Vecteur pLew82 NLS N-TAP Vecteur pTSARib TAP
A
B
Tet op
Prom NLS TAP
Tet R
Gène I
TAP
Gène I
Figure 3.1 : Représentation des différents vecteurs utilisés au cours de ce travail et permettant l'étiquetage par le TAP d'une protéine d'intérêt
Prom Promoteur T7
Tet op Opérateur de l'opéron tétracycline
Tet R Répresseur tétracycline
Gène
Gène ou morceau du gène d'intérêt
NLS Séquence de
localisation nucléaire TAP Séquence codant pour
l'étiquette TAP
A : vecteur permettant l'expression constitutive d'un protéine étiquetée par le TAP en C-terminal B et C : vecteurs permettant l'expression inductible d'une protéine étiquetée par le TAP en N-terminal
C
Vecteur pLew100 NLS N-TAP
Tet op
Prom NLS TAP
Tet R
Gène I
Prom Promoteur T7 muté
Gène R
Gène R Prom
Gène R Gène de résistance aux antibiotiques Gène R
Vecteur d'ARNi
Figure 3.2 : Représentation des vecteurs utilisés au cours de ce travail et permettant l'invalidation par ARNi d'un gène d'intérêt
Tet op
Prom
Tet R
Gène
Tet R
Tet op Prom
Prom Promoteur T7
Tet op Opérateur de l'opéron tétracycline
Tet R Répresseur tétracycline
Gène
Gène ou morceau du gène d'intérêt
L. major
51% / 68%
(6.7.10-77)
49% / 62%
(2.9.10-239)
52% / 65%
(7.4.10-93) 73% / 84%
(0)
55% / 71%
(3.9 10-266)
83% / 93%
(1.8.10-39)
71% / 87%
(6.5.10-34) 23% / 41%
(1.10-9) 42% / 63%
(2.10-94) 38% / 62%
(6.10-103) 25% / 40%
(2.10-11)
S.cerev
26% / 39%
(6.10-11) 42% / 61%
(10-88) 41% / 62%
(10-172) 25% / 41%
(4.10-14)
H. sapiens
Tbp52 (500 aa) (Tb10.70.1900) TbXPB (938 aa)
(Tb927.3.5100) TbXPD (803 aa)
(Tb927.8.5980) Tbp44 (351 aa) (Tb927.8.6540)
TbXPBz (777 aa) (Tb11.01.7950)
37% / 54%
(2.10-77)
32% / 49%
(4.10-85)
Tbp62 (595 aa) (Tb11.02.2870) TbTFB5 (90 aa)
(Tb11.03.0815)
27% / 66%
(136 aa, 0.36) 33% / 56%
(48 aa, 0.027)
T. cruzi
63% / 74%
(1.5.10-115) 80% / 90%
(0) 68% / 79%
(0)
58% / 73%
(2.5.10-159) 65% / 78%
(8.10-266)
39% / 56%
(1.6.10-100)
29% / 47%
(1.2.10-21)
Figure 3.3 : Analyse des sous-unités homologues de TFIIH chez T.brucei
Le résumé des comparaisons de séquences entre les sous-unités p44, XPD, XPB, XPBz, p52, p62 et TFB5 de T.brucei avec celles de l'homme (H. sapiens), de la levure Saccharomyces cerevisae (S.
cerev), et des trypanosomatides T. cruzi, et L. major est présenté dans ce tableau. La taille des protéines (en acide aminé) et leur numéro d'accession sont indiqués pour T.brucei. Le pourcentage d'identité/de similarité ainsi que l'E-value sont indiqués pour chaque comparaison.
A
B
Figure 3.4 : Expression des sous-unités de TFIIH au cours du cycle de vie de T. brucei L'expression des différentes sous-unités de TFIIH (indiquées à droite) a été analysée chez T. brucei au stade procyclique (PF= Procyclic Form) et aux stades sanguicoles slender (Sl) et stumpy (St) par hybridation de Northern blot (fig 3.4A) et au stade procyclique (PF) et sanguicole (BF= Bloodstream Form) par immunodétection sur Western blot (fig 3.4B). Pour les Northern blot (fig 3.4A) 5 µg d'ARN total ont été hybridés avec des sondes couvrant la totalité du gène considéré. La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (panneau du haut). Pour les Western blot, des extraits totaux de protéines séparés par électrophorèse et transférés sur nitrocellulose ont été incubés avec des anticorps de lapin spécifiques. Les tailles des marqueurs de poids moléculaires utilisés sont indiquées à gauche des gels.
TbXPD TbXPB
TbXPBz Tbp52
TbTFB5 Tbp44 PF Sl St
Tbp62
Contrôle de charge
kDa PF BF
anti- Tbp44
30 43
97 anti-
TbXPD
B
anti- TbXPB 97
TbXPD CTAP
XPDK732W CTAP
anti-Tbp44
30 97 66
50
kDa
TbXPD CTAP
XPDK732W CTAP
Nitrate d'argent
97 66
50 30
kDa
anti−−−−TbXPD
97 66
50 TAP
Tbp44 CTAP
kDa
TAP
Tbp44 CTAP
97 66
50
Nitrate d'argent kDa
Tbp52
(55.9 kDa)
TbXPB
(110 kDa)
TbXPD
Tbp44
(37 kDa)
TAPtag
NTAP TbXPD
kDa 97
68
43
30
20
A
B
1 2 3 4
- 97 - 66 - 43 - 30
kDa 1= Ctrl TAP
2= TbP44-CTAP 3= TbXPD-CTAP 4= TbK732W-CTAP 5= NTAP-TbXPD
C
TbXPD CTAP 130 -
90 -
kDa J0 J1 J2 Jours en présence de Dox
5
Figure 3.5 : Mise en évidence d'un complexe TFIIH chez T.brucei
A : Western-blot montrant l'expression, au stade procyclique, du TAP seul (1) et de différentes protéines recombinantes du complexe TFIIH, indiquées par un n° se référant à la légende. Les membranes sont révélées à l'aide d'un anticorps anti-TAP. La protéine NTAP-TbXPD a été induite avec de la doxycycline pendant 1 et 2 jours. La taille des marqueurs de poids moléculaire utilisés est indiquée.
B et C : Purification du complexe TFIIH par chromatographie d'affinité, à partir de parasites au stade procyclique exprimant une version étiquetée par le "TAP-tag" des protéines Tbp44, TbXPD ou de la version mutée de TbXPD appelée XPDTbK732W (ces différentes protéines sont étiquetées en C-term). Ces extraits purifiés ont été analysés par coloration au nitrate d'argent (fig 3.5B, partie gauche) et par Western blot (fig 3.5B, partie droite) avec l'anticorps indiqué. Les flèches noires montrent les bandes spécifiques correspondant aux protéines d'intérêt. La version étiquetée par le TAP en N-term de TbXPD a elle aussi fait l'objet de purification par affinité (fig 3.5C, partie droite). Les protéines du complexe purifiées à paritr de XPD étiqueté en C-term ou en Nterm ont été colorées au SYPRO et les bandes spécifiques (qui ne se retrouvent pas dans le contrôle exprimant le TAPtag seul (fig 3.5C, panneau de gauche) ont été analysées par spectrométrie de masse. Seules les protéines appartenant au complexe TFIIH sont indiquées.
46 66 97
kDa
97 220
66
γ-32P ATP
1 2 3 4
1= Ctrl TAP 2= TbP44 CTAP
1 3
kDa
32P ATP
α γ α γ
A B
3= TbXPD CTAP 4= TbK732W TAP
Figure 3.6 : Mise en évidence d'une activité kinase au sein du complexe TFIIH de T. brucei Un test d'activité kinase a été réalisé sur le complexe TFIIH de T.brucei. Le complexe TFIIH a été purifié à partir de différentes souches de parasites au stade procyclique exprimant l'une des protéines du complexe étiquetée par le TAP. Ces différentes souches sont représentées par un numéro et la protéine qui y est étiquetée est indiquée dans le bas de la figure. Les complexes purifiés ont été incubés en présence de γ- 32P ATP ou d' α-32P ATP comme indiqué en bas du gel, séparés par électrophorèse et visualisée par autoradiographie. La taille des marqueurs de poids moléculaire utilisés est indiquée à gauche de chaque gel.
PF
0 1 2 3 4 J ARNi Tbp44
ctrl
Log (nombre de cell)
BF
Log (nombre de cell)
- Dox + Dox
ARNi TbXPD
0 1 2 3 4 J 10
1 0.1
100
ARNi TbXPB
10 1 0.1
0 1 2 3 4 J ARNm
ARNdb
0 1 2 3 J 10
1 0.1 100
0.01
0 1 2 3 4 J 10
1 0.1 100
0.01 ctrl ctrl
ARNm ARNdb
0.1 1 10 100
0 1 2 3 J ctrl
0.1 1 10 103 102
0 1 2 3 4 J ARNi TbXPBz
0.1 1 10 100
0 1 2 3 4 J
ctrl 0 1 3 5 J 0 2 4 6 J ctrl
0 1 2 3 4 5 6 7 J
0.1 1 10 100 103 100
Figure 3.7 : Phénotypes de croissances observés suite à l'invalidation de différentes sous- unités du complexe TFIIH chez T.brucei
L'invalidation des sous-unités TbXPD, TbXPB, TbXPBz et Tbp44 a été réalisée aux stades procyclique (PF, panneaux du haut) et sanguicole (BF, panneaux du bas). Les graphiques montrent les courbes de croissance des parasites en absence (triangles noirs) ou en présence (carrés noirs) de doxycycline pour différentes périodes de temps (J= nombre de jours). Les Northern blot, hybridés avec une sonde correspondant au gène invalidé sont montrés en dessous de chaque graphique. La flèche noire indique l'ARNm et la flèche blanche indique l'ARN double brin (ARNdb).
0 1 2 3 4
Pol II
H2B TUB
0 1 2 3
ARNt
PF BF
Jours en présence de Dox Jours en présence de Dox
BrEth
Pol III
20 60 100 140
H2B TUB ARNt Rib 18S
J0 J2 J4
J0 J2
A
B
%
Rib 18S Rib 18S +
promoter
C
J0 J2 1
0.8 1
0.4
Figure 3.8 : Effet de l'ARNi de TbXPB sur la transcription
A : Analyse de la variation de la quantité de transcrits. Les ARN de trypanosomes aux stades procyclique (PF) et sanguicole (BF) ont été extraits au cours de la cinétique d’invalidation du gène TbXPB (le temps d'incubation des parasites en présence de doxycycline est indiqué en haut) et analysés par hybridation de Northern blot. Les gels ont été chargés sur base de la densité optique des échantillons, de sorte que chaque piste contient une quantité équivalente d’ARN. La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (BrEth, panneaux du bas) et l’ARN a été hybridé par des sondes correspondant aux gènes d'histone H2B (H2B), de TUBULINE (TUB) ou d'ARNt. Les polymérases qui transcrivent ces différents gènes sont indiquées à gauche.
B : Analyse de la transcription primaire par marquages métaboliques . Des fragments d'ADN des gènes indiqués (l'histone H2B (H2B), la TUBULINE (TUB), l'ARNt et l'ADNr 18S (Rib 18S)) ont été transférés par dot blot sur membranes de nitrocellulose. Ces ADN ont été hybridés avec des ARN marqués au 32P et extraits de parasites procycliques qui contiennent les vecteurs d’invalidations pour TbXPB.Ces parasites ont été perméabilisés et incubés avec du 32P-UTP après 0 (boites noires), 2 (boites grises) ou 4 (boites blanches) jours en présence de doxycycline. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différents gènes a été quantifié avec un Instant Imager et exprimé sous forme d'histogramme en pourcentage, 100 % représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
D : Analyse de la transcription primaire par "run-on". Des fragments d'ADN correspondant au promoteur et au début du gène Rib 18S (Rib 18S + promoteur), ou à la fin de ce même gène (Rib 18S), ont été transférés sur membrane de nitrocellulose par Southern blot et hybridés avec des ARN naissants marqués au 32P et synthétisés in vivo à partir de noyaux isolés. Ces noyaux ont été extraits de cellules au stade procyclique qui contiennent le vecteur d'invalidation pour TbXPB et qui ont été incubées pendant 0 (J0) ou 2 jours (J2) avec de la doxycycline. Le schéma sous la figure représente le locus ribosomique. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différentes portion du gène a été quantifié avec un Instant Imager et est indiqué à gauche de chaque panneau, 1 représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
PF BF
polyA+ RNA TbRPB9
Figure 3.9 : Alignement des protéines RPB9 de différentes espèces
Figure 3.10 : Expression de TbRPB9 au cours du cycle de vie de T.brucei Les séquences protéiques RPB9 d'Homo sapiens (Hs, n° d'accession GenBank: P36954) de Drosophila melanogaster (Dm, no d'accession GenBank S39445), de Saccharomyces pombe (Sp, no d'accession GenBank O74635), et de Saccharomyces cerevisiae (Sc, no d'accession GenBank P27999) ont été comparées avec celle de T. brucei (Tb, no d'accession GenBank Tb11.02.5180). La séquence consensus est indiquée en bas. Les résidus conservés dans les cinq séquences sont colorés en noir. Quand des acides aminés sont conservés dans trois ou quatre des cinq séquences, ils sont respectivement colorés en gris clair et gris foncé. Les chiffres représentent la nature physico-chimique des acides aminés (1 et 2 = acides, 3 = neutres, 4 = basiques, 5 =aromatiques, 6 = hydrophobes). Les deux domaines en doigt de zinc et les motifs conservés impliqués dans le processus de liaison à la Pol II sont entourés d'une boite en traits pleins et en traits pointillés respectivement.
L'expression de TbRPB9 a été analysée chez T.brucei au stade procyclique (PF) et au stade sanguicole (BF) par hybridation de Northern blot. 5 µg d'ARN poly- adénylé ont été hybridés avec une sonde couvrant la totalité du gène.
0 1 2 3
ARNm ARNdb
PF
Ctrl 0 8 24 30
BF
Log
Nombre de cellules x 106.ml-1
A
B
Heures 0,01
0,1 1 10
0 10 20 30
moinsDox plus Dox Jours
0,01 0,1 1 10
0 1 2 3 4
Jours avec Dox Heures avec Dox
Figure 3.11 : Phénotypes de croissance observés suite à l'invalidation de TbRPB9 par ARNi L'invalidation de la sous-unité TbRPB9 a été réalisée aux stades procyclique (PF, panneaux de gauche) et sanguicole (BF, panneaux de droite). Les Northern blot (panneaux A), hybridés avec une sonde couvrant le gène TbRPB9 montrent la disparition du messager (ARNm) et l'apparition de l'ARN double brin (ARN db) au cours de l'induction de l'ARNi. De l'ARN de cellules contrôles (Ctrl) qui ne contiennent pas la cassette d'invalidation a été hybridé parallèlement au stade sanguicole. Les graphiques (panneaux B) montrent les courbes de croissance des parasites en absence (losanges noirs) ou en présence (losanges blancs) de doxycycline pour différentes périodes de temps (indiqués sur l'axe des abscisses).
TUB H2B
0 24 48
BrEth
ctrl 0 8 24
PF BF
Heures en présence de Dox Heures en présence de Dox
ADN + transcription
Contraste de phase
-Dox -Dox
+Alpha
+Dox
ARNt
A
B
Figure 3.12 : Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la transcription
A : Analyse de la quantité de transcrits. Les ARN de trypanosomes aux stades procyclique (PF) et sanguicole (BF) ont été extraits au cours de la cinétique d’invalidation du gène TbRPB9 (le temps d'incubation des parasites en présence de doxycycline est indiqué en haut) et analysé par hybridation de Northern blot. Les gels ont été chargés sur base de la densité optique des échantillons, de sorte que chaque piste contient une quantité équivalente d’ARN. La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (BrEth, panneau du bas) et l’ARN a été hybridé par des sondes correspondant aux gènes d'histone H2B (H2B), de TUBULINE (TUB) ou d'ARNt.
B : Analyse de la transcription primaire par "run-on" in situ. Des parasites vivants, au stade procyclique, invalidés (+dox) ou non (-dox) pour le gène d'intérêt ont été placés dans un milieu permettant la transcription. Ce milieu contient un nucléotide marqué, le Br-UTP. Les ARN nouvellement synthétisés sont visualisés par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti Br-dUTP (rouge) et l’ADN est coloré à l’aide du DAPI (bleu) (=panneau ADN + transcription). Certains parasites ont été incubés en présence d'α-amanitine avant le marquage (= images –dox, +Alpha). Les parasites correspondants sont montrés en contraste de phase sur le panneau du dessus.
Rib 18S Rib 18S +
promoteur
20 60 100
H2B TUB ARNt Rib 18S
J0 J1 J2
J0 J2
J0 J2
C
D
%
Figure 3.12 : Effet de l'ARNi de TbRPB9 sur la transcription
C : Analyse de la transcription primaire par marquages métaboliques. Des fragments d'ADN des gènes indiqués (l'histone H2B (H2B), la TUBULINE (TUB), l'ARNt et l'ADNr 18S (Rib 18S)) ont été transférés par slot blot sur membranes de nitrocellulose. Ces ADN ont été hybridés avec des ARN marqués et extraits de parasites au stade procyclique contenant le vecteur d’invalidation pour TbRPB9. Ces parasites ont été perméabilisés et incubés avec du 32P-UTP après 0 (boites noires), 1 (boites grises) ou 2 (boites blanches) jours passés en présence de doxycycline. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différents gènes a été quantifié avec un Instant Imager et est exprimé sous forme d'histogramme en pourcentage, 100 % représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
D : Analyse de la transcription primaire par "run-on". Des fragments d'ADN correspondant au promoteur et au début du gène Rib 18S (Rib 18S + promoteur), ou à la fin de ce même gène (Rib 18S), ont été transférés sur membrane de nitrocellulose par Southern blot et hybridés avec des ARN naissants marqués au 32P et synthétisés in vivo à partir de noyaux isolés. Ces noyaux ont été extraits de cellules au stade procyclique qui contiennent le vecteur d'invalidation pour TbRPB9 et qui ont été incubées pendant 0 (J0) ou 2 jours (J2) avec de la doxycycline. Le schéma sous la figure représente le locus ribosomique. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différentes portion du gène a été quantifié avec un Instant Imager et est indiqué à gauche de chaque panneau, 1 représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
1 1
0.4 0.6
Coloration SYPRO ruby RPB1 RPB2
RPB3, GPDH
RPB5
RPB6, NDPK
RPB8 RPB11 97
66
45
30
20
Ctrl kDa
RPB7 RPB9 RPB4
Histones (H2A, H2B,
H3, H4) RHS4
HSP70 ARN helicase
GAPDH J0 J1 J2
NTAP-TbRPB9
20 35 kDa
Ctrl
Anti TbRPB1 J0 J1 J0 J2
PF
BF
Jours en présence de Dox
A B
C ARNi TbRPB9
TbRPB9-
Jours en présence de Dox NTAP
Figure 3.13 : purification de la Pol II de T. brucei
A : Expression de la protéine NTAP-TbRPB9. L'expression de la protéine de fusion a été induite en incubant pendant deux jours des trypanosomes au stade procyclique contenant le vecteur pLew100 NLS TAP TbRPB9 avec de la doxycycline. Des extraits protéiques totaux, prélevés à partir de parasites ayant passé 0 (J0), 1 (J1) ou 2 (J2) jours en présence de doxycycline ont été analysés par Western blot avec un anticorps dirigé contre l'étiquette TAP. Des cellules contrôles (Ctrl), contienant le vecteur pTSARib TAPtag sont analysées sur le même gel. La taille des marqueurs de poids moléculaires utilisés est indiquée à gauche du gel.
B : Résultat de la purification. Les protéines purifiées par chromatographie d’affinité à partir de cellules au stade procyclique exprimant le TAPtag seul (Ctrl), ou la protéine TbRPB9 étiquetée (NTAP-TbRPB9) ont été séparées par électrophorèse sur gel en gradient et colorées au Sypro Ruby. Les bandes spécifiques ont été microséquencées. Les protéines correspondant aux sous-unités canoniques du complexe Pol II sont indiquées.
Des protéines n'appartenant pas à ce complexe, indiquées en italique ont également été identifiées
C :Analyse de la protéine majeure du complexe, TbRPB1. Western blots réalisés sur des extraits totaux de parasites aux stades procyclique (PF) et sanguicole (BF) après 0 (J0), 1 (J1) et 2 (J2) jours d’induction de l’ARNi TbRPB9. Le Western blot est révélé à l’aide d’un anticorps dirigé contre TbRPB1.
RPB5
RPB6
I
II
RPB8 RPB12
RPB10
I
II RPB5z
RPB5 RPB6z
RPB6
Eucaryotes
Trypanosoma brucei
RPB12
RPB10
RPB8
Figure 3.14 : Comparaison de la composition des Pol I et II des trypanosomes (schéma du bas) et d' autres eucaryotes (schéma du haut). Mise en évidence de la duplication des sous-unités RPB5 et RPB6
Chaque ARN polymérase est représentée par un ensemble. Seules les sous-unités qui sont partagées par les Pol I et II sont indiquées. Les sous-unités en gris sont celles qui présentent des particularités chez les kinetoplastides.
TbRPB5z TbRPB5
A
B
Figure 3.15 : Deux gènes codent pour chacune des isoformes RPB5 de T. brucei
A : Schéma d’une partie du chromosome 10 de Trypanosoma brucei contenant les gènes TbRPB5 et TbRPB5z. Les chiffres représentent le nombre de paires de bases entre le trait et le début du chromosome. Les boites gris foncé représentent les ORF codant pour des protéines hypothétiques. Les boites gris clair indiquent les gènes codant pour des protéines homologues à des protéines déjà identifiées. Les gènes TbRPB5 et TbRPB5z sont indiqués.
B : Comparaison des séquences protéiques des deux isoformes de RPB5. Les séquences des sous-unités RPB5 chez l’homme (Hsapiens), la levure (Scerev) et le trypanosome (Tb) ont été comparées par Clustal W. La séquence consensus est indiquée en bas. Les résidus conservés dans les quatre séquences sont colorés en noir.
Quand des acides aminés sont conservés dans deux ou trois des quatre séquences, ils sont respectivements colorés en gris clair et gris foncé. Les chiffres représentent la nature physico-chimique des acides aminés (1 et 2 = acides, 3 = neutres, 4 = basiques, 5 = aromatiques, 6 = hydrophobes). Les cadres pointillés montrent les domaines d’insertion de RPB5z. Le domaine C-terminal, qui interagit avec la sous-unité majeure du complexe est entouré d'un trait plein.
TbRPB6 TbRPB6z
TbRPB6 TbRPB6z
PF Sl St
TbRPB5
TbRPB5z
BrEth
Figure 3.17 : Expression des différentes isoformes de TbRPB5 au cours du cycle de vie de T. brucei L'expression des différentes variants des sous-unités RPB5 a été analysée chez T.brucei au stade procyclique (PF=
Procyclic Form) et aux stades sanguicoles slender (Sl) et stumpy (St) par hybridation Northern blot. 5 µg d'ARN total ont été hybridés avec des sondes couvrant la totalité du gène considéré. La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (BrEth, panneau du bas).
Figure 3.16 : Comparaison des séquences protéiques des deux isoformes de RPB6
Les séquences des sous-unités RPB6 chez l’homme (Hsapiens), la levure (Scerev) et le trypanosome (Tb) ont été comparées par Clustal W. La séquence consensus est indiquée en bas. Les résidus conservés dans les quatre séquences sont colorés en noir. Les acides aminés conservés dans trois ou quatre des cinq séquences sont respectivements colorés en gris clair et gris foncé. Les chiffres représentent la nature physico-chimique des acides aminés (1 et 2 = acides, 3 = neutres, 4 = basiques, 5 = aromatiques, 6 = hydrophobes).
45
30 66
- + - + Dox
pLew100 NLS TbRPB5
TAP tag
TbRPB5z TAP tag
A
kDa
B
TbRPB5 TAP tag
TbRPB5z TAP tag
DAPI Anti TAP
Contraste de phase
DAPI + Anti TAP
Contraste de phase + Anti TAP
Figure 3.18 : Localisation cellulaire et analyse des complexes protéiques qui interagissent avec les sous-unités TbRPB5 et TbRPB5z
A : Expression des protéines TbRPB5-TAP et TbRPB5z-TAP. L'expression de la protéine a été induite en incubant pendant 24 heures des trypanosomes au stade procyclique contenant le vecteur pLew100 NLS TbRPB5TAP ou pLew100 NLS TbRPB5zTAP avec de la doxycycline. Des extraits protéiques totaux, prélevés à partir de parasites ayant passé 0 (- Dox), ou 24h (+Dox) en présence de doxycycline ont été analysés par Western blot avec un anticorps dirigé contre l'étiquette TAP.
B : Localisation cellulaire des protéines TbRPB5-TAP et TbRPB5z-TAP. La localisation cellulaire de chaque isoforme a été analysée par immunofluorescence sur des parasites au stade procyclique exprimant la version étiquetée de la protéine TbRPB5 ou de la protéine TbRPB5z. Les protéines étiquetées sont visualisées en vert à l'aide d'un anticorps dirigé contre le TAP et l'ADN est visualisé en bleu suite à une coloration au DAPI. Les flèches blanches pointent le nucléole localisé en contraste de phase.
TbRPA12- TAP
TbRPB9- TAP
TbRPB5z- TAP
TbRPB5- TAP
TbRPA190 TbRPA135
TbRPB5z
TbRPA12
TbRPB190 TbRPB135
TbRPB5 TbRPB9
TbRPA190 TbRPA135
TbRPB5z TbRPB5z
TAP
TbRPB1 TbRPB2 TbRPC160 TbRPC128
TbRPB5 TbRPB5-
TAP
C
TbRPC40 TbRPC40
? ?
TbRPC40
TbRPB9
?
?
C : Résultat de la purification. Les protéines purifiées par chromatographie d’affinité à partir de cellules au stade procyclique exprimant la protéine TbRPB5 étiquetée (TbRPB5-TAP) ou la protéine TbRPB5z étiquetée (TbRPB5z-TAP) ont été séparés par électrophorèse sur gel en gradient et colorées au Sypro Ruby.
Les protéines du complexe Pol I (purifié à partir de TbRPA12 étiquetée (TbRPA12-TAP)) et du complexe Pol II (purifié à partir de la protéine TbRPB9 étiquetée (TbRPB9-TAP)) sont visualisées sur le même gel (panneaux de gauche). Ces complexes avaient déjà été analysés par spectrométrie de masse et les bandes d'intérêt sont indiquées. Par comparaison, nous avons pu identifier des sous-unités spécifiques de chaque polymérase au sein des complexes TbRPB5-TAP et TbRPB5z-TAP. Celles-ci ont été découpées et analysées par spectrométrie de masse. Les protéines identifiées sont indiquées en noir. Les protéines dont on suppose l'identité par comparaison mais qui n'ont pas encore fait l'objet d'analyses spectrométriques sont indiquées en gris. D'autres bandes ont été découpées (marquées d'une flèche grise) et leur identification par spectrométrie est en cours.
Figure 3.18 : Localisation cellulaire et analyse des complexe protéiques qui interagissent avec les sous-unités TbRPB5 et TbRPB5z
Protéines spécifiques du complexe Pol I Protéines spécifiques du complexe Pol II Protéines spécifiques du complexe Pol III Protéines partagées par les complexe Pol I et III
Taille (kDa)
23 45 66 116
0,1 1 10 100
0 1 2 3 4
0,01 0,1 1 10
0 1 2 3 4
0,1 1 10 100 1000
0 1 2 3 4
Ctrl 0 1 2 3
Jours avec Dox
ARNm ARNdb
ARNm ARNdb
Ctrl 0 1 2 3
ARNm ARNdb
ARNm ARNdb
Ctrl 0 1 2 3 4
Ctrl 0 1 2 3 4
Log nombre de cellules x 106.ml-1
Jours
Log nombre de cellules x 106.ml-1
PF
BF
PF
BF
moins Dox plus Dox
a b
a b
Jours
Jours Jours moinsDox
plus Dox
0 1 2 3 4
0,1 1 10 100 1000
Jours avec Dox
Jours avec Dox
Jours avec Dox
A
B
Figure 3.19 : Phénotypes de croissance observés suite à l'invalidation de TbRPB5 (panneaux A) et de TbRPB5z (panneaux B) par ARNi
L'invalidation de chaque isoforme de RPB5 a été réalisée aux stades procyclique (PF) et sanguicole (BF). Les graphiques (panneaux a) montrent les courbes de croissance des parasites possédant le vecteur d'invalidation pour la sous-unité TbRPB5 (panneaux A) ou pour la sous-unité TbRPB5z (panneaux B) et cultivés en absence (carrés blancs) ou en présence (points noirs) de doxycycline pour différentes périodes de temps (indiquées sur l'axe des abscisses). Les Northern blot (panneaux b), hybridés avec une sonde spécifique du gène TbRPB5 (panneaux A) ou du gène TbRPB5z (panneaux B) montrent la disparition du messager (ARNm) et l'apparition de l'ARN double brin (ARN db) au cours de l'induction de l'ARNi. De l'ARN de cellules contrôles (Ctrl) qui ne contiennent pas la cassette d'invalidation a été hybridé parallèlement.
ARNi TbRPB5
ARNi TbRPB5z
Souche 1
Produit
PCR 1 Genet R
RPB5z RPB5z
Parasites sauvages
Transfection 1: Genet R
KO2xGH
Genet R Hygro R Hygro R
RPB5z
Produit PCR 2
RPB5z Souche 1
Parasites sauvages
Transfection 2: Hygro R
Souche 4 Résultat de la transfection 2
A: Stratégie utilisée pour invalider TbRPB5z par Knock-out. Des produits PCR contenant respectivement les gènes de résistance à la généticine (Genet R, produit PCR 1) ou à l'hygromycine (HygroR, produit PCR 2) et des régions homologues aux régions 3' et 5' UTR de TbRPB5z ont été transfectés dans différentes souches de parasites au stade procyclique. La région génomique théorique du locus TbRPB5z est schématisée pour ces différentes souches, représentées par des éllipses. Les ORF des différents gènes sont représentées par des boites colorées et les régions 3' et 5' UTR sont représentées par des boites blanches. La souche 1 correspond à des parasites sauvages, la souche 2 correspond à des parasites transfectés avec le produit PCR Hygro R (parasites KO1xHR) la souche 3 correspond à des parasites transfectés avec le produit PCR Genet R (parasites KO1xGR) et la souche 4 correspond à des parasites ayant été transfectés avec les produits PCR Genet R et Hygro R (KO2xGH). Les flèches montrent la succession des transfections réalisées.
Figure 3.20 : Knock-out de TbRPB5z
A
B : Les cellules invalidées présentent des malformations.
Des analyses par microscopie ont été réalisées sur les cellules doublement résistantes (cellules KO2xGH) en
"phase de latence". Les parasites sont montrés en contraste de phase et l'ADN est visualisé en bleu par coloration au DAPI
Phase DAPI
B
Hygro R
RPB5z
KO1xGR
Genet R
Souche 3
Produit PCR 2
RPB5z
Hygro R
KO1xHR
Souche 2
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 TbRPB5
TbRPB5z A
A+D C+D B+D
Amorces utilisées 1
Taille (Kb)
1,951
2 3 4
B E
B+E
Amorces utilisées
Taille (Kb)
1.024
500 1000 Taille
(pb)
Hygro R D
Taille (pb)
1650 3000
300 TbRPB5
B
2 Hygro R 2,078
E D
C D
TbRPB5
C D
3 Genet R 1,693
500 1000 2000 1650 3000
PM PM PM
Figure 3.20 : Knock-out de TbRPB5z
C et D : Analyse des populations résistantes par PCR. L'allèle d'intérêt de la région génomique théorique du locus TbRPB5z est schématisée pour les différentes souches obtenues par transfection (numérotées de 1 à 4, voir figure 22A) dans le haut de la figure. Les gènes sont représentés par des boites colorées. La position des amorces (A, B, C, D et E) utilisées pour les différentes PCR est indiquée. La taille théorique des produits PCR résultants est indiquée à droite de la figure. Le bas de la figure montre l'électrophorèse réalisée sur ces différents produits PCR, visualisés par coloration au bromure d'éthidium. Ces PCR ont été réalisées sur chacune des souches, indiquées par un numéro. La taille des marqueurs de poids moléculaire (PM) utilisés est indiquée en paires de bases (pb) à gauche de chaque gel.
H2B TUB Ctrl 0 1 2 3
Jours en présence de Dox
BrEth
Ctrl 0 1 2 3 4
Jours en présence de Dox
ARNi TbRPB5
ARNi TbRPB5z
RPB5z RPB5
- Dox + Dox
DAPI α-BrdUTP Superposition DAPI α-BrdUTP Superposition + αAm
H2B TUB H2B TUB
20 60 100
20 60 100
J0 J2
J0 J4
J0 J2
J0 J4
A
B
C
Figure 3.21 : Effet de l'ARNi de TbRPB5 (panneaux de gauche) et de TbRPB5z (panneaux de droite) sur la transcription Pol II
A : Analyse des transcrits matures. Les ARN de trypanosomes au stade procyclique (PF) ont été extraits au cours de la cinétique d’invalidation des gènes TbRPB5 (panneau de gauche) et TbRPB5z (panneau de droite). Le temps d'incubation des parasites en présence de doxycycline est indiqué en haut. Ces ARN ont été analysés par hybridation de Northern blot. Les gels ont été chargés sur base de la densité optique des échantillons, de sorte que chaque piste contient une quantité équivalente d’ARN. La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (BrEth, panneaux du bas) et l’ARN a été hybridé par des sondes correspondant aux gènes d'histone (H2B), de TUBULINE (TUB) de TbRPB5 ou de TbRPB5z comme indiqués.
B : Analyse de la transcription primaire par "run-on" in situ: Des parasites au stade procyclique, vivants, invalidés (+dox) ou non (-dox) pour le gène d'intérêt ont été placés dans un milieu permettant la transcription. Ce milieu contient un nucléotide marqué, le Br-UTP. Les ARN nouvellement synthétisés sont visualisés par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti Br-dUTP (rouge) et l’ADN est coloré à l’aide du DAPI (bleu). Des parasites non invalidés ont été incubés en présence d'α- amanitine avant le marquage (= images + αAm).
C : Analyse de la transcription primaire par marquages métaboliques. Des fragments d'ADN des gènes indiqués (l'histone H2B (H2B) et la TUBULINE (TUB)) ont été transférés par Dot blot sur membranes de nitrocellulose. Ces ADN ont été hybridés avec des ARN marqués extraits de parasites au stade procycliques contenant le vecteur d’invalidation pour le gène d’intérêt. Ces parasites ont été perméabilisés et incubés avec du 32P-UTP après 0 (boites noires), 2 ou 4 jours (boites grises) passés en présence de doxycycline. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différents gènes a été quantifié avec un Instant Imager et est exprimé sous forme d'histogramme en pourcentage, 100 % représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
ARNt/U6
J0 J2 ARNt/U6
20 60 100
J0 J2
ARNt/U6 J0 J4
J0
20 J4
60 100
ARNi TbRPB5
ARNi TbRPB5z
Ctrl 0 1 2 3
Jours en présence de dox
Ctrl 0 1 2 3 4
Jours en présence de dox
BrEth
A
B
Figure 3.22 : Effet de l'ARNi de TbRPB5 (panneaux de gauche) et de TbRPB5z (panneaux de droite) sur la transcription Pol III.
A : Analyse des transcrits matures. Les ARN de trypanosomes au stade procyclique ont été extraits au cours de la cinétique d’invalidation des gènes TbRPB5 (partie gauche) et TbRPB5z (partie droite) respectivement. Le temps d'incubation des parasites en présence de doxycycline est indiqué en haut.
Ces ARN ont été analysés par hybridation de Northern blot. Les gels ont été chargés sur base de la densité optique des échantillons, de sorte que chaque piste contient une quantité équivalente d’ARN.
La charge a été contrôlée par coloration au bromure d’éthidium (BrEth, panneaux du bas) et l’ARN a été hybridé avec une sonde couvrant le locus contenant le gène d'ARNt et le gène U6.
B : Analyse de la transcription primaire par marquages métaboliques. Des fragments d'ADN couvrant le locus contenant le gène d'ARNt et le gène U6 ont été transférés par Dot blot sur membranes de nitrocellulose. Ces ADN ont été hybridés avec des ARN marqués extraits de parasites procycliques contenant le vecteur d’invalidation pour le gène d’intérêt. Ces cellules ont été perméabilisées et incubées avec du 32P-UTP après 0 (boites noires), 2 ou 4 jours (boites grises) passés en présence de doxycycline. Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différents gènes a été quantifié avec un Instant Imager et est exprimé sous forme d'histogramme en pourcentage, 100 % représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
0 45 75 180 Temps (min)
Chase labeling
ARNi TbRPB5
ARNi TbRPB5z
0 1 2 0 2 3 4 Jours avec Dox Jours avec Dox
Pulse labeling
Calibration avec un ARNm exogène
18 S 5.8 S 28 S
28 S
18 S
18 S
28 Sα 28 Sβ
3.7 Kb 5.9 Kb 5.1 Kb
28 S
A B C
28 S
9.6 Kb
4.3 Kb
2.2 Kb 1.8 Kb 1.5 Kb
Taille
0 50 100 150 200
250 J0
J2 J4
α
β γ
αβ αγ αβ αγ
5.8 S
A B
ARN précurseurs
ARN matures
% Figure 3.23 : Effet de l'ARNi de TbRPB5 et de TbRPB5z
sur la transcription Pol I
A : Maturation des ARNr de T. brucei. Le schéma de gauche montre les étapes de maturation des ARNr (Barth et al. 2005).
Les flèches noires montrent les sites de clivages successifs. La taille des fragments obtenus suite à ces clivages est indiquée.
Le panneau de droite est le résultat d'une expérience de "chase labeling« réalisés sur des parasites procycliques. Des ARN marqués à l'adénosine tritiée ont été extraits après différents temps de "chase" comme indiqué, séparés sur gel dénaturant et visualisés par autoradiographie. Les bandes à 5.9 et 3.7 kb qui diminuent pendant le "chase" correspondent aux deux ARNr précurseurs (après clivage A). Les bandes à 5.1 et 4.3 kb correspondent aux transcrits intermédiaires (après clivages B et C). Les plus petites bandes correspondent aux transcrits matures.
B : Maturation des ARNr au cours des ARNi TbRPB5 (panneau de gauche) et TbRPB5z (panneau de droite). Le marquage des ARN totaux a été effectué sur des parasites procycliques invalidés pour les gènes mentionnés après différents temps d'incubation en présence de doxycycline (jours avec Dox). L'ARN marqué à l'adénosine tritiée a été extrait à partir d'un nombre constant de cellules, séparé par électrophorèse et visualisé par fluorographie. Un ARNm exogène a été ajouté avant l'extraction et sert de calibration.
L'histogramme du bas montre le rapport entre la quantité d'ARN 28 S non mature (5.9 kb, α) et la quantité d'ARN 28 S mature (1.8 kb, β; 1.5 kb, γ) avant (J0, boites noires) ou après induction à la doxycycline (J2 et J4, boites grises). Ces rapports sont exprimés en %, 100% correspondant au rapport entre le précurseur et le transcrit mature au J0.
20 60 100
Rib 18S J0 J2
20 60 100
Rib 18S D0 D4 J0 J4
D0 D2
C
ARNi TbRPB5
ARNi TbRPB5z
Figure 3.23 : Effet de l'ARNi de TbRPB5 et de TbRPB5z sur la transcription Pol I
C : Analyse de la transcription primaire par marquages métaboliques. Des fragments d'ADN couvrant le gène Rib 18S ont été transférés par Dot blot sur membranes de nitrocellulose. Ces ADN ont été hybridés avec des ARN marqués extraits de parasites au stade procycliques contenant le vecteur d’invalidation pour le gène d’intérêt. Les cellules ont été préalablement perméabilisées et incubées avec du 32P-UTP après 0 (boites noires), 2 ou 4 jours en présence de doxycycline (boites grises). Le taux d'hybridation des ARN marqués sur les différents gènes a été quantifié avec un Instant Imager et est exprimé sous forme d'histogramme en pourcentage, 100 % représentant le taux d'hybridation obtenu dans les cellules non induites (J0).
Exemples de marquages
« fragmentaires » Exemples de marquages
non « fragmentaires »
TbRPB5z
Pas de phénotype TbRPA12
TbRPA190
Effet de l'ARNi Nom du gène
invalidé
A
B
DAPI L1C6 Superposition
DAPI L1C6 Superposition Retard de
croissance Létal
Figure 3.24 : Effet de l'ARNi de TbRPB5z sur la structure du nucléole
A : Effet de différents ARNi Pol I sur la survie des parasites. Trois gènes appartenant au complexe Pol I ont été invalidés par ARNi et le phénotype de croissance induit par ces différents ARNi sur des parasites au stade procyclique est présenté dans ce tableau.
B : Exemples de marquages nucléolaires. Des immunofluorescences ont été réalisées dans des parasites au stade procyclique, invalidés ou non pour différentes sous-unités du complexe Pol I (TbRPA190, TbRPB12, TbRPB5z). Le marquage (vert) est réalisé à l'aide de l'anticorps L1C6 dirigé contre une protéine nucléolaire. L'ADN est visualisé en bleu suite à une coloration au DAPI. Des exemples de marquages "fragmentaires" et non "fragmentaires" sont présentés.
