Reprogramming somatic cells into rabbit and avian iPSC

HAL Id: hal-02803890

https://hal.inrae.fr/hal-02803890

Submitted on 5 Jun 2020

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Reprogramming somatic cells into rabbit and avian iPSC

Marielle Afanassieff, Bertrand Pain

To cite this version:

Marielle Afanassieff, Bertrand Pain. Reprogramming somatic cells into rabbit and avian iPSC: De- velopments for somatic samples to be used in reproductive biology. Kick-off meeting of CRB-Anim Infrastruture, Centres de Ressources Biologiques pour les Animaux Domestiques (CRB-Anim). FRA., Nov 2012, Paris, France. 54 diapos. �hal-02803890�

Infrastructures nationales en biologie et santé Réunion de lancement du projet CRB-Anim

Vendredi 9 novembre 202, de 9h30 à 17h00

Amphithéâtre du siège de l’INRA - 147, rue de l’Université – 75 007 Paris

9h00 – 9h30 Accueil des participants 9h30 – 9h45 Séance d’ouverture

INRA

9h45 – 10h15 L’Appel « Infrastructures nationales en biologie et santé » des projets

« Investissements d’Avenir » : ANR

CGI

Ministère de la Recherche

10h15 – 10h45 Les enjeux du CRB-Anim pour l’agriculture française et les ressources génétiques Ministère de l’Agriculture

10h45 – 11h15 L’exemple européen du Centre for Genetic Resources, the Netherlands (CGN) Sipke-Joost Hiemstra (Wagenigen University)

11h45 – 12h15 Présentation du projet CRB-Anim Michèle Tixier-Boichard (INRA)

12h15 – 13h30 Buffet déjeuner

Session 1 : Les Centres de Ressources Biologiques : Rôles et missions pour la recherche 13h30 – 14h00 Le projet Investissements d’Avenir « Biobanques »

(Bruno Clément, INSERM)

14h00 – 14h30 L’exemple du European Marine Biological Resource Centre (EMBRC) (Bernard Kloareg, UPMC)

14h30 – 15h00 Management of genetic diversity in genebanks with genomics and other tools (Jack Windig, CGN, WUR)

15h00 – 15h30 Pause café

Session 2 : Illustration des objectifs spécifiques du CRB-Anim

15h30 – 16h00 Du centre de ressources biologiques aux résultats scientifiques et économiques : l’exemple du modèle canin

(Catherine André, CNRS)

16h00 – 16h30 L’impact des CRB sur l’innovation en biotechnologies de la reproduction (Marielle Afanassieff , Bertrand Pain, INSERM)

16h30 – 17h00 Discussion finale

Table ronde avec les représentants des différents partenaires

Entrée libre sur inscription sur le site : https://colloque.inra.fr/kickoff-meeting-crb-anim Contact : Olivier Ruetsch (olivier.ruetsch@paris.inra.fr, 01 42 75 93 25)

FUTURS ÉTUDIANTS

VIE ÉTUDIANTE

CLINIQUES VÉTÉRINAIRES

PROFESSIONNELS ENTREPRISES

ÉCOLE NATIONALE DES SERVICES VÉTÉRINAIRES

L'INSTITUT FORMATION RECHERCHE SERVICES DOCUMENTATION INTERNATIONAL

100%

Services Web M'identifier

Contactez-nous Contacts Accès Espace presse Recrutement Marchés publics Le cheval senior, ce seigneur !

Article paru dans EQUITA LYON 2012

"Le Pôle Santé d’Equita’ Lyon est un espace d’accueil et d’information dédié à la santé du cheval et du cavalier. Il

VetAgro Sup : deux régions, un objectif commun

VetAgro Sup est né le 1er janvier 2010 de la fusion de l'École nationale vétérinaire de Lyon, l'École nationale d'ingénieurs des travaux agricoles de Clermont-Ferrand et l'École nationale des services vétérinaires. Institut d'enseignement supérieur et de recherche en alimentation, santé animale, sciences agronomiques et de environnement, VetAgro Sup, est implanté sur les deux régions Auvergne et Rhône-Alpes et place au premier rang de ses objectifs la formation de vétérinaires et d’ingénieurs, la production de connaissances et l'appui aux acteurs économiques dans les domaines de l'alimentation, de la

Stéphane Martinot

Directeur Général de VetAgro Sup santé animale, des sciences agronomiques et de l’environnement.

VetAgro Sup, est l'une des quatre écoles françaises vétérinaires, incorporée dans le Ministère de l'Agriculture. VetAgro Sup forme les étudiants autour des multiples activités professionnelles vétérinaires et agronomiques (santé animale, santé publique, protection et sécurité animale, protection environnementale, nutrition et science de aliments, etc.).

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En savoir plus Le campus vétérinaire de Lyon est spécialisé dans les sciences de l'animal de laboratoire, la biologie appliquée à la santé publique, la médecine et l'élevage des grands animaux.

Le campus agronomique de Clermont est spécialisé dans les domaines de l'agriculture, l'agro- alimentaire, l'espace rural, la forêt, l'environnement.

L’ENSV (École Nationale des Services Vétérinaires) forme les acteurs de la santé publique vétérinaire, publics mais aussi privés, français ou étrangers, en début et tout au long de leur carrière.

VetAgro Sup | Au coeur du vivant http://www.vetagro-sup.fr/

1 sur 2 19/10/12 08:56

Reprogramming somatic cells into rabbit and avian iPSC

Marielle AFANASSIEFF & Bertrand PAIN

AgroBioStem - INSERM U846 - INRA USC 1361 - Bron

CRB-Anim 9/11/2012

FUTURS ÉTUDIANTS

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CLINIQUES VÉTÉRINAIRES

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Article paru dans EQUITA LYON 2012

"Le Pôle Santé d’Equita’ Lyon est un espace d’accueil et d’information dédié à la santé du cheval et du cavalier. Il

VetAgro Sup : deux régions, un objectif commun

VetAgro Sup est né le 1er janvier 2010 de la fusion de l'École nationale vétérinaire de Lyon, l'École nationale d'ingénieurs des travaux agricoles de Clermont-Ferrand et l'École nationale des services vétérinaires. Institut d'enseignement supérieur et de recherche en alimentation, santé animale, sciences agronomiques et de environnement, VetAgro Sup, est implanté sur les deux régions Auvergne et Rhône-Alpes et place au premier rang de ses objectifs la formation de vétérinaires et d’ingénieurs, la production de connaissances et l'appui aux acteurs économiques dans les domaines de l'alimentation, de la

Stéphane Martinot

Directeur Général de VetAgro Sup santé animale, des sciences agronomiques et de l’environnement.

VetAgro Sup, est l'une des quatre écoles françaises vétérinaires, incorporée dans le Ministère de l'Agriculture. VetAgro Sup forme les étudiants autour des multiples activités professionnelles vétérinaires et agronomiques (santé animale, santé publique, protection et sécurité animale, protection environnementale, nutrition et science de aliments, etc.).

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Le campus agronomique de Clermont est spécialisé dans les domaines de l'agriculture, l'agro- alimentaire, l'espace rural, la forêt, l'environnement.

L’ENSV (École Nationale des Services Vétérinaires) forme les acteurs de la santé publique vétérinaire, publics mais aussi privés, français ou étrangers, en début et tout au long de leur carrière.

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Developments for somatic samples

to be used for reproductive biology (WP2.2)

Goals: To increase the type and the number

of samples for cryobanking

Pluripotent stem cells

Properties of pluripotent stem cells

Pluripotent stem cells Self-renewal

Properties of pluripotent stem cells

Pluripotent stem cells Self-renewal

Differentiation

Endoderm

Mesoderm

Ectoderm

Properties of pluripotent stem cells

Glucagon

Desmin

Pluripotent stem cells Self-renewal

Differentiation

Endoderm

Mesoderm

Ectoderm Oncogenesis

Properties of pluripotent stem cells

Glucagon

Desmin

Pluripotent stem cells Self-renewal

Differentiation

Endoderm

Mesoderm

Ectoderm Oncogenesis

Properties of pluripotent stem cells

Embryo colonization

Chimeras

Glucagon

Desmin

Types of pluripotent stem cell

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells

EpiSC

Types of pluripotent stem cell

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells

EpiSC

Types of pluripotent stem cell

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells

EpiSC

Blastocyst Egg cylinder

Types of pluripotent stem cell

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells EpiSC Blastocyst Egg cylinder

Cell reprogramming

Induced Pluripotent Stem Cells

iPSC

The Nobel Prize recognizes two scientists who discovered that mature, specialised cells can be reprogrammed to become immature cells capable of developing into all tissues of the body. Their findings have revolutionised our understanding of how cells and organisms develop.

John B. Gurdon discovered in 1962 that the specialisation of cells is reversible. In a classic experiment, he replaced the immature cell nucleus in an egg cell of a frog with the nucleus from a mature intestinal cell. This modified egg cell developed into a normal tadpole. The DNA of the mature cell still had all the information needed to develop all cells in the frog.

Shinya Yamanaka discovered more than 40 years later, in 2006, how intact mature cells in mice could be reprogrammed to become immature stem cells. Surprisingly, by introducing only a few genes, he could reprogram mature cells to become pluripotent stem cells, i.e. immature cells that are able to develop into all types of cells in the body.

These groundbreaking discoveries have completely changed our view of the development and cellular specialisation. We now understand that the mature cell does not have to be confined forever to its specialised state. Textbooks have been rewritten and new research fields have been established. By reprogramming human cells, scientists have created new opportunities to study diseases and develop methods for diagnosis and therapy.

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2012 jointly to

John B. Gurdon and Shinya Yamanaka

for the discovery that mature cells can be reprogrammed to become pluripotent

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2012/press.html

Reprogramming: the stem cell revolution – the iPSC

Cell reprogramming in Mouse

Differentiated cells

Sox2 c-Myc Klf4

Oct4

Overexpression Day 0

Lineage-specific genes

Differentiated

cells

Cell reprogramming in Mouse

Differentiated cells

Colony formation Loss of

morphology

Sox2 c-Myc Klf4

Oct4

Overexpression Day 0

Lineage-specific genes

Differentiated cells

Partially

reprogrammed cells (pre-iPSC)

Day 3 Day 9

Alkalin phosphatase activity

Cell reprogramming in Mouse

Differentiated cells

Pluripotent stem cells Colony

formation Loss of

morphology

Sox2 c-Myc Klf4

Oct4

Overexpression Day 0

Oct4

Sox2

Nanog

Lineage-specific genes

Pluripotency genes

Differentiated cells

Partially

reprogrammed cells (pre-iPSC)

iPSC

Day 3 Day 9 Day 16

Alkalin phosphatase activity

Interest of iPSC for conservation of species

Embryo

2N

Transfer into

surrogate mothers

Interest of iPSC for conservation of species

Embryo

2N

Gametes

N N

Transfer into surrogate mothers

FerFlizaFon +/-

transfer

Interest of iPSC for conservation of species

Embryo

2N

Gametes

N N

SomaFc Fssue

2N iPSC

Transfer into surrogate mothers

FerFlizaFon +/- transfer

Reprogramming

2N

Interest of iPSC for conservation of species

Embryo

2N

Gametes

N N

SomaFc Fssue

2N iPSC

Embryo colonizaFon

Transfer into surrogate mothers

FerFlizaFon +/- transfer

Reprogramming

2N

Interest of iPSC for conservation of species

Embryo

2N

Gametes

N N

SomaFc Fssue

2N iPSC

DifferenFaFon

Embryo colonizaFon

Transfer into surrogate mothers

FerFlizaFon +/- transfer

Reprogramming

2N

Reprogramming somatic cells into rabbit iPSC

ü  Advantages of the rabbit ?

small animal, easy and cheap to breed

prolific animal with a short reproductive interval

physiologically and genetically closer to other mammals

Reprogramming somatic cells into rabbit iPSC

ü  Advantages of the rabbit ?

small animal, easy and cheap to breed

prolific animal with a short reproductive interval

physiologically and genetically closer to other mammals

ü  Development of rabbit cryobanking

iPSC technology is available for rabbit

determination of somatic tissues/cells to be used establishment of cryoconservation conditions adaptation of reprogramming techniques

ü  Good model for farm animals

Rabbit iPSC

Skin fibroblasts

Rabbit iPSC

c-Myc Infection

Sox2 Klf4 Oct4

Skin fibroblasts

Reprogramming

iPSC colony

Day 50

Rabbit iPSC

c-Myc Infection

Sox2 Klf4 Oct4

Skin fibroblasts

Reprogramming

iPSC colony

H2O

riPSC-B2 riPSC-B7 riPSC-B19 riPSC-B24 riPSC-B25 riPSC-B29 T+

Oct4 Nanog

GAPDH Oct4 Sox2 Klf4 c-Myc

Transgenes Endogenes

RT-PCR

P6

Day 50

Rabbit iPSC

c-Myc Infection

Sox2 Klf4 Oct4

Skin fibroblasts

Reprogramming

iPSC colony

H2O

riPSC-B2 riPSC-B7 riPSC-B19 riPSC-B24 riPSC-B25 riPSC-B29 T+

Oct4 Nanog

GAPDH Oct4 Sox2 Klf4 c-Myc

Transgenes Endogenes

RT-PCR

P6

riPSC-B19 riPSC-B24 riPSC-B29

P16

riPSC-B19 riPSC-B24 riPSC-B25 riPSC-B29

P25

Day 50

Characterization of rabbit iPSC

Rabbit iPSC

Characterization of rabbit iPSC

Self-renewal

AP activity Cell cycle 42XX

Rabbit iPSC

Characterization of rabbit iPSC

Self-renewal

Pluripotency markers

Oct4 E-Cadherin

SSEA1

SSEA4

AP activity Cell cycle 42XX

Rabbit iPSC

Characterization of rabbit iPSC

Self-renewal

Differentiation and oncogenesis

Pluripotency markers

Oct4 E-Cadherin

SSEA1

SSEA4

AP activity Cell cycle 42XX

Embryoid bodies

Teratoma

Rabbit iPSC

Characterization of rabbit iPSC

Self-renewal

Differentiation and oncogenesis

Pluripotency markers

Embryo colonization ?

Oct4 E-Cadherin

SSEA1

SSEA4

AP activity Cell cycle 42XX

Embryoid bodies

Teratoma

8-cell stage embryo

Rabbit iPSC Blastocyst

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells EpiSC Blastocyst Egg cylinder

Cell reprogramming

Induced Pluripotent Stem Cells

iPSC

Reprogramming somatic cells into avian iPSC

DifferenFated Cells Precursors

Tissue-specific Stem Cells Embryonic Stem Cells

ESC Epiblast Stem Cells EpiSC Blastocyst Egg cylinder

Cell reprogramming

Induced Pluripotent Stem Cells

iPSC

Reprogramming somatic cells into avian iPSC

What about in chicken ?

?

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

Semen

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

Semen

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

Semen

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

EG : Embryonic Germ Cells

(Pärk et al., 2000)

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

Semen

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

EG : Embryonic Germ Cells

(Pärk et al., 2000)

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

Semen

PGC: Primordial Germ cells

(Van de Lavoir et al., 2006)

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

EG : Embryonic Germ Cells

(Pärk et al., 2000)

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

Semen

PGC: Primordial Germ cells

(Van de Lavoir et al., 2006)

‘Epi-likeSC’

Epiblast Stem Cells

?

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

EG : Embryonic Germ Cells

(Pärk et al., 2000)

iPS: Induced Pluripotent Stem

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

???

Semen

PGC: Primordial Germ cells

(Van de Lavoir et al., 2006)

SSC: Spermatogonial Stem cells

‘Epi-likeSC’

Epiblast Stem Cells

??? ?

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

cBC: Blastodermal cells

(Petitte et al., 1993, 2004)

EG : Embryonic Germ Cells

(Pärk et al., 2000)

iPS: Induced Pluripotent Stem

cES: Embryonic stem cells

(Pain et al., 1996, Lavial et al., 2007)

???

Semen

PGC: Primordial Germ cells

(Van de Lavoir et al., 2006)

SSC: Spermatogonial Stem cells

‘Epi-likeSC’

Epiblast Stem Cells

??? ?

Adapted from Lavial & Pain, 2010

Stem cells in chicken

Stem cells in chicken

Stem cells in chicken

Reprogramming: a stochastic and complex process

The direct infection with the polycistronic vector (pLent-KOSM) leads to small colonies unable to proliferate

MEF CEF

miPS (AP+) A

B

20µm

ciPS (AP-)

First tests

CEF I platting passage infection VA treatment J0

J4 J5

J7

J9 selection

J17 passage passage

J22 Maintenance

AP staining J30 RNA

J26

Amplification

&

characterization passage

transfection J6

è Development of a two step procedure using pPB and lentiviral vectors

New strategy

New strategy

mES cES

New strategy

New strategy

New strategy

–  To standardize the reprogramming protocol è the optimal combination –  To fully characterize the reprogrammed cells

–  To inject the reprogrammed cells into recipient embryos –  To evaluate their developmental potential

–  To determine the somatic tissues/cells to be used –  To establish the optimum cryobanking conditions

Still to be done…

SBRI - Stem Cell & Brain Research Institute, U846, INSERM, USC1361, INRA, UCB Lyon 1

AgroBioStem http:/http/www.sbri.fr

Thanks to

Chicken Group P. Aubel

A. Fuet C. Jean F. Raucci

S. Voisin C. Kress Rabbit Group

P. Savatier T. Joly P. Osteil Y. Tapponnier S. Markossian

M. Al-Khtib