Sélection de cotonniers présentant une très faible teneur en gossypol dans ses organes - Approche interspécifique

Sélection

de

cotonniers

à

teneur

variable de

gossypol

dans

ses organes

Approche interspécifique

G. Mergeal1 G. Lognay2

A.Maqueti I. VrohBi1

H. BenBouza1 J.-P.Baudoin1

I

Introduction

Les cotonniersdiploïdessauvagesaustraliens appartenant aux sec¬

tions Sturtia et Hibiscoidea du genre Gossypium produisent des

grainessansterpénoïdes alors queleursparties aériennes sont pour¬

vues deglandesàgossypol(Brubaker et

al,

1996).

L'

introgression

chez laprincipale espèce decotonnier

cultivé

du mécanismelimi¬

tant laproduction degossypoldans les grainesesthautementsou¬

haitablecarcelapermettrait

l'exploitation

ducotonniercomme une

culture vivrière tout en préservant son principal mode de défense

naturel contre les insectes ravageurs.

Le

gossypol et les autres ter¬

pénoïdesproduitsparlecotonniersonttoxiquespourla plupartdes

espèces animales

y

compris les insectes et, malheureusement, les

1Unité dephytotechnie desrégions intertropicales,faculté universitaire

desSciencesagronomiquesdeGembloux,B-5030Gembloux,Belgique.

2Unitédechimiegénérale etorganique,faculté universitairedes Scien¬

112T Des modèles biologiques à l'améliorationdes plantes

hommes

(Altman

et

al,

1990).Trois schémas de croisementpeu¬

vent être suivis pour obtenir l'introgression de

l'inhibition

de la

synthèsedugossypol dans lagrainedu cotonnier (Mergeai, 1994).

Deux d'entre eux donnentnaissanceàdeshybridestrispécifiqueset

le troisième permet

l'exploitation

directed'hybrides bispécifiques.

Comme la stratégie de croisementdirect entre G. hirsutum et une

espèceaustraliennesemblait particulièrement

difficile

àsuivrepour

réussir

l'introgression

du caractère recherché (Dilday, 1986 ;

Altman

et

al,

1987 ; Rooney et

al,

1991), nous avons décidé de

suivrelavoietrispécifique. Dansdetelshybrides,tous les chromo¬

somes de l'espèce donneuse australienne sont confrontés au

génome deG.hirsutum avec unehauteprobabilitéderecombinai¬

son,grâceà

l'utilisation

decroisementsponts.Cescroisementsfont

intervenirune espèce appartenant à un des deux génomes

ances-traux

(A

ou

D)

deG.hirsutum.Nousavonschoisi

d'utiliser

l'espèce

diploïde sauvageaméricaine G.

raimondii

commepontpour créer

unhybride trispécifique

ACDD

carlegénome

D

(auquelappartient

G.

raimondii)

montre une fortedistancephylétiquepar rapportau

génome C alors que la distance phylétique entre le génome

A

(espèces diploïdes asiatiques) et le génome C estnettementmoins

grande(Endrizziet

al,

1985).

Au

coursdesdernièresannées,denouvellesstratégies desélection

baséessur

l'utilisation

demarqueursde

l'ADN

moléculaire ontété

proposées pour réduirele tempset lesefforts nécessairesau déve¬

loppementdenouvelles variétés. Lesprincipes

d'utilisation

detels

marqueursontété décritsen détailchez de multiplesplantes culti¬

véespardenombreuxchercheurs(Tanksleyet

al,

1989 ;Paterson

et

al,

1991 ; Dudley, 1993 ; Lee, 1998). Cependant, les rapports

concernant

l'utilisation

de tels marqueurs dansdestravaux d'amé¬

lioration

génétique ducotonnierrestentrelativementraresquand on

considèrel'importanceéconomiquedecetteculture.La

RAPD

aété

utilisée pour caractériser des cultivars de cotonnier

(Multani

et

Lyon, 1995), pour évaluer la variabilité au sein de variétés élites

(Tatieni et

al,

1996 ; Iqbalet

al,

1997) etpourassisterlaréalisa¬

tion

d'un

programme de sélection récurrente à partir d'hybrides

interspécifiques(Mergeaiet

al,

1998). La technique

AFLP

est uti¬

lisabledans lesmêmesconditionsd'application queles marqueurs

RAPD.

Elle

est en général considérée comme plus fiable et plus

G.Mergeaiefal. Sélection de cotonniersàteneur variabledegossypoldans ses organes T 1 13

grandnombre demarqueurs générésparréaction(Voset

al,

1995).

Peud'applicationsdesmarqueursRFLPsontmentionnées(Wanget

al,

1995 ; Shappley et

al,

1996 ;MeredithetBrown, 1998). Une

carteRFLPducotonnierestactuellementenconstruction(Reinisch

etal. 1994)et

offre

unnouvel

outil

pour analyserl'introgressionde

matériel génétique.

L'emploi

de ces différentestechniques est très

utile pour évaluer ledegréde

similitude

génétiqueexistantentre les

matérielsissusdurétrocroisementd'hybrides interspécifiquesetle

cotonniercultivé ainsiquepourcartographierlessegments

d'ADN

d'espèces diploïdes donneuses introgressés chez les différents

hybrides tétraploïdes obtenus dans le cadre de programmes d'hy¬

bridation interspécifique.

Matériel

et

méthode

Le matériel végétal comprend l'hybride trispécifique G. hirsutum x

G. raimondii

x

G. sturtianum et ses parents. Le schéma d'obtention

détaillédel'hybridetrispécifiqueest présentédansMergeaietal.(1997).

Cethybrideaétérétrocroisépar lesvariétésC2et stam

F

de G. hirsu¬

tum pour donner une descendanceBCt, BC2,BC2S1 etBC3(fig. 1).

HRSxG.hirsutum

I

BC1 xG.hirsutum

\

autofécondation BC2 xG.hirsutum

\

BC2S1 BC3 I Figure1

Schémasuivi pour l'obtentiondu matériel analysé.

BC,,BC2, BC3=hybridesrétrocroisés de Ve,2eet3egénération.

BC2S,=matériel issu del'autofécondationd'unhybriderétrocroisé de2egénération.

114T Desmodèles biologiques à l'amélioration des plantes

Lescroisementsontétéréalisés en

utilisant

le mélanged'hormones

proposé par

Altman

(1988) : 100 mg.l-1 d'acide naphtoxyacétique

+ 50

mg.H

d'acide gibberellique. La majorité des embryons

hybrides a été cultivée in

vitro

après maturation complète de la

grainesurle

milieu

deStewartetHsu(1977)demanièreàgarantir

leurbonnegerminationetun bon démarragedesplantules.Laden¬

sitédeglandesàgossypolsur lesgrainesproduitespar

rétrocroise-ment a été évaluée en utilisant une échelle variant de 0 pour les

grainestotalementdépourvuesdeglandeà 10pourlesgrainesdont

la densité de glandes était semblable à celle de l'espèce cultivée.

L'évaluationdeladensitéenglandesàgossypolaétéréaliséeaprès

élimination

des téguments et trempage de l'amande pendant une

heure dans de l'eau stérile. Lesanalyses méiotiques desmatériels

produits ont été réalisées sur des boutons floraux fixés pendant

72 heures dansla solutiondeCarnoy (ethanol95%:chloroforme:

acide acétiqueglacial,6:3:1

v

:v:v).

Au

moins26cellulesmèredu

pollen ontétéanalyséespourchaquegénotype(Vrohet

al,

1998).

La teneuren gossypol des graines a été évaluéepar

chromatogra-phie àhaute performanceen phase

liquide

en adaptantla méthode

proposée parMarquiéetBourély (1991) pour réaliserune analyse

graine pargraine.

Lateneurenterpénoïdesdesboutons

floraux

aétéévaluéepar

chro-matographie à hauteperformanceen phase

liquide

aumoyen dela

méthode proposéepar Stipanovic etal. (1988).

L'ADN

génomiquetotaldesplantes obtenues aétéextraitenutili¬

santlaméthode développéeparVroh

Bi

etal. (1996).

Les réactions

AFLP

ont été réalisées en

utilisant

le

kit

d'analyse

AFLP

I

(Life

ScienceTechnologies, Merelbeke, Belgique)et selon

le protocoleproposéparleproducteur.Les cinqcombinaisonssui¬

vantesde sondesontétéutilisées danscette étude:

Cl

= EcoRl +

AAC/Msel

+

CAA,

C2

=

EcoRl

+

AAC/Msel +

CTT,

C3 =EcoRl

+

AAG/Msel

+ CTT,

C6 =

£coRI

+

ACT/Msel

+CAG,

C9 =EcoRl +

ACG/Msel

+ CTA.

La présence (1)ou l'absence (0) des bandes

AFLP

a éténotée de

G.Mergeaiefal. Sélectionde cotonniersà teneur variable de gossypol dans ses organes T 1 15

en utilisant le

coefficient

de Jaccard. Un dendrogramme basé sur

ces coefficients a été construit en

utilisant

la méthode

UPGMA

(unweighted

pair

groupmethod average) surle

logiciel

Systatver¬

sion 8.0 (SPSS Inc. Chicago,111.).

L'analyse RFLPaété effectuéeen utilisant49 inserts sélectionnés

surlacarteRFLPdeReinisch et

al

(1994).Après

amplification

par

PCR, ces inserts ont été utilisés comme sondes RFLP selon la

méthodedécriteparVroh biet

al.

(1999 b).

L'introgression de fragments

d'ADN

en provenance des espèces

sauvages a été évaluée chez les hybrides en analysant les

profils

montrant un polymorphisme entre les espèces parentales pour la

combinaisonsonde/enzymetestée.Quandla dispositiondesbandes

de

l'hybride

et de leur descendance rétrocroisée était similaire à

celleobservéechezleparent sauvagepourlesmarqueursRFLP, les

résultatsontétéconsidéréscommeindiquant une introgression

d'un

fragment du chromosome du parent sauvage au niveau du locus

RFLPconcerné.LesmarqueursRFLP flanquants, du marqueursup¬

posé positif, ont ensuite été vérifiés quand ils étaient disponibles

pour déterminerla

taille

approximativedessegmentsintrogressés en

centimorgans.Quandlesmarqueursadjacentsn'étaientpaspositifs,

il

a étésupposéquelarecombinaisonavaiteulieujusteau

milieu.

I

1

Résultats

Production

de plantes

introgressées

Lestableaux 1et 2 reprennentrespectivementlenombre

d'individus

obtenusàchaquegénérationderétrocroisementetla

distribution

de

fréquence des densités de glandes observées chez ces hybrides.

Surles51 grainesBC, issuesde

l'hybride

HRS,seulement3(6%)

étaient totalement démunies de glandes à gossypol (niveau 0).

La distributiondefréquencedesdensitésdeglandesàgossypolchez

le restedesgrainesBC)présentait uneformeassymétrique avec une

116' Des modèlesbiologiques à l'amélioration des plantes

BC,,BC2,BC3 =hybrides rétrocroisésde1re,2° et3egénération.

BC2S,=matérielissude l'autofécondation d'un hybride rétrocroisé de2egénération.

Années 1994 1995 1996 1997 Total BC, Nombre Nombre graines plantes utilisées adultes 17 6 13 0 9 0 12 10 51 16 BC2 Nombre Nombre graines plantes utilisées adultes 6 0 3 3 21 11 30 14 BC2S, Nombre Nombre graines plantes utilisées adultes 18 11 18 11 BC3 Nombre Nombre graines plantes utilisées adultes 6 5 6 5 ITableau 1

Nombredeplantesproduites àpartirde graines

obtenuesenrétrocroisant l'hybride HRS.

Classes dedensité 0-3 4-6 7-10 Total BC, 23 19 9 51 BC2 6 10 1 17 BC2S1 10 5 3 18 BC3 4 11 4 19 ITableau 2

Distributionde ladensité de glandesà gossypoldesgraines chezladescendancedel'hybrideHRS.

(niveaux 2 à 5). Un nombre très variable de plantes adultes a été

obtenuà

partir

desgraines

BCj

enfonctiondeleurannée demiseen

culture (tabl. 1). Après

l'obtention d'un

nombrerelativementélevé

deplantes adultesla lre année, aucuneplanteadultene

fut

produite

lesdeuxannéessuivantesmalgrélaculture

in vitro

systématiquedes

embryonsmatures. Ceproblèmepeutsansdouteêtreattribuéà une

forte dormance des graines qui avaient été cultivées moins de six

moisaprèsleur récolte. Pouréliminercettedormance supposée, les

semis furent retardés de deux mois en 1997 et toutes les graines

furentplongées pendantdeux minutes dans un baind'eau à 70 °C

avantd'être cultivées in vitro.Ces mesurespermirentuneaugmen¬

tation considérabledu tauxdeproductiondeplantes adultesà

partir

de graines

BCj

(de 0 à 50 %).Toutes les plantes

BC!

issues de

graines présentant unefaibledensitédeglandes(niveaux0à3)ont

G.Mergeaiétal. Sélectiondecotonniersàteneur variabledegossypoldans ses organes 117

densité de glandesnormale. Parmi toutes les plantes issues deces

rétrocroisements, un seul génotype a produit des graines BC2. La

majorité de celles-ci montraientunedensité de glandes àgossypol

faible à intermédiaire (tabl. 2). Seulement6 plantes adultes furent

obtenuessurun

total

de21 graines BC2. Deuxdeces6plantesont

donné 18 graines BC2Si et 19 graines BC3, avec à nouveau une

majorité d'entrés elles présentant une densité de glandes faible à

intermédiaire. La

fertilité

du matériel rétrocroisé s'est améliorée

sensiblement à mesure de l'avancement dans les générations. La

colorationdupollenàl'acéto carmin (tabl. 3)adonnédesrésultats

très bas chez

l'hybride

trispécifique et chez sa descendance

BCi

(moins de 10 % de grains colorés). Ces résultats sesont sensible¬

ment améliorésen BC2(jusqu'à60 % de grainscolorés) et en BC3

(jusqu'à80% de grains colorés). Enmoyenne, quatre croisements

ont éténécessaires pour obtenir une graine BC2 tandis

qu'un

seul

rétrocroisement d'une plante BC2 a donné environ 5 graines BC3

(donnéesnonmontrées). Les plantesBC^S, ontproduitenmoyenne

moinsd'une graineparrétrocroisement ;leurniveau de

fertilité

est

donc nettementplusfaiblequeceluidumatérielBC3.

BC,,BC2,BC3=hybrides rétrocroisés de1re,28et3egénération. BC2S, = matériel issudel'autofécondationd'unhybriderétrocroisé

de2egénération/nombre = numéro du génotype analysé au sein dechaque génération. Génotypes HRS BC1/1 BC2/1 BC3/1/1 BC3/1/4 BC3/1/5 BC3/1/8 BC3/1/12 BC2S1/6 BC2S1/8 BC2S1/13 BC2S1/14

Configurations chromosomiquesàla MétaphaseI I 14,40 6,45 3,83 3,01 3,33 1,10 2 4,50 4,83 1,71 15,80 II 17,03 22,56 3,83 23,55 25,30 23,90 25,43 24,60 22,66 22,73 24,72 15,80 III 0,93 0,3 23,61 0,30 0,14 1 0,10 0,23 0,70 0,60 0,21 1,60 IV VI 0,10 0,07 0,10 0,31 0,51 0,07 Nombrede chromosomes 52 53 52 52 54 54 52 54 52 52 52 52 Tétrades normales 124 808 820 807 980 1000 850 252 854 910 823 1000 Tétrades anormales 876 192 180 193 20 0 150 748 146 90 177 0 %pollen fertile 8,9 9,5 60,5 67,5 54,0 95,0 47,5 79,6 45,3 78,9 96,2 88,4 ITableau 3

Microsporogenèse et fertilité polinique chezl'hybrideHRSet sadescendance.

118T Desmodèlesbiologiquesà l'amélioration des plantes

Certaines plantes BC3 et

BC^

sont auto-fertilesmême sansl'ap¬

plication

derégulateursdecroissanceaumomentdelapollinisation.

Leur

descendanceserautilisée pourévaluerle déterminismedel'in¬

hibition

de la synthèse du gossypol dans la graine. Les résultats

obtenus

jusqu'à

présent laissent penser que ce caractère est sans

doutesousla dépendance

d'un

nombrerestreintde gènesdominants.

Plus des deux tiers des graines produites à chaque génération de

rétrocroisement présentent une

diminution

importantede leurden¬

sité de glandes à gossypol alors que le restedes grainesproduites

montreunedensité de glandessimilaireàcelledel'espècecultivée.

Analyse cytogénétique

du

matériel

produit

L'analyse cytogénétique de la descendance de

l'hybride

trispéci¬

fique

amisenévidenceune trèsgrandevariationdanslenombrede

chromosomes chez les plantes

BCi

etBC2.Suruntotalde 8plantes

BC]

analysées, 3présentaient entre2 et4chromosomes surnumé¬

raires et uneplante secaractérisait par l'absencedetrois chromo¬

somes(donnéesnonmontrées). Les autresplantes étaienteuploides

avec2n = 4x =52 chromosomes (Vroh

bi

etal., 1998). La plante

BCj

qui

aproduitune descendanceBC2secaractérisaitpar un haut

niveaud'association chromosomique(bi,

tri,

quadriethexavalents)

enmétaphaseI.Elle montraitégalementun nombre moyenélevéde

chiasmata, indice de fréquents échanges de matériel génétique

(tabl. 3). Deux des trois individus BC2 que nous avons analysés

cytogénétiquement étaient euploides. Le dernier présentait seule¬

ment49 chromosomes etétait complètement stérile. Les premiers

résultats de l'analyse cytogénétique des individus

BC^

et BC3

montrent que la grande majorité de ces génotypes est euploïde

(2n

= 4x =

52)mais que certainsd'entre euxprésententégalement

deschromosomesadditionnels (tabl. 3).

Quantification de l'expression

du

caractère recherché

Lestableaux4et5donnentlesteneursenterpenoïdes observéesau

G.Mergeaiefal. Sélectiondecotonniersàteneurvariabledegossypoldansses organes T 119 Génotype Parents G.hirsutum G.raimondii G.sturtianum Allohexaploide intermédiaire [G.hirsutum xG.sturtanum]2 Descendance rêtrocroiséede HRS BC2S,/9 BC3/9 Nombre boutons analysés 6 3 3. 2 5 1 Teneur totaleen terpénoTdes mg.kg-' 254 1164 23 304 254 236 G mg.kg-' 60 1056 9 81 160 166 H1 mg.kg-' 38 28 22 21 H2 mg.kg-' 64 24 24 H3 mg.kg-' 25 53 8 6 H4 mg.kg-' 30 66 15 16 HGQ mg.kg-' 36 108 13 76 26 4 ITableau4 Teneuren terpénoides (G=gossypol,H1,H2, H3,H4 =Heliocides,

HGQ=hémigossypolone)desboutonsflorauxdes parents

etde ladescendance rêtrocroiséedel'hybrideHRS.

BC3=hybride rétrocroisé de3egénération.

BC2S, =matériel issu del'autofécondation

d'unhybride rétrocroisé de2egénération/nombre=numéro

dugénotype analysé

auseindechaque génération.

Génotype Parents G.hirsutum G.raimondii G.sturtianum Allohexaploide intermédiaire [G.hirsutumxG.sturtianum]2 Descendance rêtrocroiséede MRS BC2S,/1/9 BC3/9 Nombre degraines analysées 16 6 5 9 16 9 Teneur moyenne mg.kg-' 9 700 23300 6 300 3300 4 500 Teneur minimale mg.kg-' 6 700 19150 <6 70 480 1500 Teneur maximale mg.kg-' 14000 26940 13 570 8750 6000 Ecart-type mg.kg-' 1800 3400 6 100 2200 1400 Coefficient devariation % 18,4 14,8 100 56,6 66,2 31,2 ITableau 5

Teneurtotale en gossypol desgrainesdesparents

et de ladescendancerêtrocroiséedel'hybride HRS.

BC3=hybride rétrocroisé de3egénération.

BC2S, =matériel issudel'autofécondation

d'unhybride rétrocroisé de2egénération/nombre=numéro

dugénotype analysé

120 Des modèles biologiquesàl'amélioration desplantes

matériels BC3 et BC2Sj sélectionnés à Gembloux. Toutes les

plantes analyséesprésentent une teneurtotale enterpénoïdes dans

lesboutons

floraux

similaire

àcelledel'espèce cultivée.Lateneur

en gossypol a été évaluée dans un nombre

limité

de graines par

génotype (de5 à 16). Les résultats obtenus montrentque leméca¬

nisme inhibantlasynthèsedegossypol dans lesgraines de G.stur¬

tianumfonctionneaussi dansdesstructures synthétiquestelles que

l'allohexaploïde [G. hirsutum x G. sturtianum] 2. Environ un

dixième des graines (2 sur20) produites parle meilleur génotype

BC2Sj issudel'autofécondation d'une planteBC2contenait moins

de 500 mg de gossypol par kg. Selon le groupe consultatifde la

FAO etde

l'OMS

responsabledel'établissementdesnormes rela¬

tives à la valeur alimentaire des protéines, la teneuren gossypol

libre

desproduits comestibles issus degraines decotonniernedoit

pas dépasser 600 mg.kg-' pour que ces produits soient consom¬

mables sans risque parles populations humaines. Les plantes que

nous avons obtenues constituent donc un matériel très intéressant

pour développerdescotonniersprésentantunetrèsfaible teneuren

gossypoldans

la

graineetune hauteteneurenterpénoïdes dansles

organesreproducteursdela plante.

Utilisation

des marqueurs

de

l'ADN

moléculaire

Le nombre de bandes généréespar chaquecombinaisonde sondes

AFLP

chezlesespècesparentalesvariaitde72pour la combinaison

C6

(EcoRl

+

ACT/Msel

+ CAG) à 132 pour la combinaison C2

(EcoRl

+

AAC/Msel +

CTT),avecun nombre moyende96 bandes

par combinaison.Lescinqcombinaisonsde sondesont

amplifié

un

nombretotalde477 fragments

d'ADN

parmilesquels417(87,4%)

étaient polymorphes. L'introgression de bandes

AFLP

spécifiques

dechaqueparentapermisdeconfirmer

l'origine

interspécifiquede

l'hybride

HRS. Sur les 70fragments spécifiques de l'espècedon¬

neuse G. sturtianum, 45 étaientprésentschez

l'hybride

HRS et43

seretrouvaientdanssadescendance

BC,.

A

côtédes bandesspéci¬

fiques de chaque espèce parentale (G. hirsutum, G. sturtianum,

G.

raimondii),

quelques bandes

AFLP

polymorphes étaient com¬

munes àun ou deuxparents. Lesmarqueursqui nesontpas trans¬

G.Mergeaietal. Sélectiondecotonniersàteneur variable de gossypol dans sesorganes T 121

deschromosomes

qui

nesontpasinclusdans lesgamèteslorsdela

méiose, ou constituent des marqueurs

qui

subissent des recombi¬

naisonsmodifiantles sitesdeliaisondessondes. Quatremarqueurs

spécifiques de G.sturtianum(génomeC) étaient systématiquement

présents chez toutes les plantes obtenues par rétrocroisement de

l'hybride

HRS. De tels fragments peuvent provenir de chromo¬

somesquisontpréférentiellement transmisàladescendancedu

fait

de leur haute

affinité

d'appariement avec les chromosomes des

autres parents, ou correspondentà des séquences répétées

d'ADN

distribuées dansl'ensembledugénome de l'espècedonneuse.

Ledegréd'apparentementdesgénotypesétudiésa étéévaluépar une

analysedesimilaritéenutilisantlecoefficientdeJaccard(1908).Le

tableau 6montre la matricede similaritéobtenue entreles espèces

parentales,

l'hybride

trispécifiqueetlesdescendances obtenuespar

rétrocroisement. Tous les individus BC2, BC2Sj et BC3 repris au

tableau 6 proviennent d'uneseule plante

BCj

obtenue en croisant

HRS parle

cultivar

C2de G. hirsutum. La similaritéentre l'espèce

cultivéeetlesparentssauvagesétait respectivementde29,5 %pour

G. sturtianum etde43,2 %pourG.

raimondii

cequiestconforme

auxdonnéesdisponibles concernantl'apparentement existantentre

le sous-génome D de G. hirsutum et le parent diploide américain

(Endrizziet

al,

1985).Avec un tauxdesimilaritéde 66,2 %, l'hy¬

bride trispécifique HRS est plus proche du parent

cultivé

que les

deuxespècesdiploidessauvagesutiliséespoursacréation.Le

den-drogramme générépar l'analyse

UPGMA

des

profils

demarqueurs

obtenus pourles génotypes analysés est présenté dans la figure 2.

Lespositionsdesespècesparentales danscedendrogrammesont en

accord avec la classification phylogénique actuelle du genre

Gossypiumbaséesurdesdonnéesmorphologiquesetcytogénétiques

(Endrizzi

étal,

1985). L'espècediploïdeaustralienne estlapremière

à être séparée, suivie par G. raimondii. Le cotonnier cultivé est

groupé avec

l'hybride

trispécifiqueet sadescendance obtenue par

rétrocroisement. L'examendesgénérations obtenuespar

rétrocroise-ments successifsde l'hybride trispécifique montreque l'augmenta¬

tion du degré de similarité chez ces matériels n'est pas évidente,

surtoutdans le casdessouches obtenues parautofécondation

d'un

individu

introgressé issud'un rétrocroisement. L'analysedelasimi¬

larité génétique au moyen de marqueurs

AFLP

devrait donc per¬

122' Des modèles biologiques à l'amélioration des plantes

1

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G.Mergeaietal. Sélectiondecotonniersàteneur variable de gossypol dans ses organes T 123 DISTANCES 0.0 STURT RAIM HRS BC1/1 BC2/1 HIRS BC2S1/12 BC3/1/1 BC3/1/2 BC2/1/3 BC2S1/11 BC3/1/9 BC3/1/6 BC2S1/5 BC2S1/7 BC2S1/9 BC3/1/11 BC3/1/15 BC3/1/14 BC3/3/1 BC3/3/5 0.500 \ -\ + \ -/ I + -1 +-\ I +-/ --/ -\ + \ I I I I I I -/ I I + -I I I ~\ I I I I I +\ I -/ I I -\ I +/ I -+ .\ +\ -\ I I + / I -/ I + / / -I I + \ -/ I + / I Figure 2

Relationsgénétiques entre lesespècesparentales (G. hirsutum,

G.raimondii, G.sturtianum),l'hybrideHRS et sadescendance

obtenueparrétrocroisement:dendrogrammeétablisurbase

del'analysedesdonnéesAFLPgrâceàl'utilisationde la méthode

UPGMAetlecoefficientdesimilaritéde Jaccard.

STURT =G.sturtianum,RAIM=G.raimondii, HIRS =G.hirsutum,

HRS =hybride trispécifique G.hirsutumxG.raimondii

xG.sturtianum. BC,,BC2, BC3=hybridesrétrocroisés

de1re,2eet3egénération, B^Sj =matériel issudel'autofécondation

d'unhybriderétrocroiséde2egénération/nombre=numéro dugénotypeanalysé ausein dechaquegénération.

124' Des modèles biologiques à l'amélioration des plantes

à

la

foislesplusintéressantsauniveau del'expressiondu caractère

recherchéetgénétiquement les plus proches de l'espècecultivée.

Sur les 49 marqueurs RFLP analysés, 10 combinaisons sonde/

enzyme ontdétecté une introgression de segments

d'ADN

de l'es¬

pècedonneuseG. sturtianum chez

l'hybride

trispécifiqueetchezsa

descendanceobtenuepar rétrocroisementparG. hirsutum(tabl.7).

Groupes de liaison Chrsl Chrs10 Chrs15 Chrs 22 A07-U07 D04-Chrs10 D07-Chrs 5A U01 Marqueurs RFLP A1204 A1794 A1183 A1109 A1310 G1074 A1135 A1163 1535 M16-40 Enzymes de restriction EcoRl EcoRl Hindlll EcoRV Cfol EcoRl EcoRV EcoRl Xbal EcoRl

Présence (+),absence(-)desmarqueursG.sturtianum dans la descendance de l'hybride HRS

BC,(12) BC2(4) BCzS^IO) BC3(12)

+ + + + + + + + + +++ +- + + - +

ITableau 7

Distributiondesmarqueurs RFLPintrogressés

àpartirdel'espècedonneuseG.sturtianum

dansla descendanceobtenueparrétrocroisementdel'hybrideHRS.

Lenombre degénotypesanalysés àchaquegénération

estindiquéentreparenthèses.

Lesgroupesdeliaisons correspondent à ceux de Reinishétal.(1994).

L'analyse des

profils

RFLP indique que ces segments

d'ADN

ont

été introgressés à

partir

de 8 groupes de liaison de G. sturtianum

présents chez HRS. Les individusdes générations de rétrocroise¬

ment présentent une ségrégation pour ces marqueurs et aucune

descendancerêtrocroisée nelescontient tous.Enconsidérantl'en¬

intro-G.Mergeaiet al. Sélectiondecotonniers àteneur variable de gossypol dans ses organes T 125

gressés en provenance de G. sturtianum représente approxima¬

tivement50

cM

pourles 10combinaisons sonde/enzyme détectant

une introgression. Une importantevariation est observéeentre les

sondes au niveaude la détection de segments introgressés dans la

descendancedeHRS.Parexemple,lasondeA1204duchromosome

1apermisdedétecteruneintrogression chez 13

individus

delades¬

cendanceobtenue parrétrocroisement de HRS alors que la sonde

M

16-40du groupe deliaisonU01

n'a

permisdedétecter une intro¬

gression quechezunseulgénotype.

Le

nombredefragmentsintro¬

gressés varie également fortement entre les générations. Tous les

10fragments

d'ADN

étaient présents parmi les

individus

issus du

1er rétrocroisement de HRS, alors queleur nombre étaitbeaucoup

plus faible dans les générations ultérieures (BC2, BC2S! et BC3).

L'analysedesintrogressionsenprovenancedel'espècepont montre

la présencede

huit

segmentsdechromosomede G.

raimondii

chez

HRS. En BC3, nous avons retrouvé 5 des 8 marqueurs de cette

espèce.

L'introgressiondesegments

d'ADN

à

partir

des espècessauvagesa

étédedeux types. Dansla plupartdescas, lesallèles RFLPcarac¬

téristiquesde l'espèce cultivée etdel'espèce diploïde étaientpré¬

sents et les individus de la descendance étaient hétérozygotes au

niveau du locus introgressé. Exceptionnellement, un des allèles

RFLPde G. hirsutumaétéremplacépar

l'allèle

correspondantde

l'espèce sauvage cequiestunindicederecombinaison réciproque.

1

Discussion

Nos résultats montrentque les espèces diploïdes australiennes du

génomeCpeuventêtreexploitées avecsuccès pour

l'amélioration

dela principaleespèce decotonniercultivégrâceàla création d'hy¬

brides trispécifiques incluant une espèce

diploide

américaine

(génomeD) commepont. Chezdetelshybrides,lenombre

d'appa-riements observés entreleschromosomesdesgénomesAh etC est

suffisantpour permettrel'échange dematériel génétique etle pro¬

126T Desmodèlesbiologiques à l'amélioration desplantes

Cette méthode nous a permis

d'obtenir

par rétrocroisement de

l'hybride

trispécifique HRS des plantes introgressées présentant une

diminution

drastiquedeleurteneur engossypoldanslagraine

(moins de 600mg.kg-1 degossypol)et une teneuren terpénoïdes

normaledansleursboutons floraux. Uneamélioration sensiblede

l'appariement

chromosomique et de la

fertilité

des génotypes

introgressés a été constatée au

fur

et à mesure de l'avancement

dans les générations de rétrocroisement. Un nombre restreint de

gènes dominants semble contrôler

l'inhibition

de la synthèse du

gossypol dans la graine. Ces plantes constituent un matériel très

intéressant pour le développement de variétés commerciales de

cotonnier présentant une très faible teneur en gossypol dans la

graine etuneteneurnormaleenterpénoïdes danslesorganesrepro¬

ducteursde

la

plante.

Les marqueursmoléculaires de

l'ADN

sont desoutilsprometteurs

pour suivrel'introgressiondesegmentsdechromosomes d'espèces

sauvagesliés àdescaractères intéressantschezdeslignées amélio¬

réesdela principaleespèce decotonnier

cultivé.

Nous avonsutilisé

lesmarqueurs

AFLP

pour déterminerla

similarité

existantentre dif¬

férents génotypes introgressésetla variété de G. hirsutum utilisée

dansunprogrammede sélection récurrenteréalisé à

partir

del'hy¬

bride trispécique HRS. La classification des espèces parentales

obtenue au moyen des données généréespar les marqueurs

AFLP

estcohérente avec lesconnaissancesactuellesrelatives àlaphylo¬

génie du genre Gossypium. Seulementcinq combinaisonsde sondes

ont

suffi

pourobtenir 477 fragment AFLP,cequiestnettementplus

élevéqueles375 bandesproduites sur le mêmematérielvégétalen

utilisant

30sondes RAPD(Mergeai et

al,

1998).Bienquelepour¬

centage de bandes

AFLP

polymorphes (87,4 %) soit légèrement

plus faible que dans le cas de laRAPD (90,4 %), les marqueurs

AFLP

sontplus efficacespourdétecterdesbandesspécifiques chez

les espèces diploïdes sauvages. Ainsi, 70 marqueurs

AFLP

spéci¬

fiques de l'espèce donneuse (G. sturtianum) ont été détectéspour

seulement 49 marqueurs RAPD spécifiques de cette espèce. Nos

travaux confirment donc

l'intérêt

de ce type de marqueurs pour

assister la sélection de génotypes introgressés issus d'hybrides

G.Mergeaiétal. Sélection decotonniers àteneur variabledegossypol danssesorganes T 127

L'utilisation

demarqueurs

AFLP

etRFLP spécifiquesa permisde

montrerquelacompositiongénomique de

l'hybride

trispécifiqueet

de la majoritédesdescendances obtenuespar rétrocroisementétait

du type

ACDD,

les chromosomes D provenant de G. hirsutum (2

(AD)i)

ou del'espècepontG.

raimondii

(2D5).Aucunedistinc¬

tion

entre lesdeux types dechromosomes

D n'était

possibledans

nosrecherchescytogénétiques précédentes du

fait

de

leur similarité

de forme et de

taille

(Vroh

Bi

et al., 1998). Le polymorphisme

générépar les sondesRFLPnous apermis

d'identifier

assezfacile¬

mentlessegments de chromosome introgressés.

L'hybridation

des

marqueursRFLPa également montréque lamajorité des descen¬

dancesétaienthétérozygotespourlesallèlesparentaux.Cetteobser¬

vation est cohérente avec

l'inclusion

de chromosomes entiers des

parents sauvages et/ou avec une introgression par translocation.

Néanmoins, sur les 11 combinaisons sonde/enzyme détectant une

introgression à

partir

desparents sauvages,trois combinaisons ont

misenévidence desrecombinaisonsréciproques.Le nombreimpor¬

tant d'univalents,de multivalents et de chiasmata observé lors de

l'analyse cytogénétiquedecematériellaissaitprévoir l'existencede

ces deux typesd'introgression.

Nostravaux constituent la première tentativedecaractérisationde

l'introgressionauniveaumoléculairede segments dechromosomes

d'une espèce

diploide

australienne chez la principale espèce de

cotonnier cultivé.

La

capacité de suivre des régions de chromo¬

somessurplusieursgénérations dansladescendance decroisements

dirigés devrait permettre

d'identifier

les liens existant entre ces

fragments etdescaractèresagronomiquesimportants.

Le

constatau

niveau des plantes analysées d'une ségrégation à la

fois

pour des

marqueurs RFLP caractéristiques de segments de chromosomes

connusetpour lecaractèrerecherché,devrait permettre

d'aboutir

à

terme àla cartographiedu caractère« faible teneurengossypolde

lagraine, hauteteneurengossypol dela plante».

Remerciements Cetravailaétéfinancéparla convention2.4565.95 du«Fondsdelarecherchefondamentalecollective»deBelgique.

128T Des modèlesbiologiques à l'amélioration desplantes

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