influence de différents facteurs comme le steel , stella et SDF1 (Adapté de Richardson B & Lehmann R 2010, et de Saitou,et al . 2012).
7
facteurs agissent sur les épiblastes pluripotents présents à proximité à E5.5-6. Les épiblastes pluripotents deviennent d’abord des épiblastes compétents en se mettant à exprimer le gène
Fragilis puis des précurseurs de PGC en exprimant le gène Blimp1 à E6.25-6.5 (Hayashi et
al., 2007). Après la gastrulation, les précurseurs des PGC ont migré dans la région proximale postérieure et ils se spécifient en PGC en exprimant le gène Stella (E7.25-7.5)(Nikolic et al., 2016).
Les PGC migrent au cours de l’embryogenèse du feuillet embryonnaire ectodermique pour coloniser les crêtes génitales qui formeront les futures gonades (Oatley and Brinster, 2008). L’initiation de la migration des PGC se fait sous l’influence des deux gènes Stella et Fragilis (Nikolic et al., 2016). Lors de leur migration, les PGC sont attirées vers les futures gonades grâce à l’intervention de facteurs chimio-attractants comme SDF-1. Ce facteur est sécrété par les cellules somatiques et il se lie au récepteur CXCR4 qui lui est exprimé à la surface des PGC. L’invalidation in vivo du gène codant pour SDF1 n’empêche pas la migration des PGC mais celles-ci vont se loger de manière aléatoire dans le reste des tissus de l’embryon (Doitsidou et al., 2002; Molyneaux et al., 2003; Sasado et al., 2008a) (Figure 3).
D’autres facteurs sont impliqués dans le maintien de la survie, de la prolifération et de la migration des PGC comme le ligand KIT (Steel factor) et son récepteur C-KIT. Chez la souris, l’invalidation du gène Steel (ligand du récepteur KIT) induit une apoptose et une colonisation ectopique des PGC de différents tissus embryonnaires (Gu et al., 2009; Runyan et al., 2006). Une fois implantées dans les gonades embryonnaires, les PGC expriment Dazl (Nikolic et al., 2016) qui est un gène essentiel à la survie en régulant les caspases et à la différenciation des PGC. Les souris invalidées pour le gène Dazl ne développent pas de cellules souches germinales au-delà du stade PGC (Gill et al., 2011). Une fois les PGC implantées, les cellules sont appelées communément gonocytes. Ces derniers se transformeront d’abord en prospermatogonies chez l’embryon puis en SSC juste après la naissance (Nikolic et al., 2016).
• Connaissances acquises chez la drosophile :
Chez la drosophile, à l’instar des mammifères, les PGC sont déterminées à partir d’une structure maternelle du cytoplamse ovocytaire appelée plasma germinal (Marlow, 2015). Les PGC commencent leur migration active en pénétrant dans un épithélium comprenant les cellules endodermiques. Après avoir traversé l'endoderme, elles se réorganisent sur la surface
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basale du futur intestin moyen et migrent dans le mésoderme où elles entrent en contact et adhèrent à la gonade (Santos and Lehmann, 2004).
La migration des PGC de l’intestin moyen vers le mésoderme implique dans un premier temps l’action d’une protéine G appelée TRE-1 qui en association avec une GTPase (RHO) modifie la distribution des jonctions cellulaires (cadhérine et caténine). Cette réorganisation induie la polarisation des cellules (formation d’une queue cellulaire). Une fois leur poplarisation acquise, les PGC vont initier leurs migrations vers la paroi de l’intestin moyen et par la suite la traverser (migration transépithéliale) et cela toujours grâce a TRE-1 et RHO. Dans un second temps, une fois l’intestin moyen franchi, un système d’atraction/répulsion va intervenir afin de guider la migration des PGC vers le mesoderme. Il a été montré que Wunen (wun) et Wunen-2 (wun-2), deux phosphatases de lipides exprimées par les cellules germinales agissent sur les cellules somatiques en catalysant la déphosphorylation des phospholipides de ces cellules somatiques. Cette action crée un environnement repulsif qui oriente lla migration vers le mésoderme (Jaglarz and Howard, 1995; Santos and Lehmann, 2004). Une autre enzyme appelée HMGCoAr (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase) contribue à la migration des PGC dans le mésoderme (Santos and Lehmann, 2004; Sano et al., 2005). Elle agit à l’inverse de wun et wun-2 en ayant un rôle chimio-attractant.
• Connaissances acquises chez les oiseaux :
Chez le poulet, la formation des PGC ressemble à celle observée chez la drosophile et le poisson zèbre, avec une présence d’un plasma germinal qui contrôle la spécification des PGC, avec l’intervention de deux facteur clés, CVH (chicken vasa homolog) (Nakamura et al., 2007) et cDAZL (Lee et al., 2016). Contrairement aux autres espèces, la migration des PGC après leur spécification est différente car elle circule dans le sang des embryons (Nakamura et al., 2013). Le processus de migration fait intervenir des molécules chimio-attractantes semblables à celles observées chez les mammifères comme le facteur SDF1. Le récepteur de SDF1 ne serait pas CXCR4 mais un autre membre des récepteurs membranaires de la famille des CXCL (CXCL12) . Le couple SDF1/CXCL12 serait impliqué dans la phase finale de la migration lors de la colonisation de la gonade (Stebler et al., 2004).
Figure 4: Schéma représentant la migration des cellules germinales primordiales (PGC) chez le poisson-zèbre. (A) Les PGCs en rouge, migrent lors du développement embryonnaire dans le but de coloniser les futures gonades, sous l’influence de différents facteurs (B) notamment CXCR4b et SDF-1 (adapté de Richardson B & Lehmann R 2010, Kunwar & Lehmann, 2003).
A
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• Connaissances acquises chez les poissons :
Chez les poissons téléostéens, les PGC se forment à partir des blastomères qui récupèrent une partie du cytoplasme de l’ovocyte appelé plasma germinal. Chez le poisson-zèbre, le plasma germinal est donc un déterminant maternel qui est accumulé le long des deux premiers plans de clivage des premières cellules embryonnaires puis il se condense en 4 agrégats qui resteront dans 4 cellules jusqu’au stade 4000 cellules. À partir de ce stade, les 4 cellules ayant hérité d’un agrégat de plasma germinal se dédoublent pour former les premières PGC (Raz, 2003). Le chemin de la migration des PGC a été décrit pendant la gastrulation (Molyneaux and Wylie, 2004). Au stade 8 somites (13 heures de développement), les PGC sont localisées entre le 1er et le 3ème somite et elles colonisent les gonades. Les PGC atteignent leur localisation définitive entre le 8ème et le 10ème somite en moins de 20h (Wedlich, 2006) (Figure 4).
Comme chez la souris, la copie du gène cxcr4a est essentielle à la migration des PGC chez le poissons-zèbre et le médaka (Molyneaux et al., 2003; Sasado et al., 2008). L’autre copie
cxcr4b n’est pas impliquée dans le processus de migration, mais plutôt dans le contrôle de la
direction de la migration (Sasado et al., 2008).
2.1.2. Les gonocytes ou prospermatogonies
Chez la souris, les PGC colonisent les gonades entre E10.5 et E11.5 puis elles deviennent des gonocytes désormais dénommés prospermatogonies dès E12.5. Les prospermatogonies arrêtent rapidement de proliférer de E14.5 jusqu’à 1 à 2 jours après la naissance en restant bloquées au stade G0/G1 du cycle cellulaire. Ensuite, les gonocytes localisés au centre des codons séminifères migrent vers la lame basale et reprennent leur prolifération. Ce processus de reprise de la prolifération des gonocytes est contrôlé par plusieurs facteurs incluant le facteur platelet-derived growth factor (PDGF) et le stéroïde sexuel 17β-estradiol (E2). Les gonocytes expriment le récepteur PDGF de type β de E18 à 5 jours après la naissance et les cellules de Sertoli ses ligands PDGF-B et PDGF-D (Basciani et al., 2008; Thuillier et al., 2010a)). Dans des expériences réalisées in vitro, ces facteurs stimulent la prolifération des gonocytes dans les testicules de rat (Li et al., 1997). Un autre facteur appelé leukimia inhibitor factor (LIF) serait impliqué dans la survie des gonocytes en culture (De Miguel et al., 1996).
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La transition des PGC en prospermatogonies s’accompagne de profondes modifications de marques épigénétiques avec une baisse de la méthylation de l’ADN (5mC et 5hmC) (Hill et al., 2018) .
Ces prospermatogonies seraient les premières cellules souches recrutées pour initier la première vague de la spermatogenèse (Clermont and Perey, 1957; Hasthorpe et al., 1999)
Chez les poissons, il n’y a aucune distinction entre les PGC qui migrent en direction des gonades et celles qui colonisent les gonades.
2.1.3. Les cellules spermatogoniales souches (SSC)
Chez les mammifères, l’émergence de la population de cellules spermatogoniales est due à la différenciation et à la prolifération des prospermatogonies quelques jours après la naissance (Oatley and Brinster, 2006). Présentes dans le testicule en petit nombre (environ 3000 cellules chez la souris) pendant tout le reste de la vie de l’animal, leur principale caractéristique est de pouvoir rester quiescentes, de s’autorenouveler, ou de se différencier ultimement en spermatozoïdes (Hayashi et al., 2014; Lacerda et al., 2014). Elles représentent donc les cellules souches germinales adultes (Oatley et al., 2010).
L’acide rétinoïque serait impliqué dans le processus de différenciation des prospermatogonies en SSC (Manku and Culty, 2015; Zhou et al., 2008).
Localisation des cellules souches
Chez les mammifères, les gonocytes qui étaient accumulés au centre des cordons testiculaires migrent vers la lame basale et se répartissent le long des tubes séminifères qui forment un testicule non restreint. La distribution des cellules souches germinales dans les testicules des animaux adultes est assez similaire chez certaines espèces de poissons qui ont une structure tubulaires non restreinte comme la truite (Loir, 1999a) ou le poisson-zèbre (Leal et al., 2009). Les spermatocystes se projettent de plus en plus vers la lumière des tubes séminifères au fur et à mesure que les cellules germinales en différencient. Lorsque les spermatocystes se rompent, les spermatozoïdes sont libérés dans la lumière des tubes séminifères. Cependant, chez d’autres espèces comme le médaka (Grier, 1976) , le tilapia (Lacerda et al., 2006) ou le poisson rouge (Billard, 1986), la structure des testicules est dite restreinte. Les SSC se concentrent à l’extrémité des tubules séminifères de sorte que les cellules souches germinales se retrouvent en périphérie de la gonade. Au cours de la
Figure 5 Schéma illustrant les différents types de spermatogonies chez le rat (modèle de Clermont et Bustos-Obregon (1968)). Dans ce modèle, deux classes de
cellules souches sont décrites : les spermatogonies de type A0 (cellules souches quiescentes) et les spermatogonies de type A1 à A4 qui sont des cellules souches qui se renouvellent et peuvent se différencier en spermatogonies intermédiaires. Celles-ci donneront des spermatogonies de type B et des spermatocytes. Les chiffres romains, entre parenthèses, indiquent les stades du cycle au cours desquels ces spermatogonies sont présentes(Clermont and Hermo, 1975).
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spermatogenèse, les spermatocystes migrent vers les canaux collecteurs au fur et à mesure que les cellules germinales se différencient (Uribe et al., 2014). La rupture des spermatocystes a lieu au niveau des tubes collecteurs. Chez les poissons cartilagineux comme la roussette, les cellules souches germinales sont restreintes à une zone étroite le long du vaisseaux sanguin
dorsal appelée zone germinative (Loppion et al., 2008). La structure restreinte rappelle la
structure observée chez la drosophile.
2.2. Modèles d’auto-renouvèlement et de différenciation progressive des SCC chez l’adulte
Chez les mammifères, deux modèles de division mitotique ont été proposés pour expliquer la forte amplification du nombre de gamètes produits à partir d’une SSC et le renouvèlement de ces dernières pendant toute la vie de l’individu.
2.2.1. Modèles proposés chez les mammifères
a) Modèle de Clermont et Bustos-Obregon 1968
Dans ce modèle il existe deux classes de cellules souches spermatogoniales, les
spermatogonies A0 décrites comme étant isolées et quiescentes et une autre population qui est
en renouvèlement. Les spermatogonies A1 à A4 forment une boucle d’amplification. Cette
seconde classe de cellules spermatogoniales conserve des capacités d’interconversion qui
rappelle les propriétés des cellules progénitrices. Une spermatogonie A4 peut redonner une
spermatogonie de type A1, mais aussi elles ont la possibilité de se différencier en donnant une
spermatogonie A intermédiaire (Aint) qui se divise pour donner deux cellules
spermatogoniales de type B (Clermont and Bustos‐Obregon, 1968). (Figure 5)
b) Modèle de Huckins et Oakberg chez les mammifères
Dans ce modèle, une cellule souche isolée appelée A single (As) va se diviser par mitose
pour s’auto-renouveler, soit faire une division incomplète qui va conduire à la production de
spermatogonies A paired (Apr) qui restent connectées entre elles par un pont cytoplasmique.
Ces dernières continuent leur division afin de former des chaines de 4, 8 et 16 cellules
nommées spermatogonies A alignées (Aal4-8-16). Une fois arrivées au stade A1, les cellules
sont considérées comment étant engagées de manière définitive dans le processus de différenciation spermatique. Elles progressent dans leur différenciation par divisions
Figure 6 : Modèle de prolifération des spermatogonies de truite arc-en-ciel d’après Loir, 1999. Modèle basé sur les différences morphologiques observées entre les spermatogonies chez la truite. Les A0 représentent les cellules souches spermatogoniales originelles. Les A1possédent un seul nucléole, mais aucune différence morphologique n’est observable entre les A0 et les A1. Les A2 sont des cellules de petite taille avec deux à 3 nucléoles dans le noyau. Par la suite, les A2 s’engagent dans la différenciation et donnent les spermatogonies B. Le nombre entre () représente le nombre de cellules après la division (Loir, 1999).
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mitotiques pour donner des spermatogonies A2, A3, A4 intermédiaires Aint, puis des
spermatogonies B (Figure 2).
Le modèle de Huckins et Oakberg prévaut chez les mammifères même si le manque de
marqueurs moléculaires appropriés et d'outils expérimentaux n’a pas permis de le remettre en doute. Cependant, quelques études contestent ce modèle avec l’argument avancé que l’existence d’un seul type de cellule souche indifférenciée n’explique pas en totalité toutes les observations réalisées. En effet, les observations reposant sur de l’imagerie time lapse d’un sous-ensemble de spermatogonies chez une souris transgénique, indiquent qu’il n’y a pas qu’une seule population de cellules souches homogène, mais plutôt une population hétérogène avec une variation de leur potentiel de cellule souche (Nakagawa et al., 2010).
2.2.2 Modèles proposés chez les poissons
Chez les poissons téléostéens, la classification des différentes populations de spermatogonies A indifférenciées et différenciées reste encore divergente selon les espèces. Plusieurs modèles ont été proposés chez différentes espèces de poissons incluant la truite arc-en-ciel. Le modèle de division des SSC proposé chez la truite arc-en-ciel distingue différentes sous-populations de spermatogonies A indifférenciées qui diffèrent par la taille, le nombre de lobes et la taille du nucléole, et le nombre de cellules dans les cystes. Le modèle décrit une
sous-population de spermatogonies A0 qui sont considérées comme des cellules quiescentes,
mais susceptibles d’être recrutées au début de la saison de reproduction (Loir, 1999a) (Figure 6). Ces cellules de grande taille (environ 15 µm) possèdent une morphologie et des caractéristiques ultra structurales très proches des PGC de poissons avec des mitochondries rondes, une membrane nucléaire invaginée, un noyau avec très peu d’hétérochromatine visible, un nucléole très peu fragmenté presque au centre du noyau, et un grand rapport nucléocytoplasmique (Bellaiche et al., 2014a). Le modèle décrit une deuxième sous
population de spermatogonies A1 avec les mêmes caractéristiques morphologiques et
ultrastructurales, mais de taille légèrement plus petite et parfois observées en paires. Une
sous-population de spermatogonies A2 est observée associée à une spermatogonie A1 dans des
doublets formant un syncytium. Les spermatogonies A2 pourraient se diviser pour former des
spermatogonies filles de type B1 interconnectées par un pont cytoplasmique et prises en
charge dans un cyste délimité par une à deux cellules de Sertoli. Il y aurait ensuite une succession de 5 divisions mitotiques synchrones des spermatogonies B à l’intérieur de chaque
Figure 7 : Schéma général de la différenciation des cellules germinales sein du testicule de poisson zèbre. Trois étapes composent la spermatogenèse: la prolifération et
la différenciation des spermatogonies, les deux divisons de méiose et la spermiogenèse qui aboutit à la formation des spermatozoïdes. Les cellules sont ordonnées en fonction de leurs apparitions et classées entre elles selon des critères morphologiques, Aund* : spermatogonie de type A indifférenciée (considérées comme les cellules souches originelles, Aund : spermatogonie de type A indifférenciée, Adiff : spermatogonie de type A différenciée, B: spermatogonie de type B (Schulz et al., 2010).
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cyste qui génèrent des spermatogonies de type B2, B3, B4, B5 et B6 de tailles décroissantes,
avec un noyau contenant une quantité plus importante d’hétérochromatine.
Un autre modèle a été proposé chez le poisson-zèbre pour classer les différentes populations de spermatogonies. La classification des spermatogonies repose notamment sur des caractéristiques morphologiques, telles que la forme du noyau, la quantité d'hétérochromatine, les caractéristiques nucléolaires et le nombre de cellules germinales dans un cyste. Ce modèle distingue quatre populations majeures de spermatogonies indifférenciées de type A. Une première sous-population de spermatogonies indifférenciées de type A (Aund*) montrerait des contours irréguliers de l'enveloppe nucléaire et un rapport élevé entre le cytoplasme et le noyau. Il existerait une deuxième sous-population de spermatogonies de type A indifférenciées (Aund), avec un contour lisse de l'enveloppe nucléaire et un faible rapport entre le cytoplasme et le noyau. Ces populations seraient à l’origine de deux générations successives de spermatogonies différenciées de type A et de 5 générations de spermatogonies de type B (Leal et al., 2009a) (Figure 7).
Un troisième modèle a été proposé chez un poisson cartilagineux, la roussette (Scyliorhinus canicula) en se basant sur le modèle de Huckins et Oakberg (Figure 8). La classification des sous-populations de spermatogonies a été réalisée selon le nombre de divisions mitotiques dans les lobules qui progressent le long des tubes séminifères. Les spermatogonies indifférenciées sont présentes des stades I à IIc. Elles incluent des
spermatogonies As (single) qui sont isolées et qui, lorsqu’elles se divisent, forment des
doublets cellulaires de spermatogonies Ap (Paired). Les spermatogonies Ap se divisent pour
former différentes sous-populations de progéniteurs appelés spermatogonies Au
(undifferenciated), qui dans cette espèce peuvent aller de Au4 à Au512. Elles correspondraient
aux spermatogonies Aal des rongeurs. Une fois les cystes formés au stade IIIa, les
spermatogonies sont appelées spermatogonies de type A en différenciation (differentiated) et
elles sont subdivisées en spermatogonies Ad1, Ad2, Ad4 et Ad8. Ces cellules sont présentes des
stades IIIa à V (Bosseboeuf et al., 2014). Au stade VI, la division des spermatogonies Ad8
génère des spermatocytes primaires au stade préleptotène de la prophase I de la méiose. En résumé, en l‘état de nos connaissances, les modalités de la différenciation des SCC semblent assez différentes entre les mammifères et les poissons téléostéens. Par contre, ces
Figure 8 Modèle de prolifération des spermatogonies chez la roussette. Modèle basé sur celui de Huckins et Oakberg. Les spermatogonies entre le stade I et IIc sont appelées spermatogonies A indifférenciées et sont subdivisées en : As(single), Ap (Paired) et Au (Au4 à Au512). Du stade IIIA à V, on retrouve les spermatogonies A en différenciation et elles sont subdivisées en Ad1, Ad2, Ad4et Ad8. PL: spermatocytes
préléptotene et SPCI: Spermatocytes. Adapté de Bosseboeuf et al., 2014.
Figure 9 : Modèle de division symétrique et asymétrique décrite dans la littérature retrouvée chez différentes espèces.
Deux modes de division peuvent caractériser une cellule souche. 1- une division symétrique qui aboutit à la production de deux cellules filles identiques, qui soit s’engagent dans un processus de différenciation soit restent indifférenciées et assurent l’autorenouvellement, 2- une division asymétrique qui permet de produire deux cellules filles différentes, l’une restant indifférenciée et permettant l’autorenouvellement et l’autre s’engageant dans un processus de différenciation.
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modalités apparaissent assez proches entre les poissons cartilagineux et les mammifères en accord avec la relation d’orthologie de ces deux espèces.
2.3. Mode de division des cellules souches germinales 2.3.1. Division symétrique
La division symétrique des cellules souches germinales adultes représente le mode de division privilégié chez les mammifères, que ce soit pour les PGC chez les embryons, les prospermatogonies chez les nouveau-nés, ou les SSC à l’âge adulte. Dans ce mode de division, la division mitotique d’une cellule mère génère deux cellules filles identiques entre-elles. Ce mode de division permet de multiplier de manière exponentielle le stock de cellules spermatogoniales souches. Cependant, la division mitotique de la cellule spermatogoniale souche peut aussi aboutir à la formation de deux cellules identiques mais plus différenciées que la cellule mère. Ces mitoses symétriques permettent l’apparition rapide d’une nouvelle population de spermatogonies. Les mécanismes impliqués dans le choix entre ces deux types de division symétrique restent mal compris chez les mammifères. Chez la drosophile (Drosophila melanogaster), la perte de contact cellulaire avec la région du Hub pourrait induire une division symétrique aboutissant à la formation de deux progéniteurs à partir d’une cellule spermatogoniale souche. Ce modèle d’entrée en différenciation peut être perçu comme un processus stochastique du plan de division (Salzmann et al., 2014; Sheng and Matunis,
2011) (Figure 9) .
L’importance du mode de division symétrique des cellules souches spermatogoniales à l’âge adulte pourrait être surestimée en raison des modèles expérimentaux utilisés chez les mammifères basés sur la déplétion des cellules spermatogoniales non souches par un composé chimique antimitotique comme le busulfan ou par une irradiation. Ces modèles expérimentaux pourraient être plus proches d’un processus de régénération cellulaire qu’un processus de maintien de l’homéostasie cellulaire.
Les modèles de renouvèlement des SSC proposés chez le poisson-zèbre (Leal et al., 2009)
(Leal et al) et le tilapia (Lacerda et al., 2013) favorisent la division symétrique mais pas celui proposé chez la truite (Loir, 1999).
15 2.3.2. Division asymétrique :
Il a été proposé que le mode de division symétrique vient compléter un autre mode de division dit « asymétrique » et c’est la complémentarité des deux modes qui permettrait d’assurer l’homéostasie du stock de cellules souches germinales au sein de la gonade adulte
(Nakagawa et al., 2007; De Rooij and Russell, 2000b).
Une division cellulaire asymétrique est définie comme une division qui donne lieu à deux cellules filles qui se distinguent par différentes caractéristiques morphologiques ou destinées fonctionnelles. Cette division asymétrique est bien documentée dans le cas de la spermatogenèse chez la drosophile (Shahriyari and Komarova, 2013). Les cellules souches spermatogoniales en contact avec le Hub initient une division mitotique avec un plan de division perpendiculaire de sorte que l’une des cellules filles perd contact avec les cellules du Hub. Cette cellule qui devient aussi plus distante du Hub se différencie progressivement. Les molécules d’adhésion cellulaire qui unissent la cellule spermatogoniale souche aux cellules somatiques du Hub pourraient fournir des indications de polarité destinées à maintenir l’orientation du fuseau mitotique perpendiculaire au plan d’interaction entre les cellules souches spermatogoniales et les cellules somatiques du Hub.
2.4. La niche germinale chez l’adulte
Les cellules spermatogoniales souches adultes sont des cellules indifférenciées ayant la double capacité de s'auto-renouveler et de se différencier en cellules matures fonctionnelles. Cependant, elles ne sont pas autonomes. Elles ont besoin d’être en relation avec les cellules somatiques environnantes qui forment une « niche germinale ». Cette niche assure un ancrage cellulaire et un microenvironnement approprié à la survie et à leur fonction (De Rooij, 2006; Oatley and Brinster, 2008; De Rooij, 2009a; De Siqueira-Silva et al., 2018).
Le concept de niche de cellules souches n’est pas réservé aux cellules souches germinales et il a été proposé pour la première fois pour la régulation de la fonction des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse (Schofield, 1978). Plusieurs études ont démontré par la suite, l’existence d’une niche spécifique pour chaque tissu ou organe tel que le cerveau (Conover and Notti, 2008), l’intestin (Tan and Barker, 2014) et l’ovaire (De Cuevas and Matunis, 2011; Decotto and Spradling, 2005).
Figure10 : La niche germinale chez la drosophile.
Schéma de la partie antérieure du testicule composée des cellules du HUB (bleu), des SSC (vertes) en contact du HUB, les spermatogonies (jaunes), les cellules du cyste (gris foncé). Adapté de (de Cuevas & Matunis, 2011).
Figure 11 :La niche germinale chez la souris.
Les cellules de Sertoli soutiennent différents types cellulaires de la spermatogenèse. Les spermatogonies indifférenciées (SSC) sont en contact direct avec la lame basale, recevant les signaux moléculaires des cellules environnantes comme les cellules péritubulaires, les cellules de Leydig ou des vaisseaux sanguins, au niveau apical (Caires et al., 2010).
16 2.4.1. La niche germinale chez la drosophile
Chez la drosophile, la niche germinale se trouve dans le tissu conjonctif à l'extrémité apical du testicule (Marthiens et al., 2010). Les cellules non mitotiques du stroma forment un HUB qui permet l’ancrage des cellules spermatogoniales souches et somatiques de type épithélial. Les cellules du HUB régulent leur division et leur différenciation (de Cuevas and Matunis, 2011; Decotto and Spradling, 2005) (Figure 10).
2.4.2. La niche germinale chez les mammifères
Chez certains mammifères, les SSC seraient localisées dans les régions des tubes séminifères qui sont adjacentes au compartiment interstitiel, et plus précisément à proximité de vaisseaux sanguins (Chiarini-Garcia et al., 2001; Yoshida et al., 2007a). La proximité entre la niche germinale et l’espace interstitiel pourrait permettre un apport vasculaire en oxygène, en nutriments, mais aussi en hormones, telles que la Fsh ou les stéroïdes sexuels. Ces apports pourraient influencer les cellules somatiques de la niche germinale qui incluent les cellules de Sertoli et des cellules péritubulaires. (De Rooij, 2009b; Yoshida et al., 2007b) (Figure 11).
a) Les cellules de Sertoli :
Les cellules de Sertoli jouent un rôle central dans le développement et le fonctionnement d'un testicule. Des études de traçage cellulaire ont révélé que certaines cellules de la lignée des Sertoli provenaient de l'épithélium cœlomique recouvrant les crêtes génitales (Karl and Capel, 1998). Il existe deux choix sur le mode de migration des Sertoli dans les gonades : migration active ou par ingestion passive, mais aucune de ces hypothèses prévaut à l’heure actuelle. Après avoir colonisé la gonade, le déterminant majeur du sexe Sry est exprimé dans les crêtes génitales (Svingen and Koopman, 2013). Le produit du gène sry active l’expression du gène sox9 dans les pré-Sertoli et va induire leur différenciation en Sertoli matures (Wilhelm et al., 2009). Les cellules de Sertoli composent 75% du testicule avant la puberté (Bouvattier, 2014). À ce jour, quelles que soient les espèces de mammifères étudiées, aucune
prolifération de cellules de Sertoli n’a été observée après la puberté. De ce fait, le nombre de
cellules de Sertoli reste constant pendant la vie des adultes (França et al., 2000; Russell et al., 1989). Il est déjà bien établi dans la littérature que le nombre de cellules de Sertoli par
17 b) Les cellules péritubulaires :
Les cellules péritubulaires possèdent des caractéristiques morphologiques myo-épithéliales. Ces cellules ont une double identité, à la fois fibroblastes capables de sécréter de nombreux composants de la lame basale, et cellules myoïdes, capables d’activité contractile. Chez l’embryon et de manière concomitante avec la différenciation épithéliale des cellules de Sertoli, des cellules péritubulaires immatures se différencient à partir de cellules mésenchymateuses progénitrices (Bustos‐Obregon, 1976; Leeson and Forman, 1981; Dym, 1994b). Chez les souriceaux, ces cellules péritubulaires immatures vont exprimer des faisceaux de filaments dès 8 jours après leur naissance et ces derniers permettent l’allongement définitif de ces cellules autour des tubes séminifères vers l’âge de 22 jours. La maturation des cellules péritubulaires est régulée indirectement par les hormones hypophysaires. Les androgènes relayent en partie l’action de ces hormones hypophysaires, mais la contribution de facteurs provenant de l’épithélium séminifère est probable (Bressler and Ross, 1972). Comme les cellules de Sertoli, les cellules péritubulaires sécrètent de nombreux composants de la lame basale (collagènes type 1 et type IV, laminine, fibronectine et protéoglycanes de haut poids moléculaire riches en chondroïtine). La coculture des cellules péritubulaires et des cellules de Sertoli entraine la formation de structures de type tubulaires. Les cellules péritubulaires agissent sur la polarité des cellules de Sertoli et potentialisent l’action des androgènes sur ces dernières (pour revue Verhoeven and Hoeben, 1995). Les cellules péritubulaires étant à l’interface des compartiments tubulaires et interstitiels, il est probable qu’elles interagissent avec les cellules endothéliales et les cellules de Leydig qui produisent des androgènes et des facteurs de croissance (Oatley et al., 2009). Des travaux montrent également que les cellules péritubulaires interagissent directement avec les SSC en sécrétant des facteurs paracrines qui agissent sur ces SSC (voir exemple d’interaction paracrine ci-dessous).
2.4.3. La niche germinale chez les poissons
Chez les poissons, la niche germinale est composée de cellules somatiques similaires aux cellules de Sertoli et aux cellules péritubulaires de type myoïdes décrites précédemment chez les mammifères. Les cellules de Sertoli sont responsables de fournir un ancrage aux SSC et elles expriment des facteurs sécrétés qui régulent leur survie et leur devenir au cours de la
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spermatogenèse (Nóbrega et al., 2010). Les cellules de Sertoli sont responsables de l'intégration des signaux endocriniens (Nóbrega et al., 2015).
Au début de la spermatogenèse, les SSC sont en contact permanent avec une cellule de Sertoli. Lorsque les SSC se divisent, les cellules filles restent interconnectées entre elles par un pont cytoplasmique formé par cytocinèse incomplète (Schulz et al., 2010b). Chaque cellule de ces doublets reste cependant en contact avec une cellule de Sertoli. Contrairement aux mammifères, il a été montré que les cellules de Sertoli continuent à proliférer chez l’adulte (Vilela et al., 2004). Il a été suggéré que les cellules de Sertoli au contact des SSC ne sont pas complètement différenciées et qu'elles entrent dans un nouveau cycle cellulaire mitotique à chaque recrutement de ces cellules spermatogoniales souches. Chez le tilapia, les SSC sont localisées à la périphérie des testicules, juste en dessous de l’albuginée. Une étude a démontré que les cellules de Sertoli situées dans la zone proche de la tunica albuginea, sont plus immatures et ont la capacité de proliférer (Schulz et al., 2005a). Chez les poissons, les cellules de Sertoli ne sont en contact qu'avec un seul type de cellules germinales tout au long de l'évolution du processus spermatogénétique (Nóbrega et al., 2009; Schulz et al., 2010b).
Chez les poissons téléostéens, le tissu interstitiel occupe un espace très étroit entre 3 ou 4 tubes séminifères. Sa composition cellulaire et son évolution au cours du premier cycle de reproduction ont été bien décrites chez la truite (Cauty and Loir, 1995). Le tissu interstitiel reste peu développé avant la fin du premier cycle de reproduction chez cette espèce saisonnière. Sa surface augmente surtout un peu avant l’émission des gamètes au stade VIII (spermiation). Deux types de cellules présentant des caractéristiques de myofibroblastes peuvent être observés (types M et R). Les cellules myoïdes de type M présentent une ultrastructure similaire à celle observée chez les mammifères et d’autres poissons téléostéens (Grier et al., 1980), comme le brochet (Grier et al., 1989), la carpe commune (Timmermans et al., 1992). Elles sont présentes autour des tubes séminifères, quels que soient les stades de maturation gonadique de l’animal. Les myofibroblastes de type R apparaissent tardivement à la fin du cycle de reproduction et leur adhésion à la lame basale est plus lâche. Ils pourraient correspondre à des myofibroblastes en dégénérescence. Il a été proposé que les cellules myoïdes de type M sont issues de la maturation de fibroblastes de type N qui sont présents au début du premier cycle de reproduction et pendant la régénération des gonades qui précède le deuxième cycle de reproduction. Chez les poissons, les données bibliographiques s’accordent
