Le gène FOXQ1 est-il impliqué dans l’expression du caractère « satin » chez le lapin phanère ?

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Le gène FOXQ1 est-il impliqué dans l’expression du

caractère “ satin ” chez le lapin phanère ?

Amandine Suin

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Amandine Suin. Le gène FOXQ1 est-il impliqué dans l’expression du caractère “ satin ” chez le lapin phanère ?. Autre [q-bio.OT]. 2018. �hal-02790306�

Amandine SUIN Maîtres de stage :

BTSA ANABIOTEC Mme Nathalie IANNUCCELLI Promotion 2016-2018 Mme Julie DEMARS

Castor Laghmere Chinchilla

Entreprise : Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) Centre de Recherche : Toulouse

Unité Mixte de Recherche : Génétique Physiologie et Systèmes d’Elevage (GenPhySE) Equipe de Recherche : Génétique et Epigénétique moléculaires des espèces animales

utilisées en croisement (GenEpi)

Le gène FOXQ1 est-il impliqué dans l’expression

du caractère « satin » chez le lapin phanère ?

Remerciements :

Pour commencer, je souhaite remercier Juliette Riquet de m’avoir accueillie dans l’équipe GenEpi, ainsi que Nathalie Iannuccelli ma tutrice, et Julie Demars la responsable de projets, pour leur gentillesse et leur accompagnement tout au long de cette expérience professionnelle.

Je souhaite adresser mes remerciements à Clémentine Dressaire, qui m’a accompagnée lors de la rédaction de ce rapport.

Je tiens à remercier toute l’équipe GenEpi pour son accueil chaleureux, ainsi que l’Unité GenPhySE pour la bonne humeur et l’ambiance qui y règnent. Merci à chacune des personnes pour leur amabilité.

Je remercie également Katia Feve, qui a toujours été présente pour répondre à mes questions, ce qui m’a beaucoup aidée dans l’assimilation de connaissances.

De plus, j’adresse mes remerciements à Maguy Bonnet qui m’a accueillie à bras ouverts. Je lui dis un grand merci, pour sa gentillesse et sa bonne humeur.

Bien entendu, mon attention se porte tout particulièrement à Nathalie Iannuccelli, pour sa disponibilité, ses conseils ainsi que la confiance qu’elle m’a accordée. Elle m’a consacré beaucoup de temps, dans la patience et la pédagogie et m’a permis de prendre de l’assurance et de la confiance en moi. Je la remercie pour l’aide et les connaissances qu’elle a pu m’apporter durant mes analyses mais aussi lors de la rédaction de ce dossier. Je lui témoigne toute ma reconnaissance et la remercie de m’avoir épaulée comme elle a pu le faire.

SOMMAIRE

Remerciements

INTRODUCTION ... 1

I. PRESENTATION DE L’ENTREPRISE ... 1

1) Organisation de l’INRA au niveau National ... 1

2) Présentation de l’Unité de Recherche GenPhySE ... 1

II. IDENTIFICATION DU GENE « SATIN » ... 3

1) Le caractère « satin » ... 3

2) Protocole « Cas/contrôle » ... 3

3) Protocole « Diversité » ... 4

4) Le gène FOXQ1 ... 4

5) Marqueurs moléculaires de type SNP ... 4

III. MATERIELS ET METHODES ... 5

1) Animaux et prélèvements ... 5

2) Extraction d’ADN génomique ... 5

A. Principe ... 5

B. Mode Opératoire ... 5

3) Contrôle qualité ... 6

4) Amplification d’ADN génomique ... 6

A. PCR classique ... 6

1. Principe ... 6

2. Choix des amorces ... 7

3. Mode Opératoire ... 8 4. Mise au point PCR ... 8 B. Electrophorèse classique ... 9 1. Principe ... 9 2. Mode Opératoire ... 9 C. Séquençage Sanger ... 10 1. Principe ... 10

2. Mode Opératoire de la purification de produits PCR ... 11

3. Mode Opératoire de la réaction de séquençage ... 11

1. Principe ... 11

2. Mode Opératoire ... 12

IV. RESULTATS ET DISCUSSIONS ... 13

1) Extraction d’ADN génomique et contrôle qualité ... 13

2) Mise au point PCR ... 13

3) Séquençage Sanger ... 15

4) Génotypage ... 17

A. PCR RFLP sur les animaux du protocole « Cas/contrôle » ... 18

B. PCR RFLP sur les animaux du protocole « Diversité » ... 19

V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 20

GLOSSAIRE ... 22

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INTRODUCTION

J’ai été accueillie à l’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) dans l’Unité Mixte de Recherche GenPhySE (Génétique, Physiologie et Système d’Elevage) du département scientifique de Génétique Animale. J’ai intégré l’équipe GenEpi (Génétique et Epigénétique moléculaires des Espèces animales utilisées en croisement) qui mène plusieurs projets de recherche en parallèle chez le lapin, le porc et les volailles.

Mon travail entre dans le cadre d’un programme de recherche chez le lapin phanère (élevé pour sa fourrure). Ce programme, nommé « Satin », a pour but d’identifier le gène responsable du phénotype « satin ». Le phénotype « satin » est un caractère de modification de la structure du poil qui affecte le pelage et plus particulièrement sa finesse et sa capacité à refléter la lumière. Ce caractère est dû à une mutation génétique récessive située sur un gène autosomal. Cette mutation rend le pelage dense, soyeux et brillant. L’objectif du projet est d’identifier la mutation causale responsable du phénotype « satin » afin d’optimiser la sélection génétique pour améliorer la qualité de la fourrure, dans un intérêt économique.

Une étude bibliographique a montré que chez la souris, Forkhead bOX Q1 (FOXQ1) est le gène impliqué dans l’expression du phénotype « satin » car il contient des mutations (une délétion et 2 substitutions) qui seraient responsables de ce dernier (The Winged Helix/Forkhead Transcription Factor FOXQ1 Regulates Differentiation of Hair in Satin Mice, H. K. Hong and coll, Genesis 29:163-171, 2001). Les chercheurs se sont basés sur cette étude pour localiser et identifier le gène responsable du phénotype « satin » chez le lapin.

Avant mon arrivée au laboratoire, un protocole appelé protocole familial a permis d’observer la transmission du gène sur 2 générations, sur des lapins de race Castor et Laghmere. Les animaux de ce protocole ont été génotypés à l’aide d’un panel de 6 marqueurs de type microsatellites localisés dans la région de FOXQ1. Suite aux analyses génétiques, une co-ségrégation entre les allèles de 2 des microsatellites et le phénotype « satin » a été mis en évidence. Il a alors été conclu que la mutation causale responsable du phénotype « satin » était dans une région proche du gène FOXQ1. De ce fait, le gène FOXQ1 a alors été considéré comme un excellent gène candidat positionnel et fonctionnel potentiellement responsable du phénotype « satin » chez le lapin.

Suite à cela, 2 protocoles ont été créés, les protocoles « Cas/contrôle » et « Diversité ». Le protocole « Cas/contrôle » a été créé dans l’objectif de répertorier et d’analyser la ségrégation des variants du gène FOXQ1 dans différentes races (Castor, Laghmere et Chinchilla) sans se baser sur les liens de parenté. Le protocole diversité a pour but de comparer les polymorphismes candidats entre différentes races de lapins issus de plusieurs provenances afin de valider ou non le polymorphisme responsable du caractère « satin ».

Dans le protocole « Cas/contrôle », tous les animaux produits ont été phénotypés par observation microscopique sur mèche de poils. Cependant, les individus du protocole diversité n’ont pas été phénotypés.

Durant mon stage, j’ai donc travaillé sur le gène FOXQ1 du lapin. L’objectif est de déterminer si chez le lapin phanère, FOXQ1 est impliqué dans le déterminisme génétique du caractère « satin ». Pour cela, j’ai entrepris le séquençage du gène afin de recenser les polymorphismes et voir s’il y en avait qui discriminaient les animaux « satin » et « sauvage » (non satin). J’ai identifié plusieurs variants que j’ai ensuite génotypés.

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I. PRESENTATION DE L’ENTREPRISE

1) Organisation de l’INRA au niveau National

L’Institut National de la Recherche Agronomique est un institut public de recherche

scientifique qui exerce ses activités dans le domaine de l’agronomie. La recherche scientifique

dans l’agronomie est très vaste, puisqu’elle s'intéresse aux recherches dans les domaines

animal, végétal et microbien. L’INRA interagit avec plusieurs acteurs externes : des plateformes de services, des filières, des collaborateurs de recherche scientifiques

internationaux, et des consommateurs. L’Institut a également un rôle de formation à la recherche en lien avec les Universités. L’INRA comprend 8165 agents titulaires, dont 600 sur le centre INRA Occitanie-Toulouse.

L’INRA a instauré un référentiel pour la qualité, applicable aux Unités de Recherche et d’Expérimentation. Ce référentiel spécifie les actions et les intervenants pour satisfaire 2 objectifs : traçabilité des travaux de recherche (cahier de laboratoire, mode opératoire, code-barres, base de données …) et fiabilité des résultats mesurables (métrologie des balances, des pipettes, maintenance des instruments …).

2) Présentation de l’Unité de Recherche GenPhySE

L’Unité GenPhySEest une Unité Mixte de Recherches (UMR) localisée sur 4 sites de la région toulousaine. Elle est rattachée à 2 départements scientifiques de l’INRA (Génétique Animale et PHysiologie Animale et Systèmes d’Elevage). L’Unité comprend 146 permanents, répartis dans 10 équipes de recherches (dont GenEpi). Sur le site d’Auzeville, se trouvent 2 Unités de Service : la plateforme Génomique et Transcriptomique (GeT) qui met à disposition outils scientifiques et expertises technologiques et SIGENAE (Système Informatique du GENome des Animaux d’Elevage) qui réalise des analyses bio-informatiques. Sur le site INRA d’Auzeville, l’Unité GenPhySE est répartie sur 2 bâtiments qui comprennent chacun des bureaux et des salles de laboratoire spécialisées dans un domaine technique donné avec les équipements associés : extraction d’ADN, pré-PCR (pré - Polymerase Chain Reaction) et post-PCR, électrophorèse, BET (Bromure d’EThidium : intercalant de l’ADN), ARN (Acide Ribonucléique), protéines, bactériologie …

L’Unité GenPhySE est un laboratoire de recherche qui exerce ses activités essentiellement en génétique quantitative et moléculaire. Ces 2 disciplines se complètent pour mettre en évidence des gènes responsables de certains phénotypes dans l’objectif d’optimiser la sélection animale.

L’équipe GenEpi s’intéresse aux recherches en génétique moléculaire sur le porc, le lapin et les volailles. Elle mène plusieurs projets de recherche en parallèle et chaque projet nécessite

l’implication de différentes personnes compétentes en génétique, en biologie ou en statistique. Les compétences techniques utilisées au sein de l’équipe sont : la collecte des échantillons biologiques, l’extraction d’ADN ou d’ARN, la PCR, le séquençage, le génotypage.

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II. IDENTIFICATION DU GENE « SATIN »

1) Le caractère « satin »

Le caractère « satin » est issu d’une modification de la structure du poil qui affecte sa finesse et sa capacité de réflexion de la lumière.

Un poil classique est composé de 3 couches : cuticule (partie recouvrant le poil, composée de cellules semblables à des écailles qui se chevauchent, appelées cellules imbriquées), moelle (partie centrale du poil, composée d’espaces aérés) et cortex (situé entre la cuticule et la moelle, ayant un rôle dans la pigmentation du poil).

A l’inverse, le poil satin a une surface lisse et une moelle creuse et fine (disparition des cavités intercellulaires ou espaces aérés). Le pelage est dépigmenté, car les pigments à l’intérieur du poil subissent un tassement, ce qui accroît considérablement l’intensité des couleurs et leur luminosité. Au touché, le pelage est soyeux et souple suite à la réduction de son diamètre ainsi qu’à l’amincissement de ses couches. L’aspect satiné de la fourrure dû à sa capacité de réflexion de la lumière, est accentué par la transparence de l’enveloppe pileuse, donnant ainsi un lustre exceptionnel à la toison, qui ressort nettement et régulièrement sur tout le corps.

2) Protocole « Cas/contrôle »

Un protocole appelé « Cas/contrôle » a été créé dans le but d’identifier la région du génome contenant la mutation causale responsable du caractère « satin », sans se baser sur les liens de parentés. Les races de lapins choisies dans ce protocole sont les mêmes que celles du protocole familial (Castor, Laghmere et Chinchilla), car l’intérêt de ce protocole est d’affiner les observations faites dans le protocole familial. Ce protocole est complémentaire avec le protocole familial (Cf. document n°1 - p.3).

Document n°1 : Création du protocole « Cas/contrôle »

Légende :

Génotype (S//S) ou (s//s) Allèle « sauvage » S dominant Allèle « satin » s récessif

Castor 25 « satin » [s] (s//s) + 25 « sauvage » [S] (S//S) Laghmere 25 « satin » [s] (s//s) + 25 « sauvage » [S] (S//S) Chinchilla 25 « satin » [s] (s//s) + 25 « sauvage » [S] (S//S)

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3) Protocole « Diversité »

Dans l’objectif d’identifier ou non et d’évaluer la fréquence de la mutation causale responsable du phénotype « satin », un programme appelé « Diversité » a été utilisé. Ce protocole comprend 9 races de lapins collectées dans différents élevages : Angora, Angora Albinos, Angora noir, Angora bleu, Fauve de Bourgogne, Grand Russe, Gris du Bourbonnais, Havane français et Livolsi (Cf. document n°15 - p.19).

4) Le gène FOXQ1

Le gène FOXQ1 appartient à une famille de gènes (43 gènes chez l’Homme localisés sur les chromosomes 1, 6 et 16) ayant une séquence protéique homologue d’environ 100 acides aminés (AA), appelée Forkhead box family ou forkhead domain ou encore winged helix domain (domaine de liaison à l’ADN). Ce gène est un facteur de transcription impliqué dans le développement embryonnaire (croissance), dans la régulation du cycle cellulaire (prolifération), dans la signalisation et la différenciation (épithéliale et folliculaire), dans l’expression de tissu spécifique et dans la tumorigénèse et la longévité. Que ce soit chez l’Homme ou chez la souris,

FOXQ1 fait environ 2500 b (bases), il est composé d’un seul exon, l’ARN transcrit à partir de

ce dernier est d’environ 1200 b et la protéine comprend environ 400 AA. Chez la souris 3 mutations dans le gène FOXQ1 sont associées au phénotype « satin », à savoir : une délétion (qui décale le cadre de lecture) et 2 substitutions (qui changent plusieurs AA, et donc la protéine produite). Chez le lapin la composition et le rôle exact du gène FOXQ1 ne sont pas encore connus.

5) Marqueurs moléculaires de type SNP

Les marqueurs moléculaires sont des séquences d’ADN utilisées en cartographie génétique pour se repérer sur le génome. Il existe différents types de marqueurs moléculaires, dont les SNP (Single Nucleotide Polymorphism).

Un SNP désigne une variation d’une seule paire de base (pb) à un endroit du génome chez un même individu ou entre des individus d’une même espèce. Les SNP constituent la forme la plus abondante de variations génétiques et représentent plus de 90 % de toutes les différences entre individus. Un SNP possède deux formes alléliques, ce qui explique qu’au sein d’une même espèce, on retrouve des individus homozygotes et des individus hétérozygotes pour chacun des allèles.

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III. MATERIELS ET METHODES

1) Animaux et prélèvements

Le protocole expérimental compte au total 294 animaux, dont 150 issus du protocole « Cas/contrôle », répartis en 3 races différentes (Castor, Laghmere et Chinchilla), comprenant

chacune 50 animaux, à savoir 25 « satin » et 25 « sauvage » (Cf. document n°1 - p.3). Les 144 animaux restants sont issus du protocole « Diversité ». A mon arrivée au laboratoire, les animaux du protocole « Cas/contrôle », avaient été produits et phénotypés, mais ils n’étaient pas génotypés. En ce qui concerne les animaux du protocole « Diversité », ils étaient juste produits.

Je disposais donc de 294 prélèvements biologiques (sous forme d’oreille entière) issus des protocoles « Cas/contrôle » et « Diversité ».

2) Extraction d’ADN génomique

A. Principe

L’ADN génomique est localisé dans le noyau des cellules. L’extraction d’ADNg consiste à lyser ces cellules, en se débarrassant des membranes cellulaires et des protéines avec un mélange contenant une enzyme, la protéinase K, qui digère les protéines. L’ADN est ensuite précipité à l’aide d’éthanol 100 % en présence de sels.

B. Mode Opératoire

- Placer 2 ou 3 morceaux d’oreille (taille 0,5 x 0,5 cm) dans un tube de 2 mL, après avoir rasé les poils

- Ajouter 1010 µL d’un mix de digestion, comprenant : - 900 µL de TE (Tris EDTA) à 10/0,1

- 50 µL d'EDTA (Ethylène Diamine Tétra-Acétique) à 0,5 M et à pH = 8 - 50 µL de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) à 10 %

- 10 µL de protéinase K à 20 mg/mL - Agiter très légèrement (pas de vortex)

- Incuber 3 h à 56 °C, en agitant de temps en temps (2 ou 3 fois) - Incuber toute la nuit à 37 °C

- Ajouter 350 µL de solution NaCl (Chlorure de Sodium) saturée et agiter légèrement - Centrifuger 30 min à 15 000 tours/min (rpm) à 4 °C

- Prélever le surnageant, contenant l’ADN et le mettre dans un tube avec 3 mL d’éthanol 100% - Laisser remonter la méduse afin de la récupérer avec un inoculateur bactériologique et de la déposer dans un tube contenant 500 µL de TE 10/0,1

- Placer les échantillons 1 h à 60 °C

- Faire tourner une nuit (>12 heures) à 37 °C pour remettre l'ADN en suspension

- Mesurer la concentration d’ADN au Nanodrop (DO = 260 nm) et les rapports 260/280 et 260/230

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3) Contrôle qualité

Après sa solubilisation, l’ADN est dosé par mesure de l’absorbance dans le domaine de l’UV (Ultra-Violet), à l’aide du Nanodrop 8000 qui est un spectrophotomètre permettant de travailler sur des micro-volumes (dépôt de 2 µL). Ce dosage est réalisé afin d’évaluer la qualité et la quantité de l’ADN extrait afin de le diluer correctement pour les expériences suivantes.

Le Nanodrop mesure la densité optique à 3 longueurs d’ondes différentes :  280 nm : absorbance des protéines

 260 nm : absorbance des nucléotides  230 nm : absorbance des sels.

Ces mesures lui permettent de calculer 2 rapports :

 DO 260/280 : estimation de la quantité de protéines restantes  DO 260/230 : estimation de la quantité de sels restants.

La lecture des concentrations est possible (proportionnelle à la DO) dans une gamme allant de 20 ng/µL à 15000 ng/µL. Le calcul de la concentration d’ADN suit la formule suivante : 1 unité

de DO à 260 nm = 50 µg d’ADN / mL de solution

4) Amplification d’ADN génomique

A. PCR classique

1. Principe

La PCR est une technique de réplication ciblée qui permet d’amplifier in vitro une région spécifique d’ADNg afin d’en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier (Cf. document n°3 - p.7). Elle est réalisée dans un instrument appelé thermocycleur.

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Document n°3 : Principe d’amplification par PCR

2. Choix des amorces

Pour réaliser une PCR, il est nécessaire de définir les amorces à utiliser. En fonction de la zone que l’on souhaite amplifier, il est possible d’utiliser différents couples d’amorces. Les oligonucléotides sont déterminés via un site internet appelé Primer3, dans lequel on définit les paramètres que l’on souhaite respecter (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Les paramètres d’intérêt que l’on peut faire varier pour définir une amorce, sont :

 Sa longueur

 Son pourcentage en GC

 Sa température moyenne de fusion

 Sa complémentarité 5’ et/ou 3’ avec la séquence cible Légende :

dATP : désoxyadénosine triphosphate dCTP : désoxycytosine triphosphate dGTP : désoxyguanosine triphosphate

dTTP : désoxythimidine triphosphate

: : amorces « Sens » et « Anti-sens »

Les 3 étapes du cycle PCR sont les suivantes :

● Dénaturation de l’ADNg : 5 minutes à 94 °C Permet l’obtention de matrices simple brin, car à

cette température, les liaisons faibles qui assuraient la cohésion de la double hélice d’ADN sont rompues.

● Hybridation des oligonucléotides sur l’ADN :

30 secondes entre 54 °C et 64 °C

Les oligonucléotides se fixent à leur séquence complémentaire, et vont alors servir de point de départ (d’où leur autre appellation : amorces) à l’élongation du brin complémentaire à l’ADN matrice simple brin.

● Elongation de l’ADN : 30 secondes à 72 °C La polymérase synthétise le brin complémentaire

par incorporation des dNTP (désoxyribonucléotides triphosphates) libres.

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3. Mode Opératoire

En conditions classiques de PCR et en point final, il est nécessaire d’avoir une matrice d’ADN à 20 ng (matériel de départ de la PCR) ; une enzyme de polymérisation à 0.25 U, la Go Taq Flexi (PROMEGA) ; 2 amorces à 0.5 µM (sens et anti-sens) afin de délimiter la séquence à amplifier (SIGMA) ; des dNTP libres à 0.2 mM (PROMEGA) incorporés au fur et à mesure de la réaction d’amplification ; une solution tampon à 1X (permettant de maintenir le pH) fournie avec l’enzyme ; du MgCl2 (Chlorure de Magnésium) à 1.5 mM (PROMEGA) qui est le

cofacteur de l’enzyme, et de l’eau (H2O) pour compléter jusqu’au volume fixé. Il se peut que

des mises au point doivent être faites.

4. Mise au point PCR

Pour réaliser une PCR, il faut parfois passer par de la mise au point, car les séquences s’amplifient plus ou moins bien. Il est possible d’utiliser différentes polymérases, en fonction de la taille du fragment à amplifier (de quelques centaines à quelques milliers de bases), mais également en fonction du pourcentage de GC contenu dans ce dernier.

La mise au point PCR permet d’affiner les paramètres à chaque séquence afin d’adapter les conditions d’amplification ainsi que le nombre de cycles. Pour cela, des animaux témoins sont utilisés afin de ne pas faire des tests sur les animaux du projet. Plusieurs facteurs peuvent agir pour affiner la PCR :

● La concentration en MgCl2 : Le MgCl2 est un catalyseur indispensable à l’ADN

polymérase. Sa concentration optimale se situe généralement entre 1 mM et 3 mM.

● Le nombre de cycles : Il se situe généralement entre 30 et 35 cycles.

● La température d’hybridation : Elle se situe généralement entre 54 °C et 64 °C et

elle correspond à la température de fusion des amorces moins 3 °C. Elle est définie en fonction de la Tm (Température de fusion) des amorces, qui représente la température pour laquelle 50 % des molécules d’ADN sont dénaturées. Cette température dépend de la composition en base des amorces.

● Le DMSO (Diméthylsulfoxyde) : Quand les séquences contiennent des régions

riches en GC, il est nécessaire d’ajouter des co-solvants comme le DMSO, pour abaisser la température de séparation du brin d'ADN, afin de faciliter la dénaturation de l’ADN.

● L’enzyme : Chaque enzyme fonctionne avec des paramètres bien précis, ce qui peut

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B. Electrophorèse classique

1. Principe

L’électrophorèse est une technique permettant la séparation de l’ADN en fonction de son poids moléculaire (taille + charge) (Cf. document n°4 - p.9). Le support de l’électrophorèse classique est l’agarose. Le gel d’agarose sera réalisé dans du TAE (Tris Acétate d’EDTA) 1 X. Plus les fragments à visualiser seront grands, plus ils seront retenus dans les mailles du gel et migreront lentement. Plus le gel sera concentré, plus il aura des mailles denses.

Les fragments d’ADN sont visualisables sous UV grâce au BET. L’électrophorèse sur gel d’agarose permet de contrôler le bon fonctionnement de la réaction PCR. La taille du fragment amplifié est vérifiée à l’aide d’un standard de taille (100 pb ou 10 kb selon la taille attendue), ainsi que l’absence d’amplification non spécifique.

Document n°4 : Migration de l’ADN sur gel d’agarose

2. Mode Opératoire

 Verser dans un erlenmeyer 3 g d'agarose (en poudre) et 100 mL de TAE 1 X.  Chauffer le mélange au four à micro-ondes jusqu’à que le liquide soit limpide

et transparent, puis laisser refroidir.

 Ajouter 1 goutte de BET (EUROBIO) et homogénéiser.

 Couler le gel dans un plateau (support) et positionner le nombre de peignes nécessaires pour délimiter les puits.

 Laisser figer le gel et le placer dans la cuve, puis retirer les peignes.

 Déposer les échantillons auxquels a été ajouté un tampon de dépôt (bleu agarose + rouge de crésol + eau) à raison de 10 µL par puits.

 Brancher la cuve au générateur pour faire migrer les échantillons.

 Une fois la migration terminée, éteindre le générateur et placer le gel sur une plaque à U.V afin de visualiser l’ADN.

Pour la manipulation de BET il est important de mettre une blouse, des gants et de le

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C. Séquençage Sanger

1. Principe

La technique mise au point par Sanger (1977) repose sur la synthèse d’un brin complémentaire de l’ADN par l’ADN polymérase, à l’aide d’amorces (Cf. document n°5 - p.10).

Document n°5 : Principe de la détermination de séquence par la méthode de Sanger (système 3730 Applied Biosystem)

 Au cours de cette réaction, 2 types de nucléotides sont utilisés : les dNTP (qui permettent l’élongation du brin) et les ddNTP (di-désoxyribonucléotides triphosphates). Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence du groupement OH. Chaque ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) est marqué par un fluorochrome différent, dont le spectre d’émission est spécifique. Lorsque l’ADN polymérase incorpore aléatoirement des ddNTP au lieu de dNTP, la réaction d’élongation de chaque produit monobrin est interrompue. Une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide permet de séparer tous les fragments qui diffèrent entre eux d’une seule paire de base. En fin de migration les molécules fluorescentes sont excitées par un rayon laser et la fluorescence émise au fur et à mesure de la migration est recueillie par une caméra CCD reliée à un ordinateur qui enregistre les signaux en continu.

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2. Mode Opératoire de la purification de produits PCR

Avant de lancer la réaction de séquençage, il est nécessaire de réaliser une première purification des produits PCR à l’aide de 2 enzymes : l’exonucléase I (New England Biolabs) et la TSAP (Thermosensitive Shrimp Alkaline Phosphatase). L’exonucléase I permet de détruire les fragments d’ADN simple brin, donc les amorces. La TSAP (PROMEGA), permet d’enlever le 5’P des nucléotides libres, ce qui empêche leur utilisation lors de la réaction de séquence. La purification doit être faite juste avant le séquençage, car les enzymes sont capables d’abîmer les produits PCR après un contact prolongé.

Pour réaliser cette purification dans un volume final de 15 µL, il faut : une quantité de produit PCR permettant d’avoir entre 5 et 20 ng d’ADN (ou de 1 à 12 µL de produit PCR en fonction de l’intensité du fragment sur gel d’agarose) ; les 2 enzymes à 0.5 U chacune, et de l’eau pour compléter jusqu’à 15 µL.

Le programme dans le thermocycleur dure 1h15, soit : 37 °C pendant 45 minutes (min), 80 °C pendant 30 min pour inactiver l’enzyme.

3. Mode Opératoire de la réaction de séquençage

La réaction de séquençage est réalisée, à l’aide du kit Prism AmpliTaq FS Big Dye Terminators diChloroRhodamine V3.1 (Life technologies). Une fois la réaction terminée, la réaction de séquence est conservée à -20 °C jusqu’à ce qu’une nouvelle purification soit réalisée pour éliminer l’excès de ddNTP fluorescents, avant la migration sur séquenceur.

Séquenceur utilisé : ABI3730 48 capillaires

Cette réaction nécessite pour un volume final de 20 µL : une quantité de produit PCR purifié permettant d’avoir entre 5 et 20 ng d’ADN ; une amorce sens ou anti-sens à 10 µM (une seule amorce par tube) ; le tampon fourni dans le kit à 0.5 X final ; 1 µl de Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit et de l’eau pour compléter jusqu’à 20 µL.

Le programme à entrer dans le thermocycleur dure 2h15, soit : 95 °C pendant 5 min, 95 °C pendant 30 secondes (sec), 55 °C pendant 30 sec et 60 °C pendant 4 min.

D. Génotypage de SNP par PCR-RFLP

1. Principe

La PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Lenght Polymorphism) est une technique de génotypage basée sur le profil de restriction de la séquence d’ADN étudiée. Elle est réalisée après PCR. L’enzyme de restriction est choisie en fonction de la séquence se situant autour du SNP en utilisant un site internet de fournisseur d’enzymes (New England

Biolabs). Les variations de tailles des fragments sont visualisées par électrophorèse, et

permettent de faire le génotypage du ou des SNP. Les enzymes que j’ai utilisées pour réaliser les digestions enzymatiques sur les animaux du projet « satin » sont BsaWI (Cf. document n°6 - p.12) et BccI.

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Document n°6 : Site de reconnaissance de BsaWI

2. Mode Opératoire

Les conditions de digestions enzymatiques réalisées pour BsaWI et BccI correspondent à celles préconisées par le fournisseur (New England Biolabs). Ainsi, pour les 2 digestions enzymatiques, nous avons utilisé 2 à 8 µL de produits PCR selon leur intensité sur gel d’agarose ; 1 X de tampon Cut Smart et 2 U d’enzyme dans un volume final de 15 µL.

Pour BsaWI, la réaction de digestion a été effectuée à 60 °C pendant 15 min, puis arrêtée en inhibant l’activité enzymatique 15 min à 80 °C.

Pour BccI, la réaction de digestion a été effectuée à 37 °C pendant 4 h, puis arrêtée en inhibant l’activité enzymatique 15 min à 65 °C.

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IV. RESULTATS ET DISCUSSIONS

1) Extraction d’ADN génomique et contrôle qualité

A mon arrivée, j’ai réalisé l’extraction d’ADN génomique à partir de morceaux d’oreilles des animaux du protocole « Cas/contrôle » et du protocole « Diversité », à savoir, 294 extractions (150 animaux du protocole « Cas/contrôle », ainsi que 144 animaux issus du protocole « Diversité »). J’ai ensuite contrôlé la qualité de ces extractions, afin d’obtenir des échantillons de quantité et de qualité suffisante pour la suite des manipulations.

Comme les protocoles « Cas/contrôle » et « Diversité » utilisent le même mode opératoire d’extraction à partir du même type d’échantillons (morceaux d’oreille entière), une analyse globale de la qualité a été effectuée.

Pour chaque extraction, j’ai obtenu la concentration en ADN, ainsi que les rapports DO 260/ DO 280 et DO 260/ DO 230. Les rapports optimaux sont compris entre 1.8 et 2. Suite à cela j’ai pu calculer la quantité d’ADN extraite pour chaque animal.

Les moyennes, les minimum et les maximum des concentrations, des quantités et des rapports DO 260/ DO 280 et DO 260/ DO 230 sont visualisables dans le tableau ci-dessous :

Concentration (µg/mL) Quantité (µg) DO 260/ 280 DO 260/ 230 Moyenne 335 168 1,74 1,06 Minimum 34 17 1,26 0,45 Maximum 1318 659 1,92 1,6

La quantité moyenne d’ADN obtenue (168 µg) est conforme à celle habituellement obtenue dans l’équipe (de 41 à 370 µg). Les variations peuvent s’expliquer par des digestions enzymatiques incomplètes du tissu utilisé.

Le rapport moyen de DO 260/ DO 280 (1,74) est satisfaisant en terme de contamination protéique, car il est proche de 2. Le rapport moyen DO 260/ DO 230 (1,06) est faible par rapport à 2, ce qui signifie qu’il reste des traces de sels.

Les 294 ADN extraits sont donc quantitativement et qualitativement utilisables pour la suite des manipulations.

2) Mise au point PCR

Afin d’obtenir la séquence entière du gène FOXQ1 et non une séquence aspécifique, il est nécessaire de définir correctement les paramètres de PCR. Pour cela, je me suis basée sur le séquençage du génome entier chez le lapin, appelé génome de référence. Cela m’a permis de

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définir 13 couples d’amorces, car j’avais accès à la séquence du gène d’intérêt (Cf. document n°7 - p.14).

Document n°7 : Schéma représentatif de la position des couples d’amorces sur le gène FOXQ1

J’ai testé les différents couples d’amorces sur 4 animaux choisis sur base de leur quantité d’ADN et de leur phénotype (2 homozygotes « satin » et 2 homozygotes « sauvage »).

J’ai d’abord testé ces couples avec les conditions standards de PCR et aucun couple n’amplifie la séquence cible avec une taille de fragment qui correspond à la taille attendue (Cf. document n°8 - p.14).

Document n°8 : Gel d’agarose dans des conditions classiques de PCR couples 4, 5 et 12

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- pour le couple 4 : la température d’hybridation (54 °C), le nombre de cycles (40 cycles),

l’enzyme utilisée (Long Range PROMEGA) ainsi que l’ajout de DMSO (4 %)

- pour le couple 5 : la température d’hybridation (58 °C), le nombre de cycles (40 cycles), la concentration en MgCl2 (3 mM), ainsi que l’ajout de DMSO (8 %)

- pour le couple 12 : la température d’hybridation (58 °C) et le nombre de cycles (35 cycles)

Document n°9 : Gel d’agarose après mises au point PCR couples 4, 5 et 12

Sur le gel d’agarose, j’observe que l’eau est bien négative, ce qui me permet d’interpréter les résultats obtenus. Le standard de taille utilisé est le standard de taille 100 pb. La taille attendue pour le couple 12 est de 341 pb et la taille observée sur le gel d’agarose est entre 300 et 400 pb. Les bandes observées sur le gel d’agarose pour les couples 4 et 5 sont elles aussi à la taille attendue (entre 900 et 1000 pb). J’en ai donc conclu que pour les couples 4, 5 et 12 les bandes obtenues sur le gel semblaient correspondre à la séquence ciblée.

Seulement 3 couples sur les 13 testés semblent amplifier la séquence d’intérêt. Plusieurs hypothèses permettent d’expliquer ce taux de réussite assez faible. La séquence du gène FOXQ1 est très riche en GC, ce qui complexifie les conditions d’amplification. Le gène FOXQ1 appartient à une famille de gènes qui contiennent une zone homologue, ce qui complique l’hybridation des amorces qui amplifient parfois des séquences aspécifiques. De ce fait, j’ai donc éliminé les 10 couples qui ne fonctionnent pas malgré les nombreuses mises au point PCR. Les couples 4 et 5 se chevauchent et permettent à tous les deux d’obtenir la séquence complète du gène, contrairement au couple 12 qui ne permet d’obtenir que la partie 3’ du gène située après le cadre de lecture (Cf. documents n°7 et n°9 - p.14 et p.15). Pour valider mon observation et vérifier si les couples d’amorces 4, 5 et 12 amplifient la bonne séquence, j’ai réalisé le séquençage de chacune des bandes obtenues.

3) Séquençage Sanger

Le séquençage permet de s’assurer que les produits PCR obtenus correspondent bien à la séquence du gène FOXQ1, avant de les utiliser sur les animaux du projet. J’ai donc séquencé les 3 produits PCR (obtenus à l’aide des couples d’amorces 4, 5 et 12) sur les 4 animaux témoins (2 « satin » et 2 « sauvage ») utilisés lors des mises au point PCR (Cf. document n°9 - p.15), soit au total 24 séquences (3 couples x 4 animaux x 2 amorces, soit une sens et une anti-sens). Une fois le séquençage terminé, j’ai vérifié la qualité des séquences obtenues à l’aide d’un logiciel appelé Chromas Pro (Cf. document n°10 - p.16). Du fait qu’il n’y ait pas beaucoup de bruit de fond, que chaque pic ait une base associée, et que la taille des fragments attendus avec l’amorce sens et avec l’amorce anti-sens soit identiques, j’en ai conclu que toutes les séquences obtenues étaient de bonnes qualités et donc utilisables pour la suite des analyses.

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Suite à cela, j’ai tout d’abord essayé d’aligner ces séquences sur la séquence de FOXQ1 pour voir le pourcentage d’homologie. Ensuite, pour valider les résultats obtenus, j’ai aligné ces dernières sur le génome du lapin et sur celui de l’Homme afin de voir sur quel chromosome elles se situaient. Pour cela, j’ai utilisé un site internet appelé blast

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LI

NK_LOC=blasthome).

Pour les couples 4 et 5 je n’ai pas retrouvé d’homologie avec la séquence de référence de

FOXQ1, et l’alignement sur le génome du lapin a montré que les séquences amplifiées n’étaient

pas sur le chromosome attendu (alignement dans des séquences non connues appelées scaffold). Ceci pourrait s’expliquer par le fait que le gène FOXQ1 appartient à une famille de gènes, et que sa séquence ait une portion homologue à plusieurs gènes. De ce fait, l’hybridation des amorces est plus difficile, car elles peuvent se fixer sur plusieurs endroits du génome et donc amplifier une séquence non désirée. J’ai donc abandonné ces 2 couples, car ils n’amplifient pas la séquence cible. Concernant le couple 12, j’ai aligné la séquence obtenue sur celle de la séquence de FOXQ1 et je l’ai bien retrouvée. J’ai également retrouvé cette séquence dans le chromosome contenant FOXQ1 chez l’Homme (chromosome 6) et dans le chromosome supposé contenir FOXQ1 chez le lapin (chromosome 12). J’ai donc pu confirmer que le couple 12 amplifiait la séquence attendue.

Sur les 3 couples testés, seul le couple 12 est spécifique, car il a permis d’amplifier la séquence cible. Cependant, contrairement aux couples 4 et 5 qui en se chevauchant permettaient d’obtenir la séquence complète du gène, le couple 12 ne permet d’obtenir que la fin du gène d’intérêt. Grâce aux résultats obtenus sur les animaux témoins, j’ai pu réaliser le séquençage du produit PCR issus de l’amplification avec le couple 12 sur plusieurs animaux afin de rechercher d’éventuels polymorphismes, qui pourraient être responsables du phénotype « satin ». Pour maximiser la détection de polymorphismes, j’ai utilisé les 4 individus témoins de phénotypes différents (2 « satin » et 2 « sauvage »). Cela m’a permis d’identifier 2 polymorphismes de type SNP en 3’ du gène, qui discriminent parfaitement les 2 individus « satin » des 2 individus « sauvage » (Cf. document n°10 - p.16).

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De ce fait, mes analyses ultérieures ont été focalisées sur ces 2 polymorphismes et j’ai donc génotypé les produits PCR issus de l’amplification avec le couple 12 de tous les animaux des protocoles « Cas/contrôle » et « Diversité ».

4) Génotypage

Afin de génotyper ces 2 SNP, la technique de PCR-RFLP a été utilisée, car ces derniers sont positionnés sur des sites de restriction, dont le premier est reconnu par l’enzyme BccI et le second est reconnu par BsaWI.

De ce fait, j’ai pu réaliser les digestions sur les 294 animaux dont j’avais extrait l’ADN génomique (Cf. documents n°11, n°12 et n°13 – p.17 et p.18).

Le fragment PCR amplifié issu du couple 12 a une taille de 341 pb. Les documents n°11 et n°12 page 17 résument les génotypes que l’on peut déduire au dépôt sur gel d’agarose des produits

PCR digérés par BccI et par BsaWI. Les résultats d’un seul SNP (digestion à l’aide de BsaWI) sont présentés, car le principe est identique pour les 2 SNP.

Document n°11 : Tableau récapitulatif des tailles attendues pour la digestion enzymatique par BsaWI

Enzyme : BsaWI

Taille sur le gel (pb) Génotype

231+110 Homozygote T/T 231+110+203+28 Hétérozygote T/C 203+110+28 Homozygote C/C

Document n°12 : Tableau récapitulatif des tailles attendues pour la digestion enzymatique par BccI

Enzyme : BccI

Taille sur le gel (pb) Génotype

158+140+43 Homozygote C/C 298+158+140+43 Hétérozygote C/T 298+43 Homozygote T/T

L’enzyme BsaWI discrimine l’allèle T de l’allèle C (Cf. document n°6 - p.12).

L’enzyme BccI discrimine l’allèle C de l’allèle T.

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A. PCR RFLP sur les animaux du protocole « Cas/contrôle »

Quelques résultats de digestion par BsaWI sont visualisables sur gel d’agarose (Cf. document n°13 - p.18).

Document n°13 : Electrophorèse sur gel d’agarose après digestion enzymatique par BsaWI

Suite à la digestion enzymatique par BsaWI, j’observe que l’eau est bien négative et que les 2 témoins non digérés sont à la taille attendue (341 pb). Du fait qu’il y ait un site de restriction systématiquement présent sur la séquence à digérer, la bande à 110 pb est produite, quel que soit l’allèle. Pour les individus homozygotes C/C ou hétérozygotes T/C, la bande de 28 pb n’est pas visualisable sur gel car elle est de petite taille (Cf. documents n°6, n°11 et n°13 - p.12, p.17 et p.18).

Nous observons : une bande à environ 100 pb qui semble correspondre à la bande attendue à 110 pb ; une bande proche de 200 pb qui correspondrait à la taille attendue à 203 pb et une bande entre 200 et 300 pb qui pourrait être la bande attendue à 231 pb. Nous en concluons que les digestions enzymatiques réalisées à l’aide de BsaWI ont fonctionnées. Cette méthodologie peut donc être poursuivie pour génotyper les animaux des protocoles « Cas/contrôle » et « Diversité » (Cf. documents n°14 et n°15 - p.18 et p.19).

Document n°14 : Génotypage des animaux du protocole « Cas/contrôle » à l’aide de BsaWI

Race Nombre d'animaux Phénotype HomozygoteT/T HétérozygoteT/C HomozygoteC/C

Castor 25 satin 0 0 25

Castor 25 non satin 25 0 0

Chinchilla 25 satin 0 10 15

Chinchilla 25 non satin 25 0 0

Laghmere 25 satin 0 3 22

Laghmere 25 non satin 20 5 0

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Suite au génotypage, j’ai pu observer que chez les animaux de race Castor, lorsqu’un individu a le phénotype « satin », il est homozygote C/C alors que tous les animaux « sauvages » sont hétérozygotes T/T. Nous en concluons, que les 2 polymorphismes identifiés dans le gène

FOXQ1 se comportent comme la mutation causale que l’on cherche à identifier.

Chez les lapins de races Laghmere et Chinchilla, il semble que la ségrégation soit différente de celle observée en race Castor. En effet, certains individus de phénotype « satin » sont hétérozygotes aux 2 marqueurs. Or, comme le déterminisme génétique du caractère « satin » est récessif, on s’attend à ce que tous les individus présentant un phénotype « satin » soient homozygotes pour l’allèle muté. Ainsi, nous en déduisons qu’en races Laghmere et Chinchilla, les 2 variants identifiés ne peuvent être la mutation causale responsable du caractère « satin ».

B. PCR RFLP sur les animaux du protocole « Diversité »

Le génotypage des animaux du protocole « Diversité » a été réalisé dans le but de génotyper plus d’individus de phénotypes et de races différentes, afin de déterminer si les 2 polymorphismes trouvés étaient également présents dans d’autres populations non connues jusqu’alors, pouvant présenter le phénotype « satin ». Ainsi, j’ai génotypé comme précédemment (digestions enzymatiques à l’aide de BsaWI et BccI) les 144 animaux issus du protocole « Diversité » (Cf. document n°15 - p.19).

Document n°15 : Génotypage des animaux du protocole « Diversité » à l’aide de BsaWI

Il existe différentes races pour lesquelles lors des digestions enzymatiques par BsaWI, des individus homozygotes pour l’allèle C/C sont observés, et surtout chez les lapins de race Livolsi. Il serait donc intéressant de phénotyper les animaux ayant un génotype C/C afin de valider ou d’invalider le phénotype déduit du génotype. On pourrait également poursuivre le projet en utilisant des lapins de race Livolsi, car sur 20 lapins Livolsi, plus de la moitié possèdent le génotype C/C.

Race Nombre d'animaux HomozygoteT/T

HétérozygoteT/C HomozygoteC/C Angora 18 15 3 0 Angora Albinos 16 10 5 1 Angora Noir 4 3 1 0 Angora Bleu 5 2 2 1 Fauve de bourgogne 56 17 32 7 Grand russe 2 0 2 0 Gris du bourbonnais 11 7 3 1 Havane Francais 12 9 3 0 Livolsi 20 0 9 11 144

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V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Une étude a permis de démontrer que chez la souris, le gène responsable du caractère « satin » est le gène FOXQ1. L’objectif de mon stage était de valider ou d’invalider l’hypothèse selon laquelle chez le lapin phanère, le phénotype « satin » serait également dû à une mutation dans le gène FOXQ1.

J’ai séquencé le produit PCR de 3 couples d’amorces dont j’avais obtenu un fragment à la taille attendue. Malgré les nombreuses mises au point réalisées, un seul d’eux m’a permis d’amplifier un fragment de 341 pb sur 1200 pb que fait le gène en entier. Ces 341 pb sont localisées en 3’ du gène.

Les difficultés rencontrées lors de mes analyses peuvent être les conséquences de plusieurs facteurs. La séquence du gène FOXQ1 est très riche en GC et elle appartient à une famille de gènes ayant une séquence protéique homologue d’environ 100AA. Cela complique la dénaturation de l’ADN, ainsi que la fixation des amorces qui perdent en spécificité. Etant donné que nous avons défini les couples d’amorces à partir du génome de référence, il se pourrait que l’annotation et les données disponibles pour le gène FOXQ1 chez le lapin soient inexactes. Cela expliquerait la non spécificité des amorces qui auraient été définies à partir d’une mauvaise séquence.

Pour remédier aux problèmes rencontrés, plusieurs options peuvent être tentées. Nous pourrions traiter l’ADN avec du bisulfite pour altérer la composition riche en GC de la séquence nucléotidique. Il serait également possible d’attendre une meilleure version du génome de référence et refaire le même type de travail que celui réalisé lors de mon stage. Nous pourrions encore caractériser directement la séquence de FOXQ1 des individus d’intérêt en séquençant leurs propres messagers à l’aide de la technique de Race PCR (Rapid Amplification of CDNA Ends). Pour pallier les difficultés dues à la séquence de FOXQ1, les méthodologies sont lourdes et longues à mettre en place et elles sont d’autant plus contraignantes.

De ce fait, nous avons continué les analyses sur la séquence de 341 pb. Grâce à cette dernière, nous avons mis en évidence 2 variants de type SNP dans le gène FOXQ1, qui ont ensuite été exploités en race Castor et Laghmere.

En race Castor, les 2 polymorphismes se comportent comme la mutation causale que l’on cherche à identifier, puisque tous les individus de phénotype « satin » sont homozygotes pour les allèles mutés, aux 2 SNP. Au vu de leur localisation, ces 2 polymorphismes ne peuvent pas intervenir dans la modification de la structure protéique comme chez la souris. Tout de même, bien que la totalité du gène ne soit pas disponible, ils présentent un très grand intérêt et pourraient jouer sur la régulation du gène.

En races Laghmere et Chinchilla, les résultats semblent plus ambigus, puisque des individus de phénotype « satin » sont hétérozygotes aux 2 SNP. Les études doivent être poursuivies dans ces races pour rechercher d’autres variants qui pourraient être intéressants dans le gène FOXQ1. Cependant, il se peut également que dans ces 2 races, le gène FOXQ1 ne soit pas le gène responsable du phénotype « satin ».

Enfin, l’analyse du protocole « Diversité » a permis de mettre en évidence, en race Livolsi, une fréquence importante de l’allèle muté « satin ». Il serait donc intéressant de poursuivre le

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projet en phénotypant des lapins de race Livolsi, pour valider ou non la présence du caractère « satin » dans cette race, ainsi que de génotyper un plus grand nombre d’individus Livolsi.

Mon travail a permis d’affiner les connaissances sur le gène responsable du caractère « satin » chez le lapin phanère. Mes résultats suggèrent fortement que en race Castor, le gène

FOXQ1 est associé au phénotype « satin » et que les 2 polymorphismes sont considérés comme

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GLOSSAIRE

Cf : Confer : se référer H2O : Eau

ADNg : Acide Désoxyribonucléique génomique ARN : Acide Ribonucléique

AA : Acide Aminé

SNP : Single Nucleotide Polymorphism cm : Centimètre DO : Densité Optique mL : Millilitre µL : Microlitre µg : Microgramme µM : MicroMolaire nm : Nanomètre

U/µL : Unité par microlitre ng : Nano gramme

mM : MilliMolaire mg : Milligramme

NaCl : Chlorure de Sodium % : Pourcent

TE : Tris EDTA

EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique pH: Potentiel Hydrogène

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate h : Heure

°C : Degrés Celsius min : Minute sec : Seconde

rpm : rotation par minute

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCR RFLP: Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism dNTP : Désoxyribonucléotide

UV : Ultra-Violet

MgCl2 : Chlorure de Magnésium

Tm : Melting Temperature : Température moyenne de fusion

n cycles : Nombre de cycles pb : Paire de bases

b : Base Kb : Kilobases

BET : Bromure d’Ethidium TAE : Tris Acétate d’EDTA g : Gramme

1X : Une fois concentrée

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RESUME

Le caractère « satin » affecte la finesse et la coloration du pelage, ce qui est intéressant pour l’amélioration de la fourrure chez le lapin phanère car il rend le pelage dense, soyeux et brillant. Chez la souris, des mutations dans le gène FOXQ1 sont impliquées dans l’expression du caractère « satin ». Des études génétiques menées chez le lapin phanère en races Castor, Chinchilla et Laghmere ont montré que le caractère « satin » serait dû à une mutation récessive localisée sur un autosome et que la région chromosomique contenant le gène FOXQ1 était associée avec le phénotype d’intérêt. Nous avons donc émis l’hypothèse que le gène FOXQ1 serait impliqué dans le déterminisme génétique du caractère « satin » chez le lapin.

Pour cela, j’ai tout d’abord séquencé le gène FOXQ1 chez des lapins « satin » et « sauvage » (non satin) afin de répertorier les polymorphismes. Malgré toutes les mises au point réalisées, seules 341pb (sur environ 1200pb) localisées à l’extrémité 3’ du gène ont été séquencées, ne permettant donc pas d’obtenir la phase codante de FOXQ1. J’ai identifié 2 variants de type SNP que j’ai ensuite génotypés sur 294 animaux issus de 2 protocoles expérimentaux appelés : protocole « Cas/contrôle » (composé d’animaux « satin » (cas) et « sauvage » (contrôle) établis en races Castor, Chinchilla et Laghmere) et protocole « Diversité » (regroupant diverses races de lapins). De façon très intéressante, en race Castor, j’ai observé que tous les individus « satin » étaient homozygotes pour les allèles mutés aux 2 SNP. En revanche, seule une tendance a été observée en races Chinchilla et Laghmere puisqu’il existe des individus « satin » hétérozygotes aux 2 variants considérés. Par ailleurs, j’ai mis en évidence, grâce au protocole « Diversité », que les allèles mutés étaient présents à forte fréquence chez des lapins de race Livolsi.

Mes résultats suggèrent fortement qu’en race Castor, le gène FOXQ1 est impliqué dans le déterminisme génétique du caractère « satin » et que les 2 polymorphismes identifiés peuvent être considérés comme de potentielles mutations causales. Les études devront cependant être poursuivies pour les 3 races afin de séquencer la totalité du gène FOXQ1 et peut-être d’identifier d’autres variants dans la partie codante du gène, qui pourraient jouer un rôle sur la structure de la protéine comme il a été montré chez la souris.