Évolution clonale et maladie résiduelle de demain dans le myélome multiple

Correspondances en Onco-Hématologie - Vol. XIII - n° 2 - mars-avril 2018 71

Myélome multiple

d o s s i e r

Évolution clonale et maladie résiduelle de demain dans le myélome multiple

Clonal evolution and minimal residual disease of tomorrow in multiple myeloma

S. Manier*, X. Leleu**

* Service d’hématologie, CHRU de Lille, Inserm UMR-S 1172, Lille, et Dana-Farber Cancer Institute, Boston, États-Unis.

** Service d’hématologie, CHU de Poitiers, et Inserm CIC1402, Poitiers.

L e myélome multiple (MM) évolue à partir de stades présymptomatiques − à savoir la gammapathie monoclonale de significa- tion indéterminée (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance [MGUS]) et le myélome mul- tiple indolent (Smoldering Multiple Myeloma [SMM]) − et rechute quasi systématiquement après instauration d’un traitement unique. Ce continuum clinique représente un modèle pour l’étude de l’évolution clonale et de la maladie résiduelle (Minimal Residual Disease [MRD]). Sur le plan génomique, on distingue les anomalies dites “primaires”, qui sont déjà présentes aux stades précurseurs (les translocations impliquant le locus IgH, l’hyperdiploïdie et la délétion 13q), et les anomalies dites “secondaires”, qui surviennent lors de la progression de la maladie (les translocations impliquant MYC, les mutations des voies MAPK, NF-κB et de réparation de l’ADN, ainsi que de nombreuses anomalies du nombre de copies, tels que le gain 1q

et les délétions 1p et 17p) [1-3]. À cela s’ajoutent des marqueurs moléculaires de réponse et de résistance aux traitements, les mutations de céréblon (CRBN) et la résistance aux immunomodulateurs (IMiD), ou encore les mutations de sous-unités du protéasome et la résis- tance aux inhibiteurs du protéasome. La connaissance de ces anomalies génomiques et de leur impact offre un rationnel à l’étude de leur évolution au cours du temps et des traitements successifs, afin d’établir un suivi moléculaire précis de la maladie.

Hétérogénéité et évolution clonale dans le MM

L’évolution clonale représente les variations de l’hété rogénéité clonale au cours du temps. En effet, la capacité des cellules tumorales à s’adapter au microenvironnement, à la compétition clonale ainsi

R ÉSUM É Summary

Le myélome multiple est caractérisé par une évolution clonale à partir des stades précurseurs jusqu’aux formes réfractaires de la maladie. Cette évolution clonale est responsable de la résistance aux traitements et de la progression de la maladie. Le développement d’outils permettant de suivre l’évolution clonale est nécessaire pour un suivi précis du myélome multiple de façon longitudinale. De nouvelles technologies permettent maintenant une évaluation non invasive de l’évolution clonale et de la maladie résiduelle et doivent faire l’objet d’explorations afin d’en déterminer le rôle en pratique clinique à l’avenir. Ces nouvelles méthodes impliquent l’ADN circulant, les cellules tumorales circulantes et les technologies de code barres moléculaires, de séquençage single-cell et de nouveaux outils dérivés de CRISPR.

Mots-clés : Maladie résiduelle − Évolution clonale − ADN circulant − Séquençage single-cell.

Multiple myeloma is characterized by a clonal evolution from early precursor stages to relapse/refractory settings. This clonal evolution induces resistance to treatment and progression of the disease. In a perspective of precision medicine, new tools are necessary to longitudinally monitor the molecular aspects of multiple myeloma. Recenty developed technologies allow us to assess clonal evolution and minimal residual disease in a none invasive manner, across the course of the disease.

Those involve cell-free DNA and circulating tumor cells and technologies such as single molecular identifiers, single-cell sequencing or CRISPR-derived tools.

Keywords: Minimal residual disease − Clonal evolution −

Circulating free DNA − Single-cell sequencing.

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Myélome multiple

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qu’aux traitements est guidée par la coexistence de multiples sous-clones, génétiquement hétérogènes, au sein d’une même tumeur. De façon darwinienne, le sous-clone le plus adapté à une pression de sélec- tion évoluera plus que les autres (11). Les résultats du séquençage exomique complet (Whole Exome Sequencing [WES]) de 203 patients atteints de MM ont permis d’estimer que, en moyenne, une tumeur myélomateuse est composée de 5 sous-clones (12).

Cela est toutefois probablement sous-estimé, puisque dépendant de la profondeur de séquençage. Dans cette série, les gènes de la voie MAPK, à savoir KRAS, NRAS et BRAF, étaient mutés de façon clonale chez environ 70 % des patients, et de façon sous-clonale chez les 30 % restants. En général, les gènes mutés de façon récurrente dans le MM (KRAS, NRAS, TP53, DIS3, FAM46C, BRAF, TRAF3, PRDM1, CYLD, RB1, ACTG1, LTB, IRF4, MAX, HISTH1E et SP140) étaient plus souvent sous-clonaux chez les patients nouvellement diagnos- tiqués et clonaux chez les patients précédemment traités, ce qui suggère une sélection des mutations récurrentes dans le contexte de la rechute, peut-être liée au traitement (12).

L’étude de la co-occurrence d’événements génomiques permet de définir des combinaisons de mutations fréquemment associées au diagnostic ou à la rechute et donc possiblement interdépendantes et synergiques.

Par exemple, les translocations impliquant le locus IgH et l’hyperdiploïdie sont mutuellement exclusives dans la grande majorité des cas (13-15). L’hyperdiploïdie est fortement corrélée aux mutations de NRAS et aux translocations impliquant MYC. La t(11;14) est associée aux mutations des gènes KRAS, IRF4 et CCND1.

La t(4;14) est associée aux mutations des gènes FGFR3, DIS3 et PRKD2 et aux anomalies du nombre de copies del(12p), del(13q) et gain de 1q13. La validation fonctionnelle de ces données et la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à leur co- occurrence permettent de définir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Bien que le MGUS et le SMM soient moins complexes génétiquement que le MM, l’hétérogénéité clonale est déjà présente à ces stades. Une étude portant sur le séquençage de 3 paires d’échantillons aux stades de SMM ayant ensuite progressé en MM a révélé que les sous-clones prédominants au moment de la progression étaient déjà présents au stade précurseur (16). De plus, notre équipe a récemment montré que la présence de mutations dans la voie des MAPK ou une translocation impliquant le locus de MYC représentent un risque de progression chez les patients diagnostiqués SMM (Boutros et al., Blood 2017).

L’évolution clonale est d’autant plus marquée au cours des traitements, qui induisent une forte pression de sélection. Cette évolution clonale avant et après trai- tement peut suivre plusieurs schémas dans le MM : une évolution clonale linéaire, une évolution en rami- fication ou une absence d’évolution clonale. Dans ce dernier cas (qui représente environ 35 % des MM), on retrouve la même composition de l’hétéro généité clonale avant et après traitement, ce qui suggère que tous les sous-clones sont affectés par le traite- ment de façon similaire et repeuplent la tumeur de manière équivalente. Dans le cas de l’évolution clonale linéaire (40 % des cas), il n’y a pas de modification dans la répartition des sous-clones, mais de nouvelles muta- tions sont acquises en leur sein. L’évolution clonale par ramification (25 % des cas) signifie qu’un ou plusieurs sous-clones émergent alors que d’autres diminuent en proportion au moment de la rechute (17).

La compréhension de l’évolution clonale permet d’identifier les mécanismes de progression des stades précoces aux stades avancés, ainsi que les mécanismes de résistance aux traitements, et de définir de nou- veaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques.

La MRD de demain dans le MM

L’évaluation de la MRD dans le MM se fait actuellement dans le cadre d’essais cliniques et peu ou pas encore en pratique de routine. Deux techniques de référence sont employées : la cytométrie en flux (CMF), notam- ment avec un panel de 8 couleurs recommandé par l’International Myeloma Working Group (IMWG), et le séquençage de nouvelle génération (Next-Generation Sequencing [NGS]), permettant de détecter le réar- rangement clonal des chaînes lourdes ou légères d’immunoglobulines. Ces 2 techniques nécessitent un prélèvement de moelle osseuse et permettent une sensibilité de détection de l’ordre de 10

à 10

(elles sont détaillées dans un autre chapitre de ce dossier).

Des outils en cours d’exploration laissent envisager de nouvelles possibilités d’évaluation de la MRD. Ceux-ci comprennent, entre autres, le séquençage de l’ADN circulant (ADNcirc), le séquençage single-cell et la détection de mutations par SHERLOCK.

L’ADN circulant

L’ADNcirc est constitué de petits fragments d’ADN

(environ 146 paires de bases) relargués dans

la circulation sanguine par tout type cellulaire,

notamment des cellules inflammatoires, apoptotiques

ou nécrotiques, y compris les cellules tumorales.

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L’ADN tumoral ne représente donc qu’une fraction de l’ADNcirc. Par ailleurs, il est nécessaire que l’ADNcirc soit isolé de façon appropriée pour éviter la contamination des échantillons par de l’ADN génomique des cellules mononucléées du sang, pouvant faire varier la fraction tumorale de manière artificielle. Une étude par séquençage génomique complet de faible profondeur a permis de déterminer que plus de 80 % des échantillons de patients atteints de MM, au diagnostic ou à la rechute, comportaient une fraction tumorale au sein de l’ADNcirc supérieure à 3 % (4). Les techniques de séquençage de l’ADNcirc nécessitent donc d’obtenir une profondeur suffisante.

Il a été montré que l’ANDcirc est bien représentatif du profil mutationnel des plasmocytes médullaires, par séquençage ciblé (5) et par séquençage génomique complet (4). Les mutations récurrentes dans le MM ont été retrouvées dans les 2 compartiments de façon quasi systématique dans 2 séries (4, 5). Dans certains cas, des clones n’étaient détectables qu’au niveau de l’ADNcirc et pas au sein des plasmocytes médullaires, ce qui suggère l’existence d’une hétérogénéité spatiale des clones.

L’évaluation de la MRD par séquençage d’ADNcirc est en cours d’étude dans le cadre d’essais cliniques (essai IFM 2014-01). Cette approche nécessite l’emploi d’un panel de mutations, et non l’étude du réarran- gement VDJ des chaînes lourdes des immunoglobu- lines, qui est difficile à séquencer à partir des petits fragments d’ADNcirc. Cela fait intervenir la notion d’évolution clonale, puisque certains clones peuvent régresser et d’autres persister au cours d’un traite- ment, nécessitant d’évaluer la MRD à partir de muta- tions dites “clonales”, par opposition aux mutations sous-clonales. D’autre part, il est nécessaire d’utiliser des outils permettant d’obtenir des profondeurs de séquençage importantes afin de pouvoir évaluer de faibles fractions alléliques. Pour ce faire, l’emploi de codes barres moléculaires (Unique Molecular Identifiers [UMI]) permettant d’identifier chaque brin d’ADN avant amplification est l’une des approches en cours d’évaluation.

Séquençage single-cell

Les avancées technologiques dans le domaine du séquençage ont récemment mené au développement du séquençage de cellules uniques. La technique dite

“drop-seq” permet d’isoler les cellules une à une au sein de gouttes d’huile qui comportent in fine une cellule, une bille conjuguée à des codes barres molé- culaires uniques et des primers (amorces), ainsi que du tampon de lyse cellulaire. Ce faisant, l’ARN de

chaque cellule reçoit un marqueur unique, subit une transcription inverse et est amplifié. Le pool d’ARN est ensuite séquencé, permettant d’obtenir les valeurs d’expression génique pour les quelques milliers ou dizaines de milliers de cellules séquencées. L’étude de clusters d’expression génique permet d’identifier les différentes populations cellulaires au sein de l’échan- tillon, dont les cellules tumorales (6, 7). L’approche single-cell permet également de séquencer l’ADN pour des panels ciblés (8). Le séquençage single-cell peut s’appliquer à la détection d’un faible nombre de cellules tumorales − contexte de MRD − au niveau des cellules tumorales circulantes (CTC) ou de la moelle osseuse (8). La détection des cellules tumorales de MM peut se faire par la détection de mutations récur- rentes en cas de séquençage de l’ADN ou par profil d’expression génique en cas de séquençage de l’ARN.

Le faible nombre de CTC au moment de la MRD peut représenter une limite à cette approche.

SHERLOCK

De nouvelles approches permettent de détecter des mutations avec une sensibilité remarquable.

La technique SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) [9] a récemment été décrite et fait appel à l’outil CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) [10].

Le système CRISPR-Cas9 permet de générer des

knock-out de gènes par utilisation de la Cas9, une

protéine dérivée de bactéries qui a la propriété

de reconnaître et de couper des séquences d’ADN

spécifiques. La confection de guides comportant

la séquence spécifique et ciblant un gène d’intérêt

permet d’obtenir son knock-out. Une équipe

bostonienne a récemment développé la technologie

SHERLOCK à partir d’une autre protéine de la famille

Cas, la Cas13, qui reconnaît et coupe de l’ARN

(nécessitant une transcription inverse [reverse

transcription] préalable à l’analyse de l’ADN). La

Cas13 s’active par reconnaissance du guide fixé à

son ARN cible. Cependant, son activité nucléase

n’est pas spécifique et induit la coupure des brins

d’ARN environnants. Ainsi, l’adjonction d’ARN

rapporteur émettant une fluorescence après coupure

permet d’établir un test simple pour déterminer la

présence ou non d’une séquence cible (dont une

mutation ponctuelle) d’ADN ou d’ARN. Les tests ont

démontré une sensibilité à 1 × 10

mol/l, ce qui

suggère l’applicabilité de cette approche en pratique

clinique (9). Il faut noter que la technologie SHERLOCK

peut être réalisée sur papier buvard, laissant supposer

sa facilité d’utilisation.

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Conclusion

L’avènement des thérapies ciblées et de l’immuno thé rapie dans le MM permet d’envisager une médecine de précision dans laquelle la décision thérapeutique et le suivi des traitements seront personnalisés pour chaque patient, en fonction des caractéristiques moléculaires de la tumeur.

Des outils suffisamment sensibles, spécifiques et utilisables à large échelle nécessitent donc d’être développés. Les avancées technologiques dans le domaine du séquençage, telles que le séquençage de l’ADNcirc, single-cell et SHERLOCK, offrent de nouvelles possibilités de suivi de la MRD et de l’évolution clonale. Leur applicabilité devra donc être évaluée dans le cadre d’essais cliniques. ■

S. Manier déclare ne pas avoir de liens d’intérêts.

X. Leleu n’a pas précisé ses éventuels liens d’intérêts.

1. Morgan GJ, Walker BA, Davies FE. The genetic architecture of multiple myeloma. Nat Rev Cancer 2012;12(5):335-48.

2. Kuehl WM, Bergsagel PL. Molecular pathogenesis of mul- tiple myeloma and its premalignant precursor. J Clin Invest 2012;122(10):3456-63.

3. Manier S, Salem KZ, Park J et al. Genomic complexity of multiple myeloma and its clinical implications. Nat Rev Clin Oncol 2017;14(2):100-13.

4. Manier S, Park J, Freeman S et al. Whole-exome sequen- cing and targeted deep sequencing of cfDNA enables a comprehensive mutational profiling of multiple myeloma.

ASH 2016;abstr. 197.

5. Kis O, Kaedbey R, Chow S et al. Circulating tumour DNA sequence analysis as an alternative to multiple myeloma bone marrow aspirates. Nat Commun 2017;8:15086.

6. Patel AP, Tirosh I, Trombetta JJ et al. Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.

Science 2014;344(6190):1396-401.

7. Macosko EZ, Basu A, Satija R et al. Highly parallel genome- wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell 2015;161(5):1202-14.

8. Lohr JG, Kim S, Gould J et al. Genetic interrogation of circulating multiple myeloma cells at single-cell resolution.

Sci Transl Med 2016;8(363):363ra147.

9. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 2017;356(6336):438-42.

10. Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science 2014;343(6166):84-7.

11. Manier S, Salem KZ, Park J et al. Genomic complexity of multiple myeloma and its clinical implications. Nat Rev Clin Oncol 2017;14(2):100-13.

12. Lohr JG, Stojanov P, Carter SL et al. Widespread genetic heterogeneity in multiple myeloma: implications for targeted therapy. Cancer Cell 2014;25(1):91-101.

13. Walker BA, Boyle EM, Wardell CP et al. Mutational spectrum, copy number changes, and outcome: results of a sequencing study of patients with newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 2015;33(33):3911-20.

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15. Landau DA, Carter SL, Getz G et al. Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications.

Leukemia 2014;28(1):34-43.

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17. Bolli N, Avet-Loiseau H, Wedge DC et al. Heterogeneity of genomic evolution and mutational profiles in multiple myeloma. Nat Commun 2014;5:2997.

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