La cytométrie en flux
La Cytométrie
Mesure des cellules
Comparaison d’échantillons
Paramètres physiques
Paramètres chimiques (sondes fluorescentes) Paramètres biologiques
Microscope, photos numériques
Le Flux
Dénombrement de particule
Passage une à une devant le détecteur Liquide en mouvement
La cytométrie en flux
Le Principe
Le laser
La focalisation hydrodynamique La focalisation du laser
La diffraction du laser Séparation des signaux Les résultats
La cytométrie en flux
Le principe : le laser
laser Argon 488nm Raie lumineuse
monochromatique
Un seul type de photons (dans le bleu)
Forme elliptique après focalisation
Faisceau d’éclairement très concentré
COULTER® EPICS® XL
La cytométrie en flux
Le principe : la focalisation hydrodynamique
P2
d1
d2
d1 >> d2 P2>P1 P1
La cytométrie en flux
Le principe : la focalisation hydrodynamique
100
1 ml de cellules 106/ml:
12 µm de diamètre
colonne de cellules de 9 km 1 cellule / 0.9 cm
Manchon liquidien
:
50 à 100 µmSuspension cellulaire :10 à 15 µm 12
La cytométrie en flux
Le principe : la focalisation du laser
FOCALISATION LASER
Lentilles de focalisation
Le diamètre d'un faisceau laser : 0,7 mm
peu précis
2 lentilles permettent de focaliser le laser de manière à obtenir un faisceau elliptique proche, en taille, des
événements à analyser :
TRES PRECISTRES PRECIS
La cytométrie en flux
Le principe : la diffusion axiale
photodiode
e-V
La cytométrie en flux
Le principe : la diffusion axiale
Diffusion dans l’axe
Forward scatter (FS, FSc)
Diffraction ++
Réflexion +/- Réfraction +/-
Taille des particules
La cytométrie en flux
Le principe : la diffusion latérale
i1 i2 Réflexion Réfraction
La cytométrie en flux
Le principe : la diffusion latérale
Diffusion à angle droit Side scatter (SS, SSc)
Diffraction - Réflexion ++
Réfraction +
Hétérogénéité du contenu cellulaire
La cytométrie en flux
Le principe : la diffraction du laser
Laser Diffusion axiale
Diffusion latérale + fluorescence
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
Spécificité relative
Fluorochrome spécifique pour un constituant de la cellule Toutes les cellules marquées
Ac.Nucléiques Protéines
Ions
Spécificité absolue
Fluorochrome lié à une molécule biologique Substrat fluorogène
Ligands: FC, AnV, lectines Anticorps
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
Sondes fluorescentes: plusieurs fluorescences pour chaque cellule
Fluo1
Fluo2
Fluo3
Filtres optiques
Filtres interférentiels Miroirs dichroïques
Filtres colorés absorbants
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
500nm 600nm 700nm 800nm
FITCFITC
PEPE
ECDECD PECy5PECy5
Emission
Relative Fluorescence
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
D1 D2 D3
D5
D4
D1, D2, …: photomultiplicateurs
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
La cytométrie en flux
Le principe : la séparation des signaux
La cytométrie en flux
Les résultats : la chaîne d’acquisition
h
Ampli
PMT eV
0V 10V
CAD
1023
0000000001 0000000010 1111111011 1111111111 1111111110
La cytométrie en flux
Les résultats : Digitalisation / Histogramme
11 1
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1023
N
Intensité du signal
N
intensité de fluorescence
0 1023
N %
Moy, CV, ...
La cytométrie en flux
Les résultats : analyse d’histogramme
Histogramme Distributionde
N
intensité - graphe
- courbe - profil
Spectre de fluorescence
intensité
moy
Représentation des ?
résultats sous forme d’histogrammes de distribution de
fréquence.
Analyses de populations dans des échantillons hétérogènes
La cytométrie en flux
Les résultats
La cytométrie en flux
Les résultats : Histogramme bi paramétrique
1 1
0 2 3 4
0
2
3 4
N
Paramètre 1
Paramètre 2
La cytométrie en flux
Les résultats : Histogramme bi paramétrique
La cytométrie en flux
Les résultats : Combinaison de paramètres
paramètre1 paramètre2
La cytométrie en flux
Les résultats : Conditionnement de l’analyse
Diffusion Axiale
Diffusion latérale
Diffusion AxialeDiffusion AxialeDiffusion Axiale
La cytométrie en flux
Les résultats : Conditionnement couleur
Diffusion latérale
Diffusion axiale
Diffusion latérale
Diffusion axiale
diffusion laser
fluo1 fluo2 fluo3
électronique
La cytométrie en flux
Synthése
La cytométrie en flux
Les résultats : immunofluorescence
Excellente spécificité (Ac) théorique Nombreux contrôles nécessaires
Spécificité de l’Anticorps
Fixation non spécifique pour l’antigène Affinité
La cytométrie en flux
Les résultats : Le contrôle négatif
Ac négatif Ac marqueur
1
2
Lecture dérivée des observations au microscope
La cytométrie en flux
Applications : Analyse CD4 / CD8
Diff. Latérale
Diff. Axiale
Anti-CD8
Anti-CD4 Sang
Lyse des GR
65%
20%
La cytométrie en flux
Applications : Analyse CD4 / CD8
La cytométrie en flux
Applications : Analyse des leucémies
Diffusion latérale
CD45 Leuco
Ery
La cytométrie en flux
Applications : Analyse du cycle cellulaire
Marqueurs de l’ADN Intercalants
Spécificité relative
G1 M
Dnr Colc
G1 M
Cam
Fluorescence proportionnelle à ADN
La cytométrie en flux
Applications : Analyse du cycle cellulaire
La cytométrie en flux
Applications : Analyse de l’apoptose
Marqueurs membranaires Marqueurs mitochondriaux Marqueurs enzymatiques
La cytométrie en flux
Applications : Marquage Annexine V-FITC
-phospatidylsérines
-Annexine V-FITC
Apoptose Intactes
Nécrose
Iodure de
propidium vert
rouge
Témoin CHX
TNF TNF+CHX
IP
AnV
Apotose Apotose tardive ou nécrose
La cytométrie en flux
Applications : Marquage Annexine V-FITC / IP
La cytométrie en flux Le tri par CMF
Cellules en suspension dans un jet de liquide
Formation de goutellettes Charge Electrostatique
Déviation des gouttelettes
Technologie dérivée des imprimante à jet d ’encre Jet de liquide instable dans l ’air gouttelettes Oscillations modifient le point de rupture
La cytométrie en flux
Le tri par CMF : La formation de gouttelettes
30kHz
d=Cte
La cytométrie en flux
Le tri par CMF : La formation de gouttelettes
- 0 +
t (µs) ?
?
La cytométrie en flux
Le tri par CMF : La Charge des gouttelettes
La cytométrie en flux
Le tri par CMF : La déviation des gouttelettes
+ +
+ + -
- -
-
+0 +
+
+
- +
-
-
- 3000 V
+3000 V -3000 V
Cellules
Liquide de veine
+/-
Electronique
Détecteur
La cytométrie en flux
Le tri par CMF
Technique longue
Sélection sur plusieurs paramètres à la fois Choix entre pureté et rendement
Bonne pureté >95%
Clonages
Préparations pour :
Mise en culture Biologie moléculaire Western blots Activité enzymatiques Etc …
La cytométrie en flux
Le tri par CMF: Tri des cellules NK
99% CD56+
1,3% CD56+
CD56 SSc
Enricht rosette
Tri CMF
64% CD56+
0 h
neg 3 h low
high
Jurkat 7C11
La cytométrie en flux
Le tri par CMF: Inhibiteurs des caspases
