Thèse annexe
« Modélisation chez le poisson zèbre de mutations humaines responsables d'hydrocéphalie pour en valider la causalité et en approcher le mécanisme. »
L'hydrocéphalie est une anomalie neurologique sévère, définie par l'augmentation du volume des espaces contenant le liquide céphalo-rachidien (LCR) ; les ventricules cérébraux et l’espace sous- arachnoïdien. Cette dilatation peut être due à une hypersécrétion de LCR, un défaut de résorption, ou une obstruction mécanique des voies de circulation.
Les causes d’hydrocéphalie congénitale sont largement hétérogènes. La majorité des cas sont secondaires à des anomalies du tube neural, des hémorragies intracrâniennes, des traumatismes, des tumeurs, des tératogènes ou des malformations cérébrales primitives. Les autres cas d’hydrocéphalie congénitale peuvent être divisés en hydrocéphalie syndromique et non-syndromique. Les causes syndromiques d'hydrocéphalie congénitale incluent des anomalies cytogénétiques et de nombreux syndromes rares comme le L1-syndrome, les dysplasies squelettiques, les troubles métaboliques, les dystroglycanopathies, le syndrome de Meckel, ainsi que de nombreuses causes inconnues.
L’hydrocéphalie congénitale non syndromique n’est familiale que dans une minorité de cas. Une forme liée à l'X est associée avec des mutations dans le gène L1CAM. Après l'exclusion de ces cas, le ratio homme-femme reste > 2,3 suggérant une sensibilité élevée chez l’homme ou une hérédité liée à l'X. Il y a en outre de nombreux rapports d’hydrocéphalie idiopathique dans des fratries des deux sexes et/ou chez des enfants consanguins de parents non atteints, suggérant fortement une hérédité autosomique récessive1.
De nombreux modèles animaux d’hydrocéphalie ont été décrits, principalement chez la souris. Le plus connu étant le modèle L1CAM qui récapitule le syndrome L1 humain lié à l’X caractérisé par une hydrocéphalie, une déficience mentale, des pouces en adduction et une paraplégie spastique chez les garçons atteints. La plupart des autres gènes impliqués dans l’hydrocéphalie chez la souris sont des gènes ayant un rôle au niveau des cils.
Les cils sont des projections membranaires formées de microtubules pouvant être mobile ou non. Les cils mobiles sont responsables du mouvement du liquide à la surface de la cellule. Les cils primaires sont immobiles et sont présents à la surface de la plupart des types cellulaires. Ils sont responsables de la transmission de différentes voies de signalisation et jouent un rôle dans l’homéostasie cellulaire, la division et la différenciation. Selon le type cellulaire, les ciliopathies peuvent être responsable de
surdité, d’hydrocéphalie, d’infections respiratoires, d’infertilité, de défaut de latéralisation, de polykystose rénale, d’obésité et de nombreux autres symptômes.
Il existe plusieurs liens entre les cils et l’hydrocéphalie. En effet, les ventricules cérébraux sont recouverts par l’épendyme qui comporte des cellules monociliées et multiciliées. L’hydrocéphalie peut s’expliquer soit par une atteinte des cils mobiles épendymaires qui coordonnent le flux de LCR et guide la migration de neuroblastes, soit par une atteinte du cil primaire qui joue un rôle dans la production de LCR et dans la polarité planaire. La polarité planaire intervient dans l’orientation des cellules dans le plan du tissu. Contrairement à la polarité apico-basale, elle détermine une polarité antéro-postérieure1. De plus, il existe un lien direct entre le cil primaire et les cils mobiles au niveau des cellules épendymaires. En effet, la localisation du cil primaire de la cellule de la glie radiaire, précurseur de l’épendymocyte, détermine l’orientation des bouquets de cils mobiles dans l’épendymocyte mature multicilié. L’orientation précise des cils mobiles est nécessaire à l’orientation du flux de LCR dans le système ventriculaire. Si le flux est absent ou désorganisé, il y aura développement d’une hydrocéphalie2.
Deux gènes responsables d’hydrocéphalie congénitale sont actuellement à l’étude dans notre laboratoire. Deux mutations faux-sens du gène CCDC88C ont été découvertes dans deux familles, l’une non consanguine avec quatre enfants atteints, l’autre consanguine dont le couple a subit cinq interruptions de grossesse suite à la découverte de ventriculomégalie sévère. Le second gène, KIAA****, encore confidentiel, montrait une mutation biallélique dans une famille non consanguine dans laquelle deux fœtus avaient présenté une hydrocéphalie.
Afin de valider la causalité de ces mutations nous aimerions les modéliser chez le poisson zèbre et ainsi approcher le mécanisme moléculaire sous-jacent. Le poisson zèbre est un excellent modèle animal pour l’étude du développement cérébral précoce, il présente une grande fécondité, un développement rapide et une fécondation externe. De plus, ses embryons sont transparents et permettent donc de visualiser le phénotype aisément. Il existe de nombreux modèles de poisson zèbre pour des gènes impliqués dans le développement cérébral 3 car l’extrapolation est possible entre le cerveau du poisson zèbre et de l’homme.
Une partie importante du travail lors de la modélisation d’un gène chez le poisson zèbre, est la recherche in silico de son orthologue. Dans un premier temps, il est intéressant de rechercher les homologies de séquences et la conservation synténique entre les espèces de ce gène. Ensuite, si le gène appartient à une famille multigénique chez l’homme, il faudra s’assurer de trouver le bon orthologue chez le poisson. De plus, le génome du poisson zèbre s’étant dupliqué au cours de l’évolution, il faudra vérifier si l’orthologue est unique, ou dupliqué et dans ce cas vérifier quelle copie est exprimé au bon endroit et au bon moment du développement.
Lorsque l’orthologue du gène humain est déterminé, la technique de knock-down par morpholino permettra alors de l’éteindre chez le poisson zèbre. Les morpholinos sont des oligonucléotides synthétiques d’une longueur de 25 bases, qui se fixent aux séquences complémentaires des ARNs par appariement de bases. Du point de vue de la structure, bien que les morpholinos possèdent des bases azotées classiques, ils diffèrent de l’ADN par le fait que ces bases azotées sont fixées sur des cycles morpholines au lieu de désoxyribose. Ces cycles morpholines sont liés entre eux par des groupements phosphorodiamidates au lieu de groupements phosphates. Contrairement à de nombreux types structurels antisens tels que les phosphorothioates ou les petits ARN interférants, les morpholinos ne dégradent pas les molécules d’ARN auxquelles ils se fixent. Les morpholinos agissent par encombrement stérique, en se fixant sur leur séquence cible sur un ARN.
Plusieurs contrôles doivent être intégrés dans l’expérience. Deux morpholinos sont construit pour le même gène, l’un au niveau du codon AUG d’initiation de la traduction et l’autre sur un site d’épissage. De plus, un morpholino reconnaissant une protéine imaginaire permettra de confirmer la spécificité du morpholino et d’exclure un défaut du à la présence du morpholino. Enfin, un sauvetage du phénotype par l’injection d’ADNc sauvage et modifié pour échapper aux morpholinos permettra également de confirmer que le phénotype observé est bien dû à l’extinction du gène cible.
La technique de Knock-down par morpholinos présente cependant certaines limites. En effet, l’étude de gènes dont l’activité est cyclique ou visible après plus de cinq jours post fécondation n’est pas possible. Des techniques de knock out sont alors utilisées permettant d’éteindre le gène de manière permanente. Une méthode nouvellement utilisée chez le poisson zèbre est le knock out par les TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases). Les TAL effectors sont des protéines sécrétées par une bactérie pathogène des plantes contenant 33-34 acides aminés très conservés, à l’exception du 12ième et du 13ième qui contiennent deux résidus variables (RVDs) capables de reconnaître un nucléotide spécifique. En combinant différents TAL effectors contenant des RVDs spécifique il est possible de reconnaitre n’importe quelle séquence d’ADN. La technique des TALENs consiste à fusionner ces TAL effectors avec une nucléase capable de couper l’ADN. La plus utilisées étant FOK1. Deux TAL effector sont construit de part et d’autre du site que l’on veut couper. La nucléase Fok1, en dimérisant, sera capable de couper l’ADN et de provoquer une cassure double brin à l’endroit ciblé du génome. Les erreurs introduites par la machinerie de réparation d’ADN de la cellule provoqueront l’apparition de délétions/insertions ou d’altérations permanentes dans le gène ciblé et le rendront ainsi non fonctionnel.
Lorsque le gène sera éteint de manière permanente ou partielle dans le temps, l’approche du mécanisme sera alors possible par comparaison du phénotype cérébral du poisson muté pour les gènes testés avec le phénotype des patients présentant une hydrocéphalie et ainsi valider ou non la causalité des mutations humaines trouvées chez nos patients. De plus, les gènes CCDC88C et KIAA1731 semble
avoir un rôle au niveau des cils2, 4, 5. L’étude du phénotype permettra peut-être de mettre en lumière des anomalies ciliaires conduisant à l’hydrocéphalie chez les patients.
References
1. Sawamoto K, Wichterle H, Gonzalez-Perez O, Cholfin JA, Yamada M, Spassky N, Murcia NS, Garcia-Verdugo JM, Marin O, Rubenstein JL, Tessier-Lavigne M, Okano H, and Alvarez-Buylla A (2006) New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science 311 (5761):629-632
2. Mirzadeh Z, Han YG, Soriano-Navarro M, Garcia-Verdugo JM, and Alvarez-Buylla A (2010) Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci 30 (7):2600-2610
3. Kim HT, Lee MS, Choi JH, Jung JY, Ahn DG, Yeo SY, Choi DK, and Kim CH (2011) The microcephaly gene aspm is involved in brain development in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun 409 (4):640-644
4. Kishimoto N and Sawamoto K (2012) Planar polarity of ependymal cilia. Differentiation 83 (2):S86-S90
5. Knorz VJ, Spalluto C, Lessard M, Purvis TL, Adigun FF, Collin GB, Hanley NA, Wilson DI, and Hearn T (2010) Centriolar association of ALMS1 and likely centrosomal functions of the ALMS motif-containing proteins C10orf90 and KIAA1731. Mol Biol Cell 21 (21):3617-3629
