Journal of Applied Biosciences 141: 14419 - 14425
ISSN 1997-5902
Etude de l’activité antibactérienne (in vitro) des extraits aqueux et méthanoliques de l’ail (Allium
sativum L.)
*OKOMBE EMBEYA Victor et NZUZI MAVUNGU Gaël
Service de Pharmacologie, Toxicologie et Thérapeutique, Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Lubumbashi, B.P. 1825 Lubumbashi, République Démocratique du Congo
*Auteur correspondant ; E-mail : vokombe@yahoo.fr; Tél: (+243818151587)
Original submitted in on 12th July 2019. Published online at www.m.elewa.org/journals/ on 30th September 2019 https://dx.doi.org/10.4314/jab.v141i1.7
RESUME
Objectif : Les extraits aqueux (E. aq) et méthanolique (E. met) de deux variétés d’ail blanc (petites gousses et grosses gousses) ont été soumis à un test in vitro dans le but de mettre en évidence leur propriété antibactérienne.
Méthodologie et résultats : De manière générale, deux méthodes ont été adoptées pour cette expérimentation, l’obtention des extraits ainsi que le test d’inhibition de la croissance d’Escherichia coli par la méthode de diffusion sur milieu gélosé et celui sur milieu liquide. Les résultats obtenus ont révélé un rendement supérieur avec l’extraction aqueuse pour les petites variétés (8,34 %). Sur milieu gélosé, E. coli s’est montré insensible pour les deux variétés et à toutes les concentrations utilisées. Cependant, l’extrait aqueux de petites variétés a exercé un pouvoir bactéricide sur le germe, par la méthode de diffusion en milieu liquide. Il ressort que l’eau a été le meilleur solvant pour la réalisation de l’extraction et qu’un certain nombre de facteurs ont eu une influence sur nos résultats obtenus. Il s’agit des facteurs liés à la méthode d’extraction, la concentration des extraits, le test de sensibilité, la concentration de l’inoculum.
Conclusion et application des résultats : Les résultats obtenus dans cette étude nous ont permis de conclure que l'activité bactéricide de l'ail ne peut pas être généralisée et obtenues en toutes circonstances.
Par la méthode sur milieu liquide, l’extrait aqueux des petites variétés de l’ail a exercé un pouvoir bactéricide sur Escherichia coli. Les résultats sur le test de sensibilité dépendent en grande partie de la méthode de recherche utilisée. Ces résultats doivent être compléter par des études in vivo afin de confirmer l’effet antibactérien observé.
Mots clés : activité antibactérienne, extraits aqueux et méthanolique, ail.
ABSTRACT
Objective: The aqueous extracts (E. Aq) and methanol (E. met) of two white varieties of garlic (small and large cloves garlic) were tested in vitro in order to highlight their antibacterial property.
Methodology and Results: Two methods were adopted for this experiment, extraction and the growth inhibition test of Escherichia coli by the diffusion method on agar medium and the liquid medium. The results obtained showed superior performance with aqueous extraction for the smaller varieties (8.34%).
On agar medium, E. coli proved insensitive to the two varieties and all concentrations used. However, the
aqueous extract of the small varieties has had a bactericidal power on the pathogen, by the diffusion method in liquid medium. It appears that water was the best solvent for the extraction and some factors has influenced our results. These are the factors related to the extraction method, the concentration of extracts, the sensitivity test, and the concentration of the inoculums.
Conclusion and application of results: The results in this study led to the conclusion that the bactericidal effect from Allium sativum L. could not be generalized and obtained in all circumstances. By the method on liquid medium, the aqueous extract of small varieties of garlic exerted a bactericidal power on Escherichia coli. The results on the sensitivity test depend largely on the search method used. These results must be completed in vivo to confirm the observed antibacterial effect.
Keywords: Antibacterial, aqueous and methanol extracts, garlic
INTRODUCTION
Depuis plusieurs siècles, les peuples de différentes civilisations, ont recouru aux plantes et leurs produits dérivés pour traiter certaines infections et certains troubles physiologiques (Abubakar, 2009).
Parmi les plantes largement utilisées, l’ail trouve une place prépondérante en raison des vertus thérapeutiques qui lui sont attribuées notamment l’activité antibactérienne, antiparasitaire, anticancéreuse. Un certain nombre des chercheurs se sont penchés sur les vertus thérapeutiques de l’ail notamment ses propriétés antibactériennes.
Certaines bactéries gram négatif et positif y compris E. coli, se sont révélées sensibles aux extraits éthanoliques, méthanoliques et aqueux de l’ail. Ekwenye et Elegalam (2005) ont su mettre en évidence cette activité antibactérienne.
L’importance que revêt l’ail dans cette médecine douce, connue comme moins agressive que la médecine moderne (Iserin, 2007), sous tendue par
des molécules thérapeutiques de synthèse ou naturelles modifiées, nous a poussé à évaluer dans ce travail, l’activité antibactérienne de l’ail à une époque où les traitements antibactériens sont de plus en plus sujets à des résistances multiples de la part des germes, qui, autrefois étaient sensibles. Cette étude a pour objectif général, celui de contribuer à l’amélioration de l’utilisation des plantes en pratique vétérinaire. Les objectifs spécifiques poursuivis dans cette étude sont de, procéder à l’obtention des extraits secs par macération aqueuse et de concrètes par extraction méthanolique à partir des deux variétés d’ail et d’en déterminer le rendement de l’extraction ; de comparer in vitro le pouvoir inhibiteur sur la croissance d’Escherichia coli de ces extraits en se servant de deux méthodes, la diffusion sur gélose et le test d’inhibition en milieu liquide.
MATERIEL ET METHODES Matériel
Matériel végétal : Le matériel végétal qui a fait l’objet de ce travail est constitué de deux variétés d’ail (Allium sativum L.) blanc, les grosses gousses et les petites gousses, commercialisées sur le marché de Lubumbashi. Ces gousses été collectées au marché central de Kenya, commune de la Kenya, à Lubumbashi. L’obtention de ce matériel avait eu lieu au mois de mai 2015. Lubumbashi est situé au sud de la Province du Katanga en République Démocratique du Congo entre les limites géographiques ci-après : 27°10’-27°62’ Est et 11°46’-11°82’Sud (Malaisse, 1997). Les échantillons ont été bien séchés à l’ombre et à l’abri de l’humidité, puis réduits en poudre en vue de leur analyse (Hurtel, 2006).
Souche bactérienne : La souche bactérienne utilisée dans l’essai antibactérien des plantes retenues est Escherichia coli ATCC 25929. Ce germe nous a été fourni par les Cliniques Universitaires de Lubumbashi.
Méthodes : Deux étapes sont réalisées pour cette expérience scientifique. La première se résume dans l'extraction aqueuse et méthanolique des échantillons d'Allium sativum L et la deuxième consiste à tester l'effet de ces différents extraits sur la croissance des bactéries entérohémorragiques (Escherichia coli).
Extraction : Deux types d’extraits pour chaque échantillon ont été obtenus : les extraits aqueux et les extraits méthanoliques. Ces essais sont effectués en trois étapes, dont la macération, la filtration et l’évaporation. Soixante-quatre grammes (64 g) pour
chaque variété d’ail à raison de 32 g par type d’extraction (aqueuse ou méthanolique), ont été utilisés. Les extraits ont été obtenus par macération (24 heures) de 32 g de matériel végétal dans 200 mL d’eau pour le premier type d’extraction, et dans un mélange méthanol–eau 80 % pour le deuxième. Une filtration sur papier Whatman n°1 du macérât est ensuite réalisée.
Le filtrat est alors évaporé à sec à l’aide d’un rotavapor.
Les résidus secs sont alors repris dans des flacons stérilisés puis conservés à 4°C avant la réalisation des tests antibactériens. Pour chaque extrait d’ail, deux séries de dilutions ci-après sont préparées (12,5 mg/mL; 25 mg/mL et 50 mg/mL) dans des tubes à essai contenant préalablement de l’eau physiologique d’un côté et du bouillon peptoné de l’autre, et un tube, témoin négatif ne contenant que de l’eau physiologique est prévu. Le DMSO a aidé pour homogénéiser les extraits méthanoliques et aqueux afin de réaliser une solution mère de concentration 100 mg/mL.
Etude de l’effet antibactérien des extraits : Nous avons utilisé méthodes : la méthode de diffusion sur gélose par disque et la méthode de dilution en milieu liquide. Sur milieu agar, l’activité antibactérienne des extraits aqueux et méthanoliques du matériel végétal est évaluée selon la méthode décrite par Vinod et al.
(2010). E. coli est d’abord repiqué par la méthode des stries dans des boites de Pétri contenant le milieu
Mueller Hinton, puis incubées à 37 °C pendant 24 h.
Une ou plusieurs colonies de chaque culture pure sont prélevées et transférées dans 5 mL d’eau physiologique. A l’aide d’une micropipette, 100 microlitres de cet inoculum sont prélevés et déposés dans de nouvelles boites de Pétri contenant le milieu Mueller Hinton puis étalés à l’aide d’une spatule de Drigalski. Des disques stériles (9 mm de diamètre) imprégnés de 5 µl de différentes dilutions de variétés ont été déposés à l’aide d’une pincette stérile dans les boites de pétri coulées du milieu Mueller Hinton. Le témoin positif (ciprofloxacine 5 µg par disque) et le témoin négatif (disque imprégné du sérum physiologique) sont également déposés dans les boites. Ces dernières ont été ensuite incubées à l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Les résultats sont exprimés en diamètres des zones d’inhibition produites autour des disques. Sur milieu liquide, une anse de platine est utilisée pour chaque tube en prélevant 4 colonies des germes ayant poussés sur milieu Mueller Hinton et inoculé dans les dilutions préparées, puis les tubes sont déposés dans une étuve à une température de 37°C pendant 24h. La lecture des résultats tient compte de la turbidité de la solution pour confirmer la multiplication des germes. Ainsi nous pourrions affirmer l’efficacité des extraits ou la résistance des germes aux concentrations utilisées (Burnichon et Texier, 2003).
RESULTATS
Résultats de l’extraction
Tableau 1: Rendement des extrait méthanolique et aqueux de l’ail
Espèce végétale Types d’extraits Poids brut Poids d’extrait Rendement Allium sativum
(Petite var.)
E. Aq 32 g 2,7 g 8,43 %
E. Met 32 g 0,3 g 0,93 %
Allium sativum (Grosse var.)
E. Aq 32 g 1 g 3,12 %
E. Met 32 g 0,2 g 0,62 %
Les résultats de ce tableau montrent que les extraits aqueux ont donné un bon rendement que les méthanoliques avec un grand pourcentage pour les
petites gousses d’ail, (8,43) contre (3,12) pour les grosses gousses.
Résultats de l’étude antibactérienne sur Escherichia coli : Tel que montré dans ce tableau, aucune zone d’inhibition n’a été obtenue autour des disques imbibés d’extraits de ces deux variétés sur les boîtes ensemencées. La série de trois dilutions n’a
donc eu aucun effet sur la multiplication d’E. coli. Les quatre disques de ciprofloxacine, utilisés comme témoins positifs, ont révélé une zone d’activité antibactérienne dont le diamètre est inférieur à la valeur moyenne normalement attendue.
Tableau 2 : Test sur milieu gélosé
Espèce végétale Type Diamètre d’inhibition à différentes concentrations (mm)
d’extrait 0 % 1,25 % 2,5 % 5 % Cipro Ail à petites var. E. Aq
E. Met
0 0
0 0
0 0
0 0
23 25 Ail à grosses var E. Aq
E. Met
0 0
0 0
0 0
0 0
23 24 Tableau 3 : Test sur milieu liquide
Espèce végétale Type d’extraction Turbidité des tubes à des différentes concentrations
0 % 1,25 % 2,5 % 5 %
Allium sativum (Petite variété)
E. Aq E. Met
++
++
- ++
- +
-- + Allium sativum
(Grosse variété)
E. Aq E. Met
++
++
++
+
+ +
+ + Légende : (+++) =Turbidité prononcée ; (++) = Turbidité moyennement prononcée ;( +) = Turbidité plus ou moins présente ;( -) = absence de turbidité
Ce tableau indique que l’extrait aqueux des petites variétés de l’ail est efficace à partir de la concentration 1,25 % tandis que les bactéries se sont multipliées
dans tout le reste des tubes quel que soit la concentration utilisée.
DISCUSSION
Photo 1. Observation des boites de Pétri après incubation. Photo 2. Mesure des zones d’inhibition autour des disques
Photo 3. Observation des boites des tubes après incubation
Cette étude a permis de réaliser des essais sur les extraits aqueux et méthanolique de deux variétés d’ail et d’en évaluer l’activité antibactérienne sur la croissance in vitro d’Escherichia coli par comparaison de deux tests d’inhibition, sur milieux gélosé et liquide.
En analysant les valeurs de différents rendements des extractions (0.625 % pour l’extraction méthanolique de l’ail à petites gousses, 8.44 % pour l’extraction aqueuse de l’ail à grosses gousses, 0.94 % pour l’extraction méthanolique de la variété à grosses gousses et 3.125 % pour l’extraction aqueuse du spécimen à petites gousses (Tableau I)), ceux des extractions aqueuses sont plus élevés que ceux des extractions méthanoliques. Nos résultats sont en contradiction avec ceux obtenus par Ekwenye et Elegalam (2005) qui ont plutôt eu un rendement alcoolique (éthanol) plus élevé que celui de l’extraction aqueuse. Ceci peut s’expliquer simplement par le fait que certains facteurs peuvent influencer la variation du rendement de l’extraction, notamment l’espèce végétale (variété), l’organe utilisé, les conditions de séchage de la plante, le contenu en métabolites et la nature du solvant utilisé (Mohamad et Eltaweel, 2014). Le test de sensibilité sur milieu gélosé des différentes concentrations d’extraits étudiées, n’a montré aucune zone d’inhibition pour les disques imbibés dans les boîtes ensemencées d’E. coli, contrairement aux disques témoins positifs (ciprofloxacine) qui ont réagi positivement (Tableau 2).
L’inhibition bactérienne par la méthode de diffusion en disque est en partie dépendante de la méthode d’extraction, la concentration d’extraits, la souche bactérienne étudiée, la concentration de l’inoculum (Burnichon et Texier, 2003 ; Toty et al., 2013). Nous pensons que pour notre étude, les concentrations d’extraits utilisés n’ont pas été suffisantes pour que la multiplication d’E. coli soit freinée par des disques imbibés. Cette inhibition dépendante de la concentration a été également constatée par Ekwenye et Elegalam (2005). Par ailleurs ce dernier n’a pas non plus su avoir une inhibition bactérienne avec les extraits aqueux de l’ail, alors qu’à la même concentration (100 mg/ ml), les extraits éthanoliques ont révélé une sensibilité des germes. Par contre, Jhean et Tayyad (2011) ont observé une inhibition sur E. coli avec des disques d’extraits aqueux et non avec les méthanoliques. L’absence de zone d’inhibition dans notre étude, pourrait aussi être liée à la méthode de conservation des gousses d’ail par les marchands. Ces gousses d’ail étaient restées longtemps exposées au soleil. En effet certains composés des huiles essentielles (diallyl trisulfide et diallyl tétrasulfide),
retrouvés aussi dans les broyats des bulbes, peuvent se volatiliser à certaines températures ou perdre leurs propriétés lors de certaines modifications physiques et chimiques (Srinivasan et Sangeetha, 2009). Ceci explique pourquoi Saravanan et ses collaborateurs (2009) ont enveloppé leur broyat d’ail dans un parafilm (film plastique de paraffine, malléable et translucide).
En outre, des résultats positifs ont été observés, avec les mêmes extraits et mêmes concentrations, par le test de sensibilité en milieu liquide. Nos résultats indiquent que l’extrait aqueux des petites variétés de l’ail est efficace par rapport aux restes des dilutions (Tableau 3). Ceci est en contradiction avec Souza et ses collaborateurs (1995) dont les résultats de recherche ont montré une efficacité de l’ail sur les bactéries Gram négatifs et positifs. Par contre, les résultats obtenus par Gaherwal et ses collaborateurs (2014) ont montré que les extraits méthanoliques de l’ail étaient plus efficaces que les extraits aqueux testés sur E. coli, S. tiphy et S.
aureus. Pour notre étude, la perspective sur la multi- résistantes d’Escherichia coli pourrait également expliquer la négativité des résultats observés (Toty et al., 2013). Ceci corrobore les résultats obtenus par Sairam et collaborateurs (2003) où dans les mêmes conditions d’étude Escherichia coli a résisté aux extraits méthanoliques et aqueux de macéras de graines de manguier comparativement à Staphylococcus aureus et Proteus vulgaris. Les résultats de notre étude indiquent qu’en comparant la méthode sur milieu solide de celle sur milieu liquide, cette dernière semble la plus sensible. Après analyse des différents paramètres pouvant influencer les résultats de l’antibiogramme, hormis les raisons évoquées plus haut, une autre conjugaison des facteurs peut être mis en cause, il s’agit de la méthode utilisée, des propriétés du milieu de culture choisi ainsi que la charge de l’inoculum, du temps d’incubation, de la température, du pH et d’autres facteurs (Soussy et Bonnet, 2013). L’activité antibactérienne de la ciprofloxacine (24 mm de diamètre d’inhibition en moyenne), inférieure à celle normalement attendue (31-38 mm) selon le comité de l’antibiogramme de l’association française de microbiologie (Soussy et Bonnet, 2013), nous pousse à croire que le milieu utilisé, aurait influencé dans une certaine mesure les résultats obtenus. Ceci semble plausible d’autant plus qu’Iwalokun et ses collaborateurs (2004) à des concentrations presque similaires aux nôtres (30-50 mg/mL) a observé une inhibition avec les extraits aqueux (sur bouillon de soja tryptique), sur la croissance d’E. coli. Odutunga et Dhiro (2014) quant à eux ont obtenu cette inhibition à
des concentrations d’extraits méthanoliques (sur gélose nutritive) inférieures (0.025 mg/mL) à celles que nous avions utilisées (50, 25 et 12.5 mg/mL). En effet, il sied de signaler que la méthode par dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques.
Cette détermination exige une standardisation rigoureuse du protocole expérimental (influence de l'inoculum, du délai séparant ensemencement et observation, milieu de culture), toute modification des
conditions expérimentales rendant l’interprétation difficile (Burnichon et Texier, 2003). La gélose de Mueller-Hinton est le seul milieu de culture solide pour l’étude de sensibilité qui ait été validé par le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), en 1999. Il est recommandé de toujours utiliser la gélose Mueller-Hinton pour les épreuves de diffusion en gélose, en fonction des directives internationales et du NCCLS.
CONCLUSION
L’ail est une plante médicinale largement utilisée par les populations rurales en République Démocratique du Congo. Considéré au niveau thérapeutique et nutritionnel comme l'épice de vie depuis l'aube des temps, on prête à cette plante d'innombrables vertus notamment antibactériennes. Ainsi, de cette étude il ressort que :
- Les macérations aqueuses ont donné des rendements supérieurs d’extraits, et ce, avec un grand pourcentage pour les petites gousses d’ail ;
- La détermination de la sensibilité des souches aux différents extraits dépend des concentrations des extraits ;
- Par la méthode sur milieu liquide, l’extrait aqueux des petites variétés de l’ail a exercé un pouvoir bactéricide sur Escherichia coli ;
- Les résultats sur le test de sensibilité dépendent en grande partie de la méthode de recherche utilisée.
En ce moment où la recherche des médicaments se présentant comme une alternative à la thérapeutique habituelle, il importe d’organiser des recherches plus poussées en envisageant de travailler avec des concentrations un peu plus élevées et sur une gamme germe de d’importance microbiologique.
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