TROISIEME PARTIE : RESULTATS

TROISIEME PARTIE : RESULTATS

TROISIEME PARTIE : RESULTATS 1 Pharmacognosie

1.1 Analyses chromatographique et spectrométrique des extraits et sous fractions des feuilles de Agelanthus dodoneifolius

L’extraction aqueuse a été réalisée telle qu’elle est faite selon l’un des usages traditionnels de la plante ; elle a permis d’obtenir un décocté aqueux, lyophilisé, dont les principaux groupes chimiques avaient déjà été caractérisés. Parmi ces composés, on peut citer de nombreux stérols, triterpènes et des composés polyphénoliques comme des tannins et des flavonoïdes. Du fait de leurs nombreux effets, nous avons voulu identifier les composés polyphénoliques dans les parties aériennes de A. dodoneifolius. Aussi, une technique d’extraction a permis d’extraire des flavonoïdes grâce à un épuisement successif avec les solvants organiques (Figure 23).

La CCM montre (UV), après pulvérisation avec le réactif de Neu, des spots présentant des fluorescences vertes, bleues, rouges et jaunes (Figure 27). On peut noter aussi que le nombre de ces spots diminue de la fraction à l’éther diéthylique à la fraction butanolique.

Figure 27: Photos du criblage chimique sur plaque CCM des fractions de Agelanthus dodoneifolius.

D : décocté aqueux ; Chl : acide chlorogénique ; E : fraction éther diéthylique ; Q : Quercétine ; Ac : fraction acétate d’éthyle ; But : fraction butanolique.

S1 : Acoet/Acide formique/Acide acétique/Eau (100/11/11/27) S2 : Acoet/ Acide formique/Eau (90/1/1).

D Chl E Q Ac But D Chl E Q Ac But

S1 S2

On peut noter que l’acide chlorogénique (Rf_S1 = 0.48 et Rf_S2 = 0.22), molécule de référence, est présent dans le décocté aqueux et les différentes fractions organiques avec des intensités différentes. La quercétine (RfS1 = 0.97 et RfS2 = 0.90) semble présente uniquement dans les fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle.

La figure 28 permet de visualiser les différents spots présents dans les sous fractions.

Les photos montrent essentiellement que la rutine (RfS1 = 0.32 et RfS2 = 0.06) n’est pas présente dans les sous fractions contrairement à la miquelianine (RfS1 = 0.44 et RfS2 = 0.18), présente dans la sous fraction butanolique But 2. La sous fraction butanolique But 1 laisse une traînée de coloration violette (à l’UV) aussi bien dans les systèmes de migration S1 que S2.

On peut voir que les sous fractions issues de la fraction à l’acétate d’éthyle (Ac1 et Ac2) ont des compositions chimiques très différentes.

L’UPLC-DAD-UV-MS (ESI, mode négatif) a été utilisé pour identifier et quantifier les différents composés polyphénoliques présents dans le décocté aqueux et les fractions

Ac1 R But1 Mq But2

Ac1 R

Ac2

Ac2 But1 Mq But2

Figure 28: Photos du criblage chimique sur plaque CCM des sous fractions de Agelanthus dodoneifolius.

Ac1 : sous fraction acétate d’éthyle 1 ; R : Rutine ; Ac2 : sous fraction acétate d’éthyle 2 ; But1 : sous fraction butanolique 1 ; Mq : miquelianine; But2 : sous fraction butanolique 2.

S1 S2

organiques de Agelanthus dodoneifolius. La méthode d’élution utilisée est un gradient et a été adaptée d’une méthode HPLC précédemment décrite.

Les résultats obtenus avec l’UPLC indiquent que la plante contient les acides phénoliques suivants : acide gallique, acide férulique, acide coumarique, acide ellagique et acide chlorogénique. On note la présence de flavonoïdes aglycones comme la quercétine, le kaempférol et la catéchine ainsi que des flavonoïdes glycosylés tels que l’isoquercitrine et la rutine.

Afin d’éviter les surcharges nous présentons uniquement, sur la figure 29, les chromatogrammes du décocté aqueux et de la fraction acétate d’éthyle obtenus à 360 nm. Les données nous montrent que le décocté aqueux diffère de la fraction à l’acétate d’éthyle par l’absence des flavonols quercétine et kaempférol.

0,E+00 5,E+04 1,E+05 2,E+05 2,E+05 3,E+05 3,E+05 4,E+05 4,E+05

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Temps de Rétention (min)

AU

2

4

1 3

Décocté aqueux

0,E+00 5,E+04 1,E+05 2,E+05 2,E+05 3,E+05 3,E+05 4,E+05 4,E+05

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Temps de Rétention (min)

AU

1 4

6 5 2

3

Fraction acétate d'éthyle

Figure 29: Chromatogrammes UPLC-UV du décocté et de la fraction à l’acétate d’éthyle à 360 nm.

(1): Rutine ; (2) : isoquercitrine; (3) : non identifié ; (4) : non identifié ; (5) : quercétine; (6) : kaempférol.

Par ailleurs, les sous fractions ont des compositions très différentes et ces données permettent de confirmer nos résultats obtenus avec la CCM. Notamment, le spot fortement intense au niveau de la sous fraction Ac2 correspond à l’isoquercitrine. Ce composé est aussi présent dans les sous fractions Ac1 et But2 avec des intensités plus faibles. On a identifié l’acide gallique dans la sous fraction But1 mais il faut noter que ce composé n’est pas majoritaire dans cette sous fraction.

Toutefois, comme le montrent les chromatogrammes, nous n’avons pas pu identifier tous les composés présents dans les fractions.

Le criblage chimique sur CCM de la sous fraction But2 montre la présence de la miquelianine dans cette sous fraction. La chromatographie HPLC-DAD-UV- MS (ESI, mode positif) a été utilisée pour confirmer la présence de ce composé dans la sous fraction But2.

La figure 30 montre le chromatogramme HPLC-UV et le spectre de masse (ESI, mode positif) de la miquelianine. La miquelianine a un temps de rétention de 5 min et présente une impureté à 6.6 min. La mesure du spectre de masse (ESI, mode positif) du pic de la miquelianine indique la présence d’un ion moléculaire à m/z 479 [M + H] ⁺, suggérant une masse atomique de 478 u (unités de masse atomique). L’ion issu de la fragmentation de la molécule, à m/z 303, indique une perte de masse de 176 u. Cette masse pourrait correspondre à la perte d’un acide glucuronique et la formule brute de la miquelianine ou quercétine-3-0- glucuronide est alors C₂₁H₁₈O₁₃.

x101

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6

DAD1 - C:Sig=360,4 Mq_MS_01.d

5.047

6.613

Response Units vs. Acquisition Time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

B

Figure 30: (A) Profil chromatographique en HPLC-UV (à 360 nm) et (B) Spectre de masse (ESI, mode positif) de la miquelianine.

A

La fraction butanolique But2 présente à l’UV 3 principaux pics obtenus selon les mêmes conditions chromatographiques que celles du standard. Le premier pic a le même temps de rétention que la miquelianine et le deuxième pic présente le même temps de rétention que l’impureté trouvée dans le standard (Tr = 6.66 min). Le troisième pic sort à 7.5 min (Figure 31).

La présence de la miquelianine a été confirmée dans la sous fraction But2 par la spectrométrie de masse (ESI, mode positif). Nous avons également identifié le composé qui correspond au troisième pic (Tr = 7.5 min). Comme le montre la figure 32, le spectre de masse du premier pic correspond à celui de la miquelianine, confirmant ainsi la présence de cette dernière dans la sous fraction butanolique But2.

Figure 31: Profil chromatographique en HPLC-UV (à 360 nm) de la sous fraction But2.

Absorbance (mAU)

x104

0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25

+ESI Scan (7.179-7.569 min, 34 scans) Frag=150.0V Frac2_AutoMS_01.d Subtract 463.0872

(M+H)+

280.0414

715.0203

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600

Intensité Intensité

A

B

Figure 32: Spectres de masse (ESI, mode positif) du premier pic (A) et du troisième pic (B) de la sous fraction But2.

La mesure du spectre de masse (ESI, mode positif) du troisième pic de la sous fraction But2 indique la présence d’un ion moléculaire à m/z 463 [M + H] ⁺, suggérant une masse atomique de 462 u (unités de masse atomique). La fragmentation MS/MS de l’ion moléculaire donne les pics d’ions fragments à m/z 287 de forte intensité et un ion à m/z 85 de faible intensité (Figure 33). L’ion fragment à m/z 287 indique une perte de masse de 176 u. Cette masse pourrait correspondre à la perte d’un acide glucuronique et la formule brute de ce composé serait C21H18O12. Ce composé pourrait être le kaempférol-3-O-glucuronide (l’utilisation du standard pourrait confirmer cette hypothèse).

x105

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4

Cpd 69: C21 H18 O12: +ESI Product Ion (6.973 min) Frag=150.0V [email protected] (463.0874[z=1] -> **) Frac2_AutoMS…

287.0542

85.0284

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600

Figure 33: Spectre MS/MS de l’ion moléculaire à m/z 463 (ESI, mode positif).

Ion moléculaire à m/z 463.0872

O

OH

O OH HO

O O

COOH OH HO HO

Intensité

La figure 34 présente la structure des composés polyphénoliques identifiés et quantifiés dans les fractions de Agelanthus dodoneifolius.

O

OH OH

O OH

HO

O O

COOH OH HO HO O

1 2 3 5 4

6 7

8 1'

2' 3'

4' 5' A 6'

B C

O

OH OH

OH OH

HO

O

OH OH

O OH

HO

O OH

OH O O H₃C

HO OH HO

O HO OH

OH

O OH

HO

OO OH

OH OH OH

O OH

OH

OH OH

HO

O O

O

OH

OH OH

HO

O

Structure de base des flavonoïdes

Quercétine Kaempférol Catéchine

Isoquercitrine Rutine

HO O

OH OH HO

OH O

HO HO

HO

O OH

O HO

O

HO OH

O O O

O OH HO

OH OH

Acide gallique

Acide p-coumarique

Acide chlorogénique

Acide ellagique

Miquelianine

B- Flavonoïdes A- Acides phénoliques

1.2 Dosages spectrométrique et spectrophotométrique

Figure 34: Structure des composés polyphénoliques identifiés et quantifiés dans Agelanthus dodoneifolius.

L’UPLC-DAD-UV-MS a permis l’identification et la quantification de plusieurs composés polyphénoliques dans le décocté aqueux, les fractions organiques et les sous fractions acétate et butanolique (Tableau III). Certains composés comme l’acide férulique n’ont pas pu être quantifiés car ils sont présents à l’état de traces dans les fractions.

Tableau III: Teneurs (g/kg, matière sèche) du décocté aqueux et des différentes fractions et sous fractions de Agelanthus dodoneifolius en composés polyphénoliques.

Composé

Décocté aqueux

Fr. éther diéthylique

Fr.

acétate d’éthyle

Fr.

butanolique

Ss fr.

Ac1

Ss fr.

Ac2

Ss fr.

But1

Ss fr.

But2 Acide

gallique Acide

chlorogénique Acide

coumarique Acide ellagique Catéchine Quercétine Kaempférol Rutine

Isoquercitrine

3.5

0.3

NP

NP

7.3 NP NP 2.3 0.8

20.7

NP

2.2

2.9

104.7 3.1 0.8 0.05 3.3

9.5

0.3

1.2

0.5

57.4 1.9 0.4 3.2 8.5

1.1

0.3

NP

NP

1.0 NP NP 8.2 0.6

16.3

NP

NP

NP

165.1 NP NP NP 0.2

NP

NP

NP

NP

NP NP NP NP 47.2

0.9

NP

NP

NP

NP NP NP NP NP

3.8

NP

NP

NP

13.7 NP NP NP 1.1

Fr : fraction ; Ss fr. : sous fraction ; NP : non présent.

La HPLC-UV a permis de déterminer la teneur en miquelianine dans la sous fraction But2 à partir d’une droite de calibration tracée avec la miquelianine (y = 6113.7x + 231.42 ; R²= 0.98). La sous fraction butanolique But2 contient 129.2 g équivalents miquelianine/kg de fraction But2 soit 0.032 g équivalents miquelianine/kg de poudre sèche des feuilles de Agelanthus dodoneifolius. Nous n’avons pas quantifié le kaempférol-3-O-glucuronide car nous ne disposions pas du standard au moment des analyses.

La méthode de Singleton et celle adaptée de Dowd ont permis de quantifier respectivement les polyphénols et les flavonoïdes totaux dans le décocté aqueux, les fractions à l’éther diéthylique, à l’acétate d’éthyle et au butanol (Tableau IV). Les résultats indiquent que les fractions à l’acétate d’éthyle et à l’éther diéthylique sont les plus riches en polyphénols alors que la teneur en flavonoïdes est plus importante dans la fraction butanolique et le décocté aqueux.

Tableau IV: Teneurs en polyphénols totaux (g équivalent acide gallique /kg d’extrait, matière sèche) et en flavonoïdes totaux (g équivalent rutine/kg d’extrait, matière sèche) du décocté aqueux et des différentes fractions de Agelanthus dodoneifolius.

Teneurs Décocté aqueux

Fr. éther diéthylique

Fr. acétate d’éthyle

Fr. butanolique Polyphénols

totaux Flavonoïdes totaux

212.0

41.3

528.6

8.0

622.2

32.0

388.4

50.3

2 Pharmacologie et Toxicologie

2.1 Le volet inflammation

2.1.1 Effet du décocté aqueux et des fractions organiques de Agelanthus

(ERO)

La production des ERO par les neutrophiles préalablement stimulés au PMA a été mesurée par chimiluminescence en présence de la lucigénine, composé connu pour interagir spécifiquement avec l’anion superoxyde. Les résultats présentés sur la figure 35 montrent que le décocté aqueux et les fractions organiques de A. dodoneifolius inhibent la production d’anion superoxyde comparativement aux contrôles PBS et DMSO. On peut noter que l’effet inhibiteur est dose dépendant. Dans notre modèle de CL, les fractions organiques affichent une meilleure activité inhibitrice sur la production d’anion par rapport à la décoction aqueuse.

Les fractions organiques restent inhibitrices même aux faibles concentrations (jusqu’à 1 µg/ml) alors que la fraction aqueuse est essentiellement inhibitrice aux concentrations élevées.

L’ordre d’efficacité suivant peut être établi: fraction à l’éther diéthylique ≥ fraction à l’acétate d’éthyle > fraction butanolique > décocté aqueux.

Figure 35: Effet du décocté aqueux et des fractions organiques sur la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) par les neutrophiles activés avec le PMA.

Les données, présentées sous la forme moyenne ± DS, résultent de six expériences.

Les sous fractions acétate et butanolique obtenues après un fractionnement sur une colonne ouverte ont été analysées et présentent également un important effet inhibiteur dose- dépendant sur la production des ERO. Les sous fractions présentent l’ordre d’efficacité suivant : But1 > Ac1 ≥ Ac2 > But2. Les valeurs des concentrations inhibitrices 50% (IC₅₀), déterminées avec le logiciel GraphPadPrism à partir d’une régression non linéaire, ont été comparées à celles des standards à savoir l’acide gallique (0.4 ± 0.1 µg/ml) et la quercétine (2.8 ± 0.7 µg/ml). L’effet inhibiteur des standards est aussi dose dépendant (données non présentées) et l’acide gallique inhibe beaucoup plus fortement la production des ERO comparativement à la quercétine (Tableau V).

Tableau V: Valeurs des concentrations inhibitrices (IC50) des extraits de Agelanthus dodoneifolius sur la production des espèces réactives de l’oxygène.

Composé testé

IC50 (µg/ml) Standard

Acide gallique Quercétine Fractions de A.

dodoneifolius Décocté aqueux Fr. éther diéthylique

Fr. acétate d’éthyle Fr. butanolique Sous fractions SS. fr. acétate 1 (Ac1) SS. fr. acétate 2 (Ac2) SS. fr. butanolique 1 (But1) SS. fr. butanolique 2 (But2)

0.4 ± 0.1 2.8 ± 0.7

10.4 ± 2.7 1.8 ± 0.6 1.1 ± 0.7 1.6 ± 0.9

0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.3 0.4 ± 0.1 1.8 ± 1.0

Les données, présentées sous la forme moyenne ± DS, résultent de six expériences. Fr : fraction ; SS. fr. : sous fraction.

2.1.2 Effet du décocté aqueux et des fractions organiques de Agelanthus

La libération de la MPO par les neutrophiles activés au PMA a été mesurée par un test ELISA de type « Sandwich ».

Les résultats montrent que le décocté aqueux et les fractions organiques inhibent la dégranulation des neutrophiles de manière dose dépendante. L’inhibition de la libération de la MPO décroit selon l’ordre suivant : fraction butanolique ≥ fraction à l’acétate d’éthyle >

décocté queux ≥ fraction à l’éther diéthylique (Figure 36). Les fractions à l’acétate d’éthyle et au butanol restent inhibitrices même aux faibles concentrations. Notamment, à 2.5 µg/ml, ces deux fractions ont une inhibition ≥ 40% alors que le décocté aqueux et la fraction à l’éther diéthylique ont respectivement 21% et 33% d’inhibition.

Figure 36: Effet du décocté aqueux et des fractions organiques sur la libération de la MPO par les neutrophiles activés avec le PMA.

Les données, présentées sous la forme moyenne ± DS, résultent de cinq expériences.

Parmi les sous fractions, seule la sous fraction But2 a un effet inhibiteur marqué sur la libération de la MPO. La sous fraction Ac2 a un effet modeste sur la dégranulation des neutrophiles.

On peut noter qu’aux concentrations finales utilisées, l’acide gallique et la quercétine n’ont aucun effet inhibiteur sur la libération de la MPO. Les valeurs des concentrations inhibitrices 50% (IC50) ont été rapportées dans le tableau VI.

Tableau VI: Valeurs des concentrations inhibitrices (IC₅₀) des extraits de Agelanthus dodoneifolius sur la libération de la myéloperoxydase par les neutrophiles stimulés.

Composé testé

IC₅₀ (µg/ml) Standard

Acide gallique Quercétine Fractions de A.

dodoneifolius Décocté aqueux Fr. éther diéthylique

Fr. acétate d’éthyle Fr. butanolique Sous fractions SS. fr. acétate 1 (Ac1) SS. fr. acétate 2 (Ac2) SS. fr. butanolique 1 (But1) SS. fr. butanolique 2 (But2)

> 25

> 50

13.2 ± 2.2 19.8 ± 7.2 3.9 ± 1.3 2.9 ± 0.7

> 50 32.9 ± 5.3

4.1 ± 1.3

> 50

Les données, présentées sous la forme moyenne ± DS, résultent de cinq expériences. Fr : fraction ; SS. fr. : sous fraction.

2.1.3 Effet du décocté aqueux et des fractions organiques de Agelanthus

Le SIEFED est un test qui permet de mesurer spécifiquement l’activité de la MPO sans interférences. Les résultats présentés sur la figure 37 montrent que le décocté aqueux et les fractions organiques de Agelanthus dodoneifolius exercent un effet inhibiteur dose dépendant sur l’activité de la MPO. L’ensemble des résultats obtenus avec la technique SIEFED a permis d’évaluer un profil inhibiteur de l’activité de la MPO des différentes fractions : fraction acétate ≥ fraction éther diéthylique > fraction aqueuse ≥ fraction butanolique.

Figure 37: Effet du décocté aqueux et des fractions organiques sur l’activité de la MPO mesurée par le SIEFED.

Les données, présentées sous la forme moyenne ± DS, résultent de six expériences.

Les sous fractions acétate et butanolique inhibent aussi de manière dose dépendante l’activité de la MPO avec un profil inhibiteur décroissant dans l’ordre Ac1 ≥ Ac2 > But1 ≥ But2.

Il n’existe pratiquement pas de différence significative entre les valeurs d’IC50 du décocté aqueux, de la fraction butanolique et de la quercétine. L’effet inhibiteur de l’acide gallique (IC50 = 1.1 ± 0.2 µg/ml) est plus important que la quercétine (IC₅₀ = 6.3 ± 0.4 µg/ml).

0 20 40 60 80 100 120

1,E+02 5,E+01

1,E+01 5,E+00

1, E+00 5,E-01

1,E-01 5,E-02

1, E-02 0,E+00

µg/ml

Percentages of viable cells

U373 LoVo IC50 A549

0 20 40 60 80 100 120 140

1,E+02 5,E+01

1,E+01 5,E+00

1,E+00 5,E-01

1,E-01 5,E-02

1,E-02 0,E+00

µg/ml

Percentages of viable cells

A549 U373 LoVo IC50

2.2 Le volet cancer

2.2.1 Les effets des extraits de Agelanthus dodoneifolius au niveau de la croissance de populations cellulaires cancéreuses in vitro

Après 72H d’incubation des cellules avec les extraits, on note que l’effet inhibiteur, bien que modeste, est principalement dû aux fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle (Figure 38).

Figure 38: Effets de la fraction à l’éther diéthylique (A) et à l’acétate d’éthyle (B) sur la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses A549, U373 et LoVo.

Les valeurs des concentrations inhibitrices de croissance à 50% (valeurs IC50 en µg/ml) associées aux divers extraits ont été estimées et rapportées dans le tableau VII. La fraction à l’éther diéthylique inhibe notamment la prolifération des cellules cancéreuses A549 et LoVo alors que la

B A

fraction à l’acétate d’éthyle inhibe essentiellement les cellules cancéreuses LoVo. Ces deux fractions ont un faible effet inhibiteur sur la prolifération des lignées cancéreuses U373 (IC₅₀ > 90 µg/ml). Le décocté aqueux présente un effet modéré sur les cellules U373 (IC₅₀ = 75 µg/ml) alors que la fraction butanolique n’exerce aucun effet inhibiteur sur les lignées cellulaires utilisées (IC₅₀ > 100 µg/ml).

Tableau VII: Estimation des valeurs des concentrations inhibant de 50% (IC50 en µg/ml) le taux de croissance des lignées cellulaires cancéreuses A549, U373 et LoVo en présence des fractions de Agelanthus dodoneifolius.

Fractions A549 U373 LoVo

Décocté aqueux Fr. éther diéthylique Fr. acétate d’éthyle Fr. butanolique

> 100 (66%) 47

> 100 (56%)

> 100 (92%)

75 98 95

> 100 (75%)

> 100 (77%) 49

50

> 100 (56%)

Les valeurs entre parenthèses indiquent le pourcentage de cellules vivantes à 100 µg/ml après 72H de traitement.

On peut noter que les fractions qui induisent une inhibition de croissance se caractérisent par la présence de la quercétine (voir le Tableau III). Aussi, l’effet inhibiteur de croissance des fractions à l’éther diéthylique et à l’acétate d’éthyle pourrait s’expliquer, en partie, par la présence de cette molécule. Pour la suite de ce travail, nous nous sommes attelés à caractériser l’activité anticancéreuse de la quercétine.

2.2.2 Les effets de la quercétine et de ses dérivés au niveau de la croissance de populations cellulaires cancéreuses in vitro

Les résultats, basés sur le test colorimétrique MTT, montrent que seule la quercétine induit un effet antiprolifératif avec une valeur d’IC50 (µM) estimée à 34 µM (Figure 39). Les dérivés glycosylées de la quercétine n’ont aucun effet sur la croissance des lignées cellulaires cancéreuses utilisées (Figure 39).

Figure 39: Effets de la quercétine (Ab), la quercétine 3-O-glucuronide (Bb) et la quercétine 3-0-galactoside (Cb) sur la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses.

2.2.2.1 La quercétine est cytostatique

La vidéo-microscopie quantitative a été utilisée pour visualiser, l’effet de la quercétine à 30 µM sur la morphologie, la prolifération et la migration des cellules T98G. Les résultats montrent que la quercétine inhibe la prolifération des cellules T98G et cet arrêt pourrait être lié au fait qu’elle bloque leur division comparativement au contrôle. Il n’apparaît pas de morts cellulaires massives suite au traitement à la quercétine et les cellules T98G traitées par la quercétine conservent une morphologie intègre même en fin de traitement L’ensemble de ces observations suggère fortement un mécanisme d’action cytostatique pour la quercétine (Figure 40).

Figure 40: Illustrations morphologiques, au moyen de la vidéo-microscopie, des effets antiprolifératif et cytostatique de la quercétine après 72H de traitement sur les cellules cancéreuses T98G.

Les cellules en mitose (M) sont rondes, réfringentes et caractérisées par la présence d’un spot noir au centre ; les cellules mortes (DC pour dying cells) présentent diverses modifications morphologiques.

2.2.2.2 La quercétine est un composé poly-anti-kinase

Le fait que la quercétine ralentisse la prolifération des cellules cancéreuses T98G pourrait signifier qu’elle inhibe ou interfère avec l’activité des protéines impliquées dans la division cellulaire.

Les kinases sont des enzymes qui interviennent au niveau de la signalisation intracellulaire, du contrôle de la différenciation et de la division cellulaires. Aussi, on a émis l’hypothèse selon laquelle la quercétine pourrait inhiber certaines kinases impliquées dans la division cellulaire.

Les résultats montrent qu’à 30 µM, la quercétine induit une inhibition (> 95% d’inhibition) quasi totale de l’activité de quelques 100 kinases. La quercétine inhibe fortement les kinases de la famille des tyrosine kinases, les MAP kinases et les protéines kinases cycline-dépendantes. Nous avons ensuite analysé les effets de la quercétine à une concentration de 2 µM qui ne représente plus qu’environ 7% de la concentration inhibant 50% de la croissance des cellules cancéreuses.

Cette concentration permet d’identifier les kinases qui sont des cibles spécifiques de la quercétine (Figure 41).

● ^< 5% activité résiduelle ● ^< 5% activité résiduelle

○ ^{5 -} 20% activité résiduelle

Figure 41: Effet antikinase de la quercétine testée aux doses de 30 et 2 µM.

L’inhibition est quasi-totale (ronds noirs) en présence de la quercétine à 30 µM ; à 2 µM, la quercétine inhibe presque totalement certaines kinases (> 95%) et pour les autres, l’inhibition est comprise entre 80 et 95% (ronds blancs). Les kinases inhibées concernent les tyrosine kinases (TK), tyrosine like kinases (TKL), sérine/thréonine kinases (STE), casein kinase 1 (CK1), les kinases dépendant de l’AMPc, (AGC), calcium/calmodulin protein kinase II kinases (CAMK) ainsi que les kinases du groupe CMGC regroupant les kinases cycline dépendante (CDK), mitogen-activated protein kinase (MAPK), glycogen synthase kinase (GSK) et les CDK-like kinases.

A la concentration de 2 µM, la quercétine inhibe presque totalement (> 95% d’inhibition) l’activité de près de 15 kinases comme les protéines tyrosine kinases abl (Abelson leukemia), surexprimée dans la leucémie myéloïde chronique et des protéines kinases Aurora impliquées dans la prolifération des cellules cancéreuses. Pour les kinases du groupe abl, l’inhibition

concerne les formes sauvage (wt) et mutante et pour celles du groupe Aurora, on peut noter que les 3 classes (A, B, C) sont inhibées (Figure 42).

0 20 40 60 80 100

wt E255K G250E T315I Y253F

0 20 40 60 80 100

A B C

Figure 42: (A) Inhibition des formes sauvage et mutante des kinases ABL1 et (B) des trois classes kinases Aurora.

% Activité résiduelle (Contrôle = 100%)

B A

% Activité résiduelle (Contrôle = 100%)