Les techniques de la biologie moléculaire
Préparation des acides nucléiques Isolement des noyaux
La centrifugation
Purification des acides nucléiques
Centrifugation en gradient de saccharose
Centrifugation en gradient de densité (ClCs2) Dosage spectrophotométrique des acides nucléiques Gels d’electrophorèse
Dénaturation thermique des acides nucléiques
Pr Pr é é paration des acides nucl paration des acides nucl é é iques iques
L’ADN se trouve dans le noyau des cellules eukaryotes.
La première étape de la préparation
consistera à isoler les noyaux des autres organites
On utilisera la technique de centrifugation différentielle.
Isolement de noyaux Isolement de noyaux
On découpe finement le
morceau d’organe à extraire On homogénéise de manière douce dans une solution
tampon placée entre 0°C et 4°C.
On filtre à froid l’homogénat pour éliminer les morceaux de tissus et les cellules intactes
On centrifuge le filtrat à 600g pendant 10’
On reprend le culot de noyaux à froid dans un tampon
) (rad.s angulaire
vitesse
-1ω =
) (cm.s ion
sédimentat de
vitesse
-1= V
) m effectif(c rayon
eff
= r
La centrifugation La centrifugation
r eff
g = ω 2 .
S r
v = ω 2 . eff . S = M (1-V. )
f
Centrifugation en gradient de saccharose Centrifugation en gradient de saccharose
Saccharose
La sédimentation en gradient de saccharose sépare les macromolécules en fonction de leur masse moléculaire
La sédimentation en gradient de saccharose sépare les macromolécules en fonction de leur masse moléculaire
Une centrifugation en gradient de Chlorure de Césium sépare les
macromolécules en fonction de leur densité
Une centrifugation en gradient de Chlorure de Césium sépare les
macromolécules en fonction de leur densité
Si l'on charge un mélange d'ADN et d'ARN sur sur un gradient de Chlorure de Césium 6M et que l'on centrifuge à l'équilibre, chaque
macromolécules se répartit selon sa densité. (a) Supposons que l'on traite ce mélange d'ADN
et d'ARN par une RNase on n'observe plus qu'une bande qui migre à la densité de l'ADN. (b)
a b
densité
On charge un échantillon d'ADN dans un tube et un échantillon de protéine dans un autre.
A l'équilibre, on obtient les bandes en c et d.
Dans le tube e on fait centrifuger un échantillon de chromatine. On obtient une bande en e
c e
densité
d
Centrifugation en gradient de Chlorure de C
Centrifugation en gradient de Chlorure de C é é sium sium
S S é é paration selon le poids mol paration selon le poids mol é é culaire ou la densit culaire ou la densit é é
Les noyaux sont éclatés
mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ;
le détergent détruit les membranes et
la protéinase digère les protéines associées à l'ADN
Il y a séparation de la phase aqueuse et de la phase phénolique.
L'ADN va dans la phase aqueuse et les protéines dénaturées restent à l'interphase
Centrifugation à haute vitesse
Les macromolécules vont au fond du tubeExtraction par le phénol
Centrifugation en gradient de chlorure de césium Précipitation à l'éthanol à froid
Extraction et purification de l'ADN Extraction et purification de l'ADN
M
DNA
Dosage spectrophotométrique des acides nucléiques
Loi de Beer-Lambert
Spectre d’absorption de l’ADN
Hyperchromicité
Loi de
Loi de Beer Beer - - Lambert Lambert
l
I
0I
I A I
I T I
T T
0 10 0
log 100
%
=
=
×
=
A = Absorbance T = Transmission
La loi de Beer-Lambert
c l
A = ε . . ε c l : : : Trajet Absorbance Concentrat optique ion molaire (cm) (mol L (L
-1) mol
-1cm
-1)
Pour
l'ADN natif
, on estime qu'une absorbance de0,212
sous 1 cm de traversé correspond à une concen- tration de 10 µg/mlL'absorbance molaire est une caractéristique physique associée à une molécule.
L'absorbance molaire des acides nucléiques est la moyenne de l'absorbance molaire de chaque base.
Molécule λmax (nm) ε.10-3(M-1.cm-1)
Trp 280 219 5,6 47,0
Tyr 274 222 193 1,4 7,0 48,0
Phe 257 206 188 0,2 9,3 60,0
His 211 5,9
Cys 250 0,3
Adénine 260,5 13,4
Adénosine 259,5 14,9
Guanine 275 8,1
Cytosine 267 7,1
Uracil 259,5 8,2
Thymine 264,5 7,9
DNA 258 6,6 (par base)
RNA 258 7,4 (par base)
Absorbance molaire
Absorbance molaire
Spectre d'absorption de l'ADN Spectre d'absorption de l'ADN
ADN d'E Coli natif
zmax : 258 nm
0.16 0.31
A
260nmA
280nm¡ 2
A260nm
A280nm
<
1.85si l'ADN est contaminé par des protéines
zmax : 258 nm
hyperchromicité
ADN d'EColi à 25°C ADN d'EColi à 82°C
Hyperchromicit
Hyperchromicit é é
Dénaturation thermiques des acides nucléiques
La température de demie dénaturation Effet de la force ionique
Effet de la composition en paires GC
D D é é naturation de l'ADN naturation de l'ADN
Quand on chauffe une molécule d'acide nucléique, elle se dénature. La double hélice se sépare.
Il y a rupture des liaisons hydrogènes et désempilement des bases.
La dénaturation de l'ADN s'accompagne d'un effet
hyperchromique. L'absorbance de la molécule augmente.
t°
t°
On peut donc suivre la dénaturation thermique d'un acide nucléique en
mesurant la variation de l'absorbance en fonction de la température.
Absorbance (260 nm)
tm=48°C
La température de demi
dénaturation ( tm) est la température pour laquelle 50% de l'ADN est dénaturé
Courbe de d
Courbe de d é é naturation thermique naturation thermique
Effet de la force ionique
Effet de la force ionique
La stabilité des acides nucléiques dépend de la teneur en GC de l'acide nucléique.
Appariement G-C = 3 liaisons hydrogènes
Appariement A-T = 2 liaisons hydrogènes
Effet de la composition en paires GC
Effet de la composition en paires GC
v
Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique
La particule atteint très rapidement une vitesse limite v= q.E/f avec q : charge de la particule;
E : champ électrique;
f : coefficient de frottement particule/solvant
+ _
E
q v
-
Gels d'
Gels d' é é lectrophor lectrophor è è se se
L'électrophorèse
q
dépend de la charge de la macromoléculef
dépend de la taille (encombrement)En faisant varier la concentration d'acrylamide et
de bis acrylamide, on obtient des mailles très différentes par polymérisation. CH2=CH-CO-NH2 acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH méthylène bis acrylamide
