Caractérisation et différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse équine et du sang de cordon ombilical pour des applications en ingénierie du cartilage

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Submitted on 23 Sep 2019

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Caractérisation et différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse équine et

du sang de cordon ombilical pour des applications en ingénierie du cartilage

Thomas Branly, Mélanie Desancé, Lelia Bertoni, Romain Contentin, Rodolphe Rakic, Miranda Concari, Florence Legendre, Sandrine Jacquet, Fabrice

Audigié, Jean-Marie Denoix, et al.

To cite this version:

Thomas Branly, Mélanie Desancé, Lelia Bertoni, Romain Contentin, Rodolphe Rakic, et al.. Carac-

térisation et différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse équine

et du sang de cordon ombilical pour des applications en ingénierie du cartilage. AVEF, 2017, Paris,

France. �hal-02294586�

Glycosamino -glycanes

Perfectibles !

Caractérisation et différenciation des cellules souches

mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse équine et du sang de cordon ombilical pour des applications en ingénierie du

cartilage

Thomas Branly ^1,† , Mélanie Desancé ^1,† , Lélia Bertoni ² , Romain Contentin ¹ , Rodolphe Rakic ¹ , Miranda Concari ¹ , Florence Legendre ¹ , Sandrine Jacquet ² , Fabrice Audigié ² , Jean-Marie Denoix ² , Magali Demoor ¹ & Philippe Galéra ¹ .

1. Unité BioTARGen, équipe OErAGen EA 7450, UFR Santé, Université de Caen Normandie, 14032 Caen, France.

2. Centre d’Imagerie et de Recherche sur les Affections Locomotrices Equine (CIRALE), Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Université Paris-Est, 14430 Goustranville, France.

† Contribution équivalente

Articulation arthrosique Articulation normale

• Antalgiques simples

• Anti-inflammatoires : AINS, AIS

• Chondroprotecteurs

• Sérum autologue

Débridement Micro-fracture Mosaïque-plastie Traitements

pharmacologiques

Traitements Chirurgicaux

* BMP-2 et TGF-β

₁

favorisent la différenciation des CSM et la synthèse des molécules matricielles

Le siRNA permet d’empêcher la production de collagène de type I

Prise en charge actuelle

Vers la thérapie cellulaire

Collagène de type I HtrA1

Collagène de type II Agrécane

Prélèvement

Isolement et caractérisation de

CSM

Ensemencement des cellules en 3D

Incubation de 14 jours en présence de facteurs chondrogéniques*, en

hypoxie

Implantation du substitut cartilagineux

hétérologue

Formation de cartilage

Isolement et caractérisation de CSM équines

CD29+

CD44+

CD73+

CD90+

CD105+

CD45- CMH de

type II-

Isolement Caractérisation

Adipocytes Chondrocytes Ostéoblastes

T aux de doubl ement

(1) Forte prolifération :

Passage

(2) Panel de marqueurs de surface :

(couleurs=répétitions de l’expérience)

2) Expression de marqueurs de surface caractéristiques

1) Capacités prolifératives

3) Capacités de différenciation

Critères requis pour caractériser les CSM

Caractérisation des cellules isolées

(3) Multipotence :

Différenciation des CSM en chondrocytes : transposition de la stratégie établie chez l’Homme

Transfection par des siRNAs

Col1a1 Cellules

souches

BMP-2 TGF-β1

ICM +/- Facteurs de

croissance

Hypoxie 14 jours

ARNm (RT-qPCR)

Protéines

matricielles et HtrA1 (Western-blot)

Stratégie de différenciation des CSM en chondrocytes

Col2a1 Col1a1 Col2a1/Col1a1

Ex pres s ion relat iv e des niv eaux d’AR N m

Col1a1 mRNA Col1a1

Expr es s ion rela ti v e du ni veau d’ ARNm

Milieu contrôle

Milieu de différenciation

Di fférenci ati on os téobl as ti que Di fférenci ati on adi pogéni que Di fférenci ati on c hondroc y tai re

Prélèvement de moelle osseuse (MO) ou de sang de

cordon ombilical (SCO)

1) Centrifugation sur un gradient de densité

2) Ensemencement des cellules de l’interphase

3) Les cellules souches adhèrent au plastique et

forment des colonies

4) Doublement des cellules

Caractérisation des CSM putatives

0nM siRNA

ctrl

50nM siRNA ctrl

50nM siRNA col1a1

Cartilage humain

Cartilage équin

D0 : jour 0, avant induction de la différenciation; EAC : chondrocytes articulaires équins; ICM : « Incomplete Chondrogenic Medium »; B+T : BMP-2+TGF-β

₁

La stratégie de différenciation des CSM de MO et de SCO équines a permis l’induction d’une forte synthèse du collagène de type II et de limiter l’expression de HtrA1. Pour les CSM de MO, la stratégie d’interférence par l’ARN a entraîné la diminution de l’expression du collagène de type I, atypique d’un cartilage hyalin, inhérente à l’utilisation de la BMP-2 et du TGF-β ₁ . Au contraire, le siRNA utilisé lors de cette étude n’est pas efficace sur les CSM de SCO (résultats non présentés). Nous avons donc réalisé des études ultérieures afin de déterminer une stratégie qui permet de mieux limiter la synthèse du collagène de type I. Néanmoins, la stratégie combinatoire BMP-2 et TGF-β ₁ associée à une culture hypoxique en 3 dimensions et en présence de siRNA ciblant le collagène type I constitue une stratégie de différenciation pertinente pour différencier des CSM équines en chondrocytes. Au-delà de leur capacité de différenciation, les capacités sécrétoires des CSM et leur potentiel immunomodulateur leur confèrent un intérêt pour les affections ostéoarticulaires. Des essais précliniques dans le modèle équin sont essentiels pour juger de l’intérêt : 1) du substitut cartilagineux produit par notre stratégie et 2) d’une utilisation directe des CSM dans le traitement de lésions chondrales. Nous avons d’ores et déjà obtenu des résultats préliminaires.

Conclusion

0nM siRNA

ctrl

50nM siRNA ctrl

50nM siRNA col1a1

Acan

Introduction

Et le modèle équin

1 ^{Col2a1 Col1a1} Col2a1/Col1a1 Acan

CSM de MO CSM de SCO

250 130

pro pC Mature

Collagène de type II

250 130

Collagène de type I

55 β-tubuline

pN

pro Mature

Collagène de type II

pC/pN

Collagène de type I

HtrA1 β-tubuline

220 110

220 110

55 55 D0 B+T D0 B+T

EAC

D0 C B+T C B+T C B+T

SCO MO

2

3 4

CMH de type II

CD 29

CD 44

CD 73

CD 90 CD 45

CD 105

1

2 3

(1) Au niveau des ARNm

Collagène de type II ; agrécane (marqueurs du cartilage hyalin)

Collagène de type I ; (molécules associées au fibrocartilage) Ratio collagène de type II / collagène de type I

B+T : Collagène de type II ; (SCO ++) Collagène de type I ; (SCO ++) (2) Au niveau des protéines

B+T :

(3) Au niveau des ARNm

siRNA Col1a1 : Collagène de type I des CSM de MO

(4) Au niveau des protéines

siRNA Col1a1 : Collagène de type I des CSM de MO

B+T : HtrA1

Résultats préliminaires

1) Immunohistochimie des substituts

cartilagineux à l’issue de leur implantation chez des animaux présentant une arthrose induite

Bleu de Toluidine Anticorps anti- collagène de type II Bleu de Toluidine

 Coloration et marquage positifs

 Fusion du substitut cartilagineux au cartilage sous-jacent

 L’expression du collagène n’est pas homogène

Résultats prometteurs

2) Imagerie de l’évolution d’une articulation arthrosique en fonction d’une injection intra-

articulaire de CSM ou non

Signes d’arthropathie

Aucun signe d’arthropathie Inflammation

Remodelage osseux

Amplification

Tests bactériologiques et virologiques

Dépôts calciques

Gouttelettes lipidiques

CSM Plac ébo Evaluation de la qualité du

substitut cartilagineux obtenu Biomatériau

ICM + BMP-2 + TGF-β1

ICM