Th`ese pr´esent´ee en vue de l’obtention du grade acad´emique de Docteur en Sciences de l’Ing´enieur et Technologie

UNIVERSITÉ LIBREDEBRUXELLES

M´ethodes de microscopie par holographie num´erique interf´erentielle en couleurs

avec un ´eclairage partiellement coh´erent

Th`ese pr´esent´ee en vue de l’obtention du grade acad´emique de Docteur en Sciences de l’Ing´enieur et Technologie

J´ erˆ ome Dohet-Eraly

Promoteur

Professeur Frank Dubois Service

Chimie physique – Microgravity Research Centre

Ann´ee acad´emique

2016 – 2017

Remerciements

Avant tout pour la confiance dont il m’honore et qu’il me témoigne depuis le début de notre collaboration, pour son immense bienveillance à mon égard, pour le temps consacré tout au long de mon doctorat — jusqu’à la relecture de la présente thèse —, pour son écoute attentive et également son amitié, je tiens à exprimer ma gratitude envers mon promoteur, Monsieur le Professeur Frank Dubois. Mille fois merci !

Je désire également adresser de sincères remerciements à Madame le Docteur Catherine Yourassowsky qui aura su, je l’espère, me transmettre un peu de sa formidable rigueur scientifique. Merci également pour sa gentillesse et son amitié.

Mes remerciements vont également à Monsieur le Docteur Ahmed El Mal- lahi, pour son agréable collaboration durant les deux premières années de mon doctorat.

Je voudrais aussi remercier mes collègues et amis du service 4MAT pour leur accueil chaleureux tous les midis et leurs invitations aux diverses activités qu’ils organisent.

Par ailleurs, la présente thèse de doctorat a bénéficié du soutien financier du Fonds pour la Formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agri- culture (F.R.I.A.) lors de la première année, dans le cadre d’une bourse du F.R.I.A., et du Fonds de la Recherche Scientifique – FNRS (F.R.S.-FNRS), dans le cadre d’un mandat d’aspirant du F.R.S.-FNRS, ensuite. Que ces deux organismes, qui m’ont permis d’exercer et de développer ma passion pour la recherche, trouvent ici l’expression de ma plus sincère gratitude. Je souhaite également remercier l’Université libre de Bruxelles, et en particulier l’École polytechnique de Bruxelles, pour m’avoir permis d’accomplir mon doctorat en leur sein. J’adresse en outre mes remerciements au personnel du F.R.S.-FNRS ainsi qu’à celui de l’Université libre de Bruxelles pour leur grande disponibilité.

Enfin, j’exprime ma plus profonde gratitude à mes parents, ainsi qu’à l’en-

semble de ma famille, pour m’avoir toujours entouré et soutenu.

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Résumé

La présente thèse traite de méthodes en microscopie holographique numé- rique (MHN) en couleurs, avec un éclairage de cohérence spatiale partielle. Le principal inconvénient de la microscopie optique classique est sa faible pro- fondeur de champ, rendant difficile l’observation de phénomènes dynamiques dans des échantillons épais. Au contraire, la MHN offre une reconstruction en profondeur grâce à la propagation numérique de l’hologramme. La MHN interférométrique donne aussi le contraste quantitatif de la phase, utile pour analyser des objets transparents. Un éclairage à plusieurs longueurs d’onde dans une configuration appropriée permet la MHN en couleurs. L’imagerie en flux et en couleurs de particules en MHN est ici développée, avec une méthode pour la correction automatique de la balance des couleurs et des défauts per- manents. Elle est appliquée pour l’analyse du plancton dans des échantillons d’eau de surface et fournit des images de haute qualité pour les intensité et phase optiques. En outre, la réduction du bruit obtenue en diminuant la cohé- rence spatiale de l’éclairage en MHN est également étudiée, avec deux modèles évaluant quantitativement ce phénomène en fonction de la cohérence spatiale de la lumière et de la distance entre la source de bruit et le plan d’enregis- trement. De plus, la MHN différentielle est aussi abordée. Celle-ci fournit les phases différentielles, la phase étant calculée par intégration. Cependant, les défauts présents conduisent à des aberrations lors du calcul de la phase, qui affectent sa qualité et empêchent la reconstruction holographique. Un trai- tement spécifique est développé, permettant la reconstruction numérique en profondeur. Enfin, en MHN, un critère est essentiel pour déterminer automa- tiquement la distance de netteté de l’objet. Deux critères de netteté sont ici mis au point, fonctionnant indépendamment de la nature de l’objet observé (amplitude, phase ou mixte). L’un, monochromatique, est basé sur l’analyse de l’amplitude et sur un filtrage passe-haut ; l’autre, qui détecte rapidement le plan de netteté en MHN en couleurs, compare la phase dans le domaine de Fourier entre les couleurs. Les méthodes développées dans la thèse montrent le potentiel élevé de la MHN en couleurs avec un éclairage partiellement cohérent spatialement, suggérant un avenir prometteur pour cette technique.

Mots-clefs Microscopie, holographie numérique, holographie en couleurs, in-

terférométrie, optique de Fourier, traitement d’images, cohérence spatiale par-

tielle, imagerie en flux, interférences différentielles, remise au net automatique.

iv

Abstract

The thesis deals with methods and developments in color digital hologra- phic microscopy (DHM), with a partial spatial coherence illumination. The principal drawback of classical optical microscopy is its poor depth of field, which makes difficult the observation of dynamic phenomena in thick samples.

On the contrary, DHM provides reconstruction in depth thanks to numeric pro- pagation of the recorded hologram. Another feature of interferometric DHM is the quantitative phase contrast imaging, useful for analyzing transparent objects. Usual DHM is limited to monochromatic case, but multispectral illu- mination in an appropriate setup leads to color DHM. Color in-flow imaging of particles in DHM is developed in the thesis, with a method for the automa- tic correction of color balance and permanent defects. It is applied to analyze plankton microorganisms in untreated pond water samples, and provides high quality images, for both optical phase and intensity. Moreover, noise reduction obtained when decreasing the spatial coherence of the illumination in DHM is also investigated in the thesis, with the development of two models that quan- titatively assess the noise reduction as a function of both the spatial coherence of the illumination, and the defocus distance of the noise source. Furthermore, differential DHM (DDHM) is also studied in the thesis. As DHM gives the optical phase, DDHM provides differential phases, from which phase is retrie- ved by integration. However, misalignments and defects give some aberrations, which affect phase quality and hinder refocusing. A specific hologram proces- sing is developed, giving an accurate phase image and enabling holographic reconstruction in depth. Finally, in DHM, a criterion is essential to automa- tically achieve the refocusing distance of the object. Two refocusing criteria are developed in the thesis, both working independently of the nature of the observed object (amplitude, phase, or both mixed). The first one, monochro- matic, is based on amplitude analysis and on a high-pass filtering process. The second one, which gives fast refocusing in multispectral DHM, compares the phase in the Fourier domain among wavelengths. Methods developed in the thesis show the high potential of color DHM with a partial spatial coherence illumination, suggesting a promising future for this technique.

Keywords Microscopy, Digital holography, Color holography, Interferome-

tric imaging, Fourier optics, Digital image processing, Partial spatial coherence,

In-flow imaging, Differential interferometry, Automatic refocusing.

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Table des matières

Introduction 1

1 Principes de la microscopie par holographie numérique 5

1.1 Optique de Fourier . . . 5

1.1.1 Description du champ optique . . . 5

1.1.2 Propagation en espace libre . . . 7

1.1.3 Transmission au travers d’un objet . . . 8

1.1.4 Interférences lumineuses . . . 8

1.1.5 Cohérences temporelle et spatiale . . . 10

1.2 Holographie numérique . . . 11

1.2.1 Holographie numérique en ligne . . . 11

1.2.2 Holographie numérique par interférométrie . . . 12

1.2.3 Holographie numérique par interférométrie différentielle . 18 1.2.4 Autres méthodes d’imagerie à contraste de phase . . . . 19

1.2.5 Techniques dérivées . . . 23

1.2.6 Applications . . . 25

1.3 Holographie en couleurs . . . 26

1.3.1 Principe et méthodes . . . 26

1.3.2 Avantages de la polychromie . . . 28

1.3.3 Applications . . . 28

1.4 Traitements numériques des hologrammes . . . 29

1.4.1 Reconstruction holographique . . . 29

1.4.2 Déroulage de la phase . . . 30

2 Étude du bruit en éclairage de cohérence spatiale partielle 33 2.1 De la réduction du bruit cohérent en holographie . . . 33

2.1.1 Bruit cohérent en holographie . . . 33

2.1.2 Imagerie en milieu diffusant . . . 36

2.2 Développements théoriques . . . 37

2.2.1 Éclairage de cohérence spatiale partielle en interférométrie 37 2.2.2 Modèle discret pour l’évaluation de la réduction du bruit 42 2.2.3 Modèle continu pour l’évaluation de la réduction du bruit 44 2.3 Validation expérimentale . . . 47

2.3.1 Dispositif optique et méthode . . . 48

2.3.2 Variation de la cohérence spatiale de la lumière . . . 50

2.3.3 Variation de la distance à la source de bruit . . . 51

2.3.4 Illustration de la réduction du bruit avec un échantillon . 53 2.4 Conclusion du chapitre . . . 54

3 Microscopie holographique numérique en flux et en couleurs 55 3.1 De l’imagerie en flux en microscopie optique . . . 56

3.1.1 Augmentation de la profondeur de champ . . . 56

3.1.2 Imagerie en flux . . . 57

3.2 Dispositif expérimental et méthode . . . 59

3.2.1 Dispositif pour l’imagerie en flux et en couleurs . . . 59

3.2.2 Méthode de correction des défauts permanents . . . 61

3.3 Résultats expérimentaux . . . 65

3.3.1 Correction des défauts et aberrations . . . 65

3.3.2 Images de micro-organismes du plancton . . . 67

3.4 Conclusion du chapitre . . . 67

4 Microscopie par holographie numérique différentielle 71 4.1 Principe . . . 72

4.1.1 Formation de l’hologramme . . . 72

4.1.2 Extraction des données brutes . . . 73

4.1.3 Dispositif à un bras . . . 75

4.2 Étalonnage du microscope et correction des données brutes . . . 76

4.2.1 Hologramme de référence . . . 76

4.2.2 Déroulage et correction des phases différentielles . . . 77

4.2.3 Étalonnage d’après une grille . . . 77

4.3 Calcul de l’amplitude complexe du champ issu de l’objet . . . . 80

4.3.1 Détermination de l’intensité lumineuse . . . 80

4.3.2 Détermination de la phase optique . . . 80

4.4 Résultats expérimentaux . . . 81

4.4.1 Dispositif expérimental . . . 81

4.4.2 Reconstruction holographique en profondeur . . . 81

4.5 Conclusion du chapitre . . . 82

5 Remise au net automatique en holographie numérique 85 5.1 De la remise au net en holographie numérique . . . 85

5.1.1 Cas des hologrammes monochromes . . . 86

5.1.2 Cas des hologrammes polychromes . . . 88

5.1.3 Méthodes rapides . . . 89

5.2 Critères de netteté basés sur l’intégrale du module . . . 90

5.2.1 Critère originel . . . 90

5.2.2 Critère adapté à tout type d’objet . . . 92

5.2.3 Critère adapté aux hologrammes polychromes . . . 98

5.3 Critère basé sur la phase dans le domaine de Fourier . . . 99

5.3.1 Principe . . . 99

5.3.2 Développement du critère . . . 100

viii

5.3.3 Validation par simulations numériques . . . 103 5.3.4 Validation expérimentale . . . 107 5.4 Conclusion du chapitre . . . 112

Conclusion 113

Bibliographie 117

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Table des figures

1.1 Principe de l’holographie numérique en ligne . . . 12 1.2 Interféromètres de Mach–Zehnder et de Michelson . . . 13 1.3 Illustration de la méthode de Fourier . . . 15 1.4 Intérêt du réseau de diffraction pour dévier le faisceau de réfé-

rence en faible cohérence temporelle . . . 16 2.1 Interféromètre de Mach–Zehnder . . . 38 2.2 Schéma simplifié de l’interféromètre de Mach–Zehnder . . . 38 2.3 Représentation graphique du modèle continu développé pour

évaluer la réduction du bruit en éclairage partiellement cohérent spatialement . . . 46 2.4 Dispositif optique utilisé pour la validation expérimentale des

modèles développés pour évaluer la réduction du bruit en éclai- rage partiellement cohérent spatialement . . . 48 2.5 Image focalisée de la lame génératrice de bruit utilisée pour les

expériences . . . 49 2.6 Évolution de l’écart-type relatif en fonction de l’inverse du dia-

mètre de la pupille régissant la cohérence spatiale . . . 51 2.7 Évolution de l’écart-type relatif en fonction de l’inverse de la

distance entre la plaque génératrice de bruit et le plan d’enre- gistrement . . . 52 2.8 Illustration avec un échantillon de la réduction du bruit obtenue

en diminuant la cohérence spatiale en microscopie par hologra- phie numérique . . . 54 3.1 Microscope holographique numérique interférométrique pour l’ima-

gerie en flux et en couleurs . . . 60 3.2 Illustration de l’efficacité de la méthode pour la correction de la

balance des couleurs et des défauts permanents . . . 66 3.3 Illustration de l’efficacité de la méthode pour la correction d’une

balance des couleurs fort déséquilibrée . . . 67 3.4 Images de micro-organismes du plancton remises au net après

correction . . . 68 3.5 Images d’un objet approximativement plan non perpendiculaire

à l’axe optique . . . 69

4.1 Transformée de Fourier d’un hologramme obtenu en microscopie par holographie numérique différentielle à trois faisceaux . . . . 74 4.2 Décalage latéral entre les ordres de diffraction lorsque le réseau

est légèrement hors focus . . . 75 4.3 Images de la grille utilisée pour l’étalonnage du microscope ho-

lographique numérique différentiel . . . 79 4.4 Microscope holographique numérique interférométrique différen-

tiel à un bras pour l’imagerie en couleurs . . . 82 4.5 Reconstruction numérique en profondeur en microscopie holo-

graphique numérique en couleurs par interférométrie différen- tielle à un bras . . . 83 5.1 Validation expérimentale du critère de netteté M

avec l’image

d’un micro-organisme . . . 96 5.2 Validation du critère de netteté M

avec un objet opaque si-

mulé numériquement . . . 97 5.3 Validation du critère de netteté J

avec un objet opaque simulé

numériquement . . . 104 5.4 Validation du critère de netteté J

avec un objet de phase pure

simulé numériquement . . . 105 5.5 Validation du critère de netteté J

avec un objet de nature mixte

simulé numériquement . . . 106 5.6 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un premier micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 108 5.7 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un deuxième micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 109 5.8 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un troisième micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 110 5.9 Illustration de l’efficacité du critère J

avec d’autres cellules du

plancton provenant de l’eau d’un étang . . . 111

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