Résumé :Les auteurs font la mise au point des techniques virologiques classiques et modernes permettant le dia- gnostic de la grippe au laboratoire. Les méthodes traditionnelles d'isolement des virus grippaux en culture cellulaire, la détection directe et rapide d'antigène viral par des tests immunologiques, les techniques de biologie moléculaire basées sur la détection d'acides nucléiques viraux spécifiques par reverse transcription polymerase chain reaction, ainsi que les méthodes sérologiques classiques sont décrites et leurs indications préférentielles définies.
Mots-clés :grippe, myxovirus influenza, signes, cliniques diagnostic virologique.
GRIPPE INFLUENZA
A. I. LAHLOU; B. LMIMOUNI; L. LOUZI; W. EL MELLOUKI; J. J. CHOMEL*; A. J. BAAJ
Abstract :The authors review data concerning the classical and modern virological techniques allowing the dia- gnosis of influenza virus infection in laboratory. Traditional isolation methods of influenza virus in cell culture, direct and rapid detection of viral antigen by immunoassay tests, molecular biology techniques based on the detection of specific viral nucleic acids by reverse transcription polymerase chain reaction, and classical serological methods are described and their preferential indications specified.
Key-words :flu, myxovirus influenza, clinical signs, virological diagnosis.
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Tiré à part :I. Lahlou Amine : laboratoire de microbiologie, hopital militaire Mohammed V, Hay Riad, Rabat, Maroc E.mail: idrlahlou@yahoo.com
* Laboratoire de virologie de CHU de Lyon, Univérsité Claude Bernard Lyon, 1. 69373 Lyon Cedex, France.
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INTRODUCTION
Le mot grippe est de racine gothique. Il signifie "saisir brusquement". La grippe, c'est ce qui vous aggrippe. En effet, la grippe est une infection respiratoire aigue, haute- ment contagieuse évoluant sous forme d'épidémies hiver- nales, parfois mondiales (pandémies), dont peuvent être responsables l'un des trois types de virus grippaux patho- gènes pour l'homme : myxovirus influenza A, B ou rare- ment C. Le premier isolement de virus grippal humain a été effectué en 1933.
Ces virus sont entourés d'une enveloppe lipidique por- tant deux sortes de spicules glycoprotéiques, l'hémaggluti- nine (HA) et la neuraminidase (NA). A l'intérieur se trou- vent huit segments d'ARN enchâssés dans des molécules de nucléoprotéines (NP). (fig.1). La protéine NP, spéci- fique du type, est très stable alors que les glycoprotéines de l'enveloppe, et surtout l'hémagglutinine, sont soumises à des variations antigéniques, principalement dans le cas de la grippe A (1,2).
L'intérêt du diagnostic de la grippe est multiple. Il per- met devant une infection aiguë ou lors de complications de déterminer l'agent infectieux responsable et, dans une communauté, de prendre les mesures nécessaires pour évi- ter la transmission du virus à l'entourage. La surveillance épidémiologique de la grippe est aussi fondée sur l'isole- ment et la caractérisation des isolats pour mieux appré- hender les variations des virus gripaux et modifier, éven- tuellement, la composition des vaccins. La mise en œuvre d'un diagnostic de certitude permettra aussi, dans un proche avenir une utilisation rationnelle des nouveaux médicaments anti-grippaux.
CLINIQUE
L'incubation est de 1 à 2 jours. Les signes d'invasion sont brutaux : frissons, fièvre, courbatures, myalgies, rachialgies, céphalées. Le patient présente des signes d'ir- ritation laryngo-trachéale ou bronchique, le plus souvent sans catarrhe. La courbe thermique présente parfois un aspect diphasique : c'est ce que l'on appelle le "V" grippal.
La guérison est , dans les formes non compliquées, rapide mais le convalescent souffre souvent d'une asthènie pro- fonde et traînante. Les complications sont dues au virus lui-même ou à des surinfections bactériennes. Elles tou- chent les voies respiratoires, la sphère ORL : otite, sinusi- te, bronchite aigue, bronchopneumonie. La grippe compli- quée peut se trouver chez la personne âgée ou le patient fragilisé par une pathologie préexistante (insuffisance res- piratoire, cardiaque, rénale, diabète, obésité).
La grippe maligne, observée surtout au cours des pandé- mies peut toucher le sujet jeune bien portant, la personne âgée ou le sujet à risque, et se caractérise par des formes neurologiques et des atteintes cardiaques foudroyantes.
Les groupes de patients chez lesquels la grippe est le plus à redouter, sont, les insuffisants respiratoires chroniques, les femmes enceintes, les diabétiques, les sujets immuno- déficients et toutes les personnes âgées de plus de 65 ans, justifiant une vaccination préventive.
L'existence de nombreux syndromes "grippaux" causés par d'autres virus (adénovirus, virus parainfluenza, virus respiratoires syncytial, entérovirus, coronavirus, rhinovi- rus) ou par des bactéries particulières comme Mycoplasma pneumoniae, justifie le diagnostic virologique de la grippe.
DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
DIAGNOSTIC DIRECT : MISE EN EVIDENCE DES VIRUS GRIPPAUX
Prélèvements et mode de transport :
Il est important de tenir compte de la fragilité des virus grippaux pour la réalisation des prélèvements et leur trans- port au laboratoire. La détection des virus est possible si les prélèvements sont réalisés dès l'apparition des premiers signes cliniques, car l'excrétion virale diminue rapide- ment, en 3 à 5 jours. Cependant les virus grippaux peuvent persister plus longtemps, particulièrement chez les sujets immunodéprimés. Les prélèvements se font au niveau nasal, naso-pharyngé et pharyngé soit à l'aide d'écou- villons stériles ou par des lavages nasaux ou naso-pharyn- gés. Le transport se fait dans des milieux spéciaux assurant la survie des virus. Les flacons et les écouvillons correcte- Structure du virus de la grippe (d’après Aymard)
Fig. 1
Nucléocapside ribo-nucléo-protéine
hélicoïde Protéine “membrane”
Lipides
Neuraminidase Hémagglutinine
“ENVELOPPE”
“CORE Nucléoprotéine
8 piècesARN
Polymérase
(1) Génome segmenté
(2) Génome sous forme “bicaténaire”
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Détection des antigènes viraux
Les méthodes d'immunofluorescence (IF) et d'immuno- capture Elisa (ICE), appliqués directement aux produits pathologiques, sont les plus utilisées pour le diagnostic des infections respiratoires virales et donnent des résultats sans délai. Cependant, leur sensibilité est inférieure, envi- ron 60 à 70%, à celle de la culture qui doit être mise en œuvre si l'on veut complèter la recherche virologique (3).
Elles sont, en général, plus sensibles chez les enfants que chez les adultes et les personnes âgées.
Pour le diagnostic biologique des virus grippaux, il exis- te de nombreux réactifs commercialisés pour la détection des antigènes par IF. Ils permettent de rechercher séparé- ment les virus grippaux A ou B, ou bien ils consistent à dépister, dans un premier temps, grâce à un mélange d'an- ticorps monoclonaux de différents isotypes, un ensemble de virus respiratoires (virus grippaux, virus respiratoire syncytial, adénovirus, etc....), puis en cas de résultat positif et dans un second temps, de déterminer le virus en cause (4). Les résultats ne sont interprétables que si les préléve- ments sont réalisés correctement, c'est à dire qu'ils com- portent un grand nombre de cellules infectées, une fluores- cence cytoplasmique et nucléaire. Le résultat est rapide- ment disponible (1 à 2 heures). Cette méthode, présente l'avantage d'apprécier la qualité du prélèvement effectué.
Les méthodes d'ICE (5,6) consistent à capturer l'antigè- ne (NP) sur un anticorps monoclonal fixé sur un support solide sur lequel se déroule la réaction immuno-enzyma- tique et à révéler l'antigène fixé par une suite d'étapes impliquant : un sérum polyclonal de lapin anti-NP, un sérum anti-lapin marqué à la péroxydase ainsi qu'un sub- strat adéquat. La lecture est réalisée au spectrophotomètre de plaque en densité optique. Un seuil de positivité (cut- off) est déterminé en intégrant un témoin positif et un témoin négatif. Ces méthodes sont semi-automatisables mais il n'existe pas à ce jour, de trousse commercialisée.
Elles sont cependant largement utilisées, en pratique cou- rante, par quelques laboratoires de virologie, car les diffé- rents réactifs sont disponibles séparément, soit dans le commerce, soit auprès des centres de références. Ces tech- niques différencient les virus grippaux A et B.
Des tests immunoenzymatiques sur membrane (7), faciles à réaliser, ont été mis au point et commercialisés ( Becton Dickinson). Dans un premier temps, l'antigène
grippal A présent dans le spécimen est absorbé passive- ment sur la membrane, puis révélé dans un second temps par un anticorps monoclonal conjugué à un enzyme spéci- fique de la NP de type A. Ces tests ne nécessitent pas un équipement particulier, sont facilement exécutables même par un personnel non entraîné au diagnostic virologique.
Le plus utilisé est le "Directigen R Flu A" disponible en France, il ne détecte que les virus grippaux de type A (8).
Avec les méthodes d'ICE, le résultat est obtenu dans des délais courts, 15 minutes pour les tests réalisés sur mem- brane, 4 à 5 heures pour les semi-automatisables permet- tant ainsi un diagnostic rapide.
Récemment, un nouveau test rapide basé sur la détection de l'activité neuraminidasique permet le diagnostic direct des infections grippales A et B (Zstat Flu R, Zymet R, Oklahoma city). Ce test n'est pas un test immunoenzyma- tique : il fait appel à un substrat de la NA conjugué à un chromogène qui est clivé et aboutit à un changement de coloration en présence de la NA grippale. Ce test est réali- sé en une heure et la sensibilité varie de 60 à 65% en com- paraison avec la culture virale (9).
Détection du génome viral
Les techniques d'amplification génique ont été appli- quées avec succès aux virus grippaux. Cela implique de procéder, dans un premier temps, à la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire à l'ARN génomique, grâce à l'ac- tion d'une transcriptase inverse, puis d'une amplification de tout ou une partie de l'ADN néosynthétisé par PCR; il s'agit alors de reverse tanscription-polymerase chain reac- tion ou RT-PCR. Plusieurs couples d'amorces sont propo- sés. La spécificité dépend du gène amplifié, de type pour NP et de sous-type pour HA et NA. Il est possible de pra- tiquer des RT-PCR dites "multiplex" en réalisant des amplifications de plusieurs gènes dans une même réaction utilisant plusieurs couples d'amorces. Cette méthodologie est applicable aux virus grippaux, et aussi étendue à la recherche de plusieurs virus respiratoires, en un temps et dans un même échantillon (10).
En général, les RT-PCR ont une sensibilité équivalente à la culture et elles détectent l'ARN viral dans des échan- tillons où les virus ne sont pas cultivables (11,12).
En raison de sa plus grande complexité comparée à la détection d'antigène et des problèmes potentiels liés à la présence d'inhibiteurs de PCR dans les spécimens d'origine respiratoire, la RT-PCR influenza n'est pas utilisée en rou- tine dans le diagnostic virologique standard de la grippe.
Isolement par mise en culture
L'œuf de poule embryonné a longtemps été le meilleur moyen d'isoler les virux grippaux car il présentait de nom- breux avantages, dont la sensibilité et le faible coût.
Actuellement ce système est délaissé au profit des cultures cellulaires et il est réservé aux préparations vaccinales.
Les cellules les plus sensibles pour l'isolement des virus grippaux sont les MDCK (Madin Darby Canine Kidney).
Cette lignée continue de rein de chien présente l'avantage de se cultiver facilement. Les conditions de culture les plus favorables ont été bien définies : milieu sans sérum, adjonction de trypsine pour cliver le précurseur de l'hémag- glutinine, inoculation par centrifugation du prélèvement, incubation entre 33 et 34° C. L'apparition d'un effet cytopa- thique (ECP) dans les cellules infectées dépend des virus grippaux; il peut être indécelable ou particuliérement important avec les grippes B qui provoquent rapidement, en 3 à 4 jours, une dégénérescence de la nappe cellulaire (13).
Pour mettre en évidence les virus grippaux dans les cel- lules infectées, on utilise leur propriété de se fixer sur les globules rouges de poule ou de cobaye, par hémadsorption (on détecte le virus sortant de la cellule), ou par hémag- glutination des surnageants cellulaires (14). On peut aussi révéler les virus après 4 à 5 jours de culture, par les méthodes de détection d'antigène, et particulièrement l'ICE, réalisée sur plaques permettant de grandes séries.
Cette dernière méthode augmente considérablement la sensibilité de la culture et la rapidité du résultat (15,16)
Identification des virus influenza
L'identification des virus grippaux se fait en plusieurs étapes. Le type (A,B ou C) est déterminé dès la détection du virus par la réaction de fixation du complément et/ou l'ICE, spécifiques de la NP. La caractérisation de l'HA des virus grippaux est possible par inhibition de l'hémaggluti- nation grâce à un panel d'anticorps monoclonaux de spéci- ficité connue et/ou des sérums de furets prélevés précoce- ment après l'infection expérimentale. Ainsi on peut distin- guer les sous types H1, H2, H3 et dans un sous-type, les variants (17). Le typage des virus par inhibition de l'hé- madsorption peut également être réalisé grâce aux sérums de furets. De même il est possible de caractériser la NA (N1, N2) en utilisant une réaction d'inhibition de cette acti- vité à l'aide de sérums spécifiques de furets.
Cependant la caractérisation précise des virus grippaux est réservée à des laboratoires spécialisés et particulière- ment aux laboratoires de référence collaborant avec l'OMS.
grippaux est indispensable pour plusieurs raisons. Tout d'abord il est primordial d'évaluer les variations de l'HA et de la NA pour ajuster la composition des vaccins. Ensuite, en raison de l'emploi de médicaments antigrippaux, il sera indispensable de surveiller, dans un futur proche, l'évolu- tion de la sensibilité des isolats aux diverses molécules prescrites pour déceler une éventuelle résistance.
DIAGNOSTIC INDIRECT : MISE EN EVIDENCE DES ANTICORPS
Les examens sérologiques ne présentent pas un grand intérêt pour le diagnostic d'une infection grippale aiguë car ils sont rétrospectifs et nécessitent un sérum prélevé à la phase précoce de l'infection et un autre prélevé tardive- ment, environ 15 jours plus tard. Cependant en cas de complications, et surtout chez l'adulte, ces examens sont utiles pour réaliser, à postériori un diagnostic étiologique.
Ils sont essentiels pour des enquêtes séro-épidémiolo- giques ou des contrôles de vaccination. Les paires de sérums sont examinées dans la même réaction.
La réaction de fixation du complèment repose sur la détection des anticorps d'infection dirigés contre la NP et sont spécifiques de type (A ou B). Elle ne peut être utili- sée chez les enfants de moins de 15 ans, et chez les adultes elle renseigne sur le caractère récent de l'infection, car les anticorps fixant le complèment décroissent rapidement, en 2 à 3 mois. On cherche à mettre en évidence une sérocon- version, une augmentation significative du titre des anti- corps (multiplication par 4 ou plus). La constatation d'un titre en anticorps fixant le complément supérieur ou égal à 80, si l'on ne dispose que d'un sérum, est présomptif d'une infection récente (17, 18,19).
La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (IHA) est très facile à réaliser, de faible coût et sensible à condition d'utiliser les souches virales les plus récemment impli- quées. Le sérum étudié devra au préalable être débarrassé des inhibiteurs non spécifiques de l'hémagglutinine (INS) par un traitement au RDE (Receptor Destroying Enzyme) et des hétéroagglutinines. Elle détecte les anticorps dirigés contre l'hémagglutinine, à vie longue, et de ce fait, est spé- cifique de sous type et de variant. Elle informe sur le sta- tut immunitaire car la corrélation entre anticorps IHA et la protection contre l'infection est bonne. Elle réservée aux enquêtes épidémiologiques et aux contrôles de vaccination (17, 18, 19).
Il est également possible d'analyser les anticorps élabo- rés contre l'hémagglutinine des virus grippaux par une réaction d'hémolyse radiale (20). Cette technique n'est pas
Maroc Médical, tome 23 n°2, Juin 2001 117 gnostic et au études séro-épidémiologiques mais reste réser-
vée aux laboratoires de référence. Elle est très sensible chez les enfants de moins de 5 ans.
Le titrage des anticorps inhibant l'action de la NA est aussi réservé aux centres de référence. La détection de ces anticorps a montré un intérêt dans les enquêtes épidémio- logiques effectuées autour des cas de grippe du poulet (A/H5N1)(21).
La réaction de neutralisation permet de titrer les anti- corps neutralisants protecteurs. Elle doit être effectuée sur culture de cellules ou dans l'œuf de poule embryonné.
Cependant, en raison de son coût élevé et des contraintes techniques, elle n'est réservée que lors de la mesure de l'ef- fet protecteur de nouveaux vaccins.
Les techniques immunoenzymatiques ont été appliquées au sérodiagnostic des infections grippales. Elles différen- cient les classes d'immunoglobulines spécifiques et parti- culièrement les Ig A dans les sécrétions nasales et les IgM sériques qui sont le témoin d'une infection récente.
CONCLUSION
Les méthodes virologiques actuelles permettent de réa- liser facilement et rapidement le diagnostic des infections grippales. La détection directe des virus grippaux dans les prélévements respiratoires donne une information rapide mais les prélévements doivent être correctement réalisés, à la phase aiguë de l'infection, et les méthodes les plus sen- sibles doivent être utilisées.
L'usage de "médicaments antigrippaux" devrait impli- quer, dans un avenir proche, de réaliser ces diagnostics en urgence pour la mise en œuvre d'un traitement spécifique.
Cela met en valeur les tests individuels de détection d'an- tigènes ne nécessitant pas un équipement particulier, réalisables au lit du malade mais qui, en raison de leur manque de sensibilité, devraient être réservés aux infec- tions aiguës. L'isolement du virus grippal, suivi de sa caractérisation antigénique par les laboratoires de réfé- rence, reste essentiel et devra être poursuivi pour évaluer les variations antigéniques et la sensibilité aux antiviraux.
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