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Actualités de l’industrie
Comparaison des profils chromatographiques d ’ extraits fluides de plantes fraîches standardisés et glycérinés (EPS) versus teintures mères : différences d ’ intensité et de diversité
1A. Guilbot1, A. Dessouroux1, D. Jean2, M. Pouligon2
1Groupe PiLeJe/Phytoprevent, 37, quai de Grenelle, F-75015 Paris cedex 15, France
2Institut des substances végétales, 5, rue Denis-Papin, F-63110 Beaumont, France Correspondance :a.guilbot@pileje.com
Résumé : L’usage de plantes en pratique « traditionnelle » repose sur des propriétés découvertes empiriquement. Depuis quelques années, les travaux de recherche menés sur les extraits de plantes permettent d’apporter des preuves scientifiques caractérisant les actifs. L’objectif de notre étude était de comparer deux types d’extraits liquides issus d’un même lot de plantes médicinales : extraits fluides de plantes fraîches standardisés et glycérinés (EPS) obtenus par le procédé Phy- tostandard® breveté et teintures mères (TM). La caractérisa- tion des différences qualitatives et quantitatives a concerné cinq plantes couramment utilisées en phytothérapie : l’arti- chaut, le desmodium, l’eschscholtzia, le ginseng et la mélisse.
Le dosage de traceurs et l’étude des profils chromatographiques ont permis de mettre en évidence que les EPS sont plus riches en composés et globalement plus concentrés en actifs.
Mots clés :EPS–TM–Dosage–Traceurs–Diversité– Intensité
Comparison of chromatographic profiles between standardized and glycerined fresh plants extracts and mother tinctures: differences in intensity and diversity
Abstract:The use of plants in“traditional practice”is based on empirically properties. Since few years, research studies perfor- med with plant extracts have provided scientific proofs allo- wing to characterize the active components. We aimed at comparing two types of liquid extracts coming from a same lot of medicinal plant: EPS and mother tinctures. Qualitative and quantitative differences between extracts were analyzed for five plants commonly used in phytotherapy: artichoke, desmo- dium, escholtzia, ginseng and balm. The dosage of tracers and the analysis of chromatographic profiles demonstrated that
EPS are richer in components and generally more concentrated in active components.
Keywords:EPS–Tincture–Dosage–Tracers–Diversity – Intensity
Introduction
La pratique de la phytothérapie d’aujourd’hui s’appuie à la fois sur des connaissances empiriques issues de l’usage « tra- ditionnel » des plantes et sur des éléments scientifiques plus récemment caractérisés. Ces deux sources de connaissances sont complémentaires ; les technologies modernes permet- tent de mieux comprendre le mode d’action des plantes et de leurs actifs et ainsi de proposer un usage thérapeutique documenté.
Les extraits de plantes que l’on retrouve dans les matières premières à usage pharmaceutique (MPUP) et qui sont décrits dans la Pharmacopée européenne existent sous plusieurs for- mes (sèche, pâteuse et/ou liquide). Dans le domaine des prépa- rations liquides, les teintures mères (TM) végétales sont obte- nues par l’action dissolvante d’un véhicule alcoolique sur des matières premières d’origine végétale, plantes fraîches ou sèches. Les extraits fluides de plantes fraîches standardisés et glycérinés (EPS), un autre type d’extraits fluides, sont obtenus par lixiviation hydroalcoolique, évaporation des solvants puis stabilisation et standardisation par ajout de glycérine d’origine végétale. La lixiviation à degré croissant d’alcool, étape essen- tielle du procédé d’extraction breveté Phytostandard®, permet d’extraire une grande richesse de molécules sans dégradation des actifs dans les extraits [3].
Au plan analytique, la comparaison de deux extraits est habituellement basée sur la quantité de plantes sèches mises enœuvre ou sur la quantité de matière sèche dans le produit
1Les deux premiers auteurs ont contribué de manière égale à ce travail.
© Springer-Verlag France 2013 DOI 10.1007/s10298-013-0812-8
fini. Or, la qualité d’un extrait et sa composition sont égale- ment dépendantes des caractéristiques chimiques du lot de plantes, de la variabilité liée aux conditions de culture (lieu, nature du sol, climat), de la méthode de récolte, de la tech- nique d’extraction et des moyens de conservation utilisés.
L’identification de traceurs a permis de mieux caractériser les extraits : il s’agit de molécules spécifiques d’une plante donnée (marqueurs) dont le dosage permet par extrapola- tion de suivre la concentration en principes actifs (ex. : les curcuminoïdes pour le rhizome de curcuma) et de comparer la nature moléculaire de plusieurs extraits. Les EPS sont standardisés en traceurs pour chaque production de lot, per- mettant ainsi de garantir une homogénéité des lots d’une production à l’autre.
L’objectif de notre étude était de comparer deux types d’extraits liquides, TM et EPS, obtenus à partir d’un même lot de plantes médicinales. La caractérisation des différences qualitatives et quantitatives a concerné cinq plantes cou- ramment utilisées en phytothérapie : l’artichaut, le desmo- dium, l’eschscholtzia, le ginseng et la mélisse.
Matériel et méthodes
Un seul lot de plantes fraîches a été utilisé pour réaliser les TM et les EPS, et cela pour cinq végétaux différents : feuilles fraî- ches d’artichaut (Cynara scolymusL.), feuilles fraîches de des- modium (Desmodium adscendens[SW.] DC.), parties aérien- nes fleuries fraîches d’eschscholtzia (Eschscholtzia californica Cham.), racines fraîches de ginseng (Panax ginseng C.A.
Meyer) et parties aériennes fraîches de mélisse (Melissa offici- nalisL.).
La mesure du taux d’humidité de la plante est réalisée par séchage à l’étuve à 105 °C selon la méthode de la Pharmacopée française. Les TM sont préparées à partir de plantes mises à macérer pendant trois semaines dans un mélange d’alcool pur et d’eau dont le degré alcoolique est égal à 60 °C. Les EPS ont été élaborés avec le procédé
« Phytostandard® » selon la méthode décrite précédem- ment [3].
Les divers composés des extraits de plantes ont été séparés par chromatographie liquide haute performance (HPLC, Waters Integrity). Les extraits ont ensuite été fil- trés (filtre PVDF 0,45 μm Acrodisc® LC Sigma-Aldrich Z260290) avant dépôt sur la colonne (Ascentis Express C18, Supelco, longueur 15 cm, diamètre 3,0 mm, granulo- métrie de 2,7 μm). La température de la colonne était de 25°C et le débit de la phase mobile, composée d’un éluant A (eau à 1 % d’acide acétique) et d’un éluant B (acétoni- trile à 1 % d’acide acétique), était égal à 0,3 ml/min. En sortie, la colonne était couplée à un détecteur à barrette de diodes (Waters 996 Photodiode Array Detector) pour obtenir le spectre dans l’ultraviolet (UV) des différents composés et à un détecteur évaporatif à diffusion de lumière Sedex (55 SEDERE, gain de 7, pression de 2,2 bars et température de 55 °C) pour détecter les composés n’absorbant pas dans l’UV. Les conditions d’élution spécifiques à chaque plante et les longueurs d’onde de détection sont données dans le Tableau 1. Les traceurs à doser ont été choisis en fonction des données de la littérature et de la Pharmacopée européenne.
Un profil HPLC a été obtenu pour chaque produit d’extraction (EPS et TM) réalisé à partir des cinq plantes sélectionnées. La diversité des extraits a été caractérisée en
Tableau 1. Conditions opératoires spécifiques.
Plantes Temps
(minutes)
Gradient utilisé Traceur (longueur d’onde de détection) Éluant A Éluant B
Feuilles fraîches d’artichaut (Cynara scolymusL.)
0 60
95 50
5 50
Acide chlorogénique, dérivés cafféoylquiniques totaux [10] et polyphénols totaux (adapté de [9]) (270 nm et 330 nm)
Feuilles fraîches de desmodium (Desmodium adscendens)
0 45
95 65
5 35
Isovitexine (260 nm) [6]
Parties aériennes fleuries fraîches d’eschscholtzia
(Eschscholtzia californicaCham.) 0 55
95 65
5 35
Flavonoïdes totaux (260 nm) [8]
Racines fraîches de ginseng (Panax ginsengC.A. Meyer)
0 30 95 100 115
95 80 60 15 15
5 20 40 85 85
Ginsénoside Rb1 (205 nm)
Parties aériennes fraîches de mélisse (Melissa officinalisL.)
0 45
95 25
5 75
Acide rosmarinique, dérivés hydroxycinnamiques totaux [7]
(260 nm)
comptant le nombre de pics obtenus sur chaque chromato- gramme, et l’intensité a été évaluée en mesurant l’aire moyenne sous la courbe.
Résultats
Les résultats des dosages de traceurs effectués pour les deux extraits fluides sont présentés dans le Tableau 2.
Quelles que soient la plante et la molécule dosée, la concentration en traceurs est supérieure dans les extraits fluides glycérinés (EPS) par comparaison avec les valeurs mesurées dans les TM. Le ratio EPS/TM permettant d’éva- luer « l’enrichissement » de l’EPS versus la TM varie de 1,65 (ginsénoside Rb1, traceur du ginseng) à 14,72 (acide chloro- génique dosé dans l’artichaut). Une différence d’enrichisse- ment s’observe également au sein d’un même extrait avec deux traceurs différents. L’acide rosmarinique, par exemple, est 14 fois plus concentré dans l’EPS d’artichaut alors que les dérivés hydroxycinnamiques totaux ne le sont que trois fois plus (valeurs respectives de ratio 14,52 et 3,27).
La diversité de composition des extraits a été caractérisée en faisant le rapport du nombre de pics obtenus sur chaque chromatogramme (EPS vs TM) (Fig. 1). Les résultats mon- trent que les profils HPLC obtenus avec les EPS sont plus riches en pics que les profils des TM : les pics obtenus pour
l’artichaut et l’eschscholtzia sont, par exemple, respective- ment 2 et 1,85 fois plus nombreux lorsque ces plantes sont extraites sous forme d’EPS. Le desmodium et la mélisse ont une valeur de rapport proche de 1,1 indiquant une faible variation (de l’ordre de 1/10) de la composition moléculaire en fonction de la méthode d’extraction mise enœuvre, tou- jours en faveur des EPS.
La richesse d’un extrait en molécules (l’intensité) a été évaluée en mesurant les aires sous la courbe pour chacun des pics. La somme de ces surfaces est le reflet de la concen- tration totale en molécules. Quelle que soit la plante, la somme des aires sous la courbe est supérieure pour les EPS comparés aux TM avec des ratios EPS/TM supérieurs à 1 (Fig. 2). Le rapport des intensités est supérieur à 3 pour la mélisse et l’artichaut suggérant que les EPS de ces plantes sont trois fois plus concentrés que les TM.
Discussion
La phytothérapie est une approche thérapeutique en cons- tante progression. Afin de satisfaire les attentes des pres- cripteurs et des utilisateurs, il est essentiel de connaître au mieux les caractéristiques des extraits de plantes (plante fraîche ou sèche, partie de plante, mode d’extraction et solvant associé, ratio d’extraction, standardisation) et de
Tableau 2. Concentration d’actifs exprimés en gramme pour 100 g de matière sèche végétale extraite.
Plantes Molécule(s) dosée(s) Teinture mère (TM) EPS Ratio EPS/TM
Artichaut Acide chlorogénique 0,02 0,27 14,72
Polyphénols totaux 1,44 3,00 2,08
Dérivés cafféoylquiniques totaux 1,20 3,33 2,80
Desmodium Isovitexine 0,44 0,81 1,85
Eschscholtzia Flavonoïdes totaux 2,22 4,50 2,03
Ginseng Ginsénoside Rb1 1,30 2,15 1,65
Mélisse Acide rosmarinique 0,27 3,92 14,52
Dérivés hydroxycinnamiques totaux 4,20 13,70 3,27
Fig. 2.Ratio des intensités d’extraits fluides (somme des aires sous la courbe obtenues après ana- lyse des EPS/somme des aires sous la courbe obtenues après analyse des TM)
Fig. 1.Diversité de composition des extraits (nombre de pics obtenus après analyse des EPS/nom- bre de pics obtenus après analyse des TM)
s’assurer de la qualité de fabrication et de production des produits commercialisés (statut pharmaceutique des MPUP ou certification ISO 22000 des fabricants de compléments alimentaires à base de plantes).
Les EPS sont standardisés en traceurs pour chaque pro- duction de lot permettant ainsi de garantir une homogé- néité des lots et une constante efficacité thérapeutique [3].
L’objectif de cette étude était d’évaluer les différences de composition entre deux types d’extraits, EPS et TM, issus d’un lot de plantes identiques.
La première partie de l’étude a consisté à doser les tra- ceurs connus pour les végétaux suivants, i.e. feuilles fraîches d’artichaut (Cynara scolymusL.), feuilles fraîches de desmo- dium (Desmodium adscendens[SW.] DC.), parties aériennes fleuries fraîches d’eschscholtzia (Eschscholtzia californica Cham.), racines fraîches de ginseng (Panax ginseng C.A.
Meyer) et parties aériennes fraîches de mélisse (Melissa offi- cinalis L.). Quel que soit le végétal considéré, les résultats ont permis de mettre en évidence que les EPS sont plus concentrés en traceurs que les TM. Les variations d’enrichis- sement observées au sein d’une même plante (ex. : artichaut ou mélisse) ou d’une plante à l’autre peuvent s’expliquer par la nature chimique des composés. Certaines molécules plus hydrophiles comme les acides phénols dérivés de l’acide caféique (acide chlorogénique pour l’artichaut et acide ros- marinique pour la mélisse) sont mieux extraites par le pro- cédé Phytostandard®alors qu’elles s’extraient moins facile- ment par de l’alcool fort comme avec le procédé mis en œuvre pour les TM. D’autres molécules de type hétéroside, issues de la combinaison d’oses et de substances non glucidiques (appelées aglycones ou génines), sont moins hydrophiles, et la différence de concentrations entre les EPS et les TM est donc moindre. C’est le cas par exemple de l’isovitexine (flavonoïde composé d’un ose et d’une partie plus hydrophobe, l’apigénine) et de la rutine (flavonoïde composé d’un diglycoside — hydrophile — et de quercé- tine—partie plus hydrophobe) mais également du ginséno- side Rb1, une saponine composée d’une partie plus hydro- phobe, le noyau stéroïde, associée par des liaisons glycosidiques à une partie plus hydrophile que sont les sucres. De telles différences quantitatives ont récemment été mises en évidence dans une étude comparant la teneur en bioactifs d’extraits deSatureja parvifolia(parties aérien- nes) obtenus par trois méthodes d’extraction (hydrodistilla- tion, décoction et extraction à l’alcool) [1]. L’épigallocaté- chine et la naringine n’ont pas été détectées dans l’extrait alcoolique alors qu’à l’inverse la lutéoline et l’hespérine n’étaient pas retrouvées dans l’extrait obtenu par hydrodis- tillation. Au plan quantitatif, des composés tels que les déri- vés de l’acide caffeoylquinique (4 et 5-O) ont été retrouvés dans chacun des trois extraits mais à des concentrations six à dix fois supérieures dans les extraits aqueux comparés à l’extrait alcoolique. Le rôle crucial de la composition du solvant utilisé a également été illustré par une étude analy- tique réalisée sur des extraits de sauge (Salvia officinalis) au cours de laquelle les cinétiques d’extraction de différents
composés bioactifs ont été déterminées en fonction du ratio eau/alcool [4]. La concentration en composés de type acide carnosique est maximale dans l’extrait 100 % alcoolique alors que la concentration en acide rosmarinique y est faible.
Cette dernière augmente considérablement lorsque la teneur en éthanol est inférieure à 70 %. À l’inverse, les concentra- tions en composés de type acide carnosique étaient moin- dres dans ces conditions d’extraction.
Dans une seconde partie dite « analytique », des informa- tions quantitatives ont été extraites des profils chromatogra- phiques (HPLC). Les EPS se sont avérés être moléculaire- ment plus diversifiés que les TM pour chacune des plantes testées. Cela s’explique par le procédé de fabrication, une lixiviation à teneur croissante en alcool, rendant possible l’extraction progressive des molécules hydrophiles puis hydrophobes. Ce processus d’extraction hydroalcoolique favorise donc l’extraction d’un maximum de composés, reflet du totum de la plante. Les EPS sont plus riches, mais ils sont également plus concentrés comme l’attestent les résultats de comparaison d’intensité des pics. Une analyse croisée des rapports de diversité et d’intensité permet d’aller plus loin dans le travail de comparaison. Pour le ginseng extrait sous forme d’EPS, le nombre de pics est 1,64 fois plus élevé alors que le rapport des concentrations totales est pro- che de 1. Cette observation indique que la diversité molécu- laire est moindre dans la TM, mais la concentration finale en composés est quasi équivalente au total des concentrations mesurées dans l’EPS. La mélisse, elle, présente une diversité des profils HPLC proche selon que l’extrait analysé est un EPS ou une TM (ratio de 1,16). Pourtant, l’intensité totale est 3,64 fois plus élevée pour la forme d’EPS indiquant qu’à nombre de pics presque équivalent, la concentration en un ou plusieurs composé(s) est bien supérieure dans les EPS. Le fait qu’une extraction réalisée au moyen d’un mélange de solvants binaires eau/alcool fournisse des extraits plus riches qu’une extraction monosolvant (exclusivement eau ou alcool) est bien établi. Les solvants hydroalcooliques (eau + éthanol ou méthanol) sont en effet privilégiés en raison de leur capacité à extraire les composés lipophiles et hydro- philes qui coexistent donc au sein d’un même extrait [4,12].
En raison d’un large éventail de composés présents dans les plantes, la composition du solvant utilisé pour l’extrac- tion conditionne non seulement la richesse de l’extrait, mais également son activité biologique. Les propriétés antioxy- dantes (pouvoir réducteur et activité antiradicalaire) de dif- férents extraits de coques de noix vertes ont été étudiées en fonction du procédé d’extraction [5]. L’activité antioxy- dante, tout comme la teneur en polyphénols totaux, était meilleure lorsque le solvant était un mélange d’eau et d’al- cool, par comparaison avec une extraction uniquement aqueuse ou alcoolique. Les meilleures performances d’un solvant mixte pour extraire les polyphénols totaux et aug- menter le pouvoir antioxydant ont également été caractéri- sées chez l’orthosiphon (Orthosiphon stamineus) [2], la sauge (Salvia fructosa) et l’origan (Origanum dictamnusL.) [11]. À la lumière de ces résultats et bien que nous n’ayons
pas caractérisé les propriétés des extraits, il est légitime de penser que la richesse moléculaire des EPS leur confère des activités biologiques supérieures à celles des TM.
Ainsi, en nous appuyant sur des critères objectifs de comparaison entre EPS et TM, nous avons montré que la lixiviation à teneur graduelle en alcool, mise enœuvre dans le procédé Phytostandard®, permet d’extraire un plus large spectre de composés et à de plus fortes concentrations. Une des notions fondamentales en phytothérapie repose sur la synergie d’action de l’ensemble des actifs : un principe actif isolé est, en effet, moins efficace que le totum de la plante. La plus grande diversité de composition des EPS est donc en faveur de propriétés biologiques plus importantes et d’une meilleure efficacité. Ces observations renforcent la place de choix des EPS dans l’arsenal thérapeutique et naturel que propose la phytothérapie.
Source de financement de l’étude : Laboratoire Pileje.
Conflit d’intérêt :
Les auteurs ont un conflit d’intérêt à déclarer, car ils sont personnellement ou professionnellement liés à une entre- prise commerciale ayant un rapport direct ou indirect avec le sujet de cet article.
Références
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