HAL Id: hal-01742151
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Submitted on 5 Jun 2020
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MRIC TEM Combinaison de techniques à l’échelle cellulaire et moléculaire
Aurélien Dupont, Natayme Rocha Tartaglia
To cite this version:
Aurélien Dupont, Natayme Rocha Tartaglia. MRIC TEM Combinaison de techniques à l’échelle cellulaire et moléculaire. Gen2Bio 2018, Mar 2018, Rennes, France. �hal-01742151�
MRic-TEM : Combinaison de
techniques à l’échelle cellulaire et moléculaire
Aurélien Dupont – [email protected] Natayme Rocha Tartaglia - [email protected]
22/03/2018
Biosit - Biologie Santé Innovation Technologie
https://biosit.univ-rennes1.fr/plates-formes-technologiques
Unité mixte de service - UR1 / CNRS (UMS 3480) / INSERM (US 018) Thierry Guillaudeux - Directeur
Christelle Chapron - Secrétaire générale Biogenouest
65 + personnes (30 attachés / 35 mis à disposition) 14 plates-formes / administration
Plate Forme Activité Responsable Scientifique Responsable Technique
Arche Animalerie A1, A2, A3 Laurence Bernard-Touami
Cani-DNA CRB Canidé Catherine André
CRB Santé CRB Santé Bruno Turlin
GEH Génomique Philippe Vandenkoornhuyse Sophie Michon-Coudouel
Jean Mosser Marc Aubry
InDroso Production de lignée de Drosophile Roland Le Borgne Christine Le Borgne
LNPRM Production d'Ac Monoclonaux Franck Verite
Yannick Danger
ImPACcell Analyse cellulaire Rémy Le Guevel
H2P2 Histologie Bruno Turlin Alain Fautrel
MRic
Microscopie photonique Sébastien Huet
Stéphanie Dutertre Frédéric Mourcin
Microscopie Electronique Grétoire Michaux Agnès Burel
Denis Chrétien
Secteur de culture L3 L3 Philippe Gripon
PRISM Imagerie / Spectrométrie Arnaud Bondon
Hervé Saint-Jalmes Pierre Antoine Eliat
CytomeTRI Cytométrie en flux Valérie Lecureur Gersende Lacombe
Vincent Deleurme Spectroscopies Analyse de molécule en solution Arnaud Bondon Sandrine Pottier
Biosit - Plates-Formes
https://biosit.univ-rennes1.fr/plates-formes-technologiques
Microscopie électronique : Pourquoi ?
Œil humain Microscopie photonique
Microscopie électronique
…
…
25 nm
1 µm
5 µm
500 nm
Complexe macromoléculaire
Organites Cellules
Tissus
MRic-TEM
Moléculaire Cellulaire
Responsable scientifique : Grégoire Michaux
Responsable technique : Agnès Burel
Ingénieur d’étude : Aurélien Dupont
Responsable scientifique : Denis Chrétien
Ingénieur d’étude : Aurélien Dupont
https://microscopie.univ-rennes1.fr/TEM
Villejean Bât. 6 / 8
2 Av du Pr. Léon Bernard 35043 Rennes cedex
Beaulieu Bât. 13
263 Av du Général Leclerc 35043 Rennes cedex
Nouveau projet
Contact : [email protected] [email protected]
Présentation / discussion du projet
Technique appropriée - Prestation
- Collaboration - Formation
- Mise à disposition
5 personnes autonomes
https://microscopie.univ-rennes1.fr/TEM
Techniques disponibles Fixation chimique
Congélation haute pression Plunge freezing
Contraste négatif Ombrage
Cryosubstitution Tokuyasu
Inclusion en résine Ultramicrotomie Immunomarquage
Observation - Température ambiante Observation - Cryogénique
Observation - Tomographie
Observation - Cryo-tomographie
MRic-TEM Equipements
Tecnai G2 Sphera - FEI 200 kV - Lab6
Ultrascan 1000 - Gatan
Porte échantillon - cryo Simple & double tilt - Gatan
JEM 1400 - Jeol 120 kV - Tungsten Orius SC1000 - Gatan
UCT / UC7 / UC6-Cryo - Leica EMPACT 2 - Leica
AFS I & II - Leica EMGP - Leica
JFD 9000 - Jeol Ace600 - Leica
https://microscopie.univ-rennes1.fr/TEM
Préparation pour échantillon épais
Echantillon
Fixation
Déshydratation
Inclusion
Coupe Microscope
Nature protocols 7 2012
http://www.vcbio.science.ru.nl/
http://mathbio.nmsu.edu/
research-projects.html
Support
Température ambiante
Détection d’antigène
Contraste négatif / Ombrage Chimique
/
Congélation haute pression
5 µm
5 µm
50 nm
100 nm
100 nm 5 µm
Cryogénie
3D – Cryo Tomographie Projection 2D
Acquisition à très basse température (-170°C) Hexagonale / Cubique / Vitreuse
Épais (200 μm) / Fin (150 nm)
Congélation haute pression / Plunge freezing État natif
Dubochet J., Lepault J. 1984
50 nm
Echantillon épais
Cryo-tomographie
10 nm
https://cnrsformation.cnrs.fr/
stage-18232
Implication des Vésicules Extracellulaires (EVs) sécrétés par Staphylococcus aureus dans la pathogenèse
TARTAGLIA Natayme
• L'inflammation de la glande mammaire
Vache et petit ruminants
Infection d’origine bactérienne
Subclinique
Clinique Gangreneux
Différents degrés de sévérité
S. aureus
Mammite
• L'inflammation de la glande mammaire
Infection d’origine bactérienne
S. aureus
Sécrétion de facteurs de virulence
Activation de la réponse inflammatoire Vésicules extracellulaires (VEs)
Vésicules déversées par une cellule dans son environnement
Les EVs sécrétés par S. aureus contribuent au processus de pathogenèse dans le contexte de la mammite ?
Mammite
Visualisation par techniques de microscopie
TEM
Cup-shaped
Vérifier la reproductibilité et l’homogénéité des échantillons
Visualisation par techniques de microscopie
TEM Cryo-EM
Méthode moins invasive
Les échantillons sont observés avec leur état hydraté natif
Vérifier la reproductibilité et l’homogénéité des échantillons
Visualisation par techniques de microscopie
TEM Cryo-EM
Méthode moins invasive
Les échantillons sont observés avec leur état hydraté natif
Vérifier la reproductibilité et l’homogénéité des échantillons
S. aureus O46 S. aureus RF122
S. aureus O11 S. aureus MW2
S. aureus Mu50
S. aureus N305
Visualisation par techniques de microscopie
Contraste négatif avec 2% d'acétate d'uranyle
Particules sphériques (91 ± 23 nm)
Ovines Bovines Humaines
S. aureus Newbould 305 coupe
Visualisation par techniques de microscopie
Phase exponentielle
Phase stationnaire
Tableau comparatif des techniques pour des vésicules
Contraste négatif Observation Cryogénique Inclusion en résine
Simple Rapide
Nombreux échantillons Grilles conservables
Peu onéreux Enrichissement
Etat natif Résolution Cryo-tomographie
Enrichissement
Contexte cellulaire Bloc / coupe conservable
Tomographie
Echantillon déshydratés Limité aux contours
Préparation : ½ journée Chaine du froid 1-3 échantillons / jour
Non réutilisable
Coupe Repérage Préparation - 7j Artefacts préparation Avantages
Inconvénients
Valider la purification Observer les échantillons à haute résolution
Observer dans le contexte cellulaire Objectifs
Conclusion
Coupes : Organes / Cellules Vésicules / Virus / Complexes protéiques
Fixation chimique Résine
Cryofixation Résine
Détection d’antigène
Résine
Détection d’antigène
Tokuyasu
Contour Contraste
négatif
Relief Ombrage
Cryo- Microscopie
2D
Cryo- Tomographie
3D
Conventionel
Tomographie
Structure ++
Merci de votre attention
Biogenouest Christian Diot Jocelyne Leseyec Manuel Sorroche
Biosit
Thierry Guillaudeux Denis Chrétien
Grégoire Michaux Agnès Burel
Marie Thérèse Lavault STLO
Yves Le Loir Eric Guedon Chantal Cauty
Natayme Rocha Tartaglia
Cellulaire
Responsable Scientifique :
• Grégoire Michaux
Responsable Technique :
• Agnès Burel 02 23 23 46 80
Ingénieur d’étude :
• Aurélien Dupont
Moléculaire
Responsable Scientifique :
• Denis Chrétien 02 23 23 67 64
Ingénieur d’étude :
• Aurélien Dupont
