Mémoire de fin d’études en vue de l’obtention du diplôme Filière: Sciences Biologiques
Option : Sciences pharmacologiques
Thème
Membres de Jury Présenté par : Présidente : Mᵐᵉ REZZAGUI Abir FERROUH Amira Encadrant : Dr BENGUEDOUAR Lamia LABRECHE Aida Examinatrice : Mᵐᵉ KEBSA Wided MOUSSOUS Sara
Année Universitaire 2018-2019
تـعيبـــطلا مولـــــع تـيلك ةبيــــــحلاو
نــــــسق تيئيزجلا بيجولويبلا تيولخلاو
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire
République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
تــــعهبـــج لجيج يحي نب قيدصلا دوحه
Mise en évidence par le test de la comète de la génotoxicité et de l’hépatotoxicité induites par le Benzo[a]pyrène chez la souris d’une part et d’autre part l’effet géno et cytoprotecteur de l’huile de fruits du pistachier lentisque de la région de Jijel (Texenna) contre ces toxicités.
C’est avec un énorme plaisir que nous réservons ces lignes en signe de gratitude et de profonde
reconnaissance à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation et à l’aboutissement de ce
travail.
Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant pour nous avoir aidé à réaliser ce modeste travail.
Nos vifs remerciements à notre encadreur Dr
BENGUEDOUAR Lamia pour son encadrement, sa disponibilité, ses conseils et ses orientations
enrichissantes pour ce travail.
Nous tenons à remercier infiniment les membres du jury : Mme REZZAGUI Abir, qui nous a fait l'honneur de
présider notre jury de soutenance.
Mme KEBSA Wided, pour avoir accepté de prendre part au jury de soutenance, tout le plaisir est pour nous.
Nos sincères remerciements vont également:
A monsieur BOUMASLATE Kamal
Aux ingénieurs de laboratoire de pharmacologie
expérimentale Wahiba et Mokhtar (Université de Jijel).
Remerciement
s
Toutes les lettres ne sauraient trouver les mots qu’il faut, Tous les mots ne sauraient exprimer la gratitude, L’amour, le respect et la reconnaissance.
Aussi, c’est tout simplement que :
A l’aide d’Allah, le tout puissant, j’ai pu réaliser ce travail que je dédie :
A mon cher père «Moustafa», le plus cher homme au monde, qui a tout donné sans rien recevoir. (Je le remercie du fond de mon coeur).
A ma très chère mère «Saida » qui m’a protégé, et encouragé je laremercie pour son éternel et infatigable soutien.
A ma famille et surtout mes chers frères et mes chères sœurs « Mohamed, Walid, Moussa,Ahlam, Sihem, Ahlam, Imen,»
Ama beau-frère«Boualam» et leur familles «Salima, Sara » Aux enfants « Ritadje, mino, Amina, Mariam, Youcef»
A mes chères Aida et Amira
Ames amies« Ahcen, Abou layte,Fatima,Salma Yasmina, » A toutes mes amies qui n’ont cessé de m‘encourager
A tout le groupe de ma promotion surtout Mehdi,Manal, Wissam, et Zahra.
Tous ceux que j’aime, sans lesquels tout ceci n’aurait aucun
Toutes les lettres ne sauraient trouver les mots qu’il faut, Tous les mots ne sauraient exprimer la gratitude, L’amour, le respect et la reconnaissance.
Aussi, c’est tout simplement que :
A l’aide d’Allah, le tout puissant, j’ai pu réaliser ce travail que je dédie :
A mon cher père «Abd Elmadjid», le plus cher homme au monde, qui a tout donné sans rien recevoir. (Je le remercie du fond de mon coeur)Que Dieu ait pitié de toi.
A ma très chère mère «Zohra » qui m’a protégé, et encouragé je laremercie pour son éternel et infatigable soutien.
A ma famille et surtout mes chers frères et mes chères sœur
« Youcef,Mounira, Kahina,Khalida,»
A mon frère Feteh et sa petite famille «Chahira, Lamis, Hadil»
A mon frère Yaakoub et sa petite famille «Siham, Anfal, » Ama beau-frère« Rabia»
A mes chères Amira et Sara .Ames amies«Roukia, Fatima,Nawal, Soumia, Nabila, Rahma, Ilham, Loubna, Meriem,Saida,Ibtissam,Chahra»
A toutes mes amies qui n’ont cessé de m‘encourager
A tout le groupe de ma promotion surtout Mehdi, Manal, Wissam, et Zahra.Tous ceux que j’aime, sans lesquels tout ceci n’aurait aucun sens Aida
Toutes les lettres ne sauraient trouver les mots qu’il faut, Tous les mots ne sauraient exprimer la gratitude, L’amour, le respect et la reconnaissance.
Aussi, c’est tout simplement que :
A l’aide d’Allah, le tout puissant, j’ai pu réaliser ce travail que je dédie :
A mon cher père «AbdElhamid», le plus cher homme au monde, qui a tout donné sans rien recevoir. (Je le remercie du fond de mon coeur).
A ma très chère mère «Rachida » qui m’a protégé, et encouragé je laremercie pour son éternel et infatigable soutien.
A ma famille et surtout mes chers frères et mes chères sœurs « Rayad, Nadir et leur femme Hayat, Nawel, Naziha, Nassima, Masaouda.»
Ames beaux-frères «Hicham, Hakim»
Aux enfants «Yassin, Raouf, Yasser, Yasmine, Sifo»
A mes chères Aida et Sarah ; Ames amies «,Hemama, Maryam,Soumia , Nabila,nsibi Manal,
Rekia,chahra,Ibtissam,Yasmin,Fouzia,Asma,Sofyen,Rabah, Zinou»
A toutes mes amies qui n’ont cessé de m‘encouragerA tout le groupe de ma promotion surtout, Mahdi,Manal, Wissam, et ma copine Zahra. Tous ceux que j’aime, sans lesquels tout ceci n’aurait aucun sens
Amira
Liste des figures……….…..i
Liste des Tableaux……….….ii
Liste des Abréviations………...iii
Introduction……….1
PREMIERE PARTIE : ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : La Génotoxicité I- La génotoxicité………..2
I-1-Définition……….…………...2
I-2 Méthodes d’évaluation de la génotoxicité……….…...3
I-2-1- Test d’Ames……….…….….3
I-2-2 Test de micronoyau………..……….…4
I-2-3 Test d’aberration chromosomique…………...……….…5
I-2-4- Test de comète………..……….6
I-2-4-1-Définition et Historique………...……….…..6
I-2-4-2-Nature des dommages mis en évidence………...……….….7
a-Les cassures simples et double-brin………..……….….8
-Les cassures simple-brin………...……….…8
-Les cassures double-brin………...………....8
b-Les sites alcali-labiles………..……….…9
I-2-4-3-Le principe général de test de la comète……….…11
I-2-4-4-Les Applications du test de la comète………....…….13
a-Toxicologie génétique………....………14
b- Fulidémiologie/ Biomonitoring environnemental………....………..14
c-Ecotoxicologie……….………15
I-2-4-5-Avantages et Limites de test de la comète………..15
Chapitre II: Génototoxicité du Benzo[a]pyréne et de Cyclophosphamide II- Génotoxicité du Benzo [a] pyrene et de Cyclophosphamide………….………...17
II-1- Le Benzo[a]pyrène……….17
II-1-1-Définition………..17
II-1-2-Exposition……….17
II-1-3-Propriétés toxiques et cancérogènes………..18
II-2-Le Cyclophasphamide………...……….19
II-2-1-Définition……….……….19
II-2-2-Mécanisme d'action toxique……….………..20
II-2-3-Effets indésirables et toxicité………..………20
Chapitre III : Hépatotoxicité et Stress Oxydatif induit par le B[a]P III- Hépatotoxicité et stress oxydatif induits par le B[a]P………….………21
III-1-Stress oxydatif………...………21
III-1-1-Conséquences du stress oxydant………...………...21
III-1-1-1- Dommages de l’ADN………...……….21
III-1-1-2-Oxydation des protéines………...……….21
III-1-1-3-Peroxydation lipidique………..………22
III-1-2-Le stress oxydatif dans le Foie………..………...22
III-2-Hépatotoxicité du Benzo [a] pyrène…….………..23
Chapitre IV : Pistacia lentiscus L IV- Pistacia Lentiscus L……….25
IV-1- Description de la plante……….….……….25
IV-1-1-Systématique du genre Pistacia lentiscus L……….…………....26
IV-2-Les Activités Biologiques de Pistacia lentiscus L………...……….26
IV-2-1-Activité antioxydante……….………26
IV-2-2-Activité génotoxique et antigénotoxique ……….27
IV-2-3-Activité hépatoprotectrice .………...………27
IV-2-4-Activité anti-inflammatoire………...………27
IV-2-5- Activité antiulcéreuse ……….……….27
IV-2-6- Activité cytoprotective………..27
DEUXIEME PARTIE : MATERIEL ET METHODES
I-1-Matériels……….………...29
I-1-1-Les Animaux……….………29
I-1-2- Les substances étudiées ……….29
I-2-Méthodes…….………..30
I-2-1-Traitements des animaux…….………30
I-2-2- Prélèvement du foie et obtention de suspensions cellulaire à partir des foies des souris………31
I-2-3-Réalisation du test des Comètes……….………...31
I-2-3-1-Préparation des lames……..………..32
I-2-3-2-Lyse cellulaire….………32
I-2-3-3-Déroulements de l’ADN.………...32
I-2-3-4-Electrophorèse et migration….……….………33
I-2-3-5-Neutralisation………..………....33
I-2-3-6-Déshydratation..………..33
I-2-3-7-Coloration………..………..33
I-2-3-8-Lecture et analyse des lames…..………...33
I-2-4-Mesure du stress oxydatif au niveau du foie……..……….34
I-2-4-1- Préparation de la fraction cytosolique hépatique………..……….34
I-2-4-2-Dosage des protéines totales……….………...…….……….34
I-2-4-3 -Dosage du glutathion (GSH)….………...35
I-2-4-4-Dosage de MDA hépatique dans la fraction cytosolique….……….…...35
I-2-4-5-Mesure de l’activité enzymatique de la catalase (CAT)………...36
I-2-5-Etude histologique………..………...36
I-3 -Etude statistique………..……….37
I-3-1-Stress Oxydatif………...………37
I-3-2-Test de la Comète………...………37
TROIXIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION II-1- Résultats………..39
II-1-1 - Etude de l’effet génotoxique du Benzo[a]pyrène in vivo au niveau hépatique…..…..39
II-1-1-1-Effet des différents traitements sur les paramètres de la COMETE………..40
II-1-2-Variations des paramètres du stress oxydatif hépatique……….44
II-1-2-1- Variation du taux de MDA cytosolique du foie……….……...………44
II-1-2-2-Activité enzymatique de la catalase hépatique (CAT)………..………45
II-1-2-3-Variation du taux de glutathion hépatique……….………...46
II-1-3- Etude histologique……….………..49
II-2-Discussion général……….………..50
Conclusion………...52
Référence Bibliographique………53 Annexe
Figure Titre Page 1 Effet des agents chimiques sur la molécule d’ADN 2
2 Principe du test d’Ames 4
3 Principe du test des micronoyaux: Lésion chromosomique au cours de la
mitose après exposition de cellules somatiques à un agent génotoxiques 5
4 Principales étapes du test des comètes 7
5 Sites d'alkylation des bases de l'ADN 9
6 Exemple d'un site AP 10
7 Structure moléculaire du Benzo[a]pyrène 17
8 Structure chimique de Cyclophosphamide 19
9 Mécanisme général du stress oxydatif induit par divers facteurs et maladies du foie
23
10 Parties végétales de Pistacia Lentiscus L 25
11 Diagramme représentant le design expérimental des traitements 31
12
Capture d'écran du logiciel CASP 1.2.2 (СASPlab, Wroclaw, Pologne)
montrant une comète à ADN colorée au Giemsa traitée par le logiciel. Dans le coin inférieur droit, divers paramètres de la comète mis en évidence dans la fenêtre centrale du logiciel, tels que le moment de la queue d’Olive, le
moment de la queue, le pourcentage d’ADN dans la queue, etc., sont affichés
34
13 Représentation graphique de la Box-plot 38
14
Images représentatives de comètes à ADN, obtenues à partir de cellules hépatiques, colorées avec Giemsa. (A) Noyau non endommagé (Cellule intacte); (B) Noyau peu endommagé ;(C) Noyau très endommagé et (D) Cellule fantôme
39
15 Représentation graphique du pourcentage d’ADN dans la queue et la tête 41 16 Représentation graphique de la longueur d’ADN dans la queue 41
17
représentation des valeurs moyennes des OTM des cellules hépatiques dans les différentes classes: 0-20%(classe0), 20- 40%(classe1), 40-60%(classe2), 60-80%(classe3) et plus de 80%(classe4)
42 18 Répartition des traitements en fonction de leurs dommages à l'ADN exprimés
par Olive Tail Moment à l’aide d’un Box-plot
43
19 Variations du taux MDA tissulaire hépatique 44 20 Variations de l’activité enzymatique de la catalase cytosolique hépatique 45
21
Variation du taux de GSH cytosolique hépatique 47
22
Changements histopathologiques représentatifs des tissus du foie, induit par le traitement à 100 mg / kg de B [a] P chez la souris. A(Témoin) ; B (B [a] P) ; C (B [a] P+HFPL) ; D(HFPL), (coloration HE, grossissement:×100)
49
ii
Tableau Titre Page
I Principaux avantages et inconvénients du test des comètes pour l'étude des dommages à l'ADN
16
II Taxonomie de Pistacia lentiscus L 26
ADN : Acide Désoxyribo Nucléique
ARN : Acide Ribo-Nucléique
B [a] P: Benzo[a]pyrène
BPDE: BenzoPyrène Diol- Epoxyde
BSA: Bovin Sérum Albumine
CAT : Catalase
CP: Cyclophosphamide
DMSO: Diméthyl-sulfoxyde
DTNB =Acide 5,5'-dithio-bis-2- nitrobenzoїque
EDTA: Ethylène Diamine Tétra- Acétique
ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène
GSH : Glutathion réduit
GSH-Px : Glutathion peroxydase
GSSG : Glutathion oxyde
HAPs: Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques
HBSS: Hanks Balance Salt Solution
HFPL: Huile de Fruit de Pistachier Lentisque
HO : Huile d’Olive
IARC: International Agency for Research on Cancer
IP: Intrapéritoléale
LMPA: Low Melt Point Agarose
MDA: Malonaldialdéhyde
NA: Normal Agarose
OCDE: Organisation de Coopération et de Développement Economiques
OTM : Olive Tail Moment
rpm : Routeur Par Minute
SCGE: Single Cell Gel Electrophoresis
Sites AP: Sites Abasiques
TBA : Acide Thiob-Arbiturique
TBS : Tris-Buffered Saline
TCA : Trichloracétique
TM : Tail Moment
Tris: Tris (hydroxyméthyl)- aminoéthane
Triton: T-
octylphénoxypolyéthoxyéthanol
Le développement de la toxicologie génétique est lié au constat que certains produits chimiques ou certains agents physiques seraient capables d'augmenter la fréquence des maladies héréditaires chez l'homme ou seraient à l'origine de l'apparition des cancers (Tice et al., 2000).
Ainsi ; dans un but de préserver la santé publique, il est nécessaire de déterminer si les produits chimiques utilisés dans l'industrie (produits phytosanitaires, additifs alimentaires) ou si les nouvelles molécules issues de la recherche (les candidats médicaments) ont la capacité d'endommager l'acide désoxyribonucléique, l'ADN, la cellule et les tissus e l’organisme.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont des polluants persistants, au caractère mutagène et/ou cancérigène reconnu. Ils suivent au sein des organismes diverses voies de métabolisation dont certaines potentialisent leur caractère génotoxique et peuvent conduire à l'apparition de dommages à l'ADN.
De nouveaux développements sont apparus ces dernières années, le test des Comètes en fait partie, celui-ci permet de mettre en évidence des lésions primaires de l'ADN telles que des cassures simple et double-brin, des adduits aux bases de l'ADN, des intercalations, des pontages inter et intra-brin, et des pontages ADN-protéines (Tice et al., 2000).
En toxicologie génétique, de nombreux essais sont applicables à la recherche des lésions de I'ADN, mais les travaux avec des organismes exposés à des échantillons de l'environnement ou des individus autochtones exposés in situ sont restés rares jusqu'au développement du test des comètes.
Par ailleurs, les HAPs présentent également des toxicités tissulaires multiples. Différents auteurs ont rapporté leur implication marquée dans la physiopathologie fonctionnelle et structurale de certains organes tels que le cerveau, le rein, l’estomac, le poumon mais le foie représente le tissu le plus sensible à ce toxique puisqu’il est le siège du métabolisme des xénobiotiques (Deng et al., 2018).
L'objectif de notre travail était axé sur deux volets : d’une part, la mise en œuvre du test des comètes dans des études de génotoxicité environnementale liées à l’exposition au B[a]P in vivo sur la cellule hépatique, et d’autre part, l’estimation des dommages oxydatifs au niveau du foie par la mesure des paramètres biochimiques du stress oxydatif (GSH, MDA et Catalase) ainsi qu’une observation microscopique des coupes de ce tissu. Afin de pallier à ces effets toxiques néfastes, nous avons tenté de voir si un prétraitement par un produit naturel tel que l’huile de fruits de Pistacia lentiscus L (HFPL) pourrait prévenir la génotoxicité et l’hépatotoxicité du B[a]P.
I- La génotoxicité I-1- Définition
La génotoxicité se définit comme la capacité de certains agents dits « génotoxiques » (agents physique, chimique ou biologique) à induire des dommages à l’ADN de façon directe et /ou indirecte par une activation métabolique par les enzymes du foie. Les systèmes de réparation de la cellule sont responsables de l’élimination de ces lésions. Néanmoins, une réparation imparfaite peut aussi conduire à des mutations géniques qui risquent d’engendrer des cancers. Pouvant conduire à des mutations géniques ou chromosomiques. Ces dommages, une fois fixés dans le génome, peuvent avoir des conséquences délétères sur la santé des organismes exposés et/ou de leur descendance : mortalité embryonnaire, malformations congénitales, infertilité, cancers, etc. En raison de la grande variété des substances impliquées, de leur omniprésence dans l’environnement et des conséquences démo-écologiques possibles notamment sur la survie ou le renouvellement de certaines populations sauvages, l’étude de ces substances génotoxiques représente un enjeu majeur pour la préservation de l’environnement (Cohen et al., 2003 ; Burlinson et al., 2007 ; Fardel., 2014).
La figure 1 ci-dessous illustre l’effet des agents chimiques sur la molécule d’ADN :
I-2- Méthodes d’évaluation de la génotoxicité
Les objectifs des différents tests de génotoxicité sont d’une part d’identifier des agents génotoxiques, mais également de déterminer leurs modes d’action moléculaires et cellulaires (bioactivation, nature des interactions avec l’ADN, modifications de bases, cassures de brins, pontages, intercalations, substitutions, addition ou délétion de paires de bases, cassures chromatiniennes ou chromosomiques, pertes de chromosomes entiers…) (Dearfield et al.,2005).
Différents tests et stratégies associatives de tests de génotoxicité ont été développés pour évaluer le risque de survenue des trois types de dommages génétiques responsables de pathologies humaines:
les mutations géniques (modifications d’une ou de quelques paires de bases dans un seul gène), les mutations chromosomiques de structure (translocations et inversions consécutives à des cassures double-brins directes ou indirectes) et les mutations aneugènes (qui induisent une perte de chromosomes entiers) (Dearfield et al.,2002). Les lésions primaires de l’ADN peuvent être évaluées par le test des comètes, ou par la détection de différents types d’adduits; les mutations géniques par le test d’Ames et le « Mouse lymphom assay », les lésions chromosomiques clastogènes et aneugènes par le test des aberrations chromosomiques ou le test des micronoyaux (Morita et al., 2009). Chaque test est décrit dans une ligne directrice de l’OCDE.
I-2-1-Test d’Ames
Mis au point par le Pr Ames (Ames, 1975), c’est le plus ancien des tests de toxicologie génétique (Sari-Minodier et al., 2006). Il est utilisé afin de déterminer la mutagénicité et l’anti- mutagénicité à court terme de certains agents et mixtures mutagènes (test de mutagenèse) (Czeczot et al., 1990).
Différentes méthodes peuvent mesurer le pouvoir mutagène des xénobiotiques, tel que le B[a]P. Certaines méthodes permettent la mesure du pouvoir d'un xénobiotique à redonner le phénotype normal pour certains caractères phénotypiques mutés. Par exemple, les souches de Salmonella typhymurium (TA100 et T98) dans le test d'Ames ont été préalablement mutées pour devenir auxotrophe à l'histidine. Des mutations subséquentes induites par des xénobiotiques rendent ces dernières phototrophes à l'histidine, leurs conférant ainsi, la capacité de se multiplier dans un milieu dépourvu d'histidine (Maron et Ames, 1983). D'autres tests ayant le même principe de mutations renversées existent, telle SOS chromatest (Quillardet et Hofnung, 1993).Ce test est simple, rapide (48h) et peu coûteux et est largement utilisé par de nombreux laboratoires. Il présente un inconvénient majeur : il repose sur l’utilisation de cellules bactériennes dont le métabolisme diffère des cellules animales et humaines. Or certains composés cancérogènes nécessitent d’être
métabolisés pour être actifs, ce qui signifie que certains composés peuvent être activés dans les cellules bactériennes mais pas dans les cellules animales et/ou humaines et vice-versa. Une modification du test initial a consisté à utiliser un mélange de microsomes hépatiques de mammifères (S9) afin de réaliser l’activation métabolique de certains mutagènes. Néanmoins, malgré le recours aux extraits de foie, le test d’Ames ne détecte qu’environ la moitié des agents des cancérigènes potentiels (Ames, 1975). La figure 2 représente le principe du test d’Ames :
Figure 2 : Principe du test d’Ames (Ames, 1975).
I-2-2-Test du micronoyau
Les micronoyaux sont constitués de chromosomes entiers perdus au cours de la mitose (phénomène aneugène) ou de fragments chromosomiques acentriques exclus du noyau de la cellule fille pendant la division cellulaire (phénomène clastogène). Le test évalue l’exposition à des agents clastogènes et/ou aneugènes. C’est à la fois un test de mutations chromosomiques et de mutations géniques (Schmid, 1975; Eslava, 2004). Les tests des micronoyaux ont émergé comme l'une des méthodes préférées pour l'évaluation des dommages chromosomiques (Fenech, 2000).Cette technique repose sur l’utilisation de cytochalasine B, un inhibiteur de la polymérisation des filaments d’actine nécessaire à la formation de l’anneau de microfilaments qui permet la cytodiérèse. La cellule se retrouve ainsi dans un état binucléé. Les chromosomes lésés par le stress sont incapables de migrer vers les pôles durant la mitose. En télophase, une membrane nucléaire se forme autour prenant l’aspect d’un petit noyau, c’est ce qu’on appelle un micronoyau. Il s’agit alors de comptabiliser le nombre de micronoyaux par cellules binucléées sur un total de 1000 cellules (Berthelot-Ricou et al., 2013). Ce test présente l’avantage de mettre en évidence à la fois les lésions aneugènes (anomalies du nombre des chromosomes) et les lésions clastogènes et constitue un
biomarqueur d’effet précoce qui semble aussi prédictif du risque de cancer. La figure 3 illustre le principe du test de micronoyau :
Effet aneugène : perte de chromosomes entiers.
Effet clastogène : perte de fragments de chromosomes
Figure 3 : Principe du test des micronoyaux: Lésion chromosomique au cours de la mitose après exposition de cellules somatiques à un agent génotoxique (Berthelot-Ricou et al.,
2013).
I-2-3-Test d’aberration chromosomique
Ce test se base sur la mise en évidence des différentes aberrations chromosomiques, délétion/fragmentation, (Bouraoui et al., 2011)polyploïdie ou encore, induites au niveau des cellules de la moelle osseuse des souris(rongeurs), par un agent mutagène. Ces aberrations sont détectables, sous microscope optique à la division en bloquant les cellules en métaphase avec la colchicine (inhibiteur du fuseau) (Sierra et Gaivão, 2014). Cet examen se fait au cours de la métaphase de la mitose. La fréquence des aberrations est évaluée sur 200 mitoses par lames de microscope.
L’augmentation de la fréquence des aberrations chromosomiques est prédictive de la sur venue de cancers (Bonassi, 1995 ; Hagmar, 1998) parmi ces agents génotoxiques, on note les moutardes azotées dont l’utilité clinique est affectée par leurs effets secondaires incluant le cancer secondaire (Eder et al., 1990).C’est pourquoi la recherche scientifique s’est orientée vers la recherche des molécules actives, à effet thérapeutique à partir des plantes par exemples pour remplacer ces traitements toxiques.
I-2-4-Test de comète
I-2-4-1-Définition et historique
Le test des Comètes ou «Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) Assay» visiblement, très simple, peu couteuse et ne nécessitant pas d'équipement sophistiqué et coûteux, a été le plus largement adapté et utilisé (Osipov et al., 2014).Test d’altérations primaires de l’ADN, en situation alcaline, est défini comme une nouvelle technique micro-électrophorétique rapide, simple et sensible (Ostling et Johanson, 1984), qui permet d'évaluer in vitro et in vivo les cassures d'ADN simple et double-brin et les sites alcali-labiles sur des cellules eucaryotes individualisées (McKelvey-Martin et al.,1993). Ce test permet d'établir la relation dose-effet (Wilkening et al.,2003). Il permet de mettre en évidence les propriétés clastogènes de certains produits génotoxique directement ou indirectement, lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de défragmentation de l'ADN, tels que l’apoptose (Sierra et Gaivão, 2014). Mais ne peut en aucun cas détecter des mutations. Il peut permettre, dans des conditions particulières, d'évaluer les capacités de réparation cellulaire (Tice et al., 2000).
L’idée originale de ce test revient à Rydberg et Johanson en 1978. Ils furent les premiers à quantifier les dommages à I'ADN dans des cellules isolées de mammifères incluses dans de l’agarose sur lame de microscope. Après lyse de ces cellules en conditions alcalines, permettant le déroulement partiel de la chromatine, et marquages à l'acridine orange, la mesure du rapport fluorescence verte / fluorescence rouge, traduisant le rapport entre les molécules d'ADN double-brin et simple-brin, apportait une information sur l’intégrité du génome et la mesure du degré de dommages à l'ADN. Plus tard, Ostling et Johanson (1984) apportèrent quelques modifications et donnèrent à l’essai son nom de test des comètes. Ils ajoutèrent au protocole une brève étape d'électrophorèse en conditions neutres et optèrent pour une coloration au bromure d'éthidium. Mais cette technique ne permettait que la détection des cassures double-brin (Schwartz et Cantor, 1984).
Il fallut attendre l’introduction d'une électrophorèse en conditions alcalines par Singh et al.
(1988) pour pouvoir détecter les cassures simple-brin ainsi que les sites alcali-labiles. Cette version du test des comètes a remporté depuis un vif succès et ses applications se sont répandues à de nombreux types cellulaires. Les différentes étapes du protocole expérimental sont illustrées sur la figure 4 ci-dessous.
Figure 4 : Principales étapes du test des comètes (Rojas et al., 1999).
I-2-4-2-Nature des dommages mis en évidence On a d’une part les lésions générales d’ADN :
Il y a tout d’abord les adduits encombrants qui correspondent à l’entité chimique résultant de l’établissement d’une liaison covalente entre une molécule chimique électrophile et un site nucléophile d’une base de l’ADN. Les micro-adduits sont ainsi formés par l’alkylation d’une base azotée de l’ADN. Par ailleurs des lésions oxydatives de l’ADN peuvent être générées lors de l’attaque des bases de l’ADN par les espèces réactives de l’oxygène. On peut aussi assister à la formation de sites AP : sites apuriniques ou sites apyrimidiques, sous l'effet des agents alkylants par exemple. Des pertes ou des insertions ou les modifications d’une ou plusieurs bases de l’ADN peut aussi survenir. D’autres types de lésions sont possibles mais apparaissent moins fréquemment lors de l’exposition à des génotoxiques chimiques. Il s’agit des pontages intra ou inter-brins qui correspondent à des liaisons covalentes anormales établies entre les bases de l’ADN. Ou cassures simples et doubles brins générées essentiellement par les rayonnements ionisants (Zeithaml et al., 1990).
Les dommages directs détectés par le test de la comète :
La conduite des étapes de déroulement de l'ADN et d'électrophorèse à certain pH, dans le test des comètes permet la détection différentielle (Horvathova et al., 1998; Menke et al., 2001; Wozniak et Blasiak, 2003)
- des cassures double-brin à pH < 9,0
- des cassures simples et double-brin du fait de la dénaturation des liaisons Hydrogène de la double hélice d’ADN à pH < 12,1
- des cassures simple et double-brin et d'une majorité de sites alcali labiles à pH>13.
Une cellule subit, à tout moment, des agressions physiques et chimiques d'origine exogène. L'ADN en est la cible privilégiée. La fixation covalente d'un produit au niveau de l'ADN peut provoquer des lésions ou des mésappariements à l'origine de modifications de sa structure. Les altérations possibles de l'ADN provoquées par les facteurs exogènes sont multiples et diverses.
a- Les cassures simples et double-brin -Les cassures simple-brin
Il s'agit d'une cassure sur un des deux brins du squelette phosphodiester de l'ADN. Il existe un grand nombre d'agents (exogènes) capables de rompre les liaisons phosphodiesters. Parmi eux on trouve des agents chimiques comme les peroxydes ou encore certains ions métalliques (Fe+2, Cu+2).Les radiations ionisantes produisent également des cassures, par l'action d'électrons secondaires, par l'ionisation de l'eau et la production de radicaux libres oxygénés qui sont capables d'attaquer ces liaisons (Freifelder, 1990).Les cassures simple-brin surviennent également et même fréquemment au cours de processus endogènes. Elles sont le résultat de nombreuses réactions différentes, telles que par exemple:
*la réparation par l'excision de bases ou de nucléotides,
*l'action d’endonucléases ou de la topoisomérase I.
Les cassures simple-brin sont considérées comme des lésions réparables étant donné que le brin opposé de la double hélice maintient les deux extrémités du brin cassé proches. Les cassures simple-brin sont le plus souvent réparées par l'action de l'ADN ligase. Certaines de ces cassures peuvent être réparées rapidement parce qu'elles représentent de simples discontinuités (entre un 5'- phosphate et un 3' -hydroxyl) dans le squelette phosphodiester de l'ADN .En revanche, d'autres cassures sur un 3'-phosphate nécessitent comme première étape de réparation une déphosphorylation (Eastman et Barry, 1992).
- Les cassures double-brin
Elles sont définies comme la présence de deux cassures, chacune sur un brin opposé du double hélice, localisées soit en opposition soit proche l'une de l'autre, entraînant la rupture de la double hélice. Si une molécule d'ADN comporte un nombre important de cassures simple-brin, elles peuvent se situer de façon suffisamment proche pour former une cassure double-brin.
Des cassures double-brin peuvent être produites lors de divers processus endogènes physiologiques, tels que la transcription, la recombinaison, la réplication, certains types de réparation de l'ADN, ou l'apoptose. Les facteurs exogènes responsables les plus courants sont les radiations ionisantes, les inhibiteurs de la topoisomérase II, les xénobiotiques générant des radicaux libres ou oxygénés.
Une cassure double-brin de l'ADN est une lésion qui peut conduire à une perte importante d'informations pour la cellule, à cause de la discontinuité physique du chromosome qui en résulte.
Une non-réparation ou une réparation fautive d'une cassure double-brin conduira à une aberration chromosomique, à une mortalité cellulaire ou à une transformation oncogénique (Eastman et Barry, 1992).
b- Les sites alcali-labiles
Les cassures ne sont pas toutes induites directement, certains sites fragilisés peuvent être transformés en cassure de brin lors du traitement de l'ADN avec des solutions très alcalines (pH>13). Ces sites peuvent être formés par les agents alkylants. En effet ces derniers forment des liaisons sur les sites nucléophiles de l'ADN, illustrés figure 5.
Figure 5 : Sites d'alkylation des bases de l'ADN (Friedberg, 2005).
Les agents alkylants vont ainsi affaiblir la liaison N-glycosidique, ce qui va conduire à la dépurination ou à la dépyrimidination spontanée, formant des sites apuriques ou apyrimidiniques encore appelés sites AP figure 6 :
Figure 6: Exemple d'un site AP (Friedberg, 2005).
Ces sites AP peuvent également résulter de l'excision de certaines bases endommagées initiée par une ADN-glycosylase spécifique (Friedberg et al., 1995). Notons que ces sites alcali- labiles sont stables jusqu'à des pH de 12,5(Eastman et Barry, 1992). Au-delà, les sites AP sont hydroxylés par une réaction de p-élimination produisant un clivage de la liaison phosphodiester et donc une cassure de brin.
Outre les cassures de brins et les sites alcali-labiles, cette technique permet la détection indirecte des lésions telles que les adduits ou les ponts intra-brins, parce qu'ils ralentissent la migration de l'ADN dans le champ électrophorétique (Pfuhler et Wol, 1996 ; Horvathova el al., 1998) ou via l’intervention des systèmes de réparation par excision-resynthèse (Speit et Hartmann,1995). Théoriquement le test des comètes peut mettre en évidence l'action des radiations, des mutagènes directs, des pro-mutagènes des agents alkylants, des intercalant et des dommages oxydatifs. En 1998, plus de 212 produits avaient été testés sur différents types cellulaires (Anderson et al., 1998). Cet essai permet également de détecter les processus apoptotiques qui se traduisent par des coupures régulières à chaque nucléosome de l’ADN nucléaire (Olive et al., 1993 ; Steinert, 1996).
Dans le cas de l'apoptose les comètes formées sont alors atypiques et caractéristiques quelquefois qualifiées de cellules <<fantômes> ou cellules < hérissons>Des travaux récents contestent cependant que ces observations correspondent à des cellules apoptotiques (Rundell et al., 2003 ; Meintières el al., 2003).
I- 2-4-3- Le principe général de test de comète
A l'état normal, une molécule d'ADN située dans le noyau se présente sous une forme super- enroulée. Une cassure provoque la rupture du brin d'ADN; cela entraîne un relâchement de cette structure en double hélice. Sous l'effet d'un champ électrique faible, les fragments d'ADN, plus légers et surtout chargés négativement, vont migrer vers l'anode (Tice et al., 2000).
Le protocole suit les étapes : a- Les cellules
Toute cellule eucaryote peut être employée pour la réalisation du test des Comètes à condition d'obtenir une suspension homogène de cellules bien individualisées avec une viabilité acceptable, i.e.>60% (Fairbairn, 1994).
La préparation de la suspension cellulaire à partir d'une culture (in vitro) ou d'un organisme (in vivo), constitue la première étape du test; Elle peut se révéler très délicate, car elle constitue la base du test et conditionne son bon déroulement. Il est indispensable de manipuler les cellules avec d'extrêmes précautions, afin de ne pas engendrer de lésions supplémentaires non spécifiques de l'ADN. C'est pour cette raison en particulier que certaines étapes du test se déroulent à l'obscurité, la lumière naturelle (les rayons UV en particulier) pouvant induire des lésions alcali-labiles supplémentaires (Tice et al., 2000 ; Hartmann et al., 2003 ).
En ce qui concerne le traitement ou l'exposition par les substances à étudier, le principe consiste à : Pour le protocole in vivo : exposer l'organisme vivant à la substance à tester, récupérer les tissus et/ou les échantillons biologiques d'intérêt et d'en isoler les cellules. La technique d'isolement cellulaire doit permettre de récupérer un nombre suffisant de cellules (> 1.105) viables (Anderson et al., 1998).
b- La préparation des lames
Le principe du test des Comètes consiste à inclure la suspension de cellules individualisées ainsi obtenue dans un gel d'agarose à bas point de fusion (37 ᵒC), l'ensemble étant déposé sur des lames de microscopie la suspension cellulaire ainsi obtenue dans un gel d'agarose à bas point de fusion (37 ᵒC), l'ensemble étant déposé sur des lames de microscopie. Ce mélange cellules-agarose est inclus « en sandwich» entre deux autres couches de gel d'agarose
La préparation des lames et surtout celle des agaroses (à bonne concentration) constitue également une étape importante et délicate du test.
c- La lyse
Lorsqu'une cellule est soumise à une solution de lyse contenant un détergent, non ionique ou ionique, et contenant des sels en concentration élevée, le détergent rendra la cellule perméable en dissociant la double couche de phospholipides membranaires, tandis que la solution saline
dissociera les histones de l'ADN soit plus de 95% des protéines nucléaires (Fairbairn et al., 1995).En effet la chromatine se dissocie en présence de solutions salines à concentrations élevées.
Notons que la solution de lyse ne doit en aucun cas endommager le gel d'agarose.
Un antioxydant, le diméthylsulfoxyde (DMSO) sera ajouté à 10 % pour prévenir la formation des radicaux oxygénés pouvant provenir de l'hémoglobine libérée par les érythrocytes éventuellement présents dans le(s) tissu(s) (Tice et al., 2000). De cette façon, bien que la plupart des auteurs préconisent une durée d'une heure, temps minimum pour lyser la membrane cytoplasmique, la lyse pourrait être prolongée pendant des mois sans provoquer de lésions supplémentaires.
Lors de cette étape, les membranes cellulaires, nucléaires, et les protéines liées à l'ADN sont éliminées. En revanche, à ce stade du protocole la structure de l'ADN persiste sous forme super- enroulée, malgré l'absence de la membrane du noyau et l'élimination des histones, et ce du fait de la présence de la matrice nucléaire.
d- La dénaturation
Cette étape permet alors le relâchement de la molécule d'ADN suivi par son déroulement et par la dénaturation de l'ADN double-brin, c'est-à-dire la séparation des deux brins; l'ADN devient alors simple-brin ou monocaténaire.
L'augmentation de pH est un agent dénaturant car il modifie les charges portées par les groupements chimiques engagés dans les liaisons hydrogènes qui maintiennent la structure en double hélice. Le déroulement se produit au niveau des extrémités de la molécule d'ADN mais aussi au niveau des cassures simple-brin. Notons à ce sujet que si l'ADN super-enroulée présente une cassure simple-brin, il en résulte un relâchement de la double hélice super-enroulée. Ainsi une molécule d'ADN portant une cassure est beaucoup moins compacte.
En conclusion, la réalisation de cette étape permettra la mise en évidence des cassures simple et double-brin et des sites alcali-labiles (Miyamae et al., 1997).
e- L'électrophorèse
L'ADN chargé négativement, soumis à un champ électrique, va migrer vers l'anode. Les fragments d'ADN beaucoup plus légers seront entraînés plus loin, formant ainsi une traînée, la queue de la comète.
L'électrophorèse est, comme la dénaturation, réalisée à pH alcalin (pH > 13), pendant 20 minutes, à 25 V et 300 mA. Ainsi les fragments d'ADN vont migrer dans le gel selon leur taille.
*Selon Singh (Singh et al., 1991), la tension utilisée doit être la plus faible possible permettant de faire migrer des molécules d'ADN de poids moléculaire élevé.
*Tice (Tice et al., 2000) recommande une réalisation à + 4ᵒC pour garantir une bonne reproductibilité.
*Speit (Speit et al., 1995) montre que la température de l'électrophorèse est un paramètre majeur et peut engendrer d'importantes variabilités dans les résultats.
f- La neutralisation
Après l'électrophorèse, il est recommandé de rincer les lames dans un tampon à pH=7,4. Cette étape a pour but de neutraliser la solution alcaline présente dans le gel et d'éliminer les sels et les détergents qui entraîneraient lors de la lecture un bruit de fond important (Singh, 1996).
g- La coloration
Les lames peuvent être lues en l'état immédiatement, une fixation à l'alcool permet de les conserver à température ambiante et à l'abri de la lumière (Klaude et al., 1996 ; Woods et al., 1999).
La fixation a pour but de déshydrater les lames, afin de permettre une conservation plus longue, évitant ainsi la diffusion de l'ADN à travers la matrice du gel d'agarose au fil du temps. La coloration est réalisée par un fluorochromes. Les agents les plus utilisés et décrits dans la littérature sont le BET (Ostling et Johanson, 1984, Singh et al, 1988), IP (Olive et al, 1991).Mais, dans notre étude les comètes à ADN peuvent être efficacement colorées avec un colorant Giemsa peu coûteux et polyvalent (solution d’azur-éosine-méthylène) largement utilisé dans de nombreuses applications cytochimiques et histochimiques. La sensibilité de la coloration de Giemsa pour le test des comètes était suffisante non seulement pour la visualisation des comètes, mais également pour l'imagerie et l'analyse par un logiciel de test de comète spécifique. Les complexes consistaient en deux molécules d'éosine Y et une molécule d'azur B intercalées dans la structure en double hélice de l'ADN (Osipov et al., 2014).
h- L'analyse des lésions
L'analyse des lésions de l'ADN se fait alors sous un microscope à fluorescence, reliée à un système informatique d'analyse d'image.
Les fragments sont alors mesurés quantitativement. Cette analyse est semi-automatique: les cellules sont sélectionnées une à une en balayant la lame sous le microscope.
I-2-4-4- Les Applications du test de la comète
Le test des Comètes s'est largement développé ces dernières années. Permettant une détection au niveau des cellules individualisées, il est reconnu comme un test sensible pour mesurer de faibles dommages d'ADN, nécessitant peu de cellules, de faible coût, flexible et rapide. Il est alors utilisé pour de nombreuses applications (Anderson et al., 1998).
a- Toxicologie génétique
Durant ces dernières années, le test des comètes a été utilisé comme test de mutagenèse pour évaluer les dommages à l'ADN induits par des agents génotoxiques. Les altérations primaires de l'ADN constituent des lésions qui, si elles ne sont pas réparées, donneront naissance à des mutations.
D'un point de vue réglementaire, une batterie de trois tests est préconisée pour évaluer le potentiel mutagène des produits à usage pharmaceutique (ICH S2B) :
Un test de mise en évidence de l'induction de mutation dans un système bactérien: le test d'Ames.
Un test in vitro d'évaluation de dommages chromosomiques: MLA ou «Mouse Lymphoma Assay» sur cellules L5178Y au locus TK ou un test d'aberrations chromosomiques in vitro sur culture de cellules
Un test de mise en évidence de l'induction de lésions chromosomiques in vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur. (Fairbairn et al., 1995)
En cas de résultat positif dans un ou plusieurs tests de cette batterie, des études complémentaires peuvent être exigées, comme le test de la synthèse non programmée de l'ADN (encore appelé test UDS pour Unscheduled DNA Synthesis).Dans ce cas le test des comètes
pourra être utilisé, afin de confirmer un résultat douteux. De plus il permettra «d'affiner» l'étude in vivo: des études complémentaires pourront être effectuées sur les organes cibles grâce à ce test.
Enfin, le test peut être appliqué in vitro en micro culture sur une grande variété de cellules, comme par exemple les lymphocytes humains, les cellules de lymphomes de souris, les cellules CHO, des cultures primaires d'hépatocytes de rongeur.
Cette dernière application du test peut être utilisée comme un screening primaire permettant l'évaluation précoce (nécessitant une faible quantité de produit) et rapide du potentiel génotoxique des composés (Hartmann et al., 2001 ;Kiskinis et al., 2002).
b- Fulidémiologie/ Biomonitoring environnemental
Une autre application possible du test se trouve dans le domaine de l'épidémiologie.
L'évaluation des lésions de l'ADN peut être effectuée sur des cellules isolées d'individus exposés professionnellement, cliniquement ou environnementalement (Collins et al., 1997). Le principal avantage est qu'une analyse peut être conduite sur quelques microlitres de sang (étude réalisée sur lymphocytes), ou plus rarement sur un échantillon de tissu obtenu par biopsie à l'aide d'une fine aiguille. Ce type d'étude utilise le test des Comètes comme outil de
travailleurs agricoles à des pesticides (Piperakis et al., 2003 ; Grover et al., 2003), l'exposition aux radiations ionisantes (Paz-y-mino et al., 2002 ; Garaj-Vrhovac et Kopjar, 2003),également l'effet du rayonnement solaire (Zennouche, N ,2003), l'évaluation des lésions de l'ADN chez des fumeurs versus des individus non-fumeurs (Hininger et al., 2004).
c- Ecotoxicologue
Le test des Comètes est utilisé comme approche pour évaluer les conséquences possibles de polluants sur l'environnement. Les études menées montrent que les applications potentielles de ce test sont quasiment illimitées, tout organisme pouvant être utilisé: des rongeurs, des vers de terre, des poissons (Rajaguru et al., 2003 ;Avishai et al., 2003 ; Akcha et al., 2003). De même, l'impact de la pollution sur les végétaux pourrait être apprécié.
I-2-4-5-Avantages et limites de test de comète
Les avantages et les inconvénients du test de a comète sont présenté dans le tableau I ci- dessous :
Tableau I : Principaux avantages et inconvénients du test des comètes pour l'étude des dommages à I'ADN (d'après McKelvey-Martin et al., 1993)
*Principaux avantages *Principaux inconvénients
1-Test de comète est un test rapide, simple et peu couteux
1-Le principal inconvénient du test de la comète est que, dans les conditions d’application présente, il ne permet pas la détection des agents pontants.
2-ces domaines d’applications sont nombreux 2-Il n’existe pas de protocole standard 3-Il permet de collecter de nombreuses données, sur
nombreuse cellules individualiser ce qui permet une meilleure analyse statistique
3-Il n’y a pas de recommandation pour l’analyse des résultats
4- Approche cellule par cellule 4-Il n’existe pas encore d’étude collaborative de grande ampleur
5-Applicable à toute cellule nucléé humain, animal (y compris invertébrés) ou même végétal. (Fairbairn, 1994).
Autre :
1-Informations sur des cellules isolées
2-Niveau de bruit de fond généralement élevé chez les organismes exposés in situ.
3-Outil qui ne recherche pas les aspects fondamentaux des dommages à I'ADN ni la réponse de la cellule à ces dommages
4-Nécessité de travailler sur une suspension cellulaire et la digestion enzymatique (trypsine) des tissus ou la récupération des cellules en culture par grattage (scraping) peuvent provoquer des dommages supplémentaires (Singh et al., 1991 ; Birmelin et al., 1998)
5-Ils sont notamment d’interprétation délicate, ce qui se traduit par exemple par des résultats qui peuvent Varier d’un laboratoire à l’autre. Ils ne sont pas facilement adaptables à de grandes séries d’échantillons.
6- pas de mise en culture ou en incubation des cellules nécessaires eues préalable
7-Nécessite peu de cellules (de 20000 à 50000Cellules)
8- Très sensible: seuils de sensibilité avancés :
-1000 cassures par noyau soit le taux de dommages induits par une dose de50 Grays de rayons X (Singh et al., 1991)
-100 cassures par noyau (Collins et al., 1997) -200cassures par noyau (Rojas et al., 1999) -0,1 cassure pour l0daltons (Gedik et al., 1992) -1 cassure pour 10 daltons (Collins et al., 1997)
9- Détection des cassures simple et double-brin et des sites alcali –labiles
10- Détection des effets des radiations des mutagènes directs, des promutagènes des agents alkylants, intercalant, des dommages oxydatifs, de l'apoptose (Olive et al., 1993) et des mécanismes de réparation par excision resynthèse (Speit et Hartmann, 1995)
II- Génotoxicité du Benzo [a] pyrene et de Cyclophosphamide II-1- Le Benzo[a]pyrène
II-1-1-Définition
Le B[a]P fait partie de la classe des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs). Ces derniers comprennent deux ou plusieurs noyaux aromatiques unis, où des noyaux adjacents partagent deux ou plusieurs atomes de carbone (Figure 07). Le B[a]P est un composé chimique solide qui a un poids moléculaire de 252.32 g/mol, une solubilité (Log P) égale à 6 et un point de fusion de 179°C; il est soluble dans les solvants organiques, cependant sa solubilité dans l'eau est faible (0,2 à 6,1 mg/L). Il est constitué de deux régions qui sont des sites de réactions chimiques (Miller et al., 2001). La région k est la région comprise entre le quatrième et cinquième carbone.
Cette région est une zone de grande densité électronique et de haute activité métabolique. La région baie est la région comprise entre le neuvième et le douzième carbone. Elle est considérée comme étant très réactive. La biotransformation du B[a]P génère des métabolites qui sont impliqués dans la génotoxicité. Il est classé dans le groupe 1 (cancérigène) par l'Agence Internationale pour la Recherche sur Cancer (IARC, 1983)
Figure 7 : Structure moléculaire du Benzo[a]pyrène (tiré de Miller et al., 2001).
II-1-2-Exposition au B[a]P
Le B[a]P est généré lors la combustion de la matière organique. Ainsi, on le retrouve dans la suie et les fumées de toutes origines (gaz d'échappements, fumée de cigarette etc.) (Bisson et al., 2006). À 300ᵒC et 600ᵒC, il est, un produit de combustion incomplète. Les sources d'exposition peuvent être environnementales ou professionnelles.
