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Effets des polyphénols de vin rouge sur la prolifération
cellulaire et sur le métabolisme du resvératrol
Frédéric Mazué
To cite this version:
Frédéric Mazué. Effets des polyphénols de vin rouge sur la prolifération cellulaire et sur le métabolisme du resvératrol. Sciences agricoles. Université de Bourgogne, 2011. Français. �NNT : 2011DIJOS090�. �tel-00762764�
UNIVERSITE DE BOURGOGNE
INSERM U866 / UFR SVTE / Ecole doctorale Environnement-Santé-STIC
T
HESE
Pour l’obtention du grade de
Docteur de l’Université de Bourgogne
Spécialité : Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire
Soutenance de thèse par
Frédéric
MAZUE
19 décembre 2011
E
FFETS DES POLYPHENOLS DE VIN ROUGE SUR
LA PROLIFERATION CELLULAIRE ET SUR LE
METABOLISME DU RESVERATROL
Membres du jury :
M. Philippe JEANDET, Pr., Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims.
RapporteurM. Gilbert KIRSCH, Pr., Université Paul Verlaine, Metz.
RapporteurM. Bernard WALTER, Pr., Université de Haute-Alsace, Colmar.
ExaminateurM. André SEGALA, Dir. BIVB, Beaune.
ExaminateurM. Dominique DELMAS, M.C.U., Université de Bourgogne, Dijon.
Co-directeur de thèseM. Norbert LATRUFFE, Pr., Université de Bourgogne, Dijon.
Directeur de thèseII
Thèse financée avec l’aide
- Du Conseil Régional de Bourgogne
- Du Bureau Interprofessionnel des Vins de Bourgogne
- De l’Université de Bourgogne
- De l’INSERM
III
Remerciements
Je tiens à remercier en premier lieu mes directeurs de thèse et initiateurs de ce projet sans qui cette thèse n’aurait jamais vu le jour : Norbert Latruffe et Dominique Delmas.
Un grand merci également aux financeurs de cette étude car il est bien connu que l’argent est le nerf de la guerre : le Bureau Interprofessionnel des Vins de Bourgogne et le Conseil Régional de Bourgogne. Doublement merci à Monsieur André Ségala, Madame Christine Monamy et Monsieur Jean-Philippe Gervais qui nous ont également permis de produire les vins.
Mon comité de suivi de thèse fut également d’une grande aide, merci donc à Madame Michelle Guilloux-Bénatier et Monsieur Eric Solary pour leurs conseils tout au long de ces années.
Merci aussi bien évidement aux membres du jury qui ont accepté d’évaluer cette thèse. Monsieur Bernard Walter, président de ce jury et Messieurs Philippe Jeandet et Gilbert Kirsch, rapporteurs. Merci à vous d’avoir pris du temps à consacrer à mon travail.
Je remercie également tous ceux qui ont collaboré aux expérimentations :
Concernant les vins, merci à l’unité expérimentale INRA de Pech Rouge à Gruissan, et plus particulièrement à Monsieur Michel Mikolajczak pour la concentration des vins de 2008. Merci aussi à Madame Dominique Champion de l’ex-ENSBANA pour les tentatives de lyophilisation, même si on ne peut pas gagner à tous les coups. Une fois les vins et concentrés produit, il a bien fallu les analyser, l’aide de CESEO à été déterminante. Merci donc à Monsieur David Chassagne qui nous a quitté trop tôt, merci à Madame Laurence Noret pour tous les conseils et le soutien technique lors de l’analyse des vins par HPLC. Thank you very much à ceux qui ont permis les tests in vivo : Monsieur Nitin Telang de la société Palindrome Liaisons, ainsi que Monsieur Rajendra G. Mehta de l’IIT Research institute de Chicago.
IV Enfin pour toute la partie chimie, un grand merci aux équipes de chimistes de Monsieur Corrado Tringali à Catane et de Monsieur Philippe Meunier à l’ICMUB voisin. Merci en particulier à Madame Dominique Vervandier-Fasseur et Malik Chalal pour nos diverses collaborations.
La recherche, ça ne se fait pas tout seul isolé loin de tous, donc je tiens également à remercier mes collègues étudiants et assimilés : Didier Colin, Virginie Aires, Emeric Limagne, Sylvie Jeanningros, Sira Macalou, Jessica Gobbo, Sarah Mombelli, Maÿliss Lahaye, Audrey Membrilla, Marion Eirich, Lucie Desmoulins, Alexia Cotte, Benjamin Tournier, et Alexandre Schilling ; mes voisins de bureau, Julie, Manue, Flore, Momo ; et des autres bureaux : Allan, Jacques, Soeli, Kévin, Hammam, Ségo, Zillal, Arnaud, Thomas, Aurore, Sijo et tous les stagiaires.
Merci également aux statutaires du labo : Gérard, Franck, Nathalie, Catherine, Marie Geneviève, Stéph M, Stéphane S, Doriane, Anne, Pierre, Mouss, Patrick, Jean, Françoise ; merci à tous les membres du LBMN et de l’insermU866.
Merci à tous les membres de l’association Edifice, passés, présents et futurs.
En dehors du boulot, ceux qui ne comprennent pas toujours ce que je leur raconte sur le labo mais dont le soutient m’a été nécessaire : Timmy, Masie et leurs proches, Tsétsé et sa famille, mes amis numériques, Ptit Chérubin, Chouchou, Yann et sa chup, Nico, Mike, mon cousin Gérald, mes cousins de Milly, ma famille en général, et en particulier ceux à qui je dédie cette thèse : mes parents.
Enfin je ressens le besoin de remercier la thèse en elle-même. Car grâce à toi j’ai grandi. J’ai appris beaucoup de la vie en général, du travail en particulier, et des contacts humains.
1
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES ... 1
LISTE DES FIGURES... 8
LISTE DES TABLES ... 13
LISTE DES ABREVIATIONS ... 15
INTRODUCTION ET OBJECTIFS ... 17
Préambule ... 18
Objectifs ... 19
Optimiser les effets protecteurs des polyphénols de vin rouge par des combinaisons et comprendre les mécanismes ... 19
Optimiser les effets protecteurs des polyphénols de vin rouge par des modifications structurales et comprendre les relations structures-fonctions du resvératrol ... 20
PARTIE I : ASPECTS BIBLIOGRAPHIQUES ... 21
A.
Le vin ... 22
1. La vinification en rouge ... 24
2. Composition du vin rouge ... 25
a. Eau ... 25
b. Alcools ... 25
c. Sucres ... 26
d. Minéraux : ions et métaux ... 26
e. Acides ... 27
f. Matières azotées ... 27
g. Composés phénoliques ... 27
2
B.
Effets du vin sur la santé ... 29
1. Effets négatifs d’une consommation excessive de vin ... 30
2. Le French Paradox et effets positifs d’une consommation modérée de vin ... 32
C.
Le cancer ... 34
1. Cancérogenèse, tumorogenèse, et invasion métastatique... 37
2. L’apoptose ... 38
3. Le cycle cellulaire ... 39
4. Le métabolisme de détoxification des xénobiotiques ... 40
5. Le cancer colorectal ... 42
a. Données épidémiologiques ... 42
b. Anatomopathologie colorectale ... 43
c. Prise en charge médicale ... 46
6. Prévention des cancers colorectaux ... 48
D.
Les composés phénoliques du vin ... 49
1. Effets antioxydants des polyphénols du vin rouge ... 51
2. Effets des polyphénols du vin rouge contre le cancer ... 51
3. Le resvératrol ... 52
a. Les autres stilbènes du vin rouge ... 55
b. Biodisponibilité et métabolisme du resvératrol ... 55
c. Resvératrol et santé (hors cancer) ... 57
d. Resvératrol et cancer, études in vitro ... 60
e. Resvératrol et cancer, études in vivo ... 63
f. Resvératrol et cancer, études cliniques ... 63
4. Les acides phénols ... 64
5. Les flavonoïdes ... 65 a. La quercétine ... 66 b. Catéchines ... 67 c. Les anthocyanidines ... 67 d. Les anthocyanes ... 69 6. Les Tanins ... 69 a. Tanins condensés ... 69
3
7. Effets spécifiques sur la santé des combinaisons de polyphénols du vin ... 71
E.
Les analogues du resvératrol... 72
1. Analogues naturels du resvératrol ... 73
a. Le ptérostilbène ... 73
b. Le picéatannol ... 74
c. La pinosylvine ... 74
d. La combretastatine A4 ... 74
e. Les oligomères de resvératrol ... 74
2. Analogues synthétiques du resvératrol ... 75
a. Dérivés hydroxylés ... 75
b. Dérivés méthylés/acétylés ... 76
c. Autres dérivés ... 76
PARTIE II : MATERIELS ET METHODES ... 77
A.
Solutions de polyphénols ... 78
1. Solvants ... 78
2. Traitements... 78
B.
Culture cellulaire ... 79
C.
Mesure de la prolifération cellulaire et du cycle cellulaire ... 80
1. Dénombrement cellulaire par comptage manuel ... 80
2. Cristal violet ... 81
3. Evaluation du pourcentage d’apoptose avec le Hoechst 33342 ... 81
4. Etude du cycle cellulaire par cytométrie en flux ... 82
D.
Mesure du contenu en polyphénols dans les différentes solutions ... 82
1. Polyphénols totaux ... 82
4
E.
Etude du transport cellulaire du resvératrol et de son métabolisme ... 85
1. Influx de resvératrol ... 85
2. Efflux du resvératrol ... 85
3. Recherche de production de métabolites du resvératrol par les cellules ... 86
F.
Etude des effets in vivo d’un concentré de vin sur la néoplasie des polypes
induits par l’azoxyméthane ... 86
PARTIE III : RESULTATS ... 89
Chapitre 1 : Préparation et bioactivité d’extraits polyphénoliques de
vins ... 90
A.
Production et choix des vins ... 91
1. Extrait de vin de Corbières ... 91
2. Vins expérimentaux de Bourgogne ... 92
a. Production des vins ... 92
b. Concentration des vins (vins de 2008) en deux étapes ... 93
c. Extraction de polyphénols sur colonne ... 94
B.
Caractérisation des vins expérimentaux de Bourgogne ... 95
1. Contenu polyphénolique total ... 95
2. Profils polyphénoliques des vins et des concentrés en fonction du temps de macération et du millésime ... 96
a. Identification des pics en fonction du temps de rétention ... 96
b. Acide gallique ... 98
c. Catéchines ... 98
d. Resvératrol ... 99
e. Acides caftarique, coutarique et caféique ... 100
5
g. Anthocyanidines... 101
C.
Effets antiprolifératifs ... 103
1. Effets antiprolifératifs des extraits de vin de Corbières ... 103
2. Effets antiprolifératifs des concentrés Cx et C’x des vins de Bourgogne de 2008 .. 104
3. Effets antiprolifératifs des extraits Ex10 et E15g des vins de Bourgogne de 2008 et de 2009 ... 105
a. Effets antiprolifératifs des extraits de vins Ex10... 107
b. Effets antiprolifératifs des extraits de vins E15g ... 108
c. Analyse semi-quantitative des effets antiprolifératifs des différents extraits de vin de Bourgogne ... 109
D.
Recherche de synergies des polyphénols du vin avec le resvératrol sur la
prolifération cellulaire et le transport du resvératrol ... 110
1. Effets antiprolifératifs du vin enrichi en resvératrol ... 110
2. Effets antiprolifératifs de traitements binaires / ternaires de polyphénols ... 112
3. Inhibition du cycle cellulaire ... 116
4. Effets de traitements binaires sur la mort cellulaire ... 116
5. Transports du resvératrol en présence de concentré de vin ... 119
6. Transports du resvératrol en présence d’autres polyphénols ... 121
7. Métabolisme de détoxification du resvératrol en présence de concentré de vin de Bourgogne ... 124
a. Méthodologie de détection ... 124
b. Résultats préliminaires ... 125
c. Métabolisme du resvératrol dans les cellules colorectales SW480 ... 126
d. Métabolisme du resvératrol dans les cellules hépatiques HepG2 ... 126
e. Détails des métabolites ... 127
E.
Effets in vivo d’un concentré de vin sur la néoplasie des polypes
intestinaux induits par un cancérigène, l’azoxyméthane, chez la souris ... 129
1. Approche méthodologique ... 129
6
F.
Discussion du chapitre 1 ... 131
1. Les différents vins, concentrés et extraits ... 131
2. Inhibition de la prolifération cellulaire ... 132
3. Métabolisme et transports membranaires du resvératrol ... 133
4. Effets in vivo des polyphénols de vin rouge sur la néoplasie colorectale chimio-induite ... 133
Chapitre 2 : Etude de relations structure-activité du resvératrol par
l’emploi d’analogues structuraux ... 135
A.
Présentation de l’article : Les déterminants structuraux du resvératrol
pour l'activité d'inhibition de la prolifération cellulaire : études
expérimentales et de docking de nouveaux analogues. ... 136
1. Etat des lieux ... 136
2. Présentation des travaux ... 137
3. Résultats ... 138
B.
Article ... 139
C.
Discussion sur l’article et les nouveaux travaux parus depuis notre
publication ... 148
PARTIE IV : DISCUSSION, CONCLUSIONS GENERALES ET
PERSPECTIVES ... 149
A.
Le vin, un aliment à part ou une part de l’alimentation ? ... 150
1. L’intérêt d’un apport en vin ... 150
2. Contexte nutritionnel ... 150
3. Le vin, boisson alcoolisée ... 151
7
B.
La chimioprévention du cancer par les composés phénoliques du vin 153
1. Combinaisons de molécules bioactives ... 154
2. Modifications chimiques des composés phénoliques ... 155
C.
Conclusion générale et perspectives ... 156
BIBLIOGRAPHIE ... 158
ANNEXES ... 185
Liste des publications et communications réalisées au cours de l’étude ... 186
Publications en premier auteur ... 186
Articles dans des journaux à comité de lecture ... 186
Livres ... 186
Présentations de posters lors de congrès ... 187
8
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Le monument au marchand de vin de Til-Châtel, conservé au musée archéologique
de Dijon. © F. Perrodin. Musée archéologique de Dijon. ... 23
Figure 2 : Types de cancers les plus fréquents, tous pays confondus. (Source : GLOBOCAN
2008). ... 35
Figure 3 : Types de cancers les plus fréquents, tous pays européens confondus. (Source :
GLOBOCAN 2008). ... 35
Figure 4 : Types de cancers les plus fréquents en France Métropolitaine. (Source :
GLOBOCAN 2008). ... 36
Figure 5 : Représentation schématique des événements et étapes pouvant intervenir dans
les mécanismes de la cancérogenèse. ... 37
Figure 6 : Métabolisme des xénobiotiques au niveau cellulaire. Localisation cellulaire des
CYPs, GSTs, UGTs, SULTs, MDRs et MRPs. ... 41
Figure 7 : Incidence et mortalité du cancer colorectal selon les zones géographiques.
(Source : GLOBOCAN 2008). ... 43
Figure 8 : Prolifération cellulaire anormale de l’épithélium colique aboutissant à la formation
de cryptes aberrantes. A : Crypte normale, les cellules ne prolifèrent qu’au fond de la crypte. B : Les cellules épithéliales présentent une prolifération accrue. C : Les cellules s’accumulent sur le pourtour de la crypte. D : Crypte aberrante. Adapté d’après Lipkin (Lipkin, 1974). ... 44
Figure 9 : Stades de développement du cancer colorectal suivant la séquence
adénome-cancer. Une lésion dysplasique (stade 0) évolue en polype adénomateux ou adénome (stade I), puis en carcinome (stade II) qui envahit les tissus avoisinants (stade III) puis les autres organes par des métastases (stade IV). © 2005 Terese Winslow (pour le compte du NIH, institut national américain de la santé). ... 46
Figure 10 : Voie de biosynthèse du resvératrol d’après Jeandet (Jeandet et coll., 2002). La
phénylalanine est convertie successivement en Acide cinnamique, Acide para-coumarique, Para-coumaryl-CoA et Resvératrol, par l’action des enzymes Phénylalanine ammonia-lyase, Cinnamate-4-hydroxylase, CoA Ligase et Stilbène synthase. ... 54
Figure 11 : Formules chimiques de certains des principaux acides-phénols présents dans le
vin rouge. ... 65
Figure 12 : Formules chimiques de certains des principaux flavonoïdes présents dans le vin
9
Figure 13 : Formules chimiques de certaines des principales anthocyanidines présentes dans
le vin rouge. ... 68
Figure 14 : Formule chimique des principaux dérivés naturels du resvératrol et numérotation
des carbones de la structure des stilbènes. ... 73
Figure 15 : Echelle de temps et procédure expérimentale pour l’évaluation de l’efficacité de
concentrés de vin rouge de Bourgogne à inhiber l’apparition de foyers de cryptes aberrantes (FCA) chez les souris CF-1. ... 87
Figure 16 : Photographie microscopique (x40) de foyers de cryptes aberrantes (FCA) de
côlons de souris traitées à l’AOM après coloration au bleu de méthylène. ... 88
Figure 17 : Chromatogrammes HPLC du vin V2009-1 à 280, 320, 360 et 520 nm et en
fluorescence (excitation 330 nm / émission 374 nm) avec identification des pics de plusieurs polyphénols en fonction de leur temps de rétention (comparé à des standards, Tableau 7) et du maximum d’absorbance qui leur est associé. ... 97
Figure 18 : Concentrations en mg/L de l’acide gallique dans les différents vins de 2008 (n=4)
et 2009 (n=3) mesurées par HPLC. ... 98
Figure 19 : Concentrations en mg/L de catéchine et concentration en mg/L équivalent de
catéchine de l’épicatéchine dans les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC. ... 98
Figure 20 : Concentrations en mg/L du resvératrol et du picéide ou du resvératrol total
(calculé en additionnant le resvératrol aglycone et le picéide) dans les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC. ... 99
Figure 21 : Concentrations en mg/L équivalent d’acide caféique des acides caftarique,
cis-coutarique, trans-coutarique et caféique dans les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC... 100
Figure 22 : Concentrations en mg/L équivalent de quercétine de la quercétine-3-glucoside
dans les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC. ... 101
Figure 23 : Concentrations en mg/L équivalent d’oenine (malvidine-3-glucoside) de la
delphinidine, cyanidine et pétunidine dans les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC... 101
Figure 24 : Concentrations en mg/L équivalent d’oenine de la péonidine et malvidine dans
les différents vins de 2008 (n=4) et 2009 (n=3) mesurées par HPLC. ... 102
Figure 25 : Nombre de cellules SW480 après 48 heures de traitement par l’extrait de vin de
Corbières, de 0,6 à 5,7 µg/mL de polyphénols totaux (équivalent d’acide gallique). Le resvératrol est utilisé comme contrôle positif à 30 µM. La concentration finale d’éthanol dans tous les traitements est de 0,1%. ... 104
Figure 26 : Pourcentages d’inhibition de la prolifération de cellules SW480 après 48 heures
10 étape 1, C’x pour les concentrés étape 2) à 100 µg/mL de polyphénols totaux équivalent d’acide gallique. ... 105
Figure 27 : Pourcentages de cellules SW480 adhérentes évalués par coloration au cristal
violet après 48 heures de traitement par les extraits de vins de 2008 et 2009 contenant 10 fois plus de polyphénols totaux (équivalent d’acide gallique) que les vins originaux (les valeurs sont notifiées dans le Tableau 8). (n=3). ... 107
Figure 28 : Pourcentages de cellules SW480 adhérentes évalués par coloration au cristal
violet après 48 heures de traitement par les extraits de vins de 2008 et 2009 contenant 15 g/L de polyphénols totaux (équivalent d’acide gallique) (les concentrations finales utilisées pour les traitements sont notifiées dans le Tableau 8). (n=3). ... 108
Figure 29 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (10, 30 et 100 µM), du concentré de vin C’3
(100 mg/L équivalent d’acide gallique) et de leur combinaison (10 µM de resvératrol + 100 mg/L de C’3) sur les cellules de cancer colorectal SW480, mesurés par coloration des cellules adhérentes au cristal violet après 48 heures de traitement. (n=4). ... 111
Figure 30 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (10 et 30 µM), du concentré de vin C’3 (100
mg/L équivalent d’acide gallique) et de leur combinaison (10 µM de resvératrol + 100 mg/L de C’3) sur les cellules tumorales hépatiques HepG2, mesurés par coloration des cellules adhérentes au cristal violet après 48 heures de traitement. (n=4). ... 111
Figure 31 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (5 µM) et de la quercétine (5 µM) seuls ou
en combinaison pendant 48 heures contre les cellules de cancer colorectal SW480, mesurés par comptage manuel sur cellule de Mallassez avec exclusion des cellules mortes par coloration au bleu de Trypan. (n=3). ... 113
Figure 32 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (5 µM) et de la catéchine (5 µM) seuls ou en
combinaison pendant 48 heures contre les cellules de cancer colorectal SW480, mesurés par comptage manuel sur cellule de Mallassez avec exclusion des cellules mortes par coloration au bleu de Trypan. (n=3). ... 114
Figure 33 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (5 µM), de la catéchine (5 µM) et de la
quercétine (5 µM) seuls ou en combinaison pendant 48 heures contre les cellules SW480, mesurés par comptage manuel sur cellule de Mallassez avec exclusion des cellules mortes par coloration au bleu de Trypan. (n=3). ... 115
Figure 34 : Effets antiprolifératifs du resvératrol (5 µM), de la catéchine (5 µM) et de la
quercétine (5 µM) seuls ou en combinaison pendant 48 heures contre les cellules de cancer colorectal HCT116, mesurés par comptage manuel sur cellule de Mallassez avec exclusion des cellules mortes par coloration au bleu de Trypan. (n=3). ... 115
Figure 35 : Cycle cellulaire analysé par cytométrie en flux après marquage à l’iodure de
propidium de cellules SW480 traitées pendant 48 heures par 5 µM de resvératrol (Res, B), 5 µM de catéchine (Cat, C), 5 µM de quercétine (Qrc, D), ou 5 µM de chacun de ces trois polyphénols par paires (resvératrol et catéchine : E, resvératrol et quercétine : F) ou les trois simultanément (G), comparativement au témoin (A). ... 117
11
Figure 36 : Pourcentage de cellules de cancer colorectal SW620 présentant un phénotype
apoptotique après 48 heures de traitement par le resvératrol (5 µM), la catéchine (5 µM) et la quercétine (5 µM) seuls ou en combinaisons binaires ou ternaires. (n=3). ... 118
Figure 37 : Photographies microscopiques des noyaux de cellules SW620 colorées au
Hoechst 33342 après 48 heures de traitement par le resvératrol (r) ou les combinaisons resvératrol + quercétine (rq) ou resvératrol +catéchine + quercétine. Les noyaux présentant des phénotypes apoptotiques sont indiqués par des flèches. ... 118
Figure 38 : Incorporation de [3H]-resvératrol en fonction du temps dans les cellules SW480 traitées 6 heures par 100 mg/L de concentré de vin C’3 ou par une quantité d’éthanol équivalente (témoin). (n=3). ... 120
Figure 39 : Incorporation de [3H]-resvératrol pendant 10 et 15 minutes dans les cellules SW480 traitées 6 heures par 100 mg/L de concentré de vin C’3 ou par une quantité d’éthanol équivalente (témoin). (n=6). ... 120
Figure 40 : Efflux de [3H]-resvératrol en fonction du temps dans les cellules SW480 traitées 6 heures par 100 mg/L de concentré de vin C’3 ou par une quantité d’éthanol équivalente
(témoin) après une incubation de 10 minutes avec une solution de [3H]-resvératrol. (n=3).
... 121
Figure 41 : Incorporation de [3H]-resvératrol (10 µM) en fonction du temps dans les cellules SW480 en présence ou non de quercétine (10 µM). (n=3). ... 122
Figure 42 : Incorporation de [3H]-resvératrol (10 µM) en fonction de la concentration en quercétine dans les cellules SW480. (n=3). ... 123
Figure 43 : Incorporation de [3H]-resvératrol (10 µM) pendant 10 minutes dans les cellules SW480 en présence de quercétine (10 µM) (colonne 2) ou seul après un traitement de 20 heures par 10 µM ou 50 µM de quercétine (colonnes 3 et 4). (n=3). ... 124
Figure 44 : Identification des pics correspondant au resvératrol et trois de ses métabolites
dans les milieux de culture cellulaires en fonction de leurs temps de rétention spécifiques par HPLC à 320 nm. Ici est présenté à titre d’exemple le milieu de culture cellulaire enrichi en resvératrol 30 µM ayant été 48 heures au contact des cellules hépatiques HepG2. En encarts sont également représentés l’identification des pics dans les milieux enrichis en concentré de vin C’3 100 µg/mL et C’3 100 µg/mL + resvératrol 10 µM après 48 heures au contact des cellules coliques SW480. ... 125
Figure 45 : Evaluation par HPLC du pourcentage de resvératrol métabolisé dans le milieu de
culture cellulaire après 48 heures de mise en contact avec les cellules SW480. (n=1). Influence du concentré de vin C’3. ... 127
Figure 46 : Evaluation par HPLC du pourcentage de resvératrol métabolisé dans le milieu de
culture cellulaire après 48 heures de mise en contact avec les cellules HepG2. (n=1). Influence du concentré de vin C’3. ... 127
12
Figure 47 : Aires des pics détectés en HPLC correspondant au resvératrol et à ses métabolites
après 48 heures de mise au contact des cellules SW480 et HepG2 avec un milieu de culture cellulaire contenant soit 10 µM de resvératrol, 30 µM de resvératrol, 100 mg/L de concentré de vin C’3 ou une combinaison de 100 µg/mL de C’3 et de 10 µM de resvératrol. ... 128
Figure 48 : Poids moyen des animaux des groupes contrôle (♦) (n=9) et ayant reçu un régime
enrichi en concentré de vin C’3 (☐) (n=10) en fonction de l’âge des animaux (semaines). . 130
Figure 49 : Nombre moyen de foyers de cryptes aberrantes (FCA) dans les côlons de souris
contrôle (n=6) ou ayant reçu un régime enrichi en concentré de vin C’3 (n=7). Les colonnes représentent le nombre total de FCA par animal, le nombre de foyers contenant plus de 4 cryptes aberrantes, et le nombre de foyers dans les sections proximale, médiane et distale. Les pourcentages de variations entre contrôle et traités sont représentés au dessus de colonnes. ... 130
13
LISTE DES TABLES
Tableau 1 : Composition chimique du vin, à l’exception des composés phénoliques qui sont
présentés dans le Tableau 2 (page 48). *Les valeurs minimales et maximales présentées le sont à titre indicatif et proviennent d’un panel de treize publications, d’autres dosages montrent que des vins peuvent avoir une teneur allant jusqu’à 4 g/L (Rifler et coll., 2011). Adapté d’après German (German et Walzem, 2000). ... 29
Tableau 2 : Principaux composés phénoliques présents dans un panel de 13 vins rouges. *Les
valeurs minimales et maximales présentées le sont à titre indicatif et proviennent d’un panel de treize publications, d’autres dosages montrent que des vins peuvent avoir une teneur allant jusqu’à 4000 mg/L (Rifler et coll., 2011). Adapté d’après German (German et Walzem, 2000). ... 50
Tableau 3 : Composition de la phase mobile pour l’étude des polyphénols par HPLC en
fonction du temps. ... 84
Tableau 4 : Composition de la phase mobile pour l’analyse rapide de polyphénols par HPLC
en fonction du temps. ... 84
Tableau 5 : Concentrations de polyphénols totaux et de certains polyphénols particuliers
dans des extraits de vin rouge du Languedoc (Corbières A.O.C., Carignan N majoritaire). Les concentrations sont exprimées en milligrammes de polyphénols par litre de vin. Ces valeurs sont fournies par le Pr. P. L. Teissedre à partir de résultats de dosages par HPLC. ... 92
Tableau 6 : Concentration en polyphénols totaux exprimée en milligrammes de polyphénols
par litres de produit équivalents d'acide gallique. Vins de 2008 et 2009 et concentrés de 2008 sont utilisés tels quels ou en solution dilués dans l’eau. La colonne Δ représente le rapport entre la concentration de polyphénols dans le vin (ou le concentré) et la concentration dans le vin (ou le concentré) 1. ... 96
Tableau 7 : Temps de rétention théoriques (en minutes) de certains polyphénols présents
dans le vin rouge, selon le protocole d’HPLC décrit précédemment... 97
Tableau 8 : Récapitulatif de la composition qualitative et quantitative des différents
composés phénoliques analysés dans les vins expérimentaux de Bourgogne de 2008 et 2009. ... 103
Tableau 9 : Concentration (g/L) de polyphénols totaux (équivalent d’acide gallique) dans les
différents traitements appliqués aux cellules SW480 avec les extraits de vins de 2008 et 2009. Les lignes représentent les différentes solutions utilisées, les colonnes les dilutions dans le milieu de culture cellulaire. Les valeurs sont données en grammes de polyphénols totaux (équivalent d’acide gallique) par litre de milieu de culture cellulaire. ... 106
Tableau 10 : IC50 approchés des différents extraits de vins expérimentaux de Bourgogne de 2008 et 2009, calculés à partir des tests de prolifération cellulaire sur les cellules coliques
14 SW480 avec les solutions à concentration identique en polyphénols (E15g) ou à volume égal de vin (Ex10). ... 109
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LISTE DES ABREVIATIONS
ABC « ATP-Binding Cassette »
ABCC2 « ATP-Binding Cassette sub-family C member 2 » ABCG2 « ATP-Binding Cassette sub-family G member 2 » ADN Acide DésoxyriboNucléique
AOC Appellation d'Origine Contrôlée AOM AzOxyMéthane
ARN Acide RiboNucléique
ATCC « American Type Culture Collection » Bcl-2 « B-cell leukemia/lymphoma-2 » BCRP « Breast Cancer Resistance Protein »
BIVB Bureau Interprofessionnel des Vins de Bourgogne Caspases « Cysteinyl-aspartate-cleaving proteases » Cdc25 « Cell Division Cycle »
Cdks « Cycline-dependent kinase »
CESEO Cellule d'Expertise Scientifique En Œnologie CF-1 « Carworth Farms 1 »
CIRC Centre international de Recherche sur le Cancer
CoA COenzyme A
CKI « Cdk Inhibitor » CYP CYtochrome P450
DAPI 4',6'-DiAmidino-2-PhénylIndole DISC « Death Inducing Signaling Complex » DMEM « Dulbecco's Modified Eagle's Medium » DMSO DiMéthylSulfOxyde
DPBS « Dulbecco's Phosphate Buffered Saline » EDTA « Ethylene Diamine Tetraacetic Acid »
ENSBANA Ecole Nationale Supérieure de Biologie Appliquée à la Nutrition et à l'Alimentation FasL « Fas Ligand »
FCA Foyers de Cryptes Aberrantes GLOBOCAN « GLObal Burden Of CANcer » GSTs Glutathion-S-Transférases
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HTLV-1 « Human T-lymphotropic virus 1 » IAPs « Inhibitor of Apoptosis Proteins » iNOS « Inductible Nitric Oxide Synhtase »
INRA Institut National de la Recherche Agronomique IRM Imagerie par Résonance Magnétique
IUPAC « International Union of Pure and Applied Chemistry » IUVV Institut Universitaire de la Vigne et du Vin
LDL « Low Density Lipoproteins »
MAPK « Mitogen-Activated Protein Kinase »
MONICA « MONitoring trends and determinants In CArdiovascular disease » MRP « Multidrug Resistance-associated Protein »
OMS Organisation Mondiale de la Santé PBS « Phosphate Buffered Saline » P-gp P-Glycoprotéine
qPCR « Quantitative Polymerase Chain Reaction » RPMI « Roswell Park Memorial Institute medium » SDS « Sodium DodecylSulfate »
SIRT1 SIRTuine 1
SGLT Sodium/Glucose coTransporteur SULTs SULfoTransférases
TNF « Tumor Necrosis Factor » TNM « Tumor Node Metastasis »
TRAIL « TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand » UGTs UDP GlucuronosylTransférases
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INTRODUCTION ET OBJECTIFS
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Préambule
Aujourd’hui, le Français moyen consomme environ 50 litres de vin par an, ce qui le classe parmi les premiers consommateurs mondiaux. Il est donc logique de se demander quels sont les effets que la consommation de vin peut avoir sur la santé de la population. Dans le cas des gros buveurs (au-delà de trois verres de vin par jour), des effets néfastes principalement dus à l’éthanol sont clairement observés (cirrhose du foie, cancer, infarctus, …). En revanche, il est généralement admis qu’une consommation modérée (un ou deux verres de vin par jour) est bonne pour la santé lorsqu’elle est accompagnée d’une alimentation saine et variée. Cet effet bénéfique est avéré par de nombreuses études épidémiologiques. Ces études concernent principalement l’espérance de vie globale ou les maladies coronariennes, mais quelques travaux suggèrent des effets bénéfiques vis-à-vis du cancer. La consommation de vin pourrait donc s’avérer une piste intéressante dans une optique de prévention nutritionnelle des cancers.
La première partie de ce manuscrit est consacrée à l’étude bibliographique du sujet qui s’efforcera d’établir un état des lieux des effets des polyphénols de vin rouge contre le cancer, en passant par une présentation des différents acteurs et en particulier le resvératrol.
La deuxième partie traitera des matériels et méthodes employés durant cette étude.
La troisième partie regroupera les résultats des différentes approches, incluant un article publié en 2010 dans « European Journal of Medicinal Chemistry ».
Enfin, la quatrième partie discutera des résultats de cette étude sous forme d’une synthèse critique et conclura ces travaux en proposant des perspectives.
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Objectifs
Si les effets protecteurs de polyphénols purifiés (en particulier le resvératrol) sur les modèles
in vitro voire animaux ne sont plus à démontrer, il n’en est pas de même pour les mélanges
de polyphénols (naturels ou non) pour lesquels seules quelques études ont été consacrées. Malgré tout, elles reflètent des effets notables, en particulier nos travaux sur les effets anti tumoraux de polyphénols totaux du vin rouge de Bourgogne semblent prometteurs.
C’est dans l’optique de comprendre les mécanismes de ces effets protecteurs et chercher à les optimiser que se situe mon travail de thèse.
Optimiser les effets protecteurs des polyphénols de vin rouge par des combinaisons et comprendre les mécanismes
A l’aide de tests effectués avec des extraits polyphénoliques naturels ou des combinaisons de polyphénols, nous nous sommes employés à chercher des effets synergiques entre plusieurs polyphénols purifiés et ceux présents dans des vins rouges expérimentaux de Bourgogne (en collaboration avec le BIVB) sur des lignées cellulaires d’origine colorectale. Notre étude a utilisé d’une part, des mélanges de 2 ou 3 polyphénols purifiés (resvératrol, quercétine, catéchine), et d’autre part, des extraits et concentrés de vins, mélanges naturels d’un grand nombre de polyphénols dans des proportions variables. Après avoir caractérisé nos extraits et concentrés de vins, nous avons étudié leurs effets sur le fonctionnement des cellules cancéreuses :
Prolifération et cycle cellulaire
Influx et efflux du resvératrol à travers la membrane cellulaire, dont les efficacités pourraient être modulées par des facteurs nutritionnels (tels que d’autres polyphénols) intervenant sur le métabolisme
Modulation de la cancérogenèse in vivo chez la souris CF-1 (en collaboration avec Monsieur Nitin Telang de la société Palindrome Liaisons, ainsi que Monsieur Rajendra G. Mehta de l’IIT Research institute de Chicago)
20 Il ressort que, concernant la prolifération, tous nos différents extraits et concentrés de vins sont capables d’inhiber la prolifération cellulaire, les polyphénols pouvant agir sur le cycle cellulaire en induisant des blocages à différents niveaux.
Concernant les transports membranaires de resvératrol, certains polyphénols du vin tels que la quercétine sont capables de moduler l’influx de resvératrol dans la cellule dans certaines conditions, vraisemblablement au niveau transcriptionnel principalement.
Concernant les animaux, le traitement diminue le nombre global de lésions pré-néoplasiques, et surtout le nombre de lésions de grande taille.
Optimiser les effets protecteurs des polyphénols de vin rouge par des modifications structurales et comprendre les relations structures-fonctions du resvératrol
L’autre partie de ce travail a consisté à comprendre les relations structure-fonction du resvératrol en ce qui concerne ses capacités anticancéreuses. Pour ce faire, nous avons effectué divers tests avec des analogues non naturels du resvératrol synthétisés par les chimistes de Catane (Professeur Corrado Tringali) et Dijon (Professeur Philippe Meunier). Ces molécules diffèrent du resvératrol par des substitutions (hydroxylation/méthoxylation) au niveau des deux cycles benzéniques. Systématiquement, les molécules synthétisées avaient leurs structures correspondantes dans les configurations trans- et cis-. Nous avons étudié les effets de ces différentes molécules sur la prolifération des cellules cancéreuses coliques et sur leur cycle cellulaire.
Cette approche a montré que les analogues méthoxylés du cis-resvératrol sont également de puissants anticancéreux, mais qu’ils utilisent des mécanismes d’action différents de ceux du
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PARTIE I : ASPECTS BIBLIOGRAPHIQUES
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A. Le vin
Le vin est produit depuis les débuts de la civilisation (Barnard et coll., 2011). Vraisemblablement originaire du Proche-Orient, on retrouve ses traces dans les hiéroglyphes égyptiens, le code du roi babylonien Hammourabi, ou encore des bas-reliefs assyriens. L’ancien testament présente la vigne comme un cadeau de Dieu à Noé pour le soulager dans sa solitude. L’influence du vin sur le développement de la plupart des sociétés eurasiennes est considérable, au point qu’on lui consacre de nombreuses divinités (Shesmou, Dionysos, Bacchus, le sang du Christ, …). Il est le seul aliment pour lequel un tel caractère sacré et symbolique s’est répandu.
Depuis l’Antiquité, le vin se trouve au centre du régime alimentaire de la plupart des pays du pourtour méditerranéen. Il est alors consommé sous plusieurs formes, parmi lesquelles le moretum (vin aromatisé à la mûre, framboise, myrtille et fleur d'oranger) et la saugée (vin blanc parfumé à la sauge, miel, citron, cardamome, girofle). Il y représente également une activité commerciale de premier ordre. Aujourd’hui, la consommation de vin, même si elle ne cesse de diminuer depuis quelques décennies, reste importante dans les pays du bassin méditerranéen, et le vin perdure sur nos tables en restant un élément central de notre alimentation et de notre culture. A noter que la consommation augmente dans les pays émergeants (Chine, Brésil, Argentine) et dans d’autres pays industrialisés (USA, Japon). La Bourgogne en particulier est une région viticole de premier ordre. Même si par le volume de production de vin elle ne se place pas en tête des principales régions viticoles, la Bourgogne est réputée pour la qualité de ses vins. La viticulture en Bourgogne daterait d’au moins 2000 ans comme en attestent des vestiges archéologiques de vignes à Gevrey-Chambertin (Garcia et coll., 2010). Les fouilles sur la villa gallo-romaine des Tuillières à Selongey (Ruellet et Ruellet, 1985) révèlent de nombreux indices qui tendraient à prouver une production de vin en Bourgogne à l’époque gallo-romaine. Le commerce de vin à cette époque est également révélé par la stèle de Til-Châtel (Figure 1) représentant un marchand de vin dans son échoppe servant un client à l’aide d’amphores. Le vin de Bourgogne est donc vraisemblablement consommé depuis plusieurs siècles.
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Figure 1 : Le monument au marchand de vin de Til-Châtel, conservé au musée archéologique de Dijon. © F. Perrodin. Musée archéologique de Dijon.
L’œnologie, science étudiant le vin, est sans équivalent pour d’autres aliments en matière d’investissement humains et financiers. Avec environ 20% de la production mondiale, la France est un des principaux producteurs de vin. Le commerce de vin représente donc encore aujourd’hui des intérêts économiques importants pour la France.
Le vin est produit à partir du raisin, fruit de la vigne. Plusieurs espèces de vignes ont par le passé été utilisées, mais aujourd’hui la production de vin utilise presque exclusivement les baies de Vitis vinifera (sativa). De cette unique espèce, de nombreux cépages peuvent être distingués. Un même cépage peut renfermer une grande variabilité génétique. Les plants génétiquement identiques sont des clones. L’utilisation de clones permet une production mieux contrôlée. Néanmoins la qualité du vin produit dépend également en grande partie du terroir. Des facteurs tels que le climat, le sol, l’ensoleillement, l’exposition au vent et
24 l’environnement général de la vigne sont tous à prendre en considération dans le choix du cépage/clone planté.
Dans cette étude, nous avons principalement utilisé du Pinot Noir (clone 115) cultivé en Bourgogne. La plupart des clones de Pinot Noir proviennent du quart nord-est de la France, principalement Dijon et Colmar. Il est également cultivé dans le Languedoc, en Allemagne, en Suisse et a été exporté dans l’Oregon (USA), l’Ontario (Canada) et en Nouvelle-Zélande. Suite à l’évincement du « vil et déloyal gamay » par Philippe le Hardi, le Pinot Noir s’imposa en Bourgogne, tirant parti d’un terroir qui lui est particulièrement propice. Le Pinot Noir semble en effet particulièrement bien adapté aux sols argilo-calcaires et au climat océanique à tendance semi-continentale que l’on retrouve entre Dijon et Mâcon. Ces vins de Bourgogne ont gagné leurs lettres de noblesse grâce à leur grande complexité d’arômes et leur alliance subtile de finesse, puissance et intensité. Ils ont également la réputation d’être de très bons vins de garde.
1. La vinification en rouge
Même si les procédés ont évolué, le principe de production du vin reste fondamentalement le même. Le vin est ainsi obtenu par fermentation alcoolique de raisin. Ce procédé est appelé vinification.
Les baies de raisin noir foulées sont enfermées plusieurs jours dans des cuves, c’est durant cette étape que les levures produisent l’éthanol du futur vin par fermentation alcoolique à partir des sucres du raisin. L’éthanol produit solubilise alors de nombreux composés phénoliques hydrophobes contenus dans la peau du raisin et les diffuse dans le moût en macération. Ensuite, l’écoulage permet de séparer le vin de goutte du marc. Le pressurage permet d’extraire du marc le vin de presse renfermant la majeure partie des composés phénoliques. Vin de goutte et vin de presse sont ensuite généralement mélangés avant de subir la fermentation malolactique, transformation de l'acide malique en acide lactique par des bactéries lactiques.
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2. Composition du vin rouge
Le vin rouge est, de toutes les boissons, celle qui est la plus étudiée. Sa composition est également l’une des plus complexes connues à ce jour. En effet, même si la majorité des constituants du vin est répertoriée (Tableau 1, page 29), il serait présomptueux de dire que tout est parfaitement identifié. De plus, la plupart des constituants, de part la nature particulière de la production de vin, se retrouvent à des concentrations plus ou moins variables. Les principaux facteurs de variabilité sont le cépage, le climat, le terroir, et l’année. Chaque vin à ses spécificités. De part la présence/absence de certains éléments dans le vin, et les conséquences que cela implique sur les qualités organoleptiques, les œnologues sont capables de retracer son histoire, depuis la présence de microorganismes sur la baie de raisin, jusqu’aux processus de vinification. Cette diversité de composition rend les études sur le vin complexes à généraliser.
a. Eau
Le composant majoritaire du vin est l’eau qui représente entre 80 et 90% du volume total (Wanklyn, 1873). C’est donc en solution ou en suspension que se trouvent la plupart des autres constituants.
b. Alcools
L’éthanol est un composant déterminant du vin, il est d’ailleurs parfois appelé « esprit du vin ». On peut retrouver entre 8% et 16% d’éthanol dans le vin. Sa production par les levures à partir des sucres du raisin permet d’extraire de la peau du raisin de nombreux autres composés lors de la vinification en rouge. Au delà de 16%, l’éthanol devient toxique pour les levures, ceci limitant le degré alcoolique maximal obtenu par fermentation.
Troisième constituant le plus abondant dans le vin, le glycérol qui est un polyol. Il est également produit par la fermentation des sucres par les levures, principalement en début de la fermentation alcoolique du moût. Il apporte une légère saveur sucrée (comparable au glucose) et participe au moelleux du vin.
Le vin contient également de faibles quantités de méthanol, produit de l'hydrolyse des pectines du raisin. Etant fortement minoritaire par rapport à l’éthanol, sa toxicité dans le vin est généralement négligeable. La teneur en méthanol peut néanmoins se révéler
26 significative pour certains cépages. C’est le cas par exemple du noah dont il est aujourd’hui interdit de produire le vin. On trouve également d’autres alcools dans le vin, tels que le mannitol (qu’on cherche à éviter), le sorbitol, le butane-2,3-diol, le méso-inositol, l’arabitol, l’érythritol, l’isobutanol, l’isopentanol et le tert-pentanol qui influencent le bouquet directement ou sous leurs formes estérifiées.
c. Sucres
La teneur en sucres des vins est très variable. Le jus de raisin est très riche en hexoses (glucose et fructose) qui sont convertis en éthanol dans leur grande majorité. Certains vins en conservent néanmoins une teneur résiduelle. A l’origine des vins blancs doux et liquoreux, ce phénomène est plus rare avec les vins rouges qui en France sont presque toujours « secs ». Plusieurs techniques sont possibles pour conserver ces sucres : l’ajout
d’éthanol qui tue les levures, ou d’anhydre sulfureux SO2 qui inhibe leur activité. Dans les
vins rouges on peut aussi trouver des pentoses et hexoses infermentescibles impliqués dans l’impression de goût sucré. C’est le cas du L-arabinose, D-xylose, D-ribose et L-rhamnose. Des polysaccharides et oligosaccharides sont également présents dans le vin, différents de ceux du moût, car modifiés durant la macération (Nunan et coll., 1998; Ducasse et coll., 2011).
d. Minéraux : ions et métaux
Les différentes étapes de la vinification peuvent extraire des matières solides, différentes matières minérales, ou au contraire en faire précipiter sous forme de sels. C’est l’une des raisons pour lesquelles les teneurs des vins en minéraux sont très variables mais néanmoins faibles, l’autre raison étant que la teneur en minéraux du raisin lui-même est également très
variable. Parmi ces éléments minéraux on retrouve les ions suivants : chlore (Cl-), sodium
(Na+), potassium (K+), calcium (Ca2+), magnésium (Mg2+), ammonium (NH4+), phosphore
(PO43-) et souffre (SO42-). On trouve aussi de l’iode (I), du fluor (F), du brome (Br), et de
l’oxyde de silice (SiO2). Le vin contient également des métaux tels que le cuivre (Cu), le fer
ferreux (Fe2+), l’aluminium (Al), le chrome (Cr), le nickel (Ni), l’argent (Ag) et le manganèse
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e. Acides
La composition en acides du vin est très complexe. L’acidité du vin est la résultante de la somme de l’acidité volatile et de l’acidité fixe. Certains de ces acides, en réagissant avec les alcools, donnent des esters (esters neutres ou acides).
L’acide acétique est le principal acide volatil du vin, son taux est faible dans le vin final mais peut être élevé durant la fermentation. Il n’est en revanche pas responsable des phénomènes d'acescence. En effet le responsable est surtout l’acétate d’éthyle, produit par des bactéries et levures acétiques. De ces acides volatils dépend la qualité de la vinification, ainsi que le vieillissement du vin.
Parmi les acides organiques, on trouve les acides tartrique, malique, citrique, oxalique, ascorbique, galacturonique, glyurique, mucique, succinique, lactique, citramalique, diméthylglycérique, glyoxylique, glycérique, pyruvique et oxaloacétique.
Le vin contient également des acides minéraux comme l’acide borique BO3H3 et des traces
d’acides gras tels que les acides palimitique, myristique et laurique (Yunoki et coll., 2004).
f. Matières azotées
Outre la forme ionique NH4+, on retrouve l’azote sous plusieurs formes : acides aminés,
hexosamines, purines et polypeptides. Parmi les polypeptides, on trouve dans le vin des protéines. Les protéines contenues dans le vin rouge sont assez mal connues (Smith et coll., 2011). Elles sont impliquées dans diverses interactions avec les tanins en particulier.
g. Composés phénoliques
Ils peuvent influencer certains arômes du vin et de manière générale toutes ses caractéristiques organoleptiques, les composés phénoliques sont classés en 4 familles : les acides-phénols, les flavones, les anthocyanes et les tanins. Ils seront détaillés plus loin dans ce manuscrit (Section D. Les composés phénoliques du vin, page 49 ; Tableau 2, page 50).
h. Microorganismes
On peut distinguer trois types de microorganismes dans la microflore du vin : bactéries, levures, moisissures. Cépage, climat et terroir ont là encore un rôle prépondérant dans les répartitions de ces différentes populations.
28 On trouve tout au long de la vinification, dans le vin en devenir, une grande variété de levures et en particulier Saccharomyces cerevisiae qui n’est pas forcément majoritaire, mais qui joue un rôle majeur dans la fermentation alcoolique. La plupart de ces levures disparaissent normalement dans le vin après fermentation alcoolique du fait de la disparition des sucres, mais il peut arriver que certaines subsistent dans les vins en bouteille. Selon les levures présentes, les qualités organoleptiques du vin peuvent être grandement influencées, en bien ou en mal. Certaines de ces levures (comme Brettanomyces) étant capables de passer dans un état viable non cultivable, il peut être difficile de les identifier précocement (Serpaggi et coll., 2010).
On trouve également des bactéries comme Oenococcus oeni, ou les bactéries acétiques entraînant des difficultés de stabilisation des vins (Barbe et coll., 2001). La majeure partie de ces bactéries est éliminée par sulfitage effectué dès la fin de la fermentation malolactique. Les méthodes de soutirage, collage et filtration peuvent également s’avérer utiles pour limiter le nombre de germes.
De nombreuses moisissures (Aspergillus, Botrytis, Penicillium…) peuvent pousser sur la baie et ainsi contaminer le vin par des composés tels que par exemple la géosmine, responsable du goût moisi terreux.
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Tableau 1 : Composition chimique du vin, à l’exception des composés phénoliques qui sont présentés dans le Tableau 2 (page 50). *Les valeurs minimales et maximales présentées le sont à titre indicatif et proviennent d’un panel de treize publications, d’autres dosages montrent que des vins peuvent avoir une teneur allant jusqu’à 4 g/L (Rifler et coll., 2011). Adapté d’après German (German et Walzem, 2000). Composé Concentration (g/L) Minimum* Maximum* Eau 800 900 Carbohydrates Glucose 0,5 1 Fructose 0,5 1
Pentoses (Arabinose, rhamnose, xylose) 0,8 2
Pectine 0 traces
Inositol 0,3 0,5
Fucose 0 0,005
Ethanol 80 150
Méthanol et autres alcools 3 1,9
Glycérol 3 14
Aldéhydes 0,01 0,5
Acides organiques
Acides tartarique, lactique, succinique, acétique,
3 11
malique, citrique, fumarique
Composés azotés 0,1 0,9
Composés phénoliques (voir Tableau 2 page 50) 0,9* 2,5* Composés
minéraux
Potassium, magnésium, dioxyde de carbone,
1,5 4
phosphate, souffre, calcium, chlore, silice, fluor, aluminium, manganèse, sodium, fer, brome, iode, cuivre, rubidium, oxygène
B. Effets du vin sur la santé
Les relations entre le vin et la santé sont diverses et variées. La culture populaire en a vanté les mérites au travers notamment de nombreux dictons. Certains vins furent même par le passé administrés en tant que médicament ou désinfectant. D’ailleurs, pour l’anecdote, en 1693 le médecin et botaniste Guy-Crescent Fagon prescrivait des vins de Bourgogne pour soigner la goutte à Louis XIV. Le vin était également la boisson de choix pour faire des
30 décoctions de plantes médicinales. Par exemple, jusqu’au début du XXème siècle, les médecins français prescrivent la « potion cordiale », stimulant contre l’asthénie, composée de vin de Banyuls, de sirop d’écorce d’orange amère, et de teinture de cannelle.
1. Effets négatifs d’une consommation excessive de vin
Le vin fut également (et l’est toujours parfois) diabolisé par de nombreux œnophobes. Du fait de sa teneur en alcool, une consommation non modérée peut avoir des effets néfastes importants, surtout si elle est accompagnée d’autres boissons alcoolisées. Il est classé selon
la règlementation française dans les boissons alcoolisées du 2ème groupe, ce qui en limite la
vente aux personnes de plus de 18 ans.
L’effet négatif le plus visible du vin est qu’il enivre. L’éthanol pris à forte dose agi défavorablement sur le système nerveux central pendant plusieurs heures. Outre la sensation d’euphorie, la plupart des fonctions cérébrales sont altérées. Ceci engendre des prises de risques qui, cumulées à des fonctions motrices et d’équilibre déficientes, augmentent considérablement les survenues d’accidents. Le système nerveux peut également souffrir de manière plus chronique de la prise d’éthanol. En effet, l’alcool est une drogue facilement accessible, qui est responsable d’une accoutumance forte qui peut prendre deux formes : l’alcoolisme ou le binge drinking (alcoolisme périodique). L’alcoolisme est la forme d’addiction à l’alcool la plus courante. Il se caractérise par l'absence du sentiment de satiété lors de la prise d’éthanol. L’alcoolisme pourrait concerner une part relativement importante de la population française, mais l’estimation est très complexe du fait de la diversité des facteurs psychologiques impliqués. Le vin est l’un des responsable d’une grande partie de ces cas, notamment en France (surtout dans les régions viticoles) où il est traditionnellement la boisson alcoolisée la plus répandue (Beck et coll., 2007). Le binge drinking est assez rarement associé au vin, l’état d’hyper alcoolisation recherché étant plus rapidement atteint avec d’autres boissons alcoolisées de plus forte teneur en alcool. Longtemps considéré comme une simple ivresse occasionnelle, il est aujourd’hui admis que ce comportement est la résultante d’une réelle addiction à l’alcool. Dans ces deux cas de consommation abusive, les effets de l’éthanol sur le cerveau peuvent être irréversibles, avec des pertes de connexions neuronales et la destruction (progressive ou brutale) de neurones.
31 Les troubles neurologiques peuvent ainsi entraîner des dépressions (Boden et Fergusson, 2011), et une plus forte tendance aux suicides.
La consommation d’alcool pendant la grossesse peut engendrer de graves conséquences sur le développement de l’enfant. Une prise d’alcool, même occasionnelle, entraîne des effets fœtaux de l'alcoolisation et des retards de croissance. Dans les cas les plus graves, l’enfant peut même souffrir de syndrome d'alcoolisation fœtale, provoquant des malformations et des déficiences intellectuelles.
Une étude prospective de cohorte (Sadr Azodi et coll., 2011) a montré une association dose-réponse entre la quantité de boisson spiritueuse consommée ponctuellement (mais pas chroniquement) et l’accroissement du risque de pancréatite aiguë. Cet effet néfaste ne semble pas pouvoir découler significativement d’une consommation de boissons telles que le vin ou la bière.
L’éthanol est un cancérigène du groupe 1 du CIRC (Centre international de Recherche sur le Cancer). A ce titre, lorsqu’il est présent dans une boisson, il est reconnu comme étant un inducteur certain de cancers. La dose minimale pouvant favoriser les cancers est toujours soumise à débats (Narod, 2011). En particulier, l’éthanol contribue au développement des cancers des voies aéro-digestives. Cancers de la cavité buccale, du pharynx, du larynx et de l’œsophage sont tous clairement liés à la consommation de boissons alcoolisées (Secretan et coll., 2009). Il est suggéré par certains auteurs que l’éthanol ne serait pas directement le principal responsable des cancers dus à la consommation de boissons alcoolisées, mais que ce serait l’acétaldéhyde (Salaspuro, 2011). L’acétaldéhyde peut être directement présent dans les aliments/boissons ou être produit à partir de l’éthanol, par l’action de l’enzyme alcool déshydrogénase hépatique, ou par des bactéries telles que Helicobacter pylori présentes dans l’estomac et la salive de près de la moitié de la population. L’acétaldéhyde peut ainsi agir à plusieurs niveaux, allant même jusqu’à causer des dommages à l’ADN au niveau des glandes mammaires (Abraham et coll., 2011) augmentant de ce fait les risques de cancer. Pour le cancer du côlon, l’éthanol et son métabolite l’acétaldéhyde sont également mis en cause (Baan et coll., 2007). L’éthanol (ou l’acétaldéhyde) même s’il n’est pas ingéré peut également avoir des effets pro-carcinogènes par contact. De simple bains de bouche alcoolisés contribuent au développement de cancer buccaux (McCullough et Farah, 2008).
32 Au niveau cellulaire, l’éthanol est métabolisé en acétaldéhyde, puis en acide acétique, et enfin en acétyl-coenzyme A, impliqué notamment dans le cycle de l’acide citrique permettant à la cellule d’exploiter l’énergie ainsi fournie.
L’organe qui est le plus souvent associé à la consommation d’alcool est le foie. En effet les lésions causées par l’éthanol consommé de manière régulière et exagérée peuvent induire des cirrhoses et, à fortiori, des hépato carcinomes (Nalpas et coll., 1995).
De manière générale, la plupart des études tendent à faire l’amalgame entre la consommation de vin (modérée ou excessive), de boissons alcoolisées sans distinctions, et la prise d’éthanol sans tenir compte des autres constituants du vin. En résulte une grande confusion (Stockley, 1998) et des messages vulgarisés affirmant tout et son contraire.
2. Le French Paradox et effets positifs d’une consommation modérée de vin
Ce nom de « French Paradox » ou paradoxe français désigne la remarque contradictoire que les français (principalement du sud-ouest de la France), malgré une alimentation riche en graisses, présentent un taux d’infarctus plus faible que les habitants d’autres pays industrialisés. Il a rapidement été avancé que ce paradoxe pouvait être dû aux effets protecteurs de certains aliments particuliers consommés par cette population. Le principal suspect avancé pour ces effets est le vin.
Les études épidémiologiques telles que le projet WHO-MONICA (World Health Organisation - MONitoring trends and determinants In CArdiovascular disease) (Tunstall-Pedoe et coll., 1994), et les travaux de Serge Renaud (Renaud et de Lorgeril, 1992) révèlent des bienfaits de la consommation de vin sur la santé, et plus particulièrement sur les maladies cardio-vasculaires. Ces études épidémiologiques se sont révélées en partie biaisées par les différences de critères de détermination des fréquences. D’autres études prospectives (Ducimetiere et coll., 1980) ont été menées de manière plus uniforme avec des grandes cohortes. Ces études ont révélé que les populations les moins touchées étaient en réalité celles du sud de l’Europe (dont la moitié sud de la France) pour lesquelles l’hypothèse du « vin protecteur » peut également s’appliquer, mais également l’hypothèse d’un régime alimentaire riche en fruits, légumes et huile d’olive. Ces deux hypothèses ne sont pas antinomiques et peuvent se compléter (Hu, 2003).
33 Concernant le vin seul, des effets bénéfiques sont clairement mis en évidence pour des consommations modérées (courbe en J) (Goldberg et coll., 1995; Renaud et coll., 1998). Une consommation régulière de vin rouge semble donc être corrélée à une diminution de problèmes cardiovasculaires. Il est même avancé que la prise de deux ou trois verres de vin par jour réduise le risque de maladies cardiovasculaires (0,68) (Huxley et Neil, 2003).
Des extraits de vins rouges désalcoolisés ont été montrés in vitro comme inhibiteurs de la synthèse d’endothéline-1 au niveau transcriptionnel (Corder et coll., 2001). L’endothéline-1 est un vasoconstricteur impliqué dans les maladies cardiovasculaires. Il est donc légitime de penser que le vin rouge peut prévenir les maladies coronariennes. De nombreuses études convergent également vers cette hypothèse en démontrant des effets bénéfiques à différents niveaux (Das et coll., 2007). Cet effet protecteur est encore plus marqué associé à une activité physique comme le montre une étude sur des rat hypertendus (Soares Filho et coll., 2011).
Notre laboratoire a récemment montré que chez des patients post-opérés d’un infarctus du myocarde, une consommation modérée de vin rouge de Bourgogne permettait de diminuer la production de LDL circulants, d’augmenter le statut antioxydant, et d’améliorer la fluidité membranaire des hématies (Rifler et coll., 2011), ce qui suggère là encore des effets protecteurs.
Des effets protecteurs sur les pathologies neuro-dégénératives sont également attribués à une consommation modérée de vin. Une étude a mis en évidence un effet bénéfique sur un model murin de la maladie d’Alzheimer (Wang et coll., 2006).
Enfin, les relations entre vin et cancer sont souvent critiquées et dissonantes. Des études sur l’Homme montrent parfois des effets protecteurs, mais pas contre tous les cancers. Il n’y a, par exemple, pas d’évidence concernant les cancers de la prostate (Chao et coll., 2010), mais en revanche la consommation modérée de vin se révèle efficace contre les cancers du rectum et du côlon distal (Crockett et coll., 2011).
Les premières études concernant les effets du vin sur la santé ouvrent donc des perspectives dans la prévention de nombreuses pathologies. Vers la fin des années 1990, notre laboratoire travaillait sur les relations entre les proliférateurs de peroxysomes et les cancers.
34 Etant situé en Bourgogne, où l’industrie viticole est particulièrement active, il semblait utile d’effectuer un rapprochement avec la thématique vigne, vin et santé. C’est donc tout naturellement que nous avons décidé d’orienter nos travaux sur les relations entre le vin (et son composant « phare » le resvératrol) et les cancers (en particulier le cancer colorectal).
C. Le cancer
Le cancer est devenu, depuis 2004, la première cause de mortalité dans les pays industrialisés, devant les maladies cardiovasculaires. Les données suivantes sont issues du projet GLOBOCAN 2008 (Ferlay et coll., 2010), initié par le CIRC (Centre international de Recherche sur le Cancer – International Agency for Research on Cancer) sous l’égide de l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé – World Health Organization).
Dans le monde (Figure 2), environ 13 millions de nouveaux cas et 8 millions de décès dus aux cancers sont diagnostiqués chaque année selon l’OMS. En Europe (Figure 3), 3 422 811 nouveaux cas et 1 861 096 décès ont été comptabilisés pour l’année 2008. En France (Figure 4), 332 701 nouveaux cas et 145 527 décès ont été comptabilisés pour l’année 2008.
Ces nombres, bien que déjà très importants, sont en constante augmentation. L’augmentation des incidences de cancers dans les pays industrialisés est principalement le fait de modifications des facteurs exogènes de risque. Mais il ne faut pas non plus minimiser l’évolution des méthodes de diagnostics qui permettent de meilleurs dépistages et qui augmentent artificiellement les mesures d’incidence.
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Figure 2 : Types de cancers les plus fréquents, tous pays confondus. (Source : GLOBOCAN 2008).
Figure 3 : Types de cancers les plus fréquents, tous pays européens confondus. (Source : GLOBOCAN 2008).
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Figure 4 : Types de cancers les plus fréquents en France Métropolitaine. (Source : GLOBOCAN 2008).
Parmi les facteurs environnementaux, on peut noter une évolution des modes de vie, avec une urbanisation grandissante, des modifications d’ordre alimentaire, et un vieillissement de la population. Les sociétés industrialisées favorisent une vie plus sédentaire, avec une activité physique amoindrie. L’urbanisation augmente également les contacts avec divers polluants chimiques et perturbateurs endocriniens.
Les sociétés modernes actuelles présentent également des modifications profondes des habitudes alimentaires, avec une augmentation de l’incidence du surpoids et de l’obésité, facteurs de risque majeurs pour de nombreux types de cancers. Entre 30 et 40 % des cancers pourraient être imputables à l'alimentation (Gardner et Halweil, 2000). Ceci est particulièrement vrai pour les cancers des voies digestives.
On peut remarquer une diminution de la consommation de vin rouge chez les populations jeunes, remplacé par des alcools forts. Les bénéfices santé de la consommation de vin disparaissent donc au profit des effets néfastes de l’éthanol.
