Identification de bactéries lactiques isolées de l’écosystème mammaire bovin et caractérisation de leur potentiel inhibiteur contre des pathogènes associés à la mammite

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Identification de bactéries lactiques isolées de

l’écosystème mammaire bovin et caractérisation de leur

potentiel inhibiteur contre des pathogènes associés à la

mammite

Bianca Seridan de Assis

To cite this version:

Bianca Seridan de Assis. Identification de bactéries lactiques isolées de l’écosystème mammaire bovin et caractérisation de leur potentiel inhibiteur contre des pathogènes associés à la mammite. Microbi-ology and ParasitMicrobi-ology. AGROCAMPUS OUEST, 2016. English. �tel-02798105�

1

Bianca Seridan de Assis

1

2 3 4

Identification de bactéries lactiques isolées de l’écosystème

5

mammaire bovin et caractérisation de leur potentiel

6

inhibiteur contre des pathogènes associés à la mammite

7

8 9 10 11

Thése de Doctorat soumise à 12

l´École Doctorale en Microbiologie du 13

Département de Microbiologie de 14

l´Institut de Sciences Biologiques de l´UFMG 15

Et à l'Institut Supérieur des Sciences 16

Agroalimentaire, Horticoles et du Paysage 17 De l’Agrocampus Ouest 18 19 20 21 22

Directeurs de thése: Dr. Yves Le Loir- Agrocampus Ouest-INRA 23

Dr. Jacques Robert Nicoli-UFMG 24

Co-directrice: Dr. Andreia Marçal da Silva-UFSJ 25 26 27 28 29 30

Belo Horizonte – MG – Brésil 31

Mars 2015 32

2

Bianca Seridan de Assis

1

2 3 4

Identificação de bactérias láticas isoladas do ecossistema

mamário bovino e caracterização de seu potencial inibidor

contra patógenos associados à mammite

8

9

10

Tese de Doutorado apresentado ao 11

Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do 12

Departamento de Microbiologia do 13

Instituto de Ciências Biológicas da UFMG 14

E ao Institut Supérieur des Sciences 15

Agroalimentaire, Horticoles et du Paysage

16 Do Agrocampus Ouest 17 18 19 20 21

Orientadores: Jacques Robert Nicoli-UFMG 22

Yves Le Loir- Agrocampus Ouest-INRA 23

Co-orientadora: Andreia Marçal da Silva-UFSJ 24 25 26 27 28 29

Belo Horizonte – MG – Brasil 30

Março de 2015 31

3

Sumário

1. Ecossistema mamário bovino --- 24 14

1.1. Anatomia ... 24 15

1.2. Produção e secreção do Leite ... 25 16 2. Leite --- 26 17 2.1. Conceito ... 26 18 2.2. Composição do leite ... 26 19 2.3. Sistemas antimicrobianos ... 27 20

2.4. Bactérias do ácido lático ... 28 21 2.5. Lactococcus lactis ... 29 22 3. Mastite --- 30 23 3.1 Staphylococcus aureus ... 32 24 3.2. Escherichia coli ... 34 25 4. Probióticos --- 34 26 Objetivos ... 36 27 1. Objetivo geral --- 36 28 2. Objetivos específicos --- 36 29

4 Estratégia de trabalho ... 37 1 Capítulo I ... 38 2 Resumo --- 39 3 Resumé --- 41 4

Probiotic properties of lactic acid bacteria from mammary microbiota ... 43

5

Bouchard Damien S1, 2 *, Seridan Bianca1, 2, 3 *, Saraoui Taous1, 2, Rault Lucie1, 2, Gonzalez

6

Moreno Candelaria4, Chain Florian5, François Patrice6, Victoria Chuat1, 2, Langella

7

Philippe5, Pierre Germon7, Otero Claudia4, Nader-Macias Fatima ME4, Jacques Nicoli3, Le

8

Loir Yves1, 2, † and Even Sergine1, 2, †. ... 43

9

Abstract--- 44 10

Introduction --- 45 11

Material and methods --- 47 12 Results --- 54 13 Discussion --- 59 14 Figure legends--- 64 15 Supplementary material --- 68 16 References --- 74 17 Capítulo II ... 82 18 Resumo --- 83 19 Resumé --- 86 20

Pro-inflammatory Lactococcus lactis V7 inhibits the invasion of bovine mammary

21

epithelial cells by E. coli and S. aureus ... 89

22

Seridan Assis, Bianca1,2,3; Germon, Pierre4; Silva, Andréia Marçal5; Even, Sergine1, 2;

23

Nicoli, Jacques Robert3; Le Loir, Yves1, 2*... 89

24

Abstract--- 90 25

Introduction --- 92 26

Material and methods --- 94 27

5 Results --- 99 1 Discussion --- 101 2 Figure legends--- 105 3 References --- 107 4

Experiment not presented in this paper --- 110 5

Material and Methods --- 110 6 Results --- 112 7 Discussion --- 113 8 Figure Legend --- 114 9 References --- 116 10

Discussão final e perspectivas... 118

11

Discussion finale et perspectives ... 123

12 13 14

6

Dedicatória

À minha família, que dividiu comigo minhas 18

maiores perdas e minhas maiores conquistas. 19

7

Agradecimentos

1

2

Agradeço a Deus por ter me dado saúde e paz de espírito, pois foi o que me permitiu a luta, o 3

trabalho, a dedicação e a superação. 4

5

Sou grata ao governo brasileiro, representado pela agência CAPES, e ao governo francês 6

representado pela agência Campus France, pelo financiamento da bolsa para a realização 7

desse trabalho. Agradeço ao Departamento de Microbiologia do ICB, UFMG (Brasil) e ao 8

Agrocampus Ouest (França) por me receberem como aluna de pós-graduação e me 9

proporcionarem um ambiente propício à minha formação profissional. Aos meus orientadores 10

Prof. Dr. Jacques Robert Nicoli e Dr. Yves Le Loir agradeço pela orientação e acolhida em 11

seus laboratórios, bem como pelas oportunidades de crescimento e confiança em meu 12

trabalho. À minha co-orientadora Profa. Dr. Andréia Marçal da Silva, agradeço pela 13

orientação, confiança e suporte. 14

15

A todos os integrantes da equipe do Laboratório de Ecologia e Fisiologia Microbiana (LEFM) 16

e da equipe Biodiversité Bactérienne et Interactions in situ (B2ISI) agradeço pelas 17

contribuições em suas diversas formas. Obrigada ainda à equipe ―Staph‖, que me acolheu no 18

laboratório P2: Lucie Rault, Damien Bouchard, Vincent Peton, Nadia Berkova e Martine 19

Deplanche pelas contribuições diretas e, sobretudo, Sergine Even por se envolver direta e 20

ativamente no planejamento e coordenação desse trabalho. Agradeço ainda ao Dr. Florien 21

Chain da equipe MICALIS por me receber em seu laboratório e, a ele e a Pierre germon, pela 22

ajuda na realização das análises ELISA. Agradeço ainda à secretária Laurence Fauvel e à 23

bibliotecária Anne Giboulot pelo auxílio burocrático e diplomático. Aos membros da banca de 24

avaliação desse trabalho agradeço pela disponibilidade para lerem essa tese e para se 25

deslocarem de mais ou de menos longe a fim de estarem presentes na minha defesa e 26

contribuírem com minha formação profissional através de seus valiosos comentários, 27

sugestões e críticas. 28

29

Durante os últimos quatro anos, passei meus dias e algumas noites em diferentes laboratórios. 30

Como sou grata aos colegas, amigos e parceiros que caminharam ao meu lado! Sem eles a 31

caminhada teria sido muito mais árdua. Obrigada pelo apoio a todos os colegas e amigos do 32

LEFM e do STLO. Às estagiárias Dalila Lapinha e Bárbara Nogueira, pela ajuda na execução 33

8 dos experimentos. Às técnicas Clélia, Paulette Ammet, Jessica Musset e Martine Deplanche 1

pela disposição em ajudar de forma inestimável nos bastidores dos experimentos, do início ao 2

fim. Aos colegas que me ajudaram direta ou indiretamente e que me deram força e motivação, 3

um enorme obrigada a todos vocês! Em meio a coletas, bancada, fluxo, sala de estudos, 4

cozinha e horas fora do laboratório, amizades se formaram e com cada uma dessas pessoas 5

um laço se fez: Tássia Costa, Bárbara Porto, Candelária Moreno, Nadia Berkova, Paulette 6

Amet, Anne Dolivet, Martine Deplanche, Lélia Lacou, Wanderson Silva, Rachid El Aouar, 7

Flávia Aburjaile, Na Li. Como sou abençoada por merecer essas amizades! Um 8

agradecimento especial a Nadia Berkova pela acolhida verdadeira em Rennes e pela amizade 9

especial; e a Paulette Amet, Flávia, Samir e Regina Aburjaile por estarem presentes na hora 10

certa para me dizer o que era imperativo ouvir. Essas passagens não serão esquecidas. Todas 11

essas amizades especiais que ultrapassam barreiras são algo do qual não sei mais abrir mão 12

para viver. 13

14

Esse trabalho contou com outros orientadores, outros mestres. Prof. Luiz Simeão do Carmo 15

me ensinou o amor pela profissão e foi exemplo de dedicação. E isso me foi essencial para 16

caminhar. Seus ensinamentos sobre Staphylococcus aures guardo comigo, assim como seus 17

exemplos e o carinho. Prof. Iran Borges, meu primeiro orientador de iniciação científica, 18

amigo, Mestre, guia. Obrigada por me ensinar o trabalho em equipe, o respeito pelas pessoas, 19

pelos animais, o amor pela profissão e a ética. Obrigada pelos conselhos, pelas ajudas, pela 20

constante acolhida e por me resgatar nos momentos em que precisei. Com seu apoio, tive a 21

coragem de me manter firme aos meus propósitos e à minha moral para atravessar as 22

passagens difíceis e inevitáveis no processo de se desenvolver como indivíduo e como 23

cientista, profissão que escolhi por amor. A Ana Senra sou grata pela escuta certa, por ter sido 24

o fio que não se rompeu e me ligou às minhas referências no momento em que estive longe de 25

casa. Representou o que eu tinha de estável. 26

27

Quando se está longe, os referenciais se perdem facilmente, os amigos se fazem ausentes e a 28

aridez amedronta. O que torna o aproveitamento desses períodos algo, além de possível, 29

positivo, é a consciência de que há algo permanente, guardado e protegido. Falo do 30

sentimento de pertencimento e de apoio não incondicional, porém constante. Essa luta não 31

travei sozinha; tive a meu lado minha família que tanto amo. A meu pai Blair de Assis 32

agradeço pelo encorajamento e torcida contínuos, além do estímulo a alçar grandes vôos. A 33

minha mãe Ana Seridan de Assis agradeço pelo apoio nas ações diárias e por me permitir 34

9 sentir-me acolhida e livre, esse tão lindo e difícil equilíbrio. A minha irmã Rebeca Araújo pela 1

amizade, pela cumplicidade e por acreditar sempre em mim, mesmo mais do que eu; e ao meu 2

afilhado Arthur Araújo sou grata pela motivação que me da à vida. A certeza de vocês se 3

torna a minha e isso me impulsiona por caminhos que eu não me conhecia capaz. Sou 4

eternamente grata a vocês! Contei ainda com o apoio e o encorajamento de Hilda Souza, Mara 5

Souza, Arline Assis e Amerina Rocha. Essa cumplicidade foi valiosa. Aos tios e primos 6

próximos e distantes que torceram por mim muito obrigada! 7

8

Ha ainda as amizades que resistem ao tempo. Resistem porque se admira, porque se gosta, 9

porque se sente bem, porque se encoraja, por que se torna mais forte. Rebeca Araújo 10

(escolheria se precisasse), Janine Arruda, Fernanda Ataíde, Flávia Gama, Renata Horta, Nina 11

Salomé, Rachel Segall, Alice Drummond; sem vocês eu teria rido bem menos! Dividir as 12

conquistas e as tristezas é o que torna um caminho legítimo e com vocês legitimei o meu. 13

Muito obrigada por poder sempre contar com vocês! 14

15

Ao Erik, agradeço por um dia após o outro, pelos pés no chão e pela calma inabalável. 16

Obrigada por dividir comigo esse tortuoso caminho, assim como essa passagem, tão 17

importantes para mim. Obrigada ainda por me impelir a fazer planos e acreditar que o melhor 18

ainda está por vir. 19

20

Por fim, agradeço ao processo de doutoramento, onde não encontrei exatamente o que eu 21

buscava, mas encontrei justamente o que eu precisava. Pelos meios que menos se imagina, 22

nos tornamos pessoas melhores, se as oportunidades que nos forem dadas forem bem 23

aproveitadas. Sou enormemente grata por ter tido essa oportunidade. 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

―É melhor ser alegre que ser triste 18

Alegria é a melhor coisa que existe‖ 19

Vinicius de Moraes 20

21

11

Resumo

1

A mastite apresenta um impacto económico considerável em regiões produtoras de leite de 2

diversos países, inclusive Brasil e França. Ela é a principal causa do uso de antibióticos em 3

fazendas leiteiras que necessitam atender a forte demanda social para que a agricultura utilize 4

menos insumos e ajam de forma mais respeitosa com o meio ambiente e com o bem-estar 5

animal. Dessa forma, há uma necessidade real de encontrar ferramentas alternativas e eficazes 6

para o controle da mastite infecciosa bovina. Esta tese teve como objectivo a pesquisa de 7

linhagens de bactérias lácticas (BL) com capacidade inibidora de infecção mamária bovina e 8

que possam ser utilizadas como probióticos. Para isso, 278 (165 na França e 113 no Brasil) 9

estirpes bacterianas foram isoladas a partir de leite recém-colhido e canal do teto de vacas 10

leiteiras e nove linhagens de BL não redundantes foram identificadas e caracterizadas com 11

base nas suas propriedades de parede e de produção de compostos inibidores antes de avaliar 12

suas interações com agentes patógenos causadores de mastite responsável e/ou as células 13

hospedeiras em um modelo de células epiteliais mamárias bovinas (CBSS). Algumas cepas de 14

Lactobacillus brevis e Lactobacillus plantarum mostraram uma boa capacidade de adesão em

15

células epiteliais, o que poderia inibir a invasão por Staphylococcus aureus, um importante 16

patógeno associado à mastite e responsável por estimular a produção de citocinas pró e anti-17

inflamatórias pelas CBSS. Outros ensaios de interação com as linhagens celulares por co-18

inoculação revelou que a estirpe de Lactococcus lactis V7 foi capaz de inibir 19

significativamente a invasão de CEMB por Escherichia coli e S. aureus. O mecanismo exacto 20

desta inibição não foi elucidado, mas a linhagem V7 apresenta uma elevada capacidade de co-21

agregação a E. coli. Lactococcus lactis V7 também foi capaz de modular a resposta imune de 22

CEMB infectadas por E. coli por modificar a intensidade de expressão de genes de citoquinas 23

inflamatórias. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, sugere-se que cepas de L. brevis, 24

L. plantarum e L. lactis V7 tem características interessantes para uma possível estratégia para

25

prevenir ou combater a mastite. Essas linhagens de BL são de fato capazes de inibir o 26

crescimento e a adesão e/ou invasão de bactérias patogénicas e de modular a resposta imune 27

das células hospedeiras. 28

29

12

Resumé

1

Les mammites ont un impact économique considérable dans les régions productrices de lait de 2

divers pays, dont le Brésil et la France. Elles constituent la première cause de consommation 3

d’antibiotiques dans les élevages laitiers qui doivent répondre à une forte demande sociétale 4

pour une agriculture consommant moins d’intrants et plus respectueuse de l’environnement et 5

du bien-être animal. Il y a donc une réelle nécessité de trouver des outils alternatifs efficaces 6

pour le contrôle des mammites bovines infectieuses. Ce travail de thèse a eu comme objectif 7

la recherche de souches de bactéries lactiques (BL) ayant des capacités inhibitrices de 8

l´infection mammaire, pouvant être utilisées comme probiotiques mammaires. Pour cela, 278 9

(165 en France et 113 au Brésil) souches bactériennes ont été isolées à partir de lait et de la 10

superficie et du canal du trayon de vaches laitières et 9 souches non-redondantes de BL ont 11

été identifiées et caractérisées en fonction de leurs propriétés de paroi et de production de 12

composés inhibiteurs avant d´évaluer leurs interactions avec des agents pathogènes 13

responsables de mammites et/ou avec les cellules hôtes dans un modèle de cellules 14

épithéliales mammaires bovines (CEMb). Certaines souches de Lactobacillus brevis e 15

Lactobacillus plantarum ont montré une bonne capacité d’adhésion aux cellules épithéliales

16

ce qui pourrait inhiber l´invasion par Staphylococcus aureus, un pathogène majeur 17

responsable de mammites, et de stimuler la production de cytokines pro- et anti-18

inflammatoires par les CEMb. D´autres tests d'interaction avec des lignées cellulaires en co-19

inoculation ont mis en évidence que la souche Lactococcus lactis V7 était capable d´inhiber 20

de manière significative l'invasion des CEMb par Escherichia coli et S. aureus. Le mécanisme 21

exact de cette inhibition n´a pas été élucidé, mais la souche L. lactis V7 a montré des 22

capacités prometteuses en termes de probiotique mammaire, notamment, la capacité de 23

moduler la réponse immunitaire des CEMb infectées par E. coli en intensifiant la réponse 24

inflammatoire. A partir des résultats obtenus au cours de ce travail, on peut suggérer que des 25

souches de L. brevis, L. plantarum et L. lactis V7 présentent des qualités intéressantes pour 26

une possible stratégie de prévention voire de lutte contre la mammite. Ces souches sont en 27

effet capable d'inhiber la croissance et l'adhésion et/ou l'invasion de bactéries pathogènes et de 28

moduler la réponse immunitaire des cellules-hôte. 29

30

13

Abstract

1

Mastitis causes huge economic losses in the dairy sector both in Brazil and France. They also 2

are the first cause of antibiotic consomption in the dairy farms. There is thus a need for new 3

alternatives to antibiotics to control infectious mastitis. In this thesis work, we isolated 278 4

(165 in France and 113 in Brazil) bacterial strains from bovine milk and teat canal, and 5

identified 9 non-redundant lactic acid bacteria (LAB) strains that were further tested as 6

potential mammary probiotic candidates. LAB strains were tested for their surface properties 7

and production of inhibitory compounds and then evaluated for their interactions with 8

Staphylococcus aureus and Escherichia coli, two major mastitis pathogens, or with bovine

9

mammary epithelial cells (bMEC), in vitro. Some LAB strains (Lactobacillus brevis e 10

Lactobacillus plantarum) presented inhibitory capacity against S. aureus adhesion and

11

internalisation and were shown to stimulate the production of pro- and anti-inflammatory 12

cytokines in bMEC. Other interaction tests with bMEC showed that Lactococcus lactis V7 13

was able to significantly inhibit bMEC invasion by Escherichia coli and S. aureus. Although 14

the inhibitory mechanism was not elucidated, Lactococcus lactis V7 showed promising 15

capacities in terms of mammary probiotic potential with, notably, the ability to modulate the 16

immune response of E. coli-infected bMEC by modifying the expression of inflammatory 17

cytokine genes. In this work, several LAB strains were identified in the milk and teat canal 18

microbiota. We showed that L. brevis, L. plantarum and Lactococcus lactis V7 strains had 19

interesting properties for a possible strategy to prevent or treat against mastitis. 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

14 1

Apresentação

2

3

Para a apresentação da presente tese, às seguintes normas foram estipuladas pelo Convênio de 4

Co-tutela Internacional de Tese assinado entre a Agrocampus Oeste (França) e a Universidade 5

Federal de Minas Gerais – UFMG (Brasil): A tese será redigida em português. O formato 6

adotado será por apresentação de "artigos científicos." Sendo assim, a seção de resultados

7

irá apresentar todo o trabalho de tese no formato de artigos científicos escritos em inglês

8

(publicados, submetidos ou a serem submetidos para publicação). Cada capítulo terá um

9

resumo em francês e um em português. Um resumo expandido apresentando toda a tese

10

(incluindo as seções de introdução e discussão-perspectiva) será escrito em francês.

11

Finalmente, resumos da tese serão escritas em português, francês e inglês. Portanto, essa tese

12

foi organizada em dois capítulos que abordam a busca por soluções probióticas para controle 13

de mastite bovina. Esses dois capítulos são precedidos por uma revisão de literatura e 14

seguidos por uma conclusão geral e perspectivas. 15

16

O primeiro capítulo trata da seleção de linhagens bacterianas láticas com potencial para uso 17

como probiótico mamário. Para tal, linhagens de bactérias ácido láticas previamente isoladas 18

do canal do teto de vacas leiteiras na França e identificadas, foram avaliadas quanto a sua 19

interação com células mamárias bovinas MAC-T. Algumas amostras se destacaram pelo alto 20

poder de adesão às células hospedeiras, o que poderia inibir a adesão de patógenos, 21

comprometendo sua capacidade de infecção. Essas amostras foram então avaliadas quanto a 22

seu perfil de imunomodulação, em modelos celulares humanos, permitindo o destaque de 23

linhagens potencialmente antiinflamatórias. O conjunto dos dados permitiu selecionar três 24

linhagens com potencial para uso como probiótico no controle de mastites bovinas. Esse 25

trabalho continuou posteriormente com a análise genômica de cinco cepas selecionadas para 26

investigação de proteínas possivelmente relacionadas à capacidade de adesão, bem como de 27

presença de genes de resistência e será então submetido a um jornal científico internacional. 28

29

No segundo capítulo, entre linhagens de bactérias ácido láticas previamente isoladas de leite e 30

swab de úberes bovinos oriundos do Brasil, foi selecionada uma linhagem de Lactococcus

31

lactis denominada V7. Essa linhagem inibiu acentuadamente a invasão de células mamárias

32

bovinas da linhagem PS por Escherichia coli e Staphylococcus aureus, dois dos principais 33

15 patógenos envolvidos na mastite. O mecanismo pelo qual essa inibição ocorre não foi 1

elucidado, porém observou-se a capacidade de V7 em co-agregar com E. coli, bem como em 2

provocar alterações na resposta inflamatória de células PS em infecções in vitro. Em presença 3

de Lactococcus lactis V7, células infectadas expressam maiores níveis de IL-8, IL-6 e TNF-α, 4

enquanto a expressão de TLR2 e TLR4 foi regulada. A partir dessas observações, pode ser 5

sugerido L. lactis V7 como um instrumento em potencial para uso em controle de infecções 6

mamárias bovinas. Esse trabalho foi encaminhado na forma de artigo à revista Beneficial 7 Microbes (Holanda). 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

16

Présentation

1

2

Pour la présentation de le thése, les normes suivantes ont été prévues dans l'accord de co-3

tutelle de thèse internationale signé entre l´Agrocampus Ouest (France) et l'Université 4

Fédérale de Minas Gerais - UFMG (Brésil): Le mémoire de thèse sera rédigé en portuguais. 5

Le format de rédaction adopté sera une « rédaction sur articles ». En conséquence, la section

6

Résultats présentera l’ensemble des travaux de la thèse au format d’articles scientifiques

7

rédigés en anglais (parus, soumis ou à soumettre pour publication). Chaque chapitre de

8

résultats fera l’objet d’un résumé en français et en portugais. Un résumé amplifié reprenant

9

l’ensemble de la thèse (y compris les sections introduction et discussion-perspective) sera

10

rédigé en français. Enfin, les résumés de la thèse seront rédigés en portugais, français et

11

anglais.

12

Par conséquent, cette thèse est organisée en deux chapitres qui traitent de la recherche de 13

solutions probiotiques pour le contrôle de la mammite bovine. Ces deux chapitres sont 14

précédés par une revue de la littérature et suivis par une conclusion générale et des 15

perspectives. 16

17

Le premier chapitre traite de la sélection de souches bactériennes lactiques avec un potentiel 18

d'utilisation comme probiotiques mammaires. Pour cela, des souches de bactéries lactiques 19

préalablement isolées du canal du trayon de vaches laitières et identifiées, ont été évaluées 20

quant à leur interaction avec des cellules mammaires bovines MAC-T. Quelques souches se 21

sont distinguées par leur grand pouvoir d'adhésion aux cellules hôtes, ce qui pourrait inhiber 22

l'adhésion d´agents pathogènes, compromettant leur infectivité. Ces échantillons ont ensuite 23

été évalués pour leur profil immunomodulateur dans une modèle cellulaire humaine, ce qui a 24

permis de mettre en valeur des souches potentiellement anti-inflammatoires. L'ensemble de 25

ces données a permis de sélectionner trois souches ayant un potentiel pour une utilisation en 26

tant que probiotique dans le contrôle de la mammite bovine. Ce travail s’est poursuivi après la 27

fin de la thèse avec l'analyse génomique de cinq souches sélectionnées pour la recherche de 28

protéines correlationées à la capacité d’adhésion, et aussi de la présence de génes de 29

resistence à des antibiotiques. Les résultats seront soumis à publication dans une revue 30

scientifique internationale. 31

17 Dans le deuxième chapitre, parmi des souches de bactéries lactiques isolées de lait e de frottis 1

de trayon bovins provenant du Brésil, nous avons sélectionné une souche de Lactococcus 2

lactis, V7. Cette souche a fortement inhibé l'invasion de cellules mammaires bovines de la

3

lignée MAC-T par Escherichia coli et Staphylococcus aureus, deux des principaux agents 4

pathogènes intervenant dans la mammite. Le mécanisme par lequel se produit cette inhibition 5

n’est pas été élucidé, mais il a été observé que L. lactis V7 présentait un léger profil pro-6

inflammatoire lorsqu’elle était mise en contact de MECb (lignée PS) et qu’elle intensifiait la 7

réponse inflammatoire de cellules PS infectées par E. coli in vitro. En présence de L. lactis 8

V7, les cellules infectées ont exprimé des niveaux plus élevés d'IL-8, IL-6 et TNF-α, alors que 9

l’expression de TLR2 et TLR4 a été différement régulée. A partir de ces observations, L. 10

lactis V7 peut être envisagé comme un outil potentiel pour une utilisation dans le contrôle des

11

infections mammaires bovines. Un manuscript contenant les résultats de cette étuda a été 12

soumis à la revue Beneficial Microbes (Pays-Bas). 13

14 15

18

Introdução e justificativa

1

2

A mastite é uma doença inflamatória, geralmente causada por infecção, que afeta rebanhos 3

leiteiros e impacta fortemente a saúde animal, a produção e a transformação de leite. Essa 4

doença pode ser separada em dois grupos, sendo o ambiental associado a micro-organismos 5

presentes no ambiente, normalmente agravadas na estação de chuvas, e o contagioso de rápida 6

disseminação entre os animais do rebanho. Ambos os tipos de mastite podem se apresentar na 7

forma clínica ou subclínica assintomática. A mastite infecciosa é um dos maiores problemas 8

de saúde animal que afetam a produção de leite no mundo, levando a grandes perdas 9

econômicas, que pode atingir proporções de grande importância em regiões produtoras de 10

leite de diversos países, inclusive no Brasil e na França. 11

12

O custo anual da mastite causada por Staphylococcus aureus, Staphylococcus uberis e 13

Escherichia coli em rebanhos leiteiros no mundo chegou a 4.896,00 € para 100 vacas (Halasa

14

et al., 2009). A mastite causada por diferentes agentes leva a perdas de US$ 100,00 por vaca

15

por ano, considerando o uso de antimicrobianos, descarte de leite, descarte prematuro de 16

vacas e redução da capacidade de produção de leite por vacas acometidas (Francis, 2005), 17

podendo ser ainda maior se considerados apenas os casos de mastite clinica (Huijps et al., 18

2008). 19

20

A mastite é a principal causa do uso de antibióticos em propriedades leiteiras. A antibioterapia 21

é utilizada tanto no tratamento quanto na prevenção da mastite, e seu uso exige grande 22

atenção ao respeito do período de carência dos diferentes medicamentos utilizados a fim de se 23

evitar a venda e o consumo de leite com resíduos de antibiótico. Essa exigência é uma das 24

grandes fontes de perdas econômicas nas propriedades leiteiras. Suscetíveis à recente 25

tendência à busca por produtos obtidos de produções responsáveis, a produção de leite, bem 26

como todas as actividades agropecuárias, se vê pressionada a responder a uma forte demanda 27

social para uma agricultura sustentável, que utilize menos insumos e que seja mais respeitosa 28

com o meio ambiente e o bem-estar animal. Por isso, é necessidade atual e crescente a 29

redução do consumo de antibióticos veterinários para se evitar, entre outros problemas, o 30

aparecimento de linhagens de agentes patogénicos transmissíveis ao homem resistentes aos 31

antibióticos disponíveis no mercado. 32

19

S. aureus é a causa mais freqüente de mastite clínica em rebanhos caprinos e ovinos e sua

1

prevalência em mastite subclínica é alta em bovinos (Cardoso, 2000; Pugh, 2005; Ericson et 2

al. 2009; Botrel et al., 2010). Além das mastites causadas por micro-organismos Gram

3

positivos, aquela causada por Gram negativos é de alta relevância por ocorrer em maior 4

freqüência nos períodos iniciais da lactação, bem como por causar maior intensidade de sinais 5

clínicos sistêmicos (Berkama et al., 1998). Dos micro-organismos Gram negativos 6

envolvidos, E. coli é o mais prevalente (Lehtolainen et al. 2003). A contaminação do úbere 7

bovino por esses micro-organismos é de grande importância pela alta frequência com que 8

alcançam o leite que sai da glândula já com altos índices de contaminação (Carmo, 1999). 9

Além da facilidade com que S. aureus e E. coli atinge o leite cru, é de grande relevância o fato 10

de o leite ser um meio rico em nutrientes e um excelente meio de cultivo para diversos micro-11

organismos, que nele se desenvolve rapidamente, desde que em temperatura de estocagem 12

inadequada (Jay, 1996). 13

14

A fim de atender à demanda atual e reduzir o uso veterinário de antibióticos, várias estratégias 15

de controle da mastite foram desenvolvidas, sendo alguns já disponíveis no mercado. Porém 16

todos têm eficácia limitada. Este é o casoda maioria das vacinas em busca da prevenção dessa 17

doença nos rebanhos, que têm como alvo um único micro-organismo ou um grupo restrito. 18

Sendo a mastite uma doença multifatorial, essa estratégia deve se somar às práticas de 19

diferentes manejos a fim de se avitar a contaminação de animais pelo solo ou entre si. Da 20

mesma forma, a mastite causada por determinados agentes patogénicos, tais como 21

Staphylococcus aureus, apresenta uma taxa de cura muito limitada após o tratamento

22

antibiótico. Portanto, há ainda uma necessidade real de encontrar ferramentas alternativas e 23

verdadeiramente eficazes para o controle da mastite infecciosa bovina. 24

25

As bactérias do ácido lático (BAL) são micro-organismos envolvidos nos processamentos 26

fermentativos do leite e são provenientes dos ecossistemas microbianos do próprio leite e do 27

úbere. Além do envolvimento tecnológico na produção de derivados fermentados do leite, 28

essas bactérias são importantes na preservação e proteção do ambiente mamário. Por serem 29

consideradas, em sua maioria, pela Organização Mundial de Saúde, como micro-organismos 30

seguros para o consumo humano, as BAL são de grande interesse para uso no controle de 31

doenças. É importante, portanto, conhecer melhor micro-organismos benéficos como as BAL 32

e suas interações tanto com os patógenos normalmente associados à mastite como com as 33

20 células do hospedeiro bovino. O presente estudo tem este objetivo, com ênfase nas BAL e nos 1

patogênicos S. aureus e E. coli presentes no leite de bovinos com ou sem mastite clínica. 2

3

Esta tese teve como objetivo a procura de cepas de bactérias do ácido láctico (BAL) com 4

capacidade inibitória da infecção mamária para que elas possam ser usadas como probióticos 5

no ambiente do úbere. Para tal, 278 cepas de BAL foram isoladas, identificadas por 6

sequenciamento de DNA 16S e caracterizadas de acordo com as suas interações com 7

patógenos associados à mastite e/ou com o hospedeiro em modelos de cultura celular. 8

9

Na interação com linhagens de células mamárias cultivadas, cepas de BAL foram 10

selecionadas por suas propriedades elevadas de adesão. Essa propriedade pode ser um factor 11

de inibição de agentes patogénicos, podendo assim bloquear o primeiro e fundamental passo 12

da invasão de tecidos por micro-organismos patogênicos. Algumas cepas de BAL mostraram 13

também uma capacidade de estimular a produção de citocinas pró-e anti-inflamatórias por 14

células epiteliais mamárias bovinas (CEMB), o que poderia ser usado como um mecanismo 15

de controle da mastite pela modulação da resposta imune do hospedeiro. 16

17

Outros testes de interação em cultura de células por co-inoculação revelou que a cepa 18

Lactococcus lactis V7 foi capaz de inibir significativamente a invasão de CEMB por E. coli e

19

por S. aureus. O mecanismo exacto desta inibição não foi elucidado, porém a alta capacidade 20

de co-agregação da cepa L. lactis V7 com E. coli poderia ser uma explicação plausível. L. 21

lactis V7 também foi capaz de modular a resposta imune de CEMB infectados por E. coli,

22

modificando a intensidade de expressão de genes de citocinas inflamatórias. 23

24

A partir dos resultados obtidos neste estudo, sugere-se que cepas de BAL, em particular L. 25

lactis V7, êem características interessantes para uma possível estratégia de prevenção ou de

26

tratamento da mastite. Essas cepas são de fato capazes de inibir a adesão e/ou a invasão de 27

bactérias patogénicas e de modular de forma positiva a resposta imune das células 28 hospedeiras. 29 30 31 32

21

Introduction et justification

1

2

La mammite est une maladie inflammatoire généralement causée par une infection qui affecte 3

les troupeaux laitiers et qui a un grand impact sur la santé animale, la production et la 4

transformation du lait. Cette maladie peut être séparée en deux groupes, la mammite 5

environnementale étant associée à des micro-organismes du milieu ambiant, généralement 6

exacerbée durant la saison des pluies, et la mammite infectieuse rapidement disseminée parmi 7

les animaux du troupeau. Les deux types de mammites peuvent être clinique ou subclinique 8

asymptomatique. La mammite infectieuse est l'un des principaux problèmes de santé animale 9

affectant la production de lait dans le monde, conduisant à d'énormes pertes économiques, qui 10

peuvent atteindre des proportions très importantes dans les régions productrices de lait de 11

nombreux pays, dont le Brésil et la France. 12

13

Le coût annuel de la mammite causée par Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis et 14

Escherichia coli dans les troupeaux laitiers dans le monde a été estimé à 4.896,00 € pour 100

15

vaches (Halasa et al., 2009). Les mammites causées par différents agents entraînent des 16

dépenses liées à l'utilisation d´antimicrobiens, à la perte de lait, à l´élimination prématurée de 17

vaches productrices et à la réduction de la capacité de production de lait par les vaches 18

touchées (Francis, 2005). Leur coût peut être encore plus élevé si l'on considère uniquement 19

les cas de mammite clinique (Huijps et al., 2008). 20

21

La mammite est la principale cause de l'utilisation d'antibiotiques dans les élevages laitiers. 22

L’antibiothérapie est strictement réglementée. Elle n’est utilisée que pour le traitement des 23

mammites et son utilisation est exclue des démarches prophylactiques. Elle nécessite une 24

grande attention de la part des producteurs en fonction des différents médicaments utilisés 25

pour éviter la vente et la consommation de lait contenant des résidus d'antibiotiques. Cette 26

exigence est une des sources importantes de pertes économiques dans les élevages laitiers. 27

Sensible à la tendance récente de recherche de produits issus de la production durable, la 28

production de lait, ainsi que toutes les activités agricoles, se voient pressées de répondre à une 29

forte demande sociale pour une agriculture qui utilise moins d´intrants et qui soit plus 30

respectueuse de l'environnement et du bien-être animal. Pour cela, il y a un besoin actuel et 31

croissant de réduire la consommation d'antibiotiques vétérinaires pour éviter, entre autres 32

22 problèmes, l'émergence de souches d'agents pathogènes transmissibles à l'homme résistantes 1

aux antibiotiques disponibles sur le marché. 2

3

Staphylococcus aureus est la cause la plus fréquente de la mammite clinique dans les

4

troupeaux de chèvres et de moutons et sa prévalence est élevée en mammite subclinique chez 5

les bovins (Cardoso, 2000; Pugh, 2005; Ericson et al 2009; Botrel et al., 2010). En plus des 6

mammites causées par des bactéries à Gram positif, celles causées par des bactéries à Gram 7

négatif ont un impact important: elles se produisent plus fréquemment dans les premiers 8

stades de la lactation, et induisent des signes cliniques systémiques de grande intensité 9

(Berkama et al., 1998). Des bactéries à Gram négatif impliquées, Escherichia coli est la plus 10

répandue (Lehtolainen et al., 2003). La contamination de la mamelle bovine par ces micro-11

organismes a un impact important sur la transformation laitière notamment par la 12

contamination du lait qui sort de la glande infectée (Carmo, 1999). Outre la facilité avec 13

laquelle S. aureus et E. coli atteignent le lait cru, le fait que celui-ci soit un milieu riche en 14

nutriments et un excellent milieu de culture pour divers micro-organismes est d'une grande 15

importance pour qu'ils s´y développent rapidement, en cas de température de stockage 16

incorrecte (Jay, 1996). 17

18

Afin de répondre à la demande actuelle et réduire l'utilisation massive d'antibiotiques à usage 19

vétérinaire, plusieurs stratégies de contrôle de la mammite ont été développées, dont certaines 20

sont déjà sur le marché. Mais toutes ont une efficacité limitée. C’est le cas de la plupart des 21

vaccins utilisés pour la prévention de cette maladie dans les troupeaux, qui ciblent un seul 22

micro-organisme ou un groupe restreint. Comme la mammite est une maladie multifactorielle, 23

cette stratégie devrait être appliquée en même temps que des pratiques spécifiques de traite 24

pour éviter la contamination des animaux par le sol ou entre eux. De même, la mammite 25

provoquée par certains pathogènes, tel que S. aureus, a un taux de guérison très limité après 26

un traitement antibiotique. Donc, il y a encore un réel besoin de trouver des alternatives 27

vraiment efficaces pour le contrôle de la mammite bovine infectieuse. 28

29

Les bactéries lactiques (BL) sont des micro-organismes largement utilisés dans les 30

fermentations laitières Outre l'implication technologique dans la production de dérivés laitiers 31

fermentés, les BL sont présentes au sein de divers écosystèmes (intestinal, vaginal, mais aussi 32

mammaire) et pourraient exercer un rôle dans la protection de l'environnement de la glande 33

mammaire. L’Organisation Mondiale de la Santé considère la plupart des BL comme des 34

23 micro-organismes sûrs pour la consommation humaine, et les BL sont d'un grand intérêt pour 1

une utilisation dans le contrôle de certaines maladies. Il est donc important de mieux connaître 2

les micro-organismes bénéfiques comme les BL et leurs interactions aussi bien avec les 3

pathogènes normalement associés à la mammite comme avec les cellules de l'hôte bovin. 4

Notre étude a eu cet objectif, en mettant l'accent sur les BL et les agents pathogènes E. coli et 5

S. aureus présents dans le lait de vache avec ou sans mammite clinique.

6 7

Cette thèse vise à chercher des souches de BL ayant une capacité d'inhibition de l'infection 8

mammaire de sorte qu'elles puissent être utilisées comme probiotiques dans l'environnement 9

de la glande mammaire bovine. Pour cela, 278 souches de BL ont été isolées, identifiées par 10

séquençage de l'ADN 16S, caractérisées en fonction de leurs interactions avec des agents 11

pathogènes associés à la mammite et/ou avec l’hôte en modèle de culture cellulaire. 12

13

Sur la base de leur interaction avec des cellules épithéliales mammaires bovines (CEMb) en 14

culture, des souches de BL ont été sélectionnées pour leurs propriétés d'adhésion élevées. 15

Cette propriété peut être un facteur d´inhibiton de pathogènes, pouvant ainsi bloquer la 16

première étape cruciale dans l'invasion des tissus par des micro-organismes pathogènes. 17

Certaines souches de BL ont également montré une capacité de stimuler la production de 18

cytokines pro-inflammatoires par les CEMb, ce qui pourrait être utilisé comme un mécanisme 19

de contrôle de la mammite par modulation de la réponse immunitaire de l'hôte. 20

21

D'autres tests d'interaction en culture cellulaire par co-inoculation ont révélé que la souche 22

Lactococcus lactis V7 est capable d'inhiber de manière significative l’invasion des CEMbpar

23

E. coli et S. aureus. Lactococcus lactis V7 est aussi capable de moduler la réponse

24

immunitaire de CEMb infectées par E. coli par modification de l'intensité de production d’IL-25

8 et d’expression de gènes de cytokines inflammatoires. 26

27

A partir des résultats obtenus dans cette étude, on peut suggérer des souches de BL, dont 28

Lactococcus lactis V7 en particulier, ont des caractéristiques intéressantes pour une stratégie

29

de prévention ou de traitement des mammites bovines. Ces souches sont en effet capables 30

d'inhiber l'adhésion et/ou l’internalisation de bactéries pathogènes et de moduler positivement 31

la réponse immunitaire des cellules hôtes. 32

24

Revisão de literatura

1

2

1. Ecossistema mamário bovino

3

4

1.1. Anatomia

5 6

As glândulas mamárias das fêmeas de mamíferos ruminantes apresentam em seu parênquima 7

unidades morfofuncionais denominadas adenômeros, responsáveis pela secreção láctea. Essas 8

unidades secretoras encontram-se albergadas e suspensas pelo estroma glandular, ou sistema 9

suspensor da glândula composto pela fáscia superficial do tronco, as lâminas lateral e média e 10

lamelas de sustentação, que mantém as glândulas fixadas à parede ventral da região inguinal. 11

O conjunto de parênquima e estroma é denominado úbere. 12

13

O úbere de ruminantes é composto por unidades glandulares distribuídas simetricamente de 14

cada lado da linha mediana do tronco. Nas fêmeas bovinas há quatro unidades glandulares 15

denominadas quartos mamários, sendo dois craniais, direito e esquerdo, e dois caudais. Essas 16

unidades são completamente separadas pelas lâminas mediais, compondo unidades 17

glandulares independentes, produzindo quantidades distintas de leite. Essa separação 18

impossibilita a passagem de fármacos de administração local entre os quartos. Porém, a 19

passagem para a corrente sanguínea pode ocorrer, podendo alguns fármacos chegar assim a 20

outros quartos (Pugh, 2005). 21

22

Cada unidade secretora se apresenta na forma de lóbulos compostos por alvéolos glandulares 23

unidos uns aos outros e cobertos internamente por epitélio isoprismático de camada única, que 24

produzem os componentes do leite e o secretam. Entre os alvéolos há septos de tecido 25

conjuntivo por onde passam nervos e vasos sanguíneos e são esses septos que, quando 26

maiores em diâmetro, separam o parênquima em lóbulos. O leite secretado pelos alvéolos é 27

drenado pelos ductos lactíferos e, ao se unirem, formam o seio lactífero em sua porção 28

glandular. Uma prega na mucosa, denominada Roseta de Furstenberg alberga um plexo 29

venoso de grande importância para a vascularização do úbere e divide o seio lactífero em sua 30

porção glandular, mais calibrosa e sua porção mais estreita, ou papilar, localizada na papila 31

mamária ou teto (Figura 1). 32

25 1

Cada quarto mamário das fêmeas bovinas possui uma ligação individual com o meio externo, 2

se dando através da porção papilar do seio lactífero, o ducto papilar, culminando no óstio 3

papilar que é único por papila, diferente dos equinos e humanos, em que a ligação da glândula 4

com o meio externo é feita por diversos óstios papilares. 5

6

7

Figura 1: Glândula mamária bovina 8

Fonte: Unión Ganadera Regional de Jalisco 9

http://www.ugrj.org.mx/index.php?option=com_content&task=view&id=459&Itemid=376 10

11

1.2. Produção e secreção do Leite

12 13

A secreção do leite produzido nos alvéolos ocorre mediante estímulos táteis, visuais ou 14

auditivos, mediados por respostas hormonais. A produção de leite nos alvéolos ocorre de 15

forma diferenciada nos diversos tipos de mamíferos. Na glândula bovina a secreção de leite 16

ocorre de forma separada nas células mamárias secretórias. A gordura, as proteínas e os 17

componentes solúveis são secretados no alvéolo e, só então se misturam, formando o leite 18

(Foley et al., 1972). Essa secreção ocorre de forma merócrina em bovinos, sem perda de 19

material citoplasmático, o que torna a contagem eletrônica de células somáticas um bom 20

método de monitoramento de mastite subclínica em um rebanho bovino, diferentemente da 21

secreção na glândula caprina, que ocorre de forma apócrina, com perda parcial de material 22

citoplasmático, o que resulta em superestimação da contagem para esses animais (Pugh, 23 2005). 24 25 Cisterna do teto Músculo liso Epiderme Músculo esfínster Canal do teto

26

2. Leite

2.1. Conceito

Segundo a Instrução Normativa nº 62, anexo IV (Brasil, 2011), ―Entende-se por leite, sem 5

outra especificação, o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta, em condições de 6

higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite de outras espécies deve 7

denominar-se segundo a espécie da qual proceda‖. Dessa forma, o uso do termo ―leite de 8

vaca‖ seria uma redundância. Nesse conceito está incluído o leite cru, que por não ter sofrido 9

processamento térmico, não está adequado ao consumo humano, visto no anexo III da mesma 10

IN 51 (Brasil, 2002), logo não deve ser considerado um alimento, segundo RIISPOA (Brasil, 11 1952). 12 13

2.2. Composição do leite

Uma vez esclarecido o conceito, passamos à composição desse produto de origem animal, que 16

varia de acordo com sua origem, bem como com a raça, a idade do animal, o número de 17

partos, a alimentação do animal, a época do ano, o período de lactação e o momento da 18

extração. Tomando o parâmetro legal, aceitaremos o leite bovino como referência para 19

compreender sua composição média. 20

21

Seus componentes de maior teor percentual estão apresentados na Tabela 1. 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

27 Tabela 1: Composição quantitativa do leite

1 2

Constituinte Limites de variação (%) Teor percentual médio

Água 85,5 – 89,5 87,5 Sólidos totais 10,5 – 14,5 13,0 Gordura 2,5 – 6 3,9 Proteína 2,9 – 5,0 3,4 Lactose 3,6 – 5,5 4,8 Minerais 0,6 – 0,9 0,8 Fonte: Bylund, 1995 3 4

2.3. Sistemas antimicrobianos

Várias enzimas são encontradas no leite, que é uma emulsão tamponada de gordura em água. 7

Elas atuam em diversos sistemas, em temperaturas e pH adequados. As enzimas presentes no 8

leite têm origem biológica ou se dão por produção microbiológica e varia com a composição e 9

tamanho da população microbiana. As enzimas naturalmente presentes no leite apresentam 10

grande relevância na qualidade deste por terem função de controle microbiológico, ação esta 11

de grande importância em sua conservação nas primeiras horas, até seu completo resfriamento 12

e processamento. Estes sistemas complexos têm duração média de três horas em leite bovino. 13

Entre as enzimas originais de maior relevância está a peroxidase que, no leite cru, se encontra 14

associada ao sistema lactoperoxidase, o qual utiliza, além da enzima lactoperoxidase, 15

substratos oxidáveis como sulfidrila e tiocianato. Esse sistema tem sua função estabelecida no 16

momento em que a enzima lactoperoxidase promove a dissociação de peróxidos naturalmente 17

presentes no leite e, dessa reação se desprende oxigênio. O oxigênio livre na matriz láctea 18

oxida grupos sulfidrila (SH) de enzimas metabólicas utilizadas por micro-organismos, 19

levando à morte de bactérias Gram negativas e à estase metabólica de Gram positivas, 20

controlando dessa forma o crescimento bacteriano no leite cru até seu resfriamento (Jay, 21 1996; Franranco, 2010). 22 23 24 25

28

2.4. Bactérias do ácido lático

1 2

Bactérias acido láticas (BAL) são um grupo de cocos, bastonetes e cocobacilos Gram 3

positivos composto por 12 gêneros que são Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, 4

Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus,

5

Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella (Reedy et al., 2008, Zhong et al., 2014). Esses

6

gêneros apresentam em comum uma baixa proporção C:G na estrutura de seu material 7

genético e alta tolerância ao baixo pH, até porque têm como principal produto de seu 8

metabolismo o ácido láctico, proveniente da via metabólica estritamente fermentativa de 9

carboidratos. Essa produção de ácido é responsável pela redução do pH da matriz a 10

aproximadamente quatro, o que é desejável em alimentos fermentados (Morelli, 2014; 11

Chapot-Chartier, 2014). Além disso, são microaerofílicos ou anaeróbios facultativos. Alguns 12

espécimes utilizam a produção de peroxidases como estratégia para sua tolerância ao 13

oxigênio. 14

15

Esses micro-organismos heterotróficos possuem requerimentos nutricionais complexos devido 16

a sua baixa capacidade biossintética e, por essa razão, são frequentemente encontrados 17

associados a matrizes ricas em carboidratos, aminoácidos e vitaminas, como os alimentos 18

derivados do leite (Pfeiler & Klaenhammer, 2007). Em meios de cultivo laboratoriais, formam 19

colônias de aproximadamente 2 – 3 mm a 37°C. Apesar de serem em sua maioria mesofílicas, 20

podem crescer em temperaturas entre cinco e 45°C (Reedy et al., 2008). Em virtude de suas 21

necessidades nutricionais complexas, meios ricos devem ser utilizados para seu cultivo em 22

laboratório (Savagodo et al., 2006). Essas espécies não são capazes de formar esporos e na 23

maior parte dos casos respondem negativamente ao teste de catalase (contudo algumas 24

espécies podem produzir pseudo-catalase), apresentam reação de aglutinação em meios 25

contendo hematina ou sangue e não são capazes de reduzir nitrato a nitrito ou utilizam lactato 26

(Carr et al., 2002). 27

28

Esse grupo de micro-organismos é frequentemente associado a capacidades probióticas por 29

serem, em sua maioria, seguros para a saúde humana e animal quando consumidos (FDA, 30

2006). Esse status GRAS (Generally Recognized As Safe) foi conferido à maioria das espécies 31

que compõe o grupo das BAL por serem utilizadas há muito tempo sem problemas na 32

indústria de alimentos fermentados (FDA, 2006). Além disso, como probióticos elas podem 33

29 possuir habilidade de aderir a células do hospedeiro, reduzindo assim a aderência de 1

patógenos, não são invasivas, logo não são patogênicas, nem carcinogênicas, produzem 2

substâncias antagônicas a patógenos, como peróxido de hidrogênio, ácidos e bacteriocinas e 3

não apresentam resistência transmissível a antibióticos (Reid, 1999). 4

5

Uma estrutura de grande importância na busca pelo potencial probiótico de uma linhagem do 6

grupo das BAL é a parede celular. Nessa, encontram-se proteínas, adesinas, capazes de aderir 7

à mucosa do hospedeiro, refletindo na capacidade de colonizar os sítios, bem como de aderir 8

aos patógenos ali presentes, mostrando grande importância na redução da ação patogênica de 9

micro-organismos invasores ou oportunistas (Chapot-Chartier, 2014). 10

11

Baseado no exposto acima, a capacidade antagonista contra reveladoras patogênicas, a 12

resistência transmissível a antibióticos e a caracterização da parede das BAL são entre os 13

critérios mais frequentemente avaliados durante uma seleção para uso probiótico. 14

15

2.5. Lactococcus lactis

16 17

Lactococcus lactis é uma BAL que se apresenta na forma de cocos Gram positivos em fileiras

18

ou em duplas, frequentemente isolada do leite e utilizada na produção industrial e artesanal de 19

derivados lácteos. São micro-organismos não móveis, anaeróbios facultativos e catalase 20

negativo, que atingem maior taxa de crescimento em temperaturas próximas de 30°C, 21

podendo crescer a 10°C. Seu metabolismo fermentativo produz ácido láctico, porém não 22

forma gás, o que faz dessa espécie um potencial auxiliador em processos industriais (Holt et 23

al., 1993).

24 25

Seu uso industrial é consolidado na forma de culturas liofilizadas para produção de leites 26

fermentados, manteiga e queijos, com o intuito, sobretudo, de acidificação do meio através da 27

produção de ácido láctico. Este micro-organismo é também encontrado em leite fresco, além 28

de derivados lácteos produzidos a partir de leite sem tratamento térmico prévio. 29

30

Apesar de a presença desse micro-organismo estar intimamente ligada aos derivados do leite, 31

sua utilização ultrapassa tais barreiras, sendo associado à modulação imunológica (Marinho et 32

al., 2010; Zhang et al., 2010) e à tecnologia de alimentos funcionais (Mercade et al., 2000).

30

3. Mastite

1

2

Mastite é o termo que denomina condição inflamatória da glândula mamária ou, de forma 3

geral, qualquer condição que leve a quadros de inflamação do úbere. A causa mais comum da 4

mastite é a entrada de micro-organismos exógenos pelo canal do teto, atingindo o parênquima 5

glandular. A entrada desses micro-organismos, porém pode ocorrer de forma secundária, 6

tendo um trauma ou uma ferida como porta de entrada. O desequilíbrio da condição 7

imunológica do animal é um importante fator de risco para a instalação de agentes da mastite, 8

que pode ser alterado por diversos outros fatores, como estresse nutricional, clima úmido ou 9

frio, que reduz o fluxo sanguíneo à glândula ou trauma. Dessa forma, qualquer anomalia, 10

como tetos supranumerários ou úberes baixos, que possa vir a provocar um trauma em 11

decorrência da ordenha mecânica, trato diário ou o próprio movimento do animal, pode 12

favorecer a ocorrência de mastite. A maior pressão produtiva imposta aos animais por 13

sistemas de criação intensivos, por trazer maior aporte nutricional e consequente maior 14

produção de leite, também é um importante fator que eleva a susceptibilidade ao 15

desenvolvimento da mastite, bem como o excesso de manuseio. Em rebanhos leiteiros, a 16

prevalência da mastite é de 20% em bovinos leiteiros (Pugh, 2005). Outro fator de extrema 17

importância para o surgimento de novas infecções de úbere é o estágio fisiológico da glândula 18

em decorrência da fase gestacional ou de lactação do animal. O início do período seco, que 19

coincide com o final da lactação é uma fase de transição em que cessam a limpeza e o 20

esvaziamento frequente da glândula, proporcionando o acúmulo de leite, que é um excelente 21

meio de cultura para micro-organismos (Botrel et al., 2010) e também leva à distensão das 22

células secretórias, que ficam submetidas a estresse mecânico, com prejuízos à capacidade de 23

defesa imunológica. 24

25

A mastite pode se apresentar na sua forma clínica, com sintomas aparentes ou sub-clínica, 26

quando a única forma de monitorá-la é a contagem sistemática de células somáticas. Os 27

sintomas observados na mastite clínica são aumento da temperatura externa do úbere, 28

tumefação, presença de dor e rubor e, quando os quartos posteriores forem afetados, 29

claudicação ou andar rígido (Pugh, 2005). A visualização desse tipo de mastite é facilitada 30

pela presença de grumos nos primeiros jatos de leite à ocasião da ordenha. Casos de mastite 31

clínica causados por Escherichia coli ou Mycoplasma spp. não tratados adequadamente 32

podem evoluir para septicemia, evidenciada pelo aumento da temperatura retal, da frequência 33

31 cardíaca, inapetência e redução acentuada e repentina da produção de leite, podendo levar ao 1

óbito. A mastite clínica pode evoluir ainda para o quadro gangrenoso, sobretudo em ovinos, 2

em virtude da redução do fluxo sanguíneo para a glândula após a formação do edema. O 3

micro-organismo mais frequentemente associado a tal quadro é Staphylococcus aureus (Nader 4

Filho, 2007) e a prevalência dessa infecção aumenta com a idade do animal e o número de 5

lactações. As evidências dessa infecção são a presença de edema e eritema iniciais no úbere, 6

que sofre posterior queda de temperatura e desenvolve coloração cianótica em decorrência da 7

isquemia. Em estágio mais evoluído do quadro, há presença de sinais de infecção sistêmica, 8

como aumento de temperatura retal, inapetência, recusa em se deitar e claudicação em razão 9

de dor glandular. A mastite bacteriana pode levar a um quadro clínico que pode ser tratado 10

com antibióticos, porém o prognóstico é desfavorável. Nesses casos há formação de abscessos 11

no úbere, o que torna os animais infectados fontes de contaminação para os animais sadios e 12

leva à manutenção de mastite sub-clínica no rebanho. Essa transmissão ocorre por práticas 13

errôneas de higiene do equipamento de ordenha ou do próprio pessoal envolvido na ordenha. 14

Os micro-organismos mais frequentemente associados a essa enfermidade em bovinos são 15

Staphylococcus aureus (Cardoso et al., 2000) em mastites clínicas, e Staphylococcus

16

coagulase negativo e Streptococcus dysgalactiae em mastites sub-clínicas (Botrel et al., 17

2010), tendo ainda como terceiro agente mais importante Escherichia coli (Ericson et al., 18

2009). Sabe-se. Porém, que a detecção desses micro-organismos é subestimada por baixa 19

sensibilidade dos métodos utilizados (Viora et al., 2014). 20

21

Os diversos tipos de mastite são abordados atualmente com o uso intenso de antimicrobianos, 22

apesar de o controle não ser efetivo. Em casos clínicos ou agudos, trata-se o animal com 23

antimicrobiano intra-mamário e se interrompe a coleta de leite pelo período de carência 24

indicado pelo fabricante do medicamento utilizado, a fim de evitar a presença de resíduos de 25

drogas no leite. Esse método leva a grandes perdas econômicas devido ao descarte desse leite, 26

à injúria da glândula do animal, com possíveis consequências para as lactações futuras e 27

necessidade de descarte prematuro de animais em idade produtiva. Uma alternativa 28

atualmente utilizada é o tratamento de todos os animais em idade de lactação com 29

antimicrobianos intra-mamários na entrada do período seco, ou entre lactações, que é 30

normalmente de dois meses. Esse procedimento evita o surgimento de casos clínicos. 31

Algumas propriedades fazem o monitoramento da presença de animais com mastite sub-32

clínica pela contagem de células somáticas (CCS), que mede o nível de reação inflamatória no 33

úbere. A presença de contagens acima de 7,5 x 105 células por mL (Brasil, 2011), é 34