Th`ese pr´esent´ee en vue de l’obtention du grade acad´emique de Docteur en Sciences de l’Ing´enieur et Technologie

UNIVERSITÉ LIBREDEBRUXELLES

M´ethodes de microscopie par holographie num´erique interf´erentielle en couleurs

avec un ´eclairage partiellement coh´erent

Th`ese pr´esent´ee en vue de l’obtention du grade acad´emique de Docteur en Sciences de l’Ing´enieur et Technologie

J´ erˆ ome Dohet-Eraly

Promoteur

Professeur Frank Dubois

Remerciements

Avant tout pour la confiance dont il m’honore et qu’il me témoigne depuis le début de notre collaboration, pour son immense bienveillance à mon égard, pour le temps consacré tout au long de mon doctorat — jusqu’à la relecture de la présente thèse —, pour son écoute attentive et également son amitié, je tiens à exprimer ma gratitude envers mon promoteur, Monsieur le Professeur Frank Dubois. Mille fois merci !

Je désire également adresser de sincères remerciements à Madame le Docteur Catherine Yourassowsky qui aura su, je l’espère, me transmettre un peu de sa formidable rigueur scientifique. Merci également pour sa gentillesse et son amitié.

Mes remerciements vont également à Monsieur le Docteur Ahmed El Mal- lahi, pour son agréable collaboration durant les deux premières années de mon doctorat.

Je voudrais aussi remercier mes collègues et amis du service 4MAT pour leur accueil chaleureux tous les midis et leurs invitations aux diverses activités qu’ils organisent.

Par ailleurs, la présente thèse de doctorat a bénéficié du soutien financier du Fonds pour la Formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agri- culture (F.R.I.A.) lors de la première année, dans le cadre d’une bourse du F.R.I.A., et du Fonds de la Recherche Scientifique – FNRS (F.R.S.-FNRS), dans le cadre d’un mandat d’aspirant du F.R.S.-FNRS, ensuite. Que ces deux organismes, qui m’ont permis d’exercer et de développer ma passion pour la recherche, trouvent ici l’expression de ma plus sincère gratitude. Je souhaite également remercier l’Université libre de Bruxelles, et en particulier l’École polytechnique de Bruxelles, pour m’avoir permis d’accomplir mon doctorat en leur sein. J’adresse en outre mes remerciements au personnel du F.R.S.-FNRS ainsi qu’à celui de l’Université libre de Bruxelles pour leur grande disponibilité.

Enfin, j’exprime ma plus profonde gratitude à mes parents, ainsi qu’à l’en-

semble de ma famille, pour m’avoir toujours entouré et soutenu.

Résumé

La présente thèse traite de méthodes en microscopie holographique numé- rique (MHN) en couleurs, avec un éclairage de cohérence spatiale partielle. Le principal inconvénient de la microscopie optique classique est sa faible pro- fondeur de champ, rendant difficile l’observation de phénomènes dynamiques dans des échantillons épais. Au contraire, la MHN offre une reconstruction en profondeur grâce à la propagation numérique de l’hologramme. La MHN interférométrique donne aussi le contraste quantitatif de la phase, utile pour analyser des objets transparents. Un éclairage à plusieurs longueurs d’onde dans une configuration appropriée permet la MHN en couleurs. L’imagerie en flux et en couleurs de particules en MHN est ici développée, avec une méthode pour la correction automatique de la balance des couleurs et des défauts per- manents. Elle est appliquée pour l’analyse du plancton dans des échantillons d’eau de surface et fournit des images de haute qualité pour les intensité et phase optiques. En outre, la réduction du bruit obtenue en diminuant la cohé- rence spatiale de l’éclairage en MHN est également étudiée, avec deux modèles évaluant quantitativement ce phénomène en fonction de la cohérence spatiale de la lumière et de la distance entre la source de bruit et le plan d’enregis- trement. De plus, la MHN différentielle est aussi abordée. Celle-ci fournit les phases différentielles, la phase étant calculée par intégration. Cependant, les défauts présents conduisent à des aberrations lors du calcul de la phase, qui affectent sa qualité et empêchent la reconstruction holographique. Un trai- tement spécifique est développé, permettant la reconstruction numérique en profondeur. Enfin, en MHN, un critère est essentiel pour déterminer automa- tiquement la distance de netteté de l’objet. Deux critères de netteté sont ici mis au point, fonctionnant indépendamment de la nature de l’objet observé (amplitude, phase ou mixte). L’un, monochromatique, est basé sur l’analyse de l’amplitude et sur un filtrage passe-haut ; l’autre, qui détecte rapidement le plan de netteté en MHN en couleurs, compare la phase dans le domaine de Fourier entre les couleurs. Les méthodes développées dans la thèse montrent le potentiel élevé de la MHN en couleurs avec un éclairage partiellement cohérent spatialement, suggérant un avenir prometteur pour cette technique.

Mots-clefs Microscopie, holographie numérique, holographie en couleurs, in-

terférométrie, optique de Fourier, traitement d’images, cohérence spatiale par-

tielle, imagerie en flux, interférences différentielles, remise au net automatique.

Abstract

The thesis deals with methods and developments in color digital hologra- phic microscopy (DHM), with a partial spatial coherence illumination. The principal drawback of classical optical microscopy is its poor depth of field, which makes difficult the observation of dynamic phenomena in thick samples.

On the contrary, DHM provides reconstruction in depth thanks to numeric pro- pagation of the recorded hologram. Another feature of interferometric DHM is the quantitative phase contrast imaging, useful for analyzing transparent objects. Usual DHM is limited to monochromatic case, but multispectral illu- mination in an appropriate setup leads to color DHM. Color in-flow imaging of particles in DHM is developed in the thesis, with a method for the automa- tic correction of color balance and permanent defects. It is applied to analyze plankton microorganisms in untreated pond water samples, and provides high quality images, for both optical phase and intensity. Moreover, noise reduction obtained when decreasing the spatial coherence of the illumination in DHM is also investigated in the thesis, with the development of two models that quan- titatively assess the noise reduction as a function of both the spatial coherence of the illumination, and the defocus distance of the noise source. Furthermore, differential DHM (DDHM) is also studied in the thesis. As DHM gives the optical phase, DDHM provides differential phases, from which phase is retrie- ved by integration. However, misalignments and defects give some aberrations, which affect phase quality and hinder refocusing. A specific hologram proces- sing is developed, giving an accurate phase image and enabling holographic reconstruction in depth. Finally, in DHM, a criterion is essential to automa- tically achieve the refocusing distance of the object. Two refocusing criteria are developed in the thesis, both working independently of the nature of the observed object (amplitude, phase, or both mixed). The first one, monochro- matic, is based on amplitude analysis and on a high-pass filtering process. The second one, which gives fast refocusing in multispectral DHM, compares the phase in the Fourier domain among wavelengths. Methods developed in the thesis show the high potential of color DHM with a partial spatial coherence illumination, suggesting a promising future for this technique.

Keywords Microscopy, Digital holography, Color holography, Interferome-

tric imaging, Fourier optics, Digital image processing, Partial spatial coherence,

In-flow imaging, Differential interferometry, Automatic refocusing.

Table des matières

Introduction 1

1 Principes de la microscopie par holographie numérique 5

1.1 Optique de Fourier . . . 5

1.1.1 Description du champ optique . . . 5

1.1.2 Propagation en espace libre . . . 7

1.1.3 Transmission au travers d’un objet . . . 8

1.1.4 Interférences lumineuses . . . 8

1.1.5 Cohérences temporelle et spatiale . . . 10

1.2 Holographie numérique . . . 11

1.2.1 Holographie numérique en ligne . . . 11

1.2.2 Holographie numérique par interférométrie . . . 12

1.2.3 Holographie numérique par interférométrie différentielle . 18 1.2.4 Autres méthodes d’imagerie à contraste de phase . . . . 19

1.2.5 Techniques dérivées . . . 23

1.2.6 Applications . . . 25

1.3 Holographie en couleurs . . . 26

1.3.1 Principe et méthodes . . . 26

1.3.2 Avantages de la polychromie . . . 28

1.3.3 Applications . . . 28

1.4 Traitements numériques des hologrammes . . . 29

1.4.1 Reconstruction holographique . . . 29

1.4.2 Déroulage de la phase . . . 30

2 Étude du bruit en éclairage de cohérence spatiale partielle 33 2.1 De la réduction du bruit cohérent en holographie . . . 33

2.1.1 Bruit cohérent en holographie . . . 33

2.1.2 Imagerie en milieu diffusant . . . 36

2.2 Développements théoriques . . . 37

2.2.1 Éclairage de cohérence spatiale partielle en interférométrie 37 2.2.2 Modèle discret pour l’évaluation de la réduction du bruit 42 2.2.3 Modèle continu pour l’évaluation de la réduction du bruit 44 2.3 Validation expérimentale . . . 47

2.3.1 Dispositif optique et méthode . . . 48

2.3.2 Variation de la cohérence spatiale de la lumière . . . 50

2.3.3 Variation de la distance à la source de bruit . . . 51

2.3.4 Illustration de la réduction du bruit avec un échantillon . 53 2.4 Conclusion du chapitre . . . 54

3 Microscopie holographique numérique en flux et en couleurs 55 3.1 De l’imagerie en flux en microscopie optique . . . 56

3.1.1 Augmentation de la profondeur de champ . . . 56

3.1.2 Imagerie en flux . . . 57

3.2 Dispositif expérimental et méthode . . . 59

3.2.1 Dispositif pour l’imagerie en flux et en couleurs . . . 59

3.2.2 Méthode de correction des défauts permanents . . . 61

3.3 Résultats expérimentaux . . . 65

3.3.1 Correction des défauts et aberrations . . . 65

3.3.2 Images de micro-organismes du plancton . . . 67

3.4 Conclusion du chapitre . . . 67

4 Microscopie par holographie numérique différentielle 71 4.1 Principe . . . 72

4.1.1 Formation de l’hologramme . . . 72

4.1.2 Extraction des données brutes . . . 73

4.1.3 Dispositif à un bras . . . 75

4.2 Étalonnage du microscope et correction des données brutes . . . 76

4.2.1 Hologramme de référence . . . 76

4.2.2 Déroulage et correction des phases différentielles . . . 77

4.2.3 Étalonnage d’après une grille . . . 77

4.3 Calcul de l’amplitude complexe du champ issu de l’objet . . . . 80

4.3.1 Détermination de l’intensité lumineuse . . . 80

4.3.2 Détermination de la phase optique . . . 80

4.4 Résultats expérimentaux . . . 81

4.4.1 Dispositif expérimental . . . 81

4.4.2 Reconstruction holographique en profondeur . . . 81

4.5 Conclusion du chapitre . . . 82

5 Remise au net automatique en holographie numérique 85 5.1 De la remise au net en holographie numérique . . . 85

5.1.1 Cas des hologrammes monochromes . . . 86

5.1.2 Cas des hologrammes polychromes . . . 88

5.1.3 Méthodes rapides . . . 89

5.2 Critères de netteté basés sur l’intégrale du module . . . 90

5.2.1 Critère originel . . . 90

5.2.2 Critère adapté à tout type d’objet . . . 92

5.2.3 Critère adapté aux hologrammes polychromes . . . 98

5.3 Critère basé sur la phase dans le domaine de Fourier . . . 99

5.3.1 Principe . . . 99

5.3.2 Développement du critère . . . 100

5.3.3 Validation par simulations numériques . . . 103 5.3.4 Validation expérimentale . . . 107 5.4 Conclusion du chapitre . . . 112

Conclusion 113

Bibliographie 117

Table des figures

1.1 Principe de l’holographie numérique en ligne . . . 12 1.2 Interféromètres de Mach–Zehnder et de Michelson . . . 13 1.3 Illustration de la méthode de Fourier . . . 15 1.4 Intérêt du réseau de diffraction pour dévier le faisceau de réfé-

rence en faible cohérence temporelle . . . 16 2.1 Interféromètre de Mach–Zehnder . . . 38 2.2 Schéma simplifié de l’interféromètre de Mach–Zehnder . . . 38 2.3 Représentation graphique du modèle continu développé pour

évaluer la réduction du bruit en éclairage partiellement cohérent spatialement . . . 46 2.4 Dispositif optique utilisé pour la validation expérimentale des

modèles développés pour évaluer la réduction du bruit en éclai- rage partiellement cohérent spatialement . . . 48 2.5 Image focalisée de la lame génératrice de bruit utilisée pour les

expériences . . . 49 2.6 Évolution de l’écart-type relatif en fonction de l’inverse du dia-

mètre de la pupille régissant la cohérence spatiale . . . 51 2.7 Évolution de l’écart-type relatif en fonction de l’inverse de la

distance entre la plaque génératrice de bruit et le plan d’enre- gistrement . . . 52 2.8 Illustration avec un échantillon de la réduction du bruit obtenue

en diminuant la cohérence spatiale en microscopie par hologra- phie numérique . . . 54 3.1 Microscope holographique numérique interférométrique pour l’ima-

gerie en flux et en couleurs . . . 60 3.2 Illustration de l’efficacité de la méthode pour la correction de la

balance des couleurs et des défauts permanents . . . 66 3.3 Illustration de l’efficacité de la méthode pour la correction d’une

balance des couleurs fort déséquilibrée . . . 67 3.4 Images de micro-organismes du plancton remises au net après

correction . . . 68 3.5 Images d’un objet approximativement plan non perpendiculaire

à l’axe optique . . . 69

4.1 Transformée de Fourier d’un hologramme obtenu en microscopie par holographie numérique différentielle à trois faisceaux . . . . 74 4.2 Décalage latéral entre les ordres de diffraction lorsque le réseau

est légèrement hors focus . . . 75 4.3 Images de la grille utilisée pour l’étalonnage du microscope ho-

lographique numérique différentiel . . . 79 4.4 Microscope holographique numérique interférométrique différen-

tiel à un bras pour l’imagerie en couleurs . . . 82 4.5 Reconstruction numérique en profondeur en microscopie holo-

graphique numérique en couleurs par interférométrie différen- tielle à un bras . . . 83 5.1 Validation expérimentale du critère de netteté M

avec l’image

d’un micro-organisme . . . 96 5.2 Validation du critère de netteté M

avec un objet opaque si-

mulé numériquement . . . 97 5.3 Validation du critère de netteté J

avec un objet opaque simulé

numériquement . . . 104 5.4 Validation du critère de netteté J

avec un objet de phase pure

simulé numériquement . . . 105 5.5 Validation du critère de netteté J

avec un objet de nature mixte

simulé numériquement . . . 106 5.6 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un premier micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 108 5.7 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un deuxième micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 109 5.8 Illustration de l’efficacité du critère J

avec un troisième micro-

organisme provenant de l’eau d’un étang . . . 110 5.9 Illustration de l’efficacité du critère J

avec d’autres cellules du

plancton provenant de l’eau d’un étang . . . 111

Introduction

Peu après la seconde guerre mondiale, Dennis Gabor, physicien britannique originaire de Hongrie, inventa l’holographie [1], pour laquelle il reçut en 1971 le prix Nobel [2]. Le mot « holographie » provient du grec holos qui signifie

« entier » et graphein signifiant « écrire » [3]. Il s’agit donc d’enregistrer une information complète sur le champ optique, à savoir une image des intensité et phase optiques. Dans la première configuration de Gabor de l’holographie [1], dite holographie en ligne, un objet est éclairé avec de la lumière considérée comme cohérente. L’onde diffractée par l’objet et l’onde de l’arrière-plan, non diffractée, interfèrent sur un détecteur. L’enregistrement de ces interférences sur une plaque photographique située suffisamment loin de l’objet constitue, après développement de la plaque, l’hologramme [1, 4]. Ensuite, en éclairant l’hologramme avec une onde cohérente, correspondant à l’onde originelle sans objet, une image de l’objet apparaît dans l’espace, comme s’il était physique- ment là, pour un observateur placé dans la trajectoire du faisceau lumineux et qui regarde au travers de la plaque ; ce procédé porte le nom de reconstruction holographique [1]. Il est préférable que l’objet soit petit par rapport à la ré- gion éclairée et soit monté sur un support transparent [1]. Il est intéressant de noter que les caractéristiques de l’onde utilisée pour la reconstruction, telles que la longueur d’onde, ne sont pas nécessairement les mêmes que celles de l’onde initiale ; ainsi Gabor proposa-t-il d’enregistrer un hologramme avec un faisceau d’électrons et de le reconstruire avec un faisceau de lumière visible [1].

Le but premier de Gabor était de réaliser la microscopie électronique sans lentille, évitant ainsi les aberrations qu’elles apportent [1, 5]. En effet, en ho- lographie de Gabor, l’image de l’objet microscopique est reconstruite à partir de l’hologramme macroscopique [1].

Lors de la reconstruction holographique à partir d’un hologramme enregis- tré avec la configuration en ligne, apparaissent deux images placées de manière symétrique par rapport au plan de l’hologramme. Dès lors, l’image nette de l’objet est superposée à son image propagée sur la double distance de recons- truction, appelée l’image jumelle [6, 7]. Ce phénomène altère la qualité des images reconstruites en holographie en ligne. Bragg et Rogers avancèrent qu’il est possible d’éliminer l’image jumelle lors de la reconstruction holographique, en utilisant un hologramme auxiliaire en plus de l’hologramme principal [6].

Affinant cette idée, la séparation de l’image de l’objet et de l’image jumelle fut

rendue possible par Leith et Upatnieks [7], qui réalisèrent l’enregistrement de l’hologramme avec deux faisceaux de directions différentes dont l’un traverse l’objet, ou est réfléchi par l’objet, et l’autre sert de référence. Plus tard, ceux-ci utilisèrent un réseau de diffraction pour former l’angle entre le faisceau objet et celui de référence, lequel produit des franges achromatiques [8] ; ceci permet de conserver la cohérence mutuelle des faisceaux — et donc les interférences — sur l’entièreté du capteur même lorsque la cohérence temporelle de la lumière est faible [8, 9]. Par ailleurs, pour éviter l’apparition d’une image jumelle, Gabor élabora un microscope holographique où deux hologrammes déphasés de fi/2 sont enregistrés séparément et reconstruits simultanément, révélant l’image de l’objet sans cette ambiguïté [4].

L’avènement de la numérisation de l’information et le développement des or- dinateurs et de capteurs électroniques performants permirent la mise en œuvre de l’holographie numérique [10–12]. D’une part, la plaque photographique ori- ginellement utilisée pour l’holographie est remplacée par l’enregistrement di- rect des hologrammes sous forme numérique. D’autre part, un processus de calcul numérique par ordinateur se substitue à la reconstruction holographique optique.

Le principal inconvénient de la microscopie optique classique réside dans sa faible profondeur de champ, surtout aux forts grossissements : un objet n’est net que sur une faible profondeur et les objets en dehors de la profondeur de champ sont flous. Remédiant à ce défaut, la microscopie par holographie numé- rique enregistre l’information complète du champ optique en un plan, offrant ainsi la capacité de reconstruction numérique en profondeur [13]. Dès lors, avec un seul hologramme, les images floues des objets en dehors du plan de netteté peuvent être remises au net [14]. La profondeur observable est donc considé- rablement augmentée en comparaison de la profondeur de champ usuelle. Ceci est d’un intérêt majeur notamment pour l’analyse dynamique d’échantillons épais par rapport à la profondeur de champ classique ou l’analyse en flux d’ob- jets [15]. En effet, le balayage mécanique de l’axe optique en microscopie clas- sique est remplacé par le balayage numérique à partir d’un seul hologramme enregistré. Les aspects liés à la reconstruction numérique en profondeur des hologrammes sont expliqués au point 1.4.1.

En outre, la microscopie optique classique ne permet pas d’observer des

objets réfringents et transparents nets tels que, par exemple, des cellules bio-

logiques non colorées. En effet, de tels objets affectent essentiellement la phase

optique et non l’intensité lumineuse dans le plan de netteté. Or, l’œil humain

et les capteurs usuels sont sensibles à l’intensité lumineuse, égale à la puis-

sance par unité de surface. Ces objets ne sont donc pas visibles dans le plan de

netteté. Il est donc nécessaire de traduire les variations de phase induites par

l’objet, correspondant aux variations de chemin optique, en variations d’inten- sité. Les techniques d’imagerie réalisant cette traduction sont dites à contraste de phase. Un aperçu des méthodes existantes dans ce domaine est fourni au point 1.2. Parmi elles, certaines configurations d’holographie numérique, no- tamment celles utilisant l’interférométrie avec un faisceau de référence, donnent un contraste de phase quantitatif, c’est-à-dire une mesure de l’épaisseur op- tique de l’échantillon [16]. L’extraction simultanée de l’intensité et de la phase, donnant ensemble l’amplitude complexe, est un atout important de la micro- scopie par holographie numérique.

L’holographie numérique est originellement monochromatique mais l’utili- sation d’une source lumineuse à plusieurs longueurs d’onde permet l’enregis- trement d’hologrammes polychromes. Des longueurs d’onde suffisamment bien réparties dans le spectre de lumière visible, correspondant par exemple aux trois couleurs primaires que sont le rouge, le vert et le bleu, rendent possible la microscopie par holographie numérique en couleurs [17]. L’observation en couleurs représente un apport significatif notamment en biologie car les cellules peuvent afficher naturellement un caractère coloré ou être colorées artificielle- ment. Les diverses techniques existantes et les avantages de la polychromie en holographie sont exposés au point 1.3. La présente thèse s’inscrit dans le cadre de la microscopie par holographie numérique en couleurs avec une lumière par- tiellement cohérente. Il y est plus précisément question des configurations en transmission avec l’interférométrie hors axe, c’est-à-dire où les deux faisceaux interférant sont inclinés l’un par rapport à l’autre.

D’abord, les principes à la base de l’holographie numérique et de la micro- scopie par holographie numérique, tant les cas mono- que polychromatiques, ainsi qu’une description des différentes méthodes développées dans ce domaine et un aperçu des applications existantes, constituent le chapitre 1. Ce chapitre définit également les notions d’optique nécessaires à la bonne compréhension de la thèse.

En outre, l’utilisation de sources fortement cohérentes en microscopie par holographie numérique, telles que les lasers, implique la présence de bruit, dit bruit cohérent, notamment le bruit de tavelure (speckle en anglais) [18] ou le bruit dû par exemple aux parois imparfaites du support de l’échantillon [19].

Diverses solutions furent mises en œuvre pour réduire le bruit cohérent et

sont exposées au point 2.1. En particulier, l’utilisation d’une source de lumière

partiellement cohérente spatialement permet de réduire significativement le

bruit présent sur les images obtenues [19]. Le chapitre 2 étudie ce phénomène en

proposant notamment un modèle mathématique pour évaluer quantitativement

la réduction du bruit obtenue en fonction de la cohérence spatiale de la lumière.

Par ailleurs, il est mentionné plus haut que la microscopie par holographie numérique offre une profondeur observable considérablement supérieure à la profondeur de champ en microscopie classique, grâce à la faculté de reconstruc- tion en profondeur de l’hologramme enregistré. Il est dès lors possible d’analy- ser des objets mus dans des flux dont la dimension le long de l’axe optique est supérieure à la profondeur de champ classique [15]. Une technique permettant la microscopie holographique en flux et en couleurs est proposée au chapitre 3.

De plus, ce chapitre comporte aussi la description d’une méthode automatique de correction applicable dans ce cas, développée pour compenser les défauts permanents dans le champ de vue et corriger la balance des couleurs.

Ensuite, la microscopie par holographie numérique différentielle en couleurs est décrite, au chapitre 4. Dans la configuration classique de microscopie par holographie numérique interférométrique, le faisceau traversant l’objet inter- fère avec un faisceau de référence et la phase est extraite de l’hologramme. Au contraire, dans la configuration différentielle, l’interféromètre se situe en aval de l’échantillon et le faisceau objet interfère avec une ou plusieurs répliques de lui-même, légèrement décalées latéralement [20]. De l’hologramme ainsi ob- tenu sont extraites les phases différentielles, qui correspondent aux dérivées de la phase dans les directions de décalage latéral. Un processus d’intégra- tion est alors nécessaire pour déterminer la phase de l’objet observé. En plus de sa robustesse mécanique, l’avantage de cette méthode est qu’il est pos- sible d’observer des échantillons optiquement plus épais avec des sources de cohérence faible, en maintenant la cohérence mutuelle des deux faisceaux et donc les interférences. Un faisceau de référence utilisé avec de tels objets pour- rait ne plus être mutuellement cohérent avec le faisceau objet et les faisceaux n’interféreraient pas. Cependant, cette méthode fournit seulement les phases différentielles et l’intégration peut être sujette à des erreurs qui altèrent la qualité de l’image de phase et empêchent la reconstruction en profondeur. Une méthode d’étalonnage permettant le traitement des phases différentielles est proposée dans le chapitre 4, donnant lieu à une intégration plus robuste et rendant ainsi possible la reconstruction en profondeur.

Enfin, si la reconstruction numérique en profondeur est intrinsèque à la mi- croscopie par holographie numérique, un critère de netteté est essentiel pour déterminer, parmi tous les plans pouvant être reconstruits, celui qui corres- pond au plan de netteté [21]. La détection automatique du plan de netteté est particulièrement importante dans le cas d’échantillons épais comprenant des objets à plusieurs profondeurs. Le chapitre 5 traite de cette problématique.

Plusieurs critères de netteté y sont développés.

Chapitre 1

Principes de la microscopie par holographie numérique

Le présent chapitre traite des principes fondamentaux de la microscopie par holographie numérique. D’abord, la section 1.1 explique les concepts de l’op- tique de Fourier utilisés dans la thèse et expose les notations rencontrées dans la suite. Ensuite, la section 1.2 présente les différentes configurations existant en holographie numérique et en microscopie par holographie numérique, ainsi que les méthodes de microscopie liées ou semblables. Puis, la section 1.3 se rapporte aux principes, développements et applications de l’holographie poly- chromatique. Les traitements numériques indispensables en holographie numé- rique par interférométrie, que sont la reconstruction numérique en profondeur des hologrammes et le décalage de la phase sont discutés au point 1.4.

1.1 Optique de Fourier

L’optique de Fourier trouve ses origines dans les travaux d’Abbe et de Rayleigh et s’inscrit dans le cadre plus général de la théorie ondulatoire de la lumière, selon laquelle la lumière est formée d’ondes électromagnétiques [18, 22]. Une description très commode de l’optique de Fourier par des opérateurs algébriques fut mise au point par Nazarathy et Shamir [23]. Celle-ci est utilisée dans la présente thèse.

1.1.1 Description du champ optique

1.1.1.1 Amplitude complexe

Le champ lumineux est décrit dans un plan par une fonction complexe f,

appelée amplitude complexe. Notons que la polarisation de la lumière n’est

pas considérée dans ce travail ; la lumière étant donc supposée être un phéno-

mène ondulatoire scalaire. Dans la suite, les plans seront toujours considérés

perpendiculaires à l’axe optique. L’intensité lumineuse i, égale à la puissance

lumineuse par unité de surface, et la phase du champ optique Ï, correspondant à la forme du front d’onde, sont reliées à l’amplitude complexe f dans un plan par l’expression

f (r) =

i (r) exp { jÏ (r) } , (1.1) où r désigne le vecteur position à deux dimensions dans le plan considéré et j = Ô

≠ 1.

L’intensité est calculée à partir de l’amplitude complexe par

i (r) = | f (r) |

= f (r) f

(r) , (1.2) où | w | désigne le module du nombre complexe w et w

son complexe conjugué.

L’intensité lumineuse i est la grandeur mesurée par un capteur ou perçue par l’œil humain.

Cependant, la phase peut seulement être déterminée à partir de l’ampli- tude complexe à 2fi près, ce qui constitue une ambiguïté lorsqu’elle couvre un intervalle plus grand :

{ Ï (r) } ° 2fi = arctan

{⁄ [f (r)] , Ÿ [f (r)] } , (1.3) où Ÿ [w] est la partie réelle de w ; ⁄ [w] sa partie imaginaire ; ° désigne l’opé- ration modulo généralisée, définie rigoureusement par

° : R ◊ R

æ [0, b[: (a, b) ‘æ a ° b = a + kb avec k œ Z | a + kb œ [0, b[ , (1.4) et arctan

est la fonction arc tangente à deux arguments, définie par

arctan

: R

æ [0, 2fi[: (x, y) ‘æ

Y_ __ __ __ __ _] __ __ __ __ __ [

arctan

si x Ø 0 et y > 0 arctan

+ fi si x Ø 0 et y < 0 arctan

+ 2fi si x < 0 et y > 0 arctan

+ fi si x < 0 et y < 0 fi/2 si x Ø 0 et y = 0 3fi/2 si x < 0 et y = 0

,

(1.5) où arctan : R æ] ≠ fi/2, fi/2[ est la fonction usuelle d’arc tangente.

1.1.1.2 Domaine de Fourier

L’amplitude complexe f définie à l’équation 1.1 correspond au domaine spatial. Le domaine des fréquences spatiales, ou domaine de Fourier, s’obtient en appliquant la transformée de Fourier, notée F , à l’amplitude f :

(F f) (u) =

dr exp {≠ 2fiju·r } f (r), (1.6)

où u est le vecteur des fréquences spatiales et · est le produit scalaire usuel.

L’intégrale est calculée sur R

. L’opération réciproque est la transformée de Fourier inverse, notée F

, vérifiant la relation F

F f = f = F F

f , et se formulant

1

F

f

(r) =

du exp { 2fiju·r } f (u). (1.7)

Le domaine de Fourier est très utilisé, notamment pour la propagation (voir point 1.1.2) et pour l’application de filtres passe-haut, passe-bas ou passe- bande sur les images.

1.1.1.3 Polychromie

Le cas d’un éclairage à plusieurs longueurs d’onde est considéré ci-après.

Par hypothèse, la source lumineuse est constituée par la superposition de plu- sieurs sources quasi monochromatiques, c’est-à-dire de spectres très étroits, et dont les longueurs d’onde moyennes sont séparées entre elles. Dans la suite du travail, ces longueurs d’onde distinctes formant l’éclairage polychromatique sont simplement appelées « couleurs ». La description du champ lumineux né- cessite un vecteur d’amplitudes complexes f , comportant une amplitude com- plexe pour chaque couleur, notée f

pour la couleur M . Par exemple, avec un éclairage rouge (R), vert (V) et bleu (B), le champ lumineux est décrit par

f (r) =

f

(r) , f

(r) , f

(r)

. (1.8) Dans la suite du texte, par souci de concision, nous considérons l’amplitude complexe f

dans une couleur quelconque, étant entendu que cette couleur M peut varier parmi toutes les couleurs de l’éclairage. L’exposant est en outre omis s’il n’apporte pas d’information dans le contexte où il se trouve.

1.1.2 Propagation en espace libre

La propagation de la lumière en espace libre est décrite en optique de Fou- rier de la manière suivante. L’amplitude complexe f

, correspondant à l’ampli- tude complexe f

propagée sur une distance d, est donnée selon l’approximation paraxiale par [23]

f

= exp { jkd } F

exp

≠ jfi⁄d Î u Î

F f

= R [d] f

, (1.9)

où k = 2fi/⁄ est le nombre d’onde, ⁄ est la longueur d’onde, Î u Î = Ô u·u

désigne la norme euclidienne de u et R [d] représente l’opérateur de propagation

dans l’espace libre sur une distance d.

L’équation 1.9 peut se comprendre aisément de la manière suivante. La trans- formée de Fourier appliquée à f

correspond à une décomposition en ondes planes. La propagation de l’onde plane exp { 2fij u·r } s’obtient, sous l’approxi- mation paraxiale, en multipliant par le facteur de phase exp

jkd ≠ j fi⁄d Î u Î

. La transformée de Fourier inverse recombine ensuite les ondes planes ainsi pro- pagées en un signal dans le domaine spatial.

1.1.3 Transmission au travers d’un objet

Un objet est supposé caractérisé par sa fonction de transparence complexe t de telle sorte que l’amplitude complexe f

du champ lumineux juste après l’objet est liée à l’amplitude complexe f

juste avant par

f

(r) = t (r) f

(r) . (1.10) La transparence complexe t d’un objet est liée à sa transparence réelle · et au déphasage Ï

qu’il induit, nommé plus simplement « phase de l’objet », par t (r) = · (r) exp { j Ï

(r)}. (1.11) Pour les objets non émissifs, la transparence réelle · œ [0, 1]. À l’intérieur de la surface couverte par l’objet, lorsque · = 1, l’objet est dit de phase pure ; si Ï

= 0, l’objet est dit d’amplitude pure ; quand · = 0, il est opaque ; dans les autres cas, il est de nature mixte.

La phase Ï

de l’objet traversé par la lumière et l’épaisseur optique e sont liées par la relation

Ï

(r)

2fi = e (r)

⁄ , (1.12)

avec l’épaisseur optique e donnée par

e (r) = e

(r) n (r) , (1.13) où e

est l’épaisseur vraie et n est la différence d’indice de réfraction entre l’objet et le milieu environnant.

1.1.4 Interférences lumineuses

1.1.4.1 Interférences à deux faisceaux

Lorsque deux faisceaux lumineux mutuellement cohérents se superposent,

apparaît le phénomène d’interférences lumineuses. La notion de cohérence est

expliquée au point 1.1.5. Le phénomène d’interférences se comprend de la ma-

nière suivante. Soient deux faisceaux caractérisés par des amplitudes complexes

f

et f

. La combinaison des deux faisceaux donne le faisceau d’amplitude com- plexe f

, laquelle est, par linéarité (principe de superposition), la somme des amplitudes complexes des faisceaux interférant :

f

(r) = f

(r) + f

(r) . (1.14) L’intensité lumineuse i

mesurée est donnée, d’après l’équation 1.2, par

i

(r) = (f

(r) + f

(r)) (f

(r) + f

(r))

= i

(r) + i

(r) + f

(r) f

(r) + f

(r) f

(r) , (1.15) où i

et i

sont les intensités correspondant respectivement aux faisceaux 1 et 2 seuls. Ce résultat est à comparer avec la superposition incohérente des deux faisceaux, sans interférences, donnant l’intensité i

:

i

(r) = i

(r) + i

(r) . (1.16) La comparaison des équations 1.15 et 1.16 montre que, en cas de cohérence mutuelle, l’intensité des deux faisceaux combinés diffère de la somme des in- tensités de chacun des faisceaux agissant seul : les faisceaux interfèrent.

En outre, l’équation 1.15 peut se réécrire avec les phases Ï

et Ï

des fais- ceaux, en utilisant l’équation 1.1 :

i

(r) = i

(r) + i

(r) + 2

i

(r) i

(r) cos { Ï

(r) ≠ Ï

(r) } . (1.17) 1.1.4.2 Interférences à F faisceaux

Le raisonnement précédent se généralise à F faisceaux d’amplitudes com- plexes f

(l = 1, ..., F ). L’amplitude complexe f

du faisceau résultant de la superposition des F faisceaux mutuellement cohérents vaut

f

(r) =

l=1

f

(r). (1.18)

L’intensité résultante i

en cas de cohérence mutuelle des faisceaux est cal- culée en vertu de l’équation 1.2 :

i

(r) =

l=1

i

(r) +

l=1

ÿF k=1k”=l

f

(r) f

(r), (1.19) où i

= | f

|

désigne l’intensité du l-ième faisceau seul. Cette expression est à comparer avec l’intensité i

obtenue en cas de superposition incohérente des faisceaux, donc sans interférences :

i

(r) =

l=1

i

(r). (1.20)

1.1.4.3 Interférences différentielles

Les interférences différentielles consistent à superposer (de manière cohé- rente) un faisceau et une réplique de lui-même, légèrement décalée latérale- ment [24]. Le raisonnement tenu ici implique deux faisceaux mais il est aisé- ment généralisable à F faisceaux. Considérons un faisceau d’amplitude com- plexe f . La superposition de celui-ci avec une réplique de lui-même, ayant subi une translation de vecteur ”r par rapport à l’original, donne, d’après l’équa- tion 1.17, l’intensité lumineuse i

suivante :

i

(r) = | f (r) + f (r + ”r) |

= i (r) + i (r + ”r)

+2

i (r) i (r + ”r) cos { Ï (r + ”r) ≠ Ï (r) } . (1.21) Si Î ”r Î est suffisamment proche de zéro, la phase Ï (r + ”r) peut être rem- placée par son développement en série de Maclaurin, limité à l’ordre un :

Ï (r + ”r) ¥ Ï (r) + ”r· ( Ò Ï) (r) , (1.22) où Ò désigne l’opérateur de calcul du gradient, de sorte que ”r· ( Ò Ï) (r) / Î ”r Î représente la dérivée partielle de la phase suivant la direction du vecteur ”r, aussi appelée phase différentielle.

Dès lors, l’intensité i

de l’équation 1.21 devient

i

(r) ¥ i (r) + i (r + ”r) + 2

i (r) i (r + ”r) cos { ”r· ( Ò Ï) (r) } , (1.23) qui fournit une information sur la phase différentielle, d’où le nom « interfé- rences différentielles ».

1.1.5 Cohérences temporelle et spatiale

La cohérence mutuelle de deux faisceaux mesure leur capacité à interférer.

La cohérence d’une source lumineuse mesure la faculté d’interférences de deux répliques du faisceau provenant de la source, lorsque celles-ci sont décalées l’une par rapport à l’autre. Deux types de cohérence se distinguent : la cohé- rence spatiale et la cohérence temporelle. La cohérence de la lumière fit l’objet d’études approfondies dont les théories et résultats sont repris, par exemple, dans [25,26].

D’une part, la cohérence spatiale se rapporte aux interférences lorsque les

deux répliques du faisceau sont décalées latéralement l’une par rapport à

l’autre. Théoriquement, une source pour laquelle deux répliques interfèrent

quelle que soit la distance de décalage latéral, si grande soit-elle, est de cohé-

rence spatiale totale. À l’inverse, si les répliques n’interfèrent pas quelle que

soit la distance non nulle de décalage latéral, si infime soit-elle, la source est

spatialement incohérente.

D’autre part, la cohérence temporelle d’une source mesure la capacité d’in- terférences de deux répliques du faisceau issu de cette source lorsque ces ré- pliques sont décalées axialement. La cohérence temporelle est totale lorsque les répliques interfèrent quelle que soit la distance axiale les séparant, si grande soit-elle, alors que la source est temporellement incohérente si les répliques n’interfèrent pas quelle que soit la distance non nulle de décalage axial, si infime soit-elle.

Par exemple, la lumière issue d’un laser présente des cohérences spatiale et temporelle élevées. La lumière du soleil est quant à elle de cohérence limitée, tant spatialement que temporellement. La cohérence spatiale d’une source peut être augmentée en la filtrant à travers une pupille, tel qu’expliqué en détail au point 2.2.1. L’effet de la cohérence spatiale sur la réduction du bruit en interférométrie fait l’objet du chapitre 2. Un interféromètre avec une lumière peu cohérente nécessite un alignement fin.

1.2 Holographie numérique

Comme mentionné dans l’introduction, en holographie numérique, les ho- logrammes sont enregistrés et reconstruits numériquement. Plusieurs configu- rations furent développées pour réaliser l’holographie numérique ; elles sont décrites ci-après pour le cas monochromatique. Comme l’imagerie à contraste quantitatif de la phase est, avec la reconstruction en profondeur, l’un des atouts principaux de l’holographie numérique interférométrique, un aperçu des autres techniques existantes de contraste de phase est également fourni. L’holographie polychromatique n’est pas abordée sous cette rubrique mais au point 1.3.

1.2.1 Holographie numérique en ligne

La configuration la plus simple d’holographie numérique est la configuration en ligne, qui est la forme originellement proposée par Gabor [1,4].

Le principe de l’holographie numérique en ligne est illustré sur la figure 1.1.

Un objet est éclairé avec une source de lumière suffisamment cohérente. L’ob- jet est situé à une distance d du capteur. La partie du faisceau diffractée par l’objet, d’amplitude f

, interfère sur le capteur avec la partie non diffractée f

. Pour simplifier les explications, l’onde de référence est ici supposée plane : f

(r) = A, où A est une constante réelle. En supposant que l’objet est décrit par la transparence complexe t, l’intensité i mesurée vaut, d’après les équa- tions 1.9, 1.10 et 1.15,

i (r) = A

1 + | R [d] t (r) |

+ A

(R [ ≠ d] t

(r)) + A

(R [d] t (r)) , (1.24)

où R [d] est l’opérateur de propagation dans l’espace libre sur une distance d,

défini à l’équation 1.9

C O

d S

f

f

Figure 1.1 – Principe de l’holographie numérique en ligne. C, capteur ; d, distance ; fo, onde diffractée ;fr, onde non diffractée ; O, objet ; S, source.

La reconstruction numérique i

à la distance d

s’opère en calculant R [ ≠ d

] i.

Dès lors, si d

= d,

i

= A

R [≠ d

]

1 + |R [d] t (r)|

+ A

(R [≠2d] t

(r)) + A

t (r) , (1.25) où l’image nette de l’objet apparaît au troisième terme. Cependant, cette image est perturbée par l’ordre zéro (premier terme) et l’image jumelle (deuxième terme). L’influence de l’ordre zéro peut être fortement diminuée en soustrayant une image de référence, c’est-à-dire une image enregistrée sans objet.

L’holographie en ligne classique ne permet pas l’extraction quantitative de la phase, en partie à cause de la présence de l’image jumelle. Néanmoins, il est possible de résoudre ce problème. Par exemple, une configuration améliorée d’holographie en ligne fut envisagée par Picart et Malek pour extraire l’ampli- tude complexe, et donc la phase, en holographie en ligne [27]. Leur méthode consiste à insérer entre l’objet et le capteur un modulateur spatial de lumière (spatial light modulator en anglais) induisant une modulation de phase pure, correspondant à un réseau bidimensionnel de diffraction. Ceci permet de gé- nérer un mélange cohérent des ondes correspondant aux différents ordres de diffraction. La phase différentielle correspondant à l’objet observé est alors ex- traite de l’hologramme selon plusieurs directions. La phase est obtenue après intégration. D’une certaine manière, cette méthode s’apparente aux techniques d’interférométrie différentielle présentées au point 1.2.3.

1.2.2 Holographie numérique par interférométrie

Plusieurs configurations furent développées en holographie numérique par

interférométrie afin de pouvoir extraire quantitativement la phase des holo-

grammes enregistrés, laquelle donne, avec l’intensité, l’amplitude complexe du

champ optique. Un intérêt majeur des microscopies à contraste de phase, et

notamment à contraste quantitatif de la phase, est la faculté d’observer des

objets purement transparents nets. Ainsi, il est possible, grâce à la micro-

scopie par holographie numérique, d’analyser des cellules biologiques vivantes

sans coloration ni marquage préalable [16,28–32]. L’épaisseur optique peut être

mesurée avec une précision nanométrique [16].

f_r C

S _SF f_o

M SF

M

LM L

LM L

O

(a)

C

f

S

f

SF

M LM

L

O

LM

(b)

Figure 1.2 – Interféromètres (a) de Mach–Zehnder, utilisé en transmission, et (b) de Mi- chelson, utilisé en réflexion, adaptés pour la microscopie. C, capteur ;fo, faisceau objet ;fr, faisceau de référence ; L, lentilles ; LM, objectifs de microscope ; M, miroirs ; O, objet ; S, source ; SF, séparateurs de faisceau.

1.2.2.1 Principe

Le principe de base est de séparer un faisceau en deux parties : le faisceau objet, modulé par l’échantillon, et le faisceau de référence, réplique du fais- ceau objet mais sans objet inséré. La superposition (cohérente) des deux fais- ceaux donne des interférences sur le capteur, comme expliqué au point 1.1.4.1.

Lorsque l’objet est observé en réflexion, un interféromètre de Michelson ou de Twyman–Green est communément utilisé. En transmission, il s’agit d’un in- terféromètre de Mach–Zehnder. Ces deux interféromètres sont schématisés sur la figure 1.2 pour une utilisation en microscopie.

Les configurations interférométriques d’holographie numérique permettent d’extraire l’amplitude complexe du champ optique, fournissant à la fois le contraste quantitatif de la phase et la reconstruction holographique en pro- fondeur par propagation numérique [33–35]. Plusieurs méthodes existent pour déterminer l’amplitude complexe en interférométrie. Celles-ci sont décrites ci- après.

1.2.2.2 Méthode du décalage de phase

La méthode du décalage de phase, dont l’idée de base avait déjà été avancée

par Gabor dans le cas de l’holographie en ligne [4] fut mise en œuvre par Yama-

guchi et Zhang dans le cas des configurations interférométriques d’holographie

numérique [36] et de microscopie par holographie numérique [13]. La version la

plus commune consiste à enregistrer quatre interférogrammes en décalant pour

chacun de fi/2 la phase du faisceau de référence [36, 37]. De ces quatre inter-

férogrammes procède l’hologramme, dont est extraite la phase correspondant

au faisceau objet, donnée à 2fi près (confer équations 1.3 et 1.17). Le déca-

lage de la phase s’opère classiquement grâce à un miroir monté sur un module

piézoélectrique dans le bras correspondant au faisceau de référence [36].

Cette méthode fut déclinée suivant plusieurs configurations similaires. Ainsi, il est possible de n’utiliser que deux interférogrammes plutôt que quatre en utilisant la transformée de Hilbert [38, 39]. Le déphasage fut aussi envisagé à l’aide de l’interaction entre deux modulateurs acousto-optiques placés en série dans un bras de l’interféromètre [40]. Un décalage plus rapide, de l’ordre de la milliseconde, fut proposé en insérant un modulateur acousto-optique dans chaque bras de l’interféromètre et en les réglant de manière asynchrone de manière à obtenir un déphasage entre les faisceaux variable dans le temps [38].

Par ailleurs, les interférogrammes furent même enregistrés simultanément en utilisant un multiplexage spatial : ceux-ci sont alors enregistrés sur une même image, soit par enchevêtrement [41–45], soit sur des portions distinctes [39]. Le décalage de phase est alors opéré soit en utilisant de la lumière polarisée, où une différence de phase est réalisée entre différents états de polarisation [39, 41, 43, 46], soit une lame de phase placée dans le faisceau de référence ayant une distribution de phase périodique [42], soit l’effet Talbot avec un réseau de diffraction [44], soit encore une phase aléatoire pour le faisceau de référence [45, 47]. Dans le cas de multiplexage spatial, la résolution est cependant réduite puisque les interférogrammes sont enregistrés sur le même capteur. De plus, le décalage de phase utilisant la polarisation ne tient généralement pas compte des échantillons ayant une biréfringence ou un pouvoir rotatoire non nuls.

1.2.2.3 Méthode de Fourier

La méthode de Fourier, tirant son nom du fait de l’utilisation de transfor- mées de Fourier, fut développée par Takeda et alii [48]. Elle est illustrée sur la figure 1.3. Le principe de base, comme dans la configuration proposée par Leith et Upatnieks [7], est d’incliner les faisceaux interférant l’un par rapport à l’autre. La configuration est dite désaxée ou hors axe. Par exemple, le faisceau objet, d’amplitude complexe f

, est parallèle à l’axe optique tandis que le fais- ceau de référence, d’amplitude complexe f

, forme un angle avec ce dernier.

Ainsi la figure d’interférences présente-t-elle des franges. La transformée de Fourier d’un tel hologramme présente un lobe central et deux lobes latéraux.

En effet, en supposant que le faisceau de référence est une onde plane,

f

(r) = A exp { jK·r } , (1.26) où A est une constante réelle et K définit l’inclinaison du faisceau de référence, l’intensité i mesurée vaut, d’après l’équation 1.15,

i (r) = A

+ | f

(r) |

+ A exp {≠ jK·r } f

(r) + A exp { j K·r } f

(r) . (1.27)

(a) (b) (c)

Figure 1.3 –Illustration de la méthode de Fourier pour extraire l’amplitude complexe des hologrammes enregistrés en configuration désaxée. (a) Transformée de Fourier d’un holo- gramme, (b) lobe latéral isolé et (c) lobe latéral centré.

La transformée de Fourier de l’hologramme enregistré est donc (F i) (u) =

F

A

+ | f

|

(u) + A (F f

) (u) ¢ ”

3

u + K 2fi

4

+A (F f

) (u) ¢ ”

3

u ≠ K 2fi

4

, (1.28)

où ” désigne la distribution de Dirac bidimensionnelle, avec ” (u) = (F 1) (u), et ¢ représente le produit de convolution. La figure 1.3(a) présente une image de la transformée de Fourier d’un hologramme obtenu avec une configuration désaxée, correspondant donc à l’équation 1.28.

Comme la convolution avec ” (u ≠ K/2fi) revient à une translation de vec- teur K/2fi, il s’ensuit que le premier terme de l’équation 1.28 est un lobe central alors que les deux autres termes représentent les lobes latéraux, de part et d’autre du lobe central. D’après l’équation 1.28, en isolant l’un des lobes latéraux et en le centrant dans le domaine de Fourier (espace des fré- quences spatiales), la transformée de Fourier du faisceau objet est obtenue.

La transformée de Fourier inverse permet enfin de retrouver l’amplitude com- plexe du champ optique. De celle-ci, la phase est quantitativement extraite, à 2fi près, en déterminant ponctuellement l’argument des nombres complexes d’après l’équation 1.3.

Cette méthode, dont le principal avantage réside dans le fait qu’elle four-

nit l’hologramme en une seule acquisition, permettant ainsi l’analyse d’objets

et de phénomènes dynamiques et limitant l’impact des vibrations, fut très

utilisée en holographie numérique et en microscopie par holographie numé-

rique [33, 49–53]. Dans la méthode de Fourier, les différents lobes ne peuvent

se superposer dans le domaine fréquentiel, sans quoi l’isolement d’un lobe la-

téral est compromis. Ceci réduit la résolution par rapport à une image dont

le spectre peut s’étendre sur l’entièreté de la fenêtre, comme ce peut être le

cas avec la méthode du décalage de phase. Néanmoins, afin de pallier cet in-

convénient en holographie numérique hors axe, des filtres non linéaires furent

GD

AO

(a)

M (b)

f

f

C

(c)

f

f

C

(d)

Figure 1.4 –Intérêt du réseau de diffraction pour dévier le faisceau de référence en faible cohérence temporelle. (a) et (c) Faisceau dévié par une grille de diffraction et conservation du premier ordre, les faisceaux interfèrent sur l’entièreté du capteur ; (b) et (d) faisceau dévié par un miroir, les faisceaux n’interfèrent que sur une portion du capteur. AO, arrêt optique ; C, capteur ; GD, grille de diffraction ;fo, faisceau objet ;fr, faisceau de référence ; M, miroir. Les rectangles roses représentent des impulsions lumineuses et les zones vertes montrent la portion du capteur où des interférences sont présentes.

envisagés, pour isoler efficacement un lobe latéral malgré le chevauchement des lobes ; cette technique nécessite un faisceau de référence plus intense que le fais- ceau objet et permet d’utiliser une taille de lobe latéral allant jusqu’à la moitié de la fenêtre [54]. La transformée de Hilbert fut aussi utilisée pour extraire l’information de l’hologramme hors axe [55]. Par la suite, un réseau de diffrac- tion fut utilisé pour incliner un faisceau lorsqu’une lumière de faible cohérence temporelle est employée en microscopie par holographie numérique [17,56]. En effet, l’utilisation d’un miroir pour incliner l’un des deux faisceaux ne permet pas des interférences sur l’entièreté du capteur lorsqu’une lumière de faible cohérence temporelle est considérée car les faisceaux ne sont pas partout mu- tuellement cohérents. Au contraire, un réseau de diffraction, suivi d’un arrêt optique pour ne conserver qu’un seul ordre, est efficace en faible cohérence temporelle, comme démontré par Leith et Upatnieks [8]. Ce phénomène est illustré sur la figure 1.4.

Il fut également envisagé d’inclure les deux faisceaux de l’interféromètre de

Mach–Zehnder dans un seul bras, en partageant le même système de lentilles ;

les deux faisceaux se propageant côte à côte [57]. L’utilisation d’une lumière

de cohérence spatiale élevée est requise dans ce cas.

1.2.2.4 Autres méthodes d’extraction de la phase en interféromé- trie

L’hétérodynage en fréquences temporelles fut également envisagé pour ex- traire l’amplitude complexe. Dans cette configuration, le faisceau objet et le faisceau de référence sont décalés en fréquence (temporelle) grâce à l’oscilla- tion d’un miroir monté sur un module piézoélectrique [58, 59] ou à l’aide de modulateurs acousto-optiques [60].

Dans une configuration interférométrique en transmission, avec l’un des mi- roirs monté sur un module piézoélectrique, il fut également envisagé de me- surer à phase constante, c’est-à-dire de compenser les modifications de phase induites par l’objet en adaptant la différence de potentiel électrique aux bornes du module piézoélectrique [61]. La mesure de la phase est alors déduite de la différence de potentiel appliquée. Cette méthode, permettant une très bonne qualité d’image de phase, obtenue en outre sans l’ambiguïté usuelle à 2fi près, est cependant lente car elle requiert un balayage latéral et nécessite un traite- ment préalable de l’échantillon.

1.2.2.5 Génération d’un faisceau de référence à partir du faisceau objet

En 1965, Cathey [62, 63] inventa une méthode, appelée « génération d’un faisceau de référence local en holographie », permettant de générer le faisceau de référence à partir du faisceau traversant l’objet. Pour ce faire, le faisceau émanant de l’objet est séparé en deux parties dont l’une est filtrée spatialement par une petite pupille, ce qui correspond à un filtre passe-bas, afin d’approcher un vrai faisceau de référence, en réduisant fortement l’influence de l’objet.

L’avantage principal de cette technique est qu’elle fonctionne même lorsque la cohérence de la source est très faible puisque, comme la séparation a lieu en aval de l’objet, le faisceau de référence et le faisceau objet sont issus du même faisceau, sans modulation subséquente par un objet. Les faisceaux sont donc mutuellement cohérents, même pour des objets impliquant un déphasage correspondant à la longueur de cohérence ou supérieur.

Indebetouw et Klysubun [58] adaptèrent plus tard cette méthode à l’hologra-

phie numérique, en utilisant l’hétérodynage en fréquences temporelles. Cette

technique fut également utilisée avec la méthode du décalage de phase, où seule

la portion centrale du faisceau (dans le domaine de Fourier) subit un décalage

de phase, par exemple avec un modulateur spatial de lumière [64], y compris

avec une lumière de faible cohérence temporelle [28,65,66]. La même méthode

fut aussi proposée en configuration désaxée, avec le calcul de la phase par la

méthode de Fourier [67].

Des configurations interférométriques à un bras furent également dévelop- pées selon ce principe ; les montages à un bras étant, en principe, plus robustes.

Popescu et alii développèrent une configuration interférométrique désaxée à un bras ; la caractéristique hors axe permet l’enregistrement de l’hologramme en une seule acquisition [68, 69]. Un réseau de diffraction est placé dans le plan de l’image de l’objet. Dans la suite du montage, seuls les ordres de diffraction 0 et 1 sont sélectionnés. L’un des deux ordres est filtré passe-bas de manière à approcher un faisceau de référence. Les deux ordres sont recombinés et inter- fèrent ; la phase est extraite comme dans une configuration de Mach–Zehnder hors axe classique [68]. Cette configuration fut ensuite utilisée avec un éclairage en lumière blanche spatialement cohérente, mais temporellement incohérente, pour réduire le bruit de tavelure [70].

Une méthode employant un principe similaire, mais utilisant le décalage de phase et nécessitant donc l’enregistrement de quatre images, fut par ailleurs utilisée en aval d’un microscope à contraste de phase de Zernike [32,71]. Dans ce cas, le faisceau à la sortie du microscope voit sa phase décalée sur un anneau, correspondant à la lumière non diffractée. Cet anneau se rapporte donc au faisceau de référence des interféromètres classiques. Cependant, la méthode ne fournit qu’une approximation de la phase et le halo caractéristique de la microscopie à contraste de phase reste présent sur les images. Cette méthode fut utilisée avec une approche tomographique, où une succession d’images sont enregistrées le long de l’axe optique, subissant ensuite un traitement numérique de déconvolution [72].

Cependant, il est à noter que, dans toutes ces configurations, le faisceau objet filtré passe-bas ne peut être considéré comme un faisceau de référence classique qu’en première approximation. En effet, pour qu’un objet générale- ment quelconque n’influence en rien ce faisceau, il faudrait que l’ouverture du filtre soit de très petite taille. Or, pour observer les interférences, une quantité suffisante de lumière doit former le faisceau de référence. L’aspect quantitatif de la phase extraite ne semble donc pas assuré dans ce cas et la faculté de reconstruction holographique pourrait être altérée.

1.2.3 Holographie numérique par interférométrie diffé- rentielle

Une configuration interférométrique à un bras mesurant les phases diffé-

rentielles dans deux directions orthogonales fut également envisagée, d’abord

développée au sein de notre laboratoire [20, 73]. Celle-ci utilise un réseau de

diffraction en aval de l’objet, placé près du plan image du microscope, composé

de deux réseaux multilignes croisés. Le réseau est placé légèrement hors focus,

de telle manière à ce que l’ordre zéro et les premiers ordres de diffraction soient

légèrement décalés latéralement. Seuls l’ordre zéro et un ordre dans chacune