Caractérisation des forces cohésives mises en jeu entre micelles de caséines en milieu concentré

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Caractérisation des forces cohésives mises en jeu entre micelles de caséines en milieu concentré

Wenjiao Shao

To cite this version:

Wenjiao Shao. Caractérisation des forces cohésives mises en jeu entre micelles de caséines en milieu concentré. 2011, 30 p. �hal-01454146�

Agrocampus Ouest Département Agroalimentaire

65 rue de Saint Brieuc CS 84215 35042 Rennes Cedex

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Département Agroalimentaire 65 rue de Saint Brieuc

CS 84215 35042 Rennes Cedex

Tél : 02 23 48 53 22

Mémoire de Fin d'Etudes

(Février-Août 2011)

Master professionnel

Master Alimentation, Lait, Innovation, Management (ALIM)

Option : INDUSTRIE et ECONOMIE LAITIERES (IEL)

Caractérisation des forces cohésives mises en jeu entre micelles de caséines en milieu concentré

Par : Mlle SHAO Wenjiao

Devant le jury : Soutenu : le 08/09/2011

Maîtres de stage : Geneviève GESAN-GUIZIOU, Antoine BOUCHOUX, Peng QU Enseignant responsable : Romain JEANTET

Tuteur scientifique : Romain JEANTET, Tomas CROGUENNEC

"Les analyses et les conclusions de ce travail d'étudiant n'engagent que la responsabilité de son auteur et non celle d’Agrocampus Ouest".

1 Remerciements

Ce stage de master 2 a été réalisé à l’Unité Mixte de Recherche Science et Technologie du Lait et de l’Œuf (UMR STLO) de l’INRA de Rennes, dans l’équipe « Transfert et Interactions dans les Procédés de l'Industrie Laitière (TIPIL) ».

Le bon déroulement de mon stage a été rendu possible grâce à l’aide apportée par les nombreuses personnes présentes au laboratoire. Pour manifester ma gratitude, je voudrais remercier d’une façon particulière :

- la directrice de l’UMR STLO Sylvie LORTAL pour l’opportunité qu’elle m’a offerte de réaliser ce stage dans le laboratoire.

- mes maitres de stage Geneviève GESAN-GUIZIOU et Antoine BOUCHOUX, pour leur accueil, leur confiance et leur franche collaboration qui m’ont permis de réaliser ce stage de recherche, pour leur conseils utiles quant à la conduite du travail,

- Peng QU pour ses conseils francs et Fabienne LAMBROUIN pour son aide technique, - Mme Arlette LOUBEYRE qui m’a conseillé pour le choix de ce stage,

- Un merci sans égal à mes parents pour leurs supports à tous les moments dans ma vie en France : sans vous rien n’était possible,

Enfin, je souhaiterais dire un grand merci à toute l’équipe TIPIL pour son support et je voudrais exprimer toute ma reconnaissance à l’ensemble du personnel du laboratoire STLO, qui de près ou de loin, a contribué à la réussite de ce stage.

2

SOMMAIRE

1. Introduction et objectifs ... 4

2. Eléments bibliographiques ... 3

2.1 La micelle de caséine... 7

2.1.1 La micelle native ... 7

2.1.2 La micelle réticulée par la transglutaminase... 7

2.2 Interactions entre micelles de caséine en fonction de la concentration...11

2.3 Influence des différentes conditions physico-chimiques sur les interactions protéiques en générale et sur les interactions inter- et intra-micellaires dans le cas de la micelle de caséine... 6

3. Matériels et Méthodes... 9

3.1 Protocole opératoire ... 9

3.1.1 Préparation de dispersions modèles de micelles natives et réticulées... 9

3.1.1.1 Poudre de PPCN (PhosphoCaséinate Natif) ... 9

3.1.1.2 Perméat d’ultrafiltration (UF) ...10

3.1.1.3 Redissolution de la dispersion modèle de micelles de caséine...10

3.1.1.4 Préparation des dispersions modèles de micelles de caséine réticulées...10

3.1.2 Fabrication de gel de micelles de caséine par ultracentrifugation ...22

3.1.3 Evaluation de l’irréversibilité des gels de micelles obtenus...25

3.1.4 Récapitulatif des conditions physico-chimiques testées ...27

3.1.5 Récapitulatif de la démarche et des échantillons prélevés ...27

3.2 Méthodes analytiques et calculs de concentration ...28

3.2.1 Mesure de taille des particules ...28

3.2.2 Gels d’électrophorèse ...30

3.2.3 Mesure de turbidité des dispersions colloïdales...32

3.2.4 Détermination de la concentration en micelle ...33

4. Résultats et discussions ...20

4.1 Gel référence de micelles ‘‘natives’’ dans l’UF à 20°C...20

4.2 Gel référence de micelles réticulées dans l’UF à 20°C ...21

4.3 Effet de calcium ...21

4.3.1 Gel de micelles redispersé dans l’eau distillée (20°C) ...22

4.3.2 Gels de micelles de caséine dans l’EDTA (30 mmol.L^-1,20°C)...22

4.4 Gel de micelles de caséine dans l’urée (6 mol.L^-1, 20°C) ...23

4.5 Gel de micelles de caséine dans l’Eau à pH basique (pH ~ 8.5, 20°C)...25

4.6 Gel de micelles dans l’UF à 6°C, 20°C et 50°C ...52

4.7 Comparaisons des conditions de redispersion ...55

3 5. Conclusion et perspectives...55 6. Références

7. Annexes

8. Abréviations et symboles

4 1. Introduction et objectifs

Le lait, suspension colloïdale constituée majoritairement d’eau (~ 840 g.L^-1), de glucides (~

50 g.L^-1), de lipides (~ 40 g.L^-1), de protéines (~ 35 g.L^-1), de sels minéraux (~ 9 g.L^-1), est un aliment biologique qui tient une place primordiale dans notre régime alimentaire. Les propriétés fonctionnelles et nutritionnelles de ses constituants, et notamment des protéines laitières, sont en effet particulièrement intéressantes et très souvent recherchées par le consommateur.

Le lait est pour une grande part consommé à l’état « transformé », c’est-à-dire sous forme de fromage, crème dessert, yaourt, etc. Parmi les opérations unitaires qui constituent les procédés de transformation du lait, la filtration membranaire (micro- et ultra- filtration principalement) est très largement utilisée. Elle permet notamment de faire la concentration et le fractionnement des constituants du lait, en particulier lors de la transformation fromagère. A l'heure actuelle, la maîtrise des opérations de filtration membranaire est un enjeu majeur pour ceux qui souhaitent exploiter au mieux toutes les caractéristiques des constituants du lait, et notamment des protéines.

D'une manière générale, les performances des opérations de filtration de lait écrémé sont limitées par la formation de couches de matières concentrées à la surface des membranes. Ces couches de matières sont constituées principalement de micelles de caséine. Quand la concentration à la surface de la membrane atteint un niveau "critique", les micelles forment alors un ‘dépôt irréversible’, ou un ‘gel’, qui colmate la membrane et pénalise la filtration [Gésan-Guiziou et al., 1999]. Pour optimiser les performances de filtration du lait, il s’avère donc nécessaire d’approfondir les connaissances sur la nature et la structure de ces couches de matière. Dans des travaux précédents menés au sein de l’UMR STLO Rennes, il a été montré que les mécanismes de structuration des dépôts sont directement liés aux interactions colloïdales entre les micelles de caséine lors de leur concentration à la paroi membranaire [Jimenez-Lopez et al., 2011]. Les résultats préliminaires obtenus par de la thèse de Qu et al.

[2010b] ont montré que la cohésion du gel micellaire est principalement attribuée à des forces cohésives entre les surfaces des micelles.

5 Le but du travail de recherche mené au cours de ce stage est d’identifier et de caractériser les forces cohésives entre les surfaces des micelles en milieu concentré ; forces qui conduisent à l’irréversibilité du ‘‘gel’’. Pour ce faire, notre stratégie consiste à étudier l’irréversibilité d’un gel de micelles (natives et réticulées pour limiter la dégradation de la micelle en figeant l’intérieur de sa structure) dans différentes conditions physico-chimiques.

Ce rapport comprend 3 parties. Une première partie dans laquelle sont brièvement présentés les éléments bibliographiques et les notions utilisées dans ce travail justifiant le positionnement et la démarche mise en œuvre : les micelles de caséine et les interactions entre ces objets. La deuxième partie porte sur les matériels, les méthodes ainsi que les protocoles utilisés au cours de ce stage. Enfin, la troisième partie comprend les résultats obtenus, les conclusions, et les perspectives de cette étude.

6 Figure 1 : Représentation des différents modèles de micelle de caséines. A. Modèle « sous- micelles ». B. Modèle « structure ouverte ». C. modèle « éponge ».

Figure 2 : Réticulation entre une lysine et une glutamine par la transglutaminase.

7 2. Eléments bibliographiques

Sont présentées dans ce chapitre certaines considérations générales sur la micelle de caséine native, la micelle de caséine réticulée par la transglutaminase, et leurs interactions en fonction de la concentration en micelles et des conditions physico-chimiques.

2.1 La micelle de caséine 2.1.1 La micelle native

Les caséines représentent approximativement 80% du total des protéines qu’on trouve dans le lait de vache. Elles sont au nombre de 4 (αs1, αs2, β, κ). Les quatre caséines s’associent avec des minéraux (8% en masse) sous forme d’agrégats globulaires qui sont dénommés les micelles de caséine. Les micelles sont globalement sphériques avec un diamètre variant de 50 nm à 500 nm, est un diamètre moyen approximatif de 200 nm [Horne, 2002]. Les minéraux présents dans la micelle comprennent du phosphore covalent sous forme de P-sérines, un complexe phosphate-citrate de calcium et de magnésium amorphe, et du calcium ionique lié aux caséines par des effets électrostatiques.

Il existe une certaine controverse sur la structure exacte de la micelle de caséine. Il y a historiquement deux modèles : (A) modèle à sous-micelle [Schmidt, 1982] (B) modèle à nanoclusters [Holt, 1992]. Récemment, des nouveaux modèles de structure de micelle sont proposés, (C) en particulier le modèle éponge (Figure 1). Outre les nanoclusters (2-3 nm), la micelle comporterait ainsi des zones plus ou moins compactes dont le comportement est distinct au cours de la compression [Bouchoux et al., 2010]. Quelque soit le modèle considéré, il est communément admis que sur la surface externe de la micelle, les extrémités C-terminales de la caséine κ dépassent de l’ensemble de la structure et confèrent à la micelle une ‘‘chevelure’’ caractéristique; ‘‘brosse’’ responsable des forces de répulsion électro- stériques entre micelles de caséine.

2.1.2 La micelle réticulée par la transglutaminase (TGase)

Récemment, plusieurs auteurs ont utilisé la transglutaminase pour réticuler la micelle [Huppertz et al., 2008 ; Moitzi et al., 2010].

La transglutaminase (TGase) est une enzyme qui existe naturellement chez les mammifères, les microorganismes, les plantes, les poissons. C'est une enzyme (Figure 2) qui catalyse la

8 Figure 3 : Comparaison de turbidité (τ_normalised) d’une dispersion (2.5 g.L^-1) de micelles réticulées en fonction de (A) l’ajout d’urée (0-6 mol.L^-1) et de (B) l’ajout de citrate (0-50 mmol.L^-1) entre des valeurs obtenues expérimentalement (cercle noir) et des valeurs calculées (ligne noir) en négligeant la dissociation des micelles [Huppertz et al., 2007c].

Figure 4 : Influence du pH sur la stabilité à l’éthanol du lait écrémé. Ce lait a été incubé avec 0.05g.L^-1 de TGase à 30 °C après des durées de : 0 h (cercle noir), 2 h (cercle blanc), 4 h (triangle noir), 6 h (triangle blanc), 8 h (carré noir), 24 h (carré blanc), la désactivation a été réalisée à 70 °C pendant 10 min [Huppertz et al., 2007b].

9 formation de liaisons covalentes entre des groupements amines libres (ex. lysines) et le groupement gamma-carboxamide des glutamines [Griffin et al., 2002]. Les caséines sont de très bons substrats pour la transglutaminase [Ikura et al., 1980].

Des études ont été réalisées pour étudier la réticulation sur la micelle par la TGase. Il a été montré que :

- La taille de la micelle de caséine, déterminée par DLS (Dynamic Light Scattering), n’est pas affectée par l’incubation avec la TGase [Huppertz et al., 2008]. La réticulation a lieu exclusivement à l’intérieur de la micelle, et non entre les différentes micelles [Huppertz et al., 2008].

- Des études SANS (Small Angle Neutron Scattering) et SAXS (Small-Angle X-ray Scattering) ont été réalisée ; ce sont des techniques permettant d’élucider la structure des colloïdes [Huppertz et al., 2008]. Et il a été montré que la structure interne de la micelle réticulée est similaire à celle de la micelle native [Huppertz et al., 2008].

Il a également été montré que la réticulation par la TGase à l’intérieur de la micelle de caséine conduit à des micelles de caséine plus stables et plus résistantes face à des agents de dissociation :

- Il a été montré de bonnes corrélations entre les valeurs obtenues expérimentalement de turbidité d’une dispersion (2.5 g.L^-1) de micelles réticulées et les valeurs calculées en négligeant la dissociation des micelles que ce soit avec l’ajout d’urée (0-6 mol.L^-1, Figure 3A) ou l’ajout de citrate (0-50 mmol.L^-1, Figure 3B). Les micelles réticulées sont donc complètement résistantes face à la dissociation respectivement par l’urée et par le citrate [Huppertz et al., 2007c].

La TGase permet donc de rendre la micelle ‘‘indestructible’’.

- Il a été montré que les micelles natives dans le lait, à pH 6.8, se gélifient après 5min de réchauffement à 140°C, par contre les micelles réticulées dans les mêmes conditions se gélifient après environ 25 min. La réticulation des micelles ralentit donc la coagulation sous haute température [Huppertz et al., 2008].

- La stabilité à l’éthanol du lait écrémé (un indicateur de coagulation du lait par l’éthanol, c’est la concentration minimum en éthanol à laquelle la coagulation est observée) augmente progressivement lors de l’augmentation de temps d’incubation avec la TGase (Figure 4). La micelle réticulée est donc plus stable face à la coagulation par l'éthanol [Huppertz et al.,

10 Figure 5 : Pressions osmotiques de dispersions de micelles de caséine : PPCN dans l’UF.

Echelle verticale : pression osmotique, en Pa. Echelle horizontale : concentration en caséine dans le sac de dialyse [Bouchoux et al, 2009].

Figure 6 : Teneur en eau (g d’eau / g de caséine) des gels de micelles de caséine ([Cas] = 400, 550, 800 g.L^-1) obtenus par compression osmotique formés par la compression osmotique en fonction de la concentration en caséine (g.L^-1). Les gels ont été redispersés dans un ultrafiltrat

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0 200 400 600 800 1000

[Cas]_ini (g.L^-1)

water / caseins (g.g)

0h 4h 16

11 2007b].

Une hypothèse proposée par Huppertz et al. pour expliquer ces deux modifications sur la coagulation (gélification après un temps plus long pour les micelles réticulées) est la suivante : la réticulation viendrait former des liaisons qui figent partiellement la ‘‘chevelure’’

de caséines κ à la surface de la micelle. Elle rendrait ainsi les chaines de caséine κ moins flexibles et le collapse de la brosse de caséines κ par l'ajout d'éthanol ou l'augmentation de température serait donc moins importante. Ce dernier point est important à garder en mémoire pour la compréhension des résultats car indique que la TGase vient modifier partiellement les interactions de surface de la micelle, ce qu'il faudrait idéalement éviter dans nos manipulations.

2.2 Interactions entre micelles de caséine en fonction de la concentration

Notre objectif est d’étudier les forces cohésives entre les micelles en milieu concentré. Pour cela, il est nécessaire de connaitre le niveau de concentration en caséine à atteindre pour former un gel et créer des forces cohésives entre les micelles. Bouchoux et al. [2009] ont montré que les interactions entre les micelles dépendent de la concentration en caséine. Trois régimes ont été observés (Figure 5):

i. Régime dilué ([Cas]<150g.L^-1) : les micelles sont bien séparées et il n’y pas d’interaction entre elles.

ii. Régime de transition ([Cas] entre 150g.L^-1 et 200 g.L^-1) : Cette plage de concentration correspond au moment où les micelles commencent à être au contact les unes aux autres.

Dans cette zone, des interactions se créent entre les micelles à travers leur ‘‘chevelures’’

de caséine κ.

iii. Régime concentré ([Cas]>200 g.L^-1) : la dispersion de micelles devient un ‘solide’

cohésif qui ne peut plus complètement se redisperser dans la phase aqueuse, indiquant que des liaisons cohésives sont irréversiblement formées. Dans cette zone, on peut considérer que toutes les micelles sont au contact, elles se déforment et l’eau à l’intérieur des micelles est progressivement éliminée à mesure que la concentration augmente.

Des forces cohésives se forment donc au cours de la concentration de micelles de caséine pour des concentrations > 200 g.L^-1. Une étude récente [Qu et al., 2010a] suggère que ces forces sont essentiellement des forces de surface, i.e., forces entre composés situés à la surface des micelles. En effet, ces auteurs ont mesuré le regonflement (= teneur en eau) de gels concentrés de micelles de caséine (Figure 6) obtenus par compression osmotique ([Cas] = 400, 550, 800

12

13

14 g.L^-1), et redispersé dans un solvant correspondant à la phase aqueuse du lait. Les résultats indiquent que les gels, après 4 et 16 h, reprennent une teneur en eau qui correspond à la teneur en eau d'une micelle dans le lait. Il semble donc raisonnable de considérer que le gel

"regonflé" est constitué de micelles ayant recouvert leur hydratation originales, mais collées les unes aux autres par les forces cohésives qui nous intéressent.

2.3 Influence des différentes conditions physico-chimiques sur les interactions protéiques en générale et sur les interactions inter- et intra-micellaires dans le cas de la micelle de caséine

Les interactions entre les micelles dépendent non seulement du niveau de concentration en micelles de caséine, mais également des conditions physico-chimiques. En termes de modifications physico-chimiques, plusieurs paramètres ont été étudiés dans la littérature. Le résumé des modifications engendrées par quelques conditions qui semblent intéressantes pour comprendre les forces mises en jeu dans la cohésion des gels de caséine est présenté dans le tableau 1. Certaines sont relatées ici :

- Eau :

Dans le cas spécifique de la micelle de caséine, l'utilisation de l’eau comme solvant à la place d'un solvant "natif" conduit à la dissociation du calcium micellaire en raison des modifications des équilibres ioniques dus à l’absence de calcium.

- Chélatant du calcium (EDTA):

Toujours dans le cas de la micelle de caséine, les sels chélatants tels que l’EDTA entraînent la dissociation de HPO4Ca, et une solubilisation du phosphate de calcium. Il en résulte une désintégration de la micelle de caséines lorsqu'elle n'est pas "rigidifiée" par la TGase [Croguennec et al., 2008].

- Urée :

D'une manière générale, à des concentrations suffisamment élevées (6-8 M), l'urée a pour effet de dénaturer les protéines globulaires (= "unfolding"). Les processus mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés, mais deux mécanismes semblent maintenant acceptés : (1) mécanisme indirect : l’urée, en tant qu'agent chaotrope, vient modifier la nature du solvant et sa structuration. Les forces hydrophobes sont alors affaiblies [Das et al., 2009].

(2) mécanisme direct : l'urée a une affinité envers la protéine (chaine principale et acides aminés) qui est meilleure que celle de l'eau envers les protéines. Les parties hydrophobes de la protéine sont ainsi mieux solvatées (par l'urée), et cette meilleure affinité entraine l'intrusion de molécules d'urée dans le cœur hydrophobe de la protéine, d'où la dénaturation [Das et al.,

15 2009]. De plus, il y a une formation préférentielle de liaisons hydrogènes entre molécules d'urée et la chaine principale de la protéine, ce qui contribue à casser les liaisons hydrogènes

"intra-backbone" qui contribuent à la stabilisation de la protéine.

Canchi et al. [2010] montrent que la rupture de liaisons hydrogènes "intra-backbone" ne joue pas un rôle dominant dans la dénaturation de protéine (Trp-cage miniprotéine).

Dans le cas particulier de la micelle, assemblage de caséines, protéines non structurées, l'urée a pour effet de "désassembler" l'édifice en affaiblissant les forces hydrophobes et en cassant les liaisons hydrogènes potentiellement mises en jeu dans la cohésion de la micelle [Horne et al., 2009 ; Holt, 1998]. Comme signalé précédemment, cette dissociation de la micelle est évitée quand elle traitée par la TGase.

- pH basique :

La solubilité du phosphate de calcium diminue avec l’augmentation de pH, cela conduit à la super-saturation de phosphate de calcium dans la phase aqueuse [Chow, 2001].

L'augmentation de pH peut donc être envisagée comme favorisant la formation de phosphate de calcium micellaire en raison des modifications des équilibres ioniques [Vaia et al., 2006].

Au-delà de pH 9.0, le lait se transparise du fait d’une désintégration de l’édifice micellaire.

Ceci s'explique par le phénomène générale d'augmentation de la charge nette des caséines à pH basique, et donc à de plus grandes répulsions électrostatiques entre caséines [Vaia et al., 2006]. Il est aussi suggéré que le pH alcalin change les caractéristiques du solvant, entraînant des forces hydrophobes plus faibles, et une dissociation de la micelle [Vaia et al., 2006].

- Température :

D’une manière générale, lors que la température augmente, le nombre de liaisons hydrogènes diminue [Cooper, 2000] tandis que les interactions hydrophobes sont renforcées [Privalov et al., 1989]. Le changement de température influence donc potentiellement deux catégories de forces entre les micelles : liaisons hydrogènes et interactions hydrophobes. Il faut donc considérer l’effet combiné de la température sur ces deux types de forces.

Ainsi, dans le cadre de ce stage, qui vise à caractériser les forces cohésives entre les surfaces des micelles en milieu concentré, le travail a consisté en deux étapes majeures :

(1) une phase de mise au point méthodologique visant, d’une part à figer l’intérieur de la micelle par réticulation avec la transglutaminase, et d’autre part à former un gel de micelles suffisamment cohésif par ultracentrifugation.

(2) l’étude des interactions par suivi de l’irréversibilité (remise en suspension) des gels dans différentes conditions physico-chimiques (ajout de séquestrant du calcium et d’urée, pH

16 basique, température).

Figure 7: Démarche du travail

17 3. Matériels et Méthodes

Le but de ce travail a donc été de caractériser des forces cohésives mises en jeu entre les surfaces des micelles de caséine en milieu concentré. Pour cela, nous avons réalisé des manipulations avec des gels, suffisamment cohésifs, de micelles de caséine, natives et réticulées, redispersés dans différentes conditions physico-chimiques : l’eau, l’EDTA (30 mmol.L^-1), l’urée (6 mol.L^-1), eau à pH basique (pH~8.5), température (6°C, 20°C, 50°C). Ce chapitre présente les matériels, les protocoles opératoires et les méthodes analytiques utilisées, ainsi que les calculs nécessaires au traitement des résultats.

3.1 Protocole opératoire

Les grandes étapes de la stratégie de ce travail sont données en Figure 7. Les dispersions de micelles natives et réticulées sont tout d’abord préparées. Les micelles de caséines dispersées sont ensuite concentrées par ultracentrifugation pour former un gel suffisamment concentré dans lequel des liaisons cohésives existent entre micelles. Enfin, le gel est redispersé dans des solvants à différentes conditions physico-chimiques de façon à tenter de "casser"

spécifiquement certaines liaisons. L’irréversibilité du gel est alors étudiée et la nature des forces cohésives est déterminée. Dans certaines conditions physico-chimiques, l’irréversibilité du gel de micelles natives n’a pas pu été étudiée du fait de la déstructuration de l’édifice micellaire. Dans ce cas, seule l’irréversibilité du gel de micelles réticulées est reportée.

3.1.1 Préparation de dispersions modèles de micelles natives et réticulées 3.1.1.1 Poudre de PPCN (PhosphoCaséinate Natif)

Le but de ce travail était d'étudier les forces cohésives entre les surfaces des micelles de caséine. Il était donc nécessaire de manipuler uniquement cet objet sans les autres constituants protéiques du lait. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des poudres de PPCN (Phosphocaséinate Natif) produites à l’UMR Science et Technologie du Lait et de l’Œuf [Schuck et al., 1994]. Le principe de préparation consiste à traiter du lait écrémé et de successivement le microfiltrer sur des membranes de 0.1µm, de diafiltrer le rétentat obtenu à l’eau osmosée (élimination des protéines autres que les caséines), de le reconcentrer et ensuite de le sécher par atomisation [Pierre et al., 1992]. Cette méthode de fabrication permet de maintenir les micelles de caséine dans un état quasi-natif, i.e. avec des propriétés physico- chimiques globalement inchangées par rapport aux micelles natives. La poudre de PPCN que nous avons utilisée contient environ 80 % (Total caséines/EST extrait sec total) de micelles de caséine, 4.5 % d’eau, des minéraux et un faible pourcentage de protéines résiduelles autres

18

164,2nm

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

10 100 1000

intensité

taille(nm)

Tableau 2 : Caractéristiques de la poudre de PPCN utilisée dans ce travail (Poudre fabriquée au laboratoire STLO, 44^ème semaine 2010).

Composés Quantité en g.kg^-1

Matière sèche 955,1

MAT 842,4

NPN 1,9

NCN 65,9

Total Caséines 776,5

EST : Extrait Sec Total; MAT : Matières Azotées Totales; NPN : Azote non protéique; NCN : Azote non Caséinique

Figure 8 : Distribution de taille (intensité en %) en fonction du diamètre hydrodynamique des micelles de caséine (nm) pour les micelles de caséine natives après la re-solubilisation de la poudre de PPCN pendant 15h à 35°C mesurée par DLS.

19 que des caséines. Ses caractéristiques sont détaillées en Tableau 2.

3.1.1.2 Perméat d’ultrafiltration (UF)

Les dispersions de PPCN ont été préparées par redissolution de la poudre de PPCN dans un perméat d’ultrafiltration d'un lait (UF) qui correspond à une phase aqueuse identique à celle d’un lait. Ce perméat provient de l’ultrafiltration d’un lait écrémé sur membranes de seuil de coupure 10 kDa. Il contient environ 50 g.L^-1 de lactose et 9 g.L^-1 de sels minéraux. A cet UF ont été ajoutés 0.5 g.L^-1 d’azoture de sodium, un agent bactériostatique qui peut limiter le développement bactérien.

3.1.1.3 Redissolution de la dispersion modèle de micelles de caséine

La re-solubilisation de la poudre de PPCN dans l’UF a été réalisée en se référant au travail de Gaiani et al. [2006]. La redispersion du PPCN est totale après 12 heures à 35°C. Toutes nos expériences ont été effectuées avec des dispersions reconstituées à 25 g.L^-1 de caséines (noté [Cas] = 25 g.L^-1) après 15 h à 35°C. Dans ces conditions, nous avons confirmé la re- solubilisation de la poudre de PPCN par mesure de la distribution de taille des micelles (Figure 8) à l’aide d’un DLS-zetasizer 3000 HS (Malvern, UK). La taille de la micelle dans la dispersion est de ~160 nm, la poudre de PPCN est donc bien re-solubilisée (= pas d'agrégats).

Cette dispersion de micelles natives a finalement subi les mêmes conditions d’incubation et de désactivation que les micelles réticulées (T = 90°C, durée = 30 min, voir 3.1.1.4).

3.1.1.4 Préparation des dispersions modèles de micelles de caséine réticulées

Afin de limiter la déstructuration des micelles de caséine sous certaines conditions physico- chimiques, les micelles provenant de la dispersion modèle (PPCN + UF) ont été réticulées.

Suivant les préconisations de Huppertz et al. [2007b], la dispersion de PPCN ([cas] = 25 g.L^-

1) a été incubée avec la poudre de transglutaminase provenant d’Ajinomoto Foods (Paris, France) avec une activité de 100 unités / g poudre pendant 24 h à 30°C. La concentration en TGase dans la dispersion de PPCN est de 1g.L^-1. Selon l’équation 1, l’activité de TGase dans la dispersion de PPCN est de 4 unités / g caséine.

20

1 10

400

Turbidité (cm-1)

λ(nm) dispersion 'native'_5g.L-1 dispersion réticulée_5g.L-1

700

Figure 9 : Profil de SDS-Page d’une dispersion de PPCN ([cas]= 25 g.L^-1) incubée avec 1 g.L^-1 Transglutaminase à 30°C après 24h.

Figure 10 : Turbidité (cm^-1) en fonction de longueur d’onde (nm) pour la dispersion de micelles natives et réticulées à [Cas] = 5 g.L^-1.

21

164,2

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

10 100 1000

intensité

taille (nm) micelle native

micelle réticulée

177.2

Figure 11 : Distribution de taille (intensité en %) en fonction du diamètre hydrodynamique des micelles de caséine (nm) natives et réticulées. Dispersions (25 g.L^-1) après traitements d’incubation et de désactivation (Incubation : 30°C, 24 h ; Désactivation : 90°C, 30 min).

22

= 4 unités / g caséine Eq. 1

La désactivation de l'enzyme est indispensable pour éviter qu'elle ne crée des liaisons lors de l’ultracentrifugation. Le traitement thermique intense de 90°C pendant 30 min selon Moitzi et al. [2010] a été choisi.

L’électrophorèse en SDS-page a été réalisée pour vérifier la qualité de la réticulation. Le profil de SDS-page (Figure 9) montre qu’il y a clairement trois marques pour les caséines α, β, κ sur le profil de micelles natives, c’est-à-dire les micelles natives sont déstructurées ; par contre, il n’y a pas de marques évidentes sur le profil de micelles réticulées (une trace de caséine αs1 existe) : les monomères de caséines sont donc encore principalement sous forme de micelles. Donc cette condition permet de réticuler les micelles natives de caséines.

La pente de la turbidité de la dispersion de micelles réticulées ([Cas] = 5 g.L^-1) est égale à celle de la dispersion de micelles natives ([Cas] = 5 g.L^-1, Figure 10). Les micelles restent donc intactes après la réticulation par la TGase. A la même longueur d’onde, la turbidité de la dispersion de micelles réticulées est un peu plus élevée que celle de la dispersion de micelles natives en raison de l'ajout de TGase (= gain de matière dans la structure micellaire).

La distribution de taille des micelles natives et réticulées (Figure 11) montre, après les traitements d’incubation et de désactivation, que la taille des micelles réticulées (177 nm) est très proche de celle de la micelle native (164 nm).

3.1.2 Fabrication de gel de micelles de caséine par ultracentrifugation

L’objectif de notre travail est d’étudier les forces cohésives des micelles en milieu concentré (gel). Parmi les techniques envisageables pour concentrer les micelles, la compression osmotique est envisageable [Bouchoux et al., 2009], mais nécessite des durées d’équilibre très longues (plusieurs semaines), difficilement compatibles avec la durée de ce stage.

De ce fait, des manipulations d’ultracentrifugation ont été réalisées à l’aide d’une ultracentrifugeuse Discovery 90SE (Sorvall, Japon). Cette technique permet d'exposer des échantillons à de fortes accélérations (force centrifuge), permettent de faire la séparation des constituants. La force centrifuge qui agit sur un corps en rotation est proportionnelle à la

23

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

fraction redispresée

5g.L-1 25g.L-1

1h

0,1 0,2 0,3 0,4

fraction redispresée (-)

micelles natives

1h 2h 3h

Figure 12 : Fractions redispersées des gels de micelles natives fabriqués par l’ultracentrifugation 1 h pour 5 g.L^-1 (cercle blanc) et 25 g.L^-1 (cercle noir) de dispersions de micelles natives (environ 10 g dans chaque tube) à la vitesse de 150 000 g (38 500 rpm).

Figure 13 : Fractions redispersées des gels de micelles natives en fonction de la durée de l’ultracentrifugation pour 5g.L^-1 de dispersions natives (environ 10g dans chaque tube) à la vitesse de 150 000 g (38 500 rpm).

24 masse de ce corps. Donc plus la masse d'une molécule est importante plus elle migrera rapidement pour une même valeur de force centrifuge. Nous pouvons donc par ce principe fractionner une préparation en un culot, constitué de matériel plus ou moins solidement entassé dans le fond du tube à centrifuger, et en un surnageant qui sera le liquide résiduel au- dessus du sédiment [Maire et al., 1990]. Il est ainsi possible en ultracentrifugeant une dispersion de micelles, de concentrer ces objets dans un culot d’ultracentrifugation et de former ainsi un gel cohésif.

Le protocole d’ultracentrifugation retenu suite à des expériences préliminaires est le suivant : (1) Diluer la dispersion de micelles natives ou réticulées de façon à atteindre 5 g.L^-1. (Des résultats préliminaires (Figure 12) montrent que la fraction redispersée pour une dispersion de 25 g.L^-1 (50%) estbeaucoup plus élevée que celle pour la dispersion de 5 g.L^-1 (30%). Le gel fabriqué de la dispersion à 5 g.L^-1 est plus cohésif que celui fabriqué de la dispersion à 25 g.L^-1. 5 g.L^-1 a donc été choisi comme concentration en caséine dans les dispersions avant ultracentrifugation.)

(2) Mettre environ 10g de dispersion diluée dans chaque tube d’ultracentrifugation.

(3) Fixer la vitesse d’ultracentrifugation à 150 000 g (38 500 rpm) pendant 3h à 20°C.

(Dans l’étude de Huppertz et al., [2007a], 100 000 g est choisi comme le paramètre de vitesse de l’ultracentrifugation pour séparer les micelles de caséine des autres composants de la dispersion de poudre du lait sans protéines sériques et former un culot de micelles de caséine.

Pour mieux concentrer les micelles, la vitesse retenue ici a été choisie de 150 000 g.

De plus, l’impact de la durée d’ultracentrifugation sur les fractions redispersées de micelles natives a été étudié (Figure 13). Les résultats préalablement obtenus montrent que, plus la durée d’ultracentrifugation est longue (1 h, 2 h, 3 h), plus la fraction redispersée est faible. Le gel obtenu est donc plus cohésif à des temps d’ultracentrifugation élevés. La durée de 3 h a dont été retenue.)

(4) Mesurer l’EST et évaluer l’irréversibilité des gels obtenus par mesure des concentrations en caséines.

Les gels de micelles de caséine ont donc été préparés par ultracentrifugation à 20°C avec 5 g.L^-1 de dispersions (environ 10 g dans chaque tube) pendant 3 h à la vitesse de 150 000 g (38 500 rpm). La concentration en caséine des gels de micelles de caséine natives fabriqués avec

25 ces conditions est de ~305 g.L^-1 (Tableau 5), les gels sont donc suffisamment cohésifs selon l’étude de Bouchoux et al. [2009] (voir 2.2, régime iii concentré).

3.1.3 Evaluation de l’irréversibilité des gels de micelles obtenus

Les gels (environ 0.1 - 0.15 g) obtenus à la fin de l’ultracentrifugation ont été récupérés.

Chaque gel a ensuite été immergé dans 20 mL de phase solvante aux conditions physico- chimiques retenues (voir 3.1.4). Après 16 h d’immersion et une légère agitation manuelle nécessaire à homogénéiser la phase surnageante, l’échantillon a été laissé 10 min au repos.

Quelques mL de surnageant sont prélevés et analysés pour déterminer la concentration en caséine dans le surnageant (noté [Cassurnageant]) par la méthode de Bradford (détermination de la concentration massique en g.g^-1, voir 3.2).

La « Fraction redispersée », fraction de caséines redispersées dans la phase solvante, qui traduit l’aptitude du gel à se redisperser, est calculée selon l’équation 2 :

Eq. 2

[Castotal] est la concentration en caséine totale dans la dispersion (un gel dans 20 mL de phase

solvante avec conditions physico-chimiques retenues) et déterminée par l’EST des gels de micelles obtenus (voir 3.2.3).

La fraction redispersée est une mesure caractérisant la « non-cohésion » des gels obtenus.

Plus la redispersion est faible, plus le gel est cohésif et plus il est difficile à redisperser. La fraction redispersée s’exprime de 0 à 1. Pour une fraction redispersée = 0, aucune caséine n’est revenue en solution, le gel est très cohésif ; pour une fraction redispersée = 1, toutes les caséines sont revenues en solution, le gel est totalement réversible, il n’est pas cohésif.

26

27 3.1.4 Récapitulatif des conditions physico-chimiques testées

La phase aqueuse retenue pour redisperser le gel de micelles de caséine est généralement l’UF sauf dans deux conditions physico-chimiques (Eau et pH basique) où l’eau distillée est utilisée. Les conditions physico-chimiques testées dans notre travail sont :

- Eau : Eau distillée (l’UMR Science et Technologie du Lait et de l’Œuf, Rennes, France) - EDTA : Nous avons choisi 30 mmol/L d’EDTA (Merck KGaA, Germany), avec un ajustement du pH à 6.8 réalisé avec la solution de NaOH suite aux travaux de Marchin et al.

[2007a]. Dans ces conditions, 80 % de calcium est dissocié de micelle pour une concentration en caséine de 26 g.L^-1.

- Urée : Nous avons choisi une concentration en urée de 6 mol.L^-1 (Carlo Erba Reactifs SA), suite aux travaux de Holt [1998], dans lesquels il montre que cette concentration est suffisante pour déstructurer complètement les micelles dans le lait.

- Milieu à pH basique (pH~8.5) : L’eau distillée est choisie comme la phase solvante pour le milieu à pH basique. En effet, quand nous ajoutons de la soude dans l’UF, le calcium est précipité. Nous avons donc choisi le pH basique inférieur à 9 pour éviter la déstructuration de micelle. En effet, au-delà de pH 9.0, le lait se transparise du fait d’une désintégration de l’édifice micellaire [Croguennec et al., 2008], cet avis est compatible avec Van Dijk H.J.M [1992]. Le milieu basique a été préparé à partir d’une eau distillée avec NaOH (Carlo Erba Reactifs SA, [NaOH]= 2.5.10^-4 mol.L^-1). Le pH mesuré après 16h de redispersion des gels dans cette condition est de 8.26 0.13.

- Température (6°C, 20°C, 50°C) : Nous avons choisi trois niveaux de températures : (1) la température de référence ambiante (20°C), (2) une température inférieure à la température ambiante (6°C), une autre supérieure (50°C). L’étude sur l’effet de température a été réalisée dans un UF. 20°C est choisi comme la température de référence pour étudier les autres conditions physico-chimiques.

3.1.5 Récapitulatif de la démarche et des échantillons prélevés

La démarche générale suivie pour évaluer l’effet de différentes conditions physico-chimiques sur la redispersion des gels de micelles natives et réticulées est représentée sur la Figure 14.

Pour étudier la redispersion, quatre étapes sont nécessaires :

1. Préparation des dispersions ([Cas] = 5 g.L^-1) de micelles natives et réticulées.

2. Ultracentrifugation.

28 3. Immersion des gels (natifs et réticulés) dans des solvants préparés selon les différentes conditions physico-chimiques retenues.

4. Etude (fraction redispersée, turbidité, distribution de taille) de la redispersion des gels après 16 h et détermination de la nature des forces cohésives.

Pour chaque condition, deux témoins (micelles natives et réticulées) sont préparés de manière à prendre en considération l’effet du temps sur les micelles dans les différentes conditions physico-chimiques. La concentration en caséine dans les témoins a été choisie à 2 g.L^-1 (cette concentration correspond approximativement à [Castotal] obtenue après la redissolution d’un gel de ~ 0 .15 g dans ~20 mL de phase solvant, elle a été calculée suivant la démarche présentée en Annexe A). Pour préparer les témoins, trois étapes principales sont nécessaires : 1. Préparation des dispersions ([Cas] = 25 g.L^-1) de micelles natives et réticulées.

2. Préparation des dispersions de micelles dans les solvants préparés selon les différentes conditions physico-chimiques à [Cas] = 2 g.L^-1.

3. Etude sur la turbidité et la distribution de taille après 16 h d’immersion.

Il y a donc trois types d’échantillons prélevés : 1. Dispersions initiales

« micelles ‘‘natives’’_dispersion » : dispersions de micelles ‘‘natives’’ initiale (non réticulées)

« micelles réticulées_dispersion » : disperison de micelles réticulées initiale 2. Surnageants :

« objets_surnageant ‘‘natif’’ » : surnageants après redispersion du gel de micelles natives dans les conditions physico-chimiques après 16 h

« objets_surnageant réticulé » : surngeant après redispersion du gel de micelles réticulées dans les condition physico-chimiques après 16 h

3. Témoins :

« objets_témoin ‘‘natif’’ » : dispersion de micelles natives ([Cas] = 2 g.L^-1) aux conditions physico-chimiques choisies après 16 h d’immersion

« objets_témoin réticulée » : dispersion de micelles réticulées ([Cas] = 2 g.L^-1) aux conditions physico-chimiques choisies après 16 h d’immersion

3.2 Méthodes analytiques et calculs de concentration 3.2.1 Mesure de taille des particules

29 Tableau 3 : Paramètres utilisés pour les mesures de la distribution de taille à 25°C

Matériels Viscosité (cp) Index de réfraction

Micelle de caséine - 1.570

UF 0.99 1.342

Eau 0.89 1.333

30 Des mesures de distribution de taille des micelles ont été réalisées à l’aide d’un DLS- zetasizer 3000 HS (Malvern, UK). La technique de détermination de la taille des particules consiste à mesurer l’effet Doppler produit lors de l’éclairement des particules colloïdales par un faisceau laser He-Ne (λ=633nm) [Marchin et al., 2007a]. Le mouvement Brownien des particules est ensuite calculé à partir de l’effet Doppler et permet de déduire un coefficient de diffusion. Ce coefficient permet à son tour de déterminer le diamètre hydrodynamique des particules. Les paramètres utilisés pour ces mesures de taille sont ceux préconisés par Regnault et al. [2004] et recalculés pour T° = 25°C : les paramètres sont donnés dans le Tableau 3.

3.2.2 Gels d’électrophorèse (SDS-Page, Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Des gels électrophorèses sont utilisés afin de s’assurer que les micelles incubées par la TGase ont bien été réticulées [Huppertz et al., 2007b].

L'électrophorèse a pour but de séparer les macromolécules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge électrique au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique. La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) a été décrite par Laemmli [1970]. Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4 % à 20 % (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : protéines, peptides et des fragments d'acides nucléiques. Le gel peut également se faire en conditions dénaturantes (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant). Dans ce cas, on ajoute un agent dénaturant dans le tampon: le SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour la séparation des protéines (on parle alors de SDS-PAGE).

La technique consiste à dénaturer préalablement les échantillons dans une solution de SDS.

La micelle native est ainsi déstructurée et hydrolysée (= les caséines) la composant se retrouvent alors en solution; tandis que la micelle réticulée par la TGase n’est pas déstructurée. Les échantillons sont ensuite déposés dans les puits d’un gel d’électrophorèse en polyacrylamide. Les caséines de l’échantillon migrent sous l’effet d’un champ électrique. Les

31 Tableau 4 : Constituants de gel inférieur et de gel supérieur de SDS-Page (fiche de fonctionnement de UMR STLO)

Gel inférieur (8 mL) Gel supérieur (5 mL)

Acrylamide 40% (29 :1) 2.8 mL 0.5 mL

Tampon inférieur Laemmli (Tris-HCl, 1.5mol.L^-1, pH 8.8)

2 mL -

Tampon supérieur Laemmli (Tris-HCl, 0.5mol.L^-1, pH 6.8)

- 1.25 mL

Eau osmosée 3 mL 3.25 mL

SDS 10%

(Sodium Dodecyl Sulfate)

80 µL 50 µL

APS 10%

(Ammonium Persulfate)

40 µL 25 µL

TEMED

(Tetramethylethylenediamine)

12 µL 5 µL

32 protéines ayant migré sont ensuite fixées sur le gel et colorées. Le gel est enfin scanné pour être interprété. Selon un protocole mis en place par Gagnaire (UMR STLO), les étapes principales sont :

(1) Préparation des échantillons : un témoin (3 µl LMW + 22 µL TEL), un échantillon de dispersion de micelles natives (2 µL 25g.L^-1 de dispersion de micelles natives + 23 TEL), un échantillon de dispersion de micelles réticulées (2 µL 25g.L^-1 de dispersion de micelles réticulées + 23µL de TEL).

- LMW : low molecular weight, c’est un marqueur standard de poids moléculaire

- TEL (Tampon Echantillon Laemmli) : Solubiliser 7.57 g de TRIS + 2 g de DSD + 0.3 g de DDT + 10 g de Glycerol + 0.01 g de Bleu de Bromophénol + 40 mL d’eau osmosée, ajuster le pH à 6.8 avec 5 mol.L^-1 de HCl, compléter à 50 mL.

(2) Préparation d’un gel inférieur et d’un gel supérieur. Les constituants de ces deux gels sont montrés dans le Tableau 4.

(3) Assemblage du système d’électrophorèse, remplir le cuve interne et le cuve externe avec le tampon de cuve.

(4) Chauffer les échantillons à 100°C pendant 15 min après les déposer.

(5) Migration à 200V.

(6) Coloration (bleu de Coommassie) et Scanning.

3.2.3 Mesure de turbidité des dispersions colloïdales

Des mesures de distribution de taille des micelles ont été réalisées à l’aide d’un spectrophotomètre UVIKON 922 (Bonneuil-sur-Marne, France). La turbidité désigne la teneur d'un liquide en matières qui le troublent. Dans les cours d'eau elle est généralement causée par des particules colloïdales qui absorbent, diffusent et/ou réfléchissent la lumière.

Nous avons mesuré la turbidité (cm^-1) des dispersions en fonction de longueur d’onde (400 nm – 700 nm), la pente de la courbe obtenue peut indiquer si les objets dans la dispersion sont sous forme de micelle selon une littérature de Pitkowski et al. [2008] (ex. si la pente d’une dispersion modifiée par conditions physico-chimiques est cohérente à celle de la dispersion de micelles de caséine natives, les micelles dans cette dispersion modifiée restent intactes).

33 3.2.4 Détermination de la concentration en micelle

- Méthode de Bradford

La méthode de Bradford permet de déterminer de faibles concentrations de protéines dans un milieu liquide. Elle a été utilisée pour déterminer le degré de réversibilité des gels obtenus lors de l’ultracentrifugation. Le principe de cette technique est un dosage colorimétrique (Bradford reagent, SIGMAn, USA), basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans la ou les protéines. Ce réactif réagit avec l’échantillon de dispersion de protéines pendant 10-15 min. Une fois que la réaction est terminée, l’absorbance de l’échantillon à λ=595nm est déterminée par spectrophotométrie (spectrophotomètre Uvikon 922, Milan, Italie). La valeur d’absorbance obtenue est proportionnelle à la concentration en protéines dans l’échantillon. Les équations utilisées pour le calcul de la concentration en caséine [Cas] en g.g^-1 à partir de l’absorbance Abs dans différentes solutions sont :

- La dispersion de micelles natives dans l’UF:

[Cas] _ g.g^-1= -3.128.10^-1 Abs² + 1.109 Abs Eq. 3 - La dispersion de micelles réticulées dans l’UF :

[Cas] _ g.g^-1= 2.574.10^-1 Abs² + 6.650.10^-1 Abs Eq. 4 - La dispersion de micelles réticulées dans l’Urée (6 mol.L^-1):

[Cas] _ g.g^-1= 6.21.10^-2 Abs² + 4.830.10^-1 Abs Eq. 5 - La dispersion de micelles réticulées dans l’EDTA (30 mmol.L^-1):

[Cas] _ g.g^-1= -7.84.10^-2 Abs² + 6.798.10^-1 Abs Eq. 6

- Extrait sec

La mesure de l’extrait sec total (EST) nous permet de déterminer la concentration en caséine totale pour calculer la fraction redispersée. Cette méthode consiste à faire évaporer de l’eau d’une prise d’essai, dans une étuve à la température de 100°C pendant au moins 18 h. La valeur de l’EST est donnée par la formule suivante :

Eq. 7

34 Avec mhumide , la masse de l’échantillon avant dessiccation et msèche, sa masse après séchage. A partir des mesures d’EST réalisées, la concentration en caséine dans les gels concentrés de micelles - concentration en g.g^-1- a pu être déterminée à partir de la relation suivante :

mv_g.L^-1 = 371.71 [Cas]_ g.g^-1 + 1022.7 Eq. 8 Cette relation a été obtenue à partir de la mesure d’EST de solutions modèles de concentrations connues en caséine en g.g^-1. De la même façon les concentrations en caséine après 16 h de redispersion des gels dans la phase solvante, mais en g.L^-1 cette fois-ci, ont été déterminées à partir de l’équation générale suivante :

[Cas] _ g.L^-1 = [Cas] _ g.g^-1 mv_g.L-1

Eq. 9

Et connaissant [Cas] _ g.g^-1 (équation 9) et mv_g.L^-1 (équation 7) :

[Cas]_g.g^-1 = 8.815.10-1 EST_g.g-1 + 4.933.10-2 Eq.

10

L’unité de concentration g.L^-1 est l’unité choisie pour la représentation des résultats de ce stage.

35

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Fraction redispersée (-)

micelles natives micelles réticulées

UF Eau EDTA pH basique UF UF Urée 30 mM pH~8.5 6M 20°C 20°C 20°C 20°C 6°C 50°C 20°C

Figure 15 : Fractions redispersées des gels de micelles natives (colonnes blanches) et réticulées (colonnes grises) dans les différentes conditions physico-chimiques testées après 16 h d’immersion.

Tableau 5 : Concentrations en caséine des gels de micelles natives et des micelles réticulées après ultracentrifugation et 16h de redispersion dans l’UF à 20°C. Pour les gels de micelles natives et réticulées après ultracentrifugation, les résultats de [Cas] sont les valeurs moyennes de trois essais. Pour les gels après 16h de redispersion, les résultas viennent d’un essai.

Gels [Cas]_g.kg [Cas]_g.L^-1

Gel après ultracentrifugation ^natif réticulé

333 348

305 325 Gel après 16h de redispersion ^natif

réticulé

240 247

176 183

36

122

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

10 100 1000

intensité

taille (nm) micelles réticulées_dispersion objets_surnageant réticulé ¹⁷⁷ 164 B

91

0 2 4 6 8 10 12 14 16

10 100 1000

intensité

taille (nm) micelles 'natives'_dispersion objets_surnageant 'natif'

A

0,01 0,1 1 10

400

Turbidité (cm-1)

λ(nm) dispersion 'native'

surnegeant ''natif'' surnageant réticulé

700

Figure 16 : Turbidité (cm^-1) en fonction de longueur d’onde (nm) des dispersions. Les gels de micelles natives (croix) et réticulées (carré) sont redispersés dans l’UF à 20°C pendant 16 h.

Figure 17 : Distribution de taille (intensité en %) en fonction du diamètre hydrodynamique (nm). Les gels de micelles natives (A) et réticulées (B) sont redispersés dans l’UF à 20°C pendant 16 h.

37 4. Résultats et discussions

L’objectif de ce chapitre est de présenter les résultats obtenus au cours de stage, et de les discuter. Nous rappelons que la stratégie est de tenter de casser certaines liaisons, de façon spécifique, en mettant les gels de micelles de caséine dans différentes conditions physico- chimiques. Notre travail de recherche a porté sur la mesure des fractions redispersées (voir 3.1.3) de ces gels après 16 h dans différentes conditions physico-chimiques. Les résultats des fractions redispersées dans toutes les conditions retenues sont présentés en Figure 15.

4.1 Gel référence de micelles ‘‘natives’’ dans l’UF à 20°C

Les résultats de fractions redispersées après 16h de redispersion des gels de micelles natives dans l’UF à 20°C (Figure 15) montrent que la fraction redispersée est de 20%. 80% des micelles de caséine restent donc liées les unes aux autres par des forces cohésives. Il existe donc encore suffisamment de forces cohésives entre micelles dans ces conditions de référence pour que l'on puisse tenter de les casser par immersion du gel dans différentes conditions physico-chimiques. Après 16h, la concentration en caséine dans le gel est de 176 g.L^-1 (Tableau 5); nous retrouvons donc le résultat de Qu et al. [2010a] qui semble indiquer que les micelles ont "regonflées" à leur teneur en eau d'origine et sont au contact les unes avec les autres dans le gel.

Les mesures de turbidité montrent que la pente du surnageant ‘‘natif’’ est sensiblement la même que celle d'une dispersion de micelles natives (Figure 16). Ceci suggère que le surnageant contient des micelles d'une forme et d'une structure globalement identiques aux micelles ‘‘natives’’. De plus, les valeurs absolues de turbidité, rapportées à la concentration en caséine dans le surnageant, correspondent tout à fait à la turbidité d'une solution témoin ne contenant que des caséines micellaires (résultats de Qu [2010b], non présentés ici). Il semble donc raisonnable de dire que le surnageant ne contient pratiquement que des caséines sous forme micellaire. En d'autres termes, le taux de redispersion s'explique principalement par le fait que certaines micelles se détachent du gel lors de son regonflement.

Les mesures de distribution de taille montrent que la taille d’objets redispersés (91 nm en moyenne) dans le surnageant après 16h est un peu plus petite mais du même ordre de grandeur que celle des micelles dans la dispersion initiale (164 nm en moyenne, Figure 17).

Nous ne retrouvons pas ce résultat avec des gels préparés par compression osmotique [Qu,

38

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Fraction redispersée(-)

micelles natives micelles réticulées

UF 20°C Eau 20°C EDTA 20°C

Figure 18 : Fractions redispersées des gels de micelles natives (colonnes blanches) et réticulées (colonnes grises) dans ces trois conditions suivantes: dans l’UF, dans l’eau distillée, dans l’EDTA (30 mmol.L^-1). Résultats obtenus après 16 h de redispersion à 20°C

39 2010b]. C'est donc probablement du à la méthode employée pour créer le gel, à savoir l'ultracentrifugation : lors de l’ultracentrifugation, les micelles les plus grosses se déposent préférentiellement au fond du tube et subissent une force centrifuge plus élevée que les petites micelles. Ainsi, le gel récupéré est inhomogène, avec une couche peu concentrée, et donc probablement peu cohésive, contenant majoritairement des petites micelles. Et c'est cette couche qui se redisperse préférentiellement lors de l'expérience de redispersion.

4.2 Gel référence de micelles réticulées dans l’UF à 20°C

La fraction redispersée des micelles réticulées sous forme de gel est de 30 % (Figure 15), environ 10 % plus élevées que celle du gel de micelles natives. Et de la même façon que précédemment, les mesures de turbidité du surnageant réticulé montrent que la pente du surnageant réticulé reste à même de celle de la dispersion de micelles natives (Figure 16), ce qui indique que les objets redispersés dans le surnageant sont principalement des micelles.

Enfin, la concentration en caséine du gel de micelles réticulées dans l’UF après 16 h est proche de celle du gel de micelles natives, 183 g.L^-1 (comparée à 176g.L^-1, Tableau 5).

Les micelles réticulées sont donc plus facilement redispersées. La réticulation change donc, mais de manière modérée, les propriétés cohésives à la surface de la micelle. Il est possible, comme l’a suggéré Huppertz et al. [2007b ; 2008] que la réticulation permette de former des liaisons qui figent partiellement la ‘‘chevelure’’ de caséine κ à la surface de la micelle (voir 2.1.2). La formation de ces liaisons couvrirait certaines zones dans lesquelles existent des forces cohésives de surface. Les différences observées entre le comportement des gels de micelles natives et réticulées étant tout de même minimes, nous considérerons que la nature des forces cohésives à la surface de micelle n’est pas grandement modifiée par la réticulation.

Mais nous continuerons de comparer les fractions redispersées des gels de micelles natives et des gels de micelles réticulées.

4.3 Effet de calcium

Des manipulations, sur les redispersions des gels de micelles natives et réticulées pendant 16 h à 20°C dans l’eau distillée (absence de calcium de la phase aqueuse) et dans l’UF en présence d’un séquestrant du calcium (EDTA, 30 mmol.L^-1), ont été réalisées afin d’étudier le rôle de calcium sur la cohésion des gels de micelles de caséine. La Figure 18 présente les résultats de fractions redispersées dans ces deux conditions.