la fin de chaque séance.

(1)

::

1

SOMMAIRE

❖ Première séance :

'fP d'initiation. ...•... 7

❖ Deuxième séance :

- pH-métrie de la glycine. . . .. . . .. . . .. 10

❖ Troisième séance

Réactions colorées des protéines et des acides aminés... . . ... 18

❖ Quatrième séance

Réactions d'identification des glucides ... 24

2

(2)

1 '

CONSEILS AUX ETUDIANfS

A-RECOMMANDATIONSGENERALES

1- Les T.P. commencent le matin à 8 heures 30, l'après-midi à 14 heures 2- Le port de blouse est obligatoire dans la salle de TP.

3- Il est formellement interdit de fumer dans la salle de 1P.

4- Lire les manipulations avant la séance de TP.

5- Lire attentivement le texte avant d'entreprendre une expérience, et se conformer strictement aux indications données.

6- Maintenir la paillasse en parfait état de propreté. N'utiliser que la verrerie propre. Les tubes propres sont toujours disposés dans les portoirs, l'ouverture vers le bas.

7- Ne pas déboucher plus d'un flacon à la fois ; le reboucher dès que l'on ne s'en sert plus:

les réactions obtenues seront ainsi plus fiables.

8- Ne pas intervertir les pipettes; en cas de doute, les rincer soigneusement à l'eau du robinet, puis à l'eau distillée.

9- Pour faire des prises de volume :

• Un bécher ~ué donne toujours des volumes approximatifs.

• Une éprouvette est peu précise.

• Une fiole jaugée indique des volumes exacts.

• Une pipette libère un volume exact. ..

10- Lors de l'utilisation d'une pipette ou d'une burette, la surface du liquide forme un ménisque ; c'est la partie inférieure du ménisque qui doit être utilisée pour repérer le -niveau· du liquide. Cependant, avec des solutions fortement colorées, on ne peut pas distinguer le ménisque ; la surface libre du liquide semble horizontale, et c'est elle que l'on amène en coïncidence avec le trait de jauge.

11- Pour régler l'écoulement d'une pipette, l'orifice supérieur doit être bouché avec· !'INDEX parfaitement sec et non pas avec le pouce. La pipette doit être tenue verticalement, la pointe appuyée sur la paroi du récipient. On ne souffle jamais dans une pipette. On n'utilise pas la même pipette pour divers produits.

12- L'utilisation du spectrophotomètre, de la centrifugeuse et du pH-mètre vous sera expliquée par l'enseignant.

13-En fin de séance, laver la-verrerie utilisée à l'eau de robinet, la rincer à l'eau distillée et la mettre à l'envers pour égouttage. :•,·.

14-Nettoyer la paillasse (paillasse et verrerie sales= points en moins).

B- DANGERS DIVERS ET PRECAUTIONS ELEMENTAIRES

1- Les solvants inflammables sont dangereux. La plupart peuvent s'enflammer par simple contact avec une surface chaude (plaque chauffante, chauffe-ballo~ etc ... ) : sulfure de carbone, éther éthylique, éther cie pétrole, benzène, méthanol, toluène ...

2- Ne jamais ajouter de pierre ponce dans un solvant chaud, ce qui provoquerait

une

ébullition brutale.

3- Etre particulièrement prudent pendant la manipulation de solvant. Eteindre toute flamme.

4- De nombreuses réactions sont violentes et peuvent provoquer des projections dangereuses.

Ne jamais viser un camarade avec l'orifice d'un appareil (ballon, tube à essais, erlen .,.) dans lequel on fait une réaction. Naturellement ne pas mettre son nez ou son œil au- dessus de l'ouverture.

3

(3)

5- Attention aux produits agressifs pour l'œil, la peau et les poumons : NaOH, KOH, H2S04, HN03, brome, phénol etc ...

6- Toujoms verser l'acide dans l'eau, et non pas le contraire, smtout dans le cas de l'acide sulfurique.

7- . Ne jamais pipe1er à la bouche les acides forts, les solvants ; des propipettes seront mises à votre disposition à cet égard.

8- En cas de brûlures extérieures, suite à une projection d'acide ou de base, laver abondamment à l'eau la partie atteinte, et prévenir de suit l'enseignant.

9- En résumé, pour éviter les accidents, il faut travailler avec beaucoup de soins et de propreté, ca1me et prudence.

C-PRESENTATIONDUMATERIEL

Les planches présentées ci-après vous donnent un aperçu du. matériel et de quelques verreries utilisés habituellement en travaux pratiques de Biochimie.

N.B.

Les

comptes rendus doivent être rendus

à

la fin de chaque séance.

4

(4)

Cl. MATERIEL

Au cours dès séances de TP, le matériel le plus utilisé pour la mesure des volumes (liquides) est le suivant (voir page 4):

- Les pipettes :-elles libèrent un volume exact

Pour régler l'écoulement d'une pipette, l'orifice supérieur doit être bouché avec l'INDEX parfaitement sec et NON PAS AVEC LE POUCE. La pipette doit être tenue verticalement, la pointe appuyée sur la paroi du récipient. On NE SOUFFLE JAMAIS DANS UNE PIPETTE.

On rince la pipette si on change de solution.

Lors de l'utilisation d'une pipette ou d'une burette, la surface du liquide forme un ménisque, c'est la partie inférieure du ménisque qui doit être utilisée pour repérer le niveau du liquide.

Cependant, avec des solutions fortement colorées, on ne peut pas distinguer le ménisque ; la surface libre du liquide semble horizontale, et c'est elle que l'on amène en coïncidence avec le trait de jauge.

- Les fioles jaugées : Ce sont des récipients en pyrex portant un trait de jauge et contiennent exactement le volume indiqué.

- Les burettes graduées : elles permettent la distribution avec précisioii des volumes ( elles doivent toujours être vidées et rincées après usage ). ,

~ Les éprouvettes graduées : elles sont peu précises, elles conviennent surtout pour les graduati<?~ intermédiaires.

- Les béchers gradués et les erlenmeyers : ils indiquent une contenance approximative.

C2. APPAREILS

- L' Appareil de distillation d'eau: l'eau utilisée dans un laboratoire de biochimie est une eau distillée. Pour l'obtenir, l'eau de ville passe par un appareil à distiller où elle est vaporisée à l'aide d'une résistance électrique. La vapeur d'eau formée est ensuite condensée sur un réfrigérant, l'eau est ainsi recueillie à l'aide d'un entonnoir.

- Le Bain-marie: C'est un récipient contenant de l'eau chauffée par une résistance électrique à une température réglable par un thermomètre à contact L'évaporation de l'eau peut provoquer une baisse du niveau d'eau dans le bain-marie.

- La centrifugeuse : elle comprend un moteur qui soumet à une rotation rapide un rotor dans lequel se trouvent des tubes comprenant la suspension à centrifuger. La force centrifuge à laquelle est soumise une particule est proportionnelle à sa distance à l'axe du rotor (r) et au carré à l'angle· (w) parcouru par seconde.

- Le spectrophotomètre: C'est un appareil de mesure de la transmission et de la densité optique à toutes les longue~s d'onde ( ultraviolet et visible ). Si seules les longueurs d'onde dans le visible sont disponibles, l'appareil est appelé photomètre.

5

(5)

- L'agitateur magnétique: Il permet la rotation d'un aimant à l'aide d'un moteur élëctrique qui provoque la rotation d'un barreau aimanté placé dans un récipient et l'agitation ainsi provoquée

assure

le brassage du liquide .

- Le pHmètre: C'est un appareil de mesure de pH d'une solution donnée. Il comporte une électrode à membrane de verre qui est constituée d'une boule de verre très mince dans laquelle se trouve une solution tampon et une électrode de référence ( fil d'argent recouvert de chlorure d'argent).

C3. MATERIEL

Bécher Entonnoir Erlemneyer Ballon fond rond

Fiole jaugée Burette Pipette Eprouvettte

6

(6)

SEANCEI

TP D'INITIATION

7

-----··- -····•-·•----.- - - ~ - - - - - - - - -

(7)

· SEANCE D'INITIATION

1) Présentation de chaque séance de travaux pratiques.

II) Démonstration du fonctionnement du :matériel utilisé pendant les séances de travaux pratiques et des

pm

airions à prendre :

• Pipettes, bmettes, propipettes (pour les solutions d'acides et de base concentrées)

• Bain-marie

• Spectrophotomètre

• Centrifugeuse

• pH-mètre (insister sur les électrodes, les barreaux aimantés et l'agitateur magnétique)

III) Partie théorique : Définir les dilutions avec exemples, Normalité, Molarité, Concentration pondérale.

IV) Exercices d'application :

1. Comment préparer 100 ml d'une solution de NaOH. (Na=23; 0=16; H=l) - IN

-0,IN

2. A partir d'une solution mère de NaCl à 10 g/1, préparer : - 50 ml de NaCl à 7,5 g/1

- 25ml de NaCl à 2 g/1 - 1000ml de NaCl à 0,9 g/1

3. Commentprocéderpourpréparer lOOmld'une solution IN deHCl, d=l,18; PM=

36. (HCl est commercialisé à 36%).

4. Comment procéder pour préparer 50ml d'une solution IN de H2S04, d=l ,84 ; PM=98. (H2S04 est commercialisé à 98%).

5. Préparer 100ml d'une solution contenant:

- NaCl à 98/11o - MgCli à 30mM - Glucose à 36mg/l On dispose de :

- NaCl en poudre

- Solution de MgCh à 142,5g/I

- Solution de glucose à lmM (Na=23; Mg=24; Cl=35,5; C=12; 0=16 ;H=l).

Formule brute Glucose: C~i206 JI). Partie Pratique :

· Préparation de solutions diluées avec gamme étalon : On dispose d'une solution de rouge de méthyle (0,25g/I).

8

(8)

$ Réaliser les dilutions en cascade suivantes: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16 et 1/32 avec de l'eau distillée pour un volume final de 10ml.

$ Lire les densités optiques ( ^l

=

425nm) des différentes dilutions par spectrophotométrie.

$ & emp lir 1 tabl e eau swvant:

Dilution

1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

Concent ration

(mol/L) Densité optique

$ Tracer la droite DO

=

f( rouge de méthyle)

9

·- ---•-··- - ---- -- - -

(9)

PH-METRIE DE LA GLYCINE

10

SEANCE II

(10)

PH-METRIE DE LA GLYCINE

I.

Introduction

Tous les acides aminés (AA) contiennent au moins un groupement carboxylique et uri groupement aminé en position a.. En solution aqueuse et selon le pH du milieu, ces acides existent au moins sous 3 formes ioniques :

<

^COOH

R-CH

Ntt;

Forme cation (A+>'7

·--

^\

Zwitterion (A

1

La proportion de ces 3 formes dépend du pH de la solution :

à pH~ 1, les AA sont en quasi-totalité sous la forme de cations A+

- à pH ~11, ils sont essentiellement sous la forme A-

Forme anion (A)

- à pH intermédiaires, il existe une zone de pH où la majeure partie de ces AA est sous la forme ion mixte : Zwittèrion

Le point isoél~c1rique est le pH pour lequel la charge nette de la molécule est nulle (A

1-

[H1.[A1

[Al De même:

Ka2=

[Hl.

[Al [A1

Au point isoélec1rique, on a [Al

= [

A

1

D'où les équations suivantes:

[A1.

[Hl - - - -

Ka1

[A1 .Ka2

[Hl

Ka1

=

Constante d'équilibre·

11

(11)

~

- ---,

'

[H1

²=Ka1

-Kai [H1 = &1 . ^Ka:.z

Log[Hl

=

^{½ l.ogKa.}⁺½ LogKaz Or, pH= -Log

[H1

Donc,

1

^pHî

⁼

^{pKa, :}^pKa,

D'après l'équation d' .Anderson pour les solutions tampon : [sel]

pH=pKa+Log - - - [acide]

Lorsque [sel]= [acide], le pH= pKa

. D'après l'équilibre A+:;:::==~ A± +

Ir

où A+.. est l'acide et A1;-son sel avec une base forte (comme NaOHpar exemple), le pH= pKa1 lorsque [A1= [Ai, c'est à dire an point de demi dissociation de A+_ Donc, le pKa correspond au pH de demi-dissociation.

Par pH-métrie, on pomra déterminer les valeurs des pKa et la valeur du point isoélectrique (pHi).

La courbe dt ti.tml:iun présente des paliers dont les points d'inflexion correspondent aux points de demi dissociation (pKa): les AA ont un pouvoir tampon maximum an niveau de ces paliers.

N,,CH ,

Il. Titration cl'-amie faible par une base forte: détermination du point d'éqaivalence 1.lntroclllctioa

Dans une titration, le problème est pH

. naturellement de caractériser le point auquel les espèces réagissaoks sont présentes en quantités équivalentes (point de neutralisation totale). Ce point PE

d'équivalence mïncidc avec le point d'inflexion de la courbe de titralïon.. La détermination graphique de

ce point peut se :làire par la méthode des tangentes. w1mne du titrant

12

- - - - · - - - -

(12)

1 \

2. Etalonnage du pH-mètre

- Brancher la prise de courant au secteur

- Mettre en marche le pH-mètre avec le bouton ON

- Enlever le capuchon de l'électrode délicatement pour ne pas la casser. La rincer de haut en bas avec de l'eau distillée (utiliser une pissette d'eau distillée) et l'essuyer sans presser avec du papier filtre.

Plonger la sphère de l'électrode dans le flacon contenant la solution étalon pH 7, appuyer sur (ou tourner) le bouton mesure pH, si le pH est différent de 7, et le ramener à pH 7 avec le bouton standardisation.

- Remettre le bouton sur la position d'attente, retirer l'électrode et la rincer comme précédemment.

- Replonger l'électrode dans la solution pH 4, mettre en position mesure et régler le pH à 4 avec le bouton température sans toucher au bouton de standardisation.

..:. · Mettre le pH-mètre en position d'attente - Le pH-mètre est maintenant étalonné

... Retirer l'électrode, la rincer et la plonger dans un bécher contenant de l'eau distillée.

3. Manipulation

Au cours de cette séance, vous aurez à déterminer la normalité de l'acide acétique commercial, en le titrant avec de la soude 0,1 N.

- Préparer une solution diluée d'acide acétique commercial dans une fiole jaugée de 100 ml - Prendre 10 ml de cette solution à doser, la mettre dans un bécher de 100 ml et lui rajouter

40 ml d'eau distillée

- Remplir la burette avec de la _soude 0,1 N

- Plonger avec précaution l'électrode dans la solution à titrer

- Noter-le pH de l'acide et commencer la titration en rajoutant des volumes de soude de 0,5 en 0,5ml

Arrêter la titration à pH 11-12 - Tracer la courbe de titration

- Déterminer la normalité de votre solution

13

(13)

III. Titration de b glycine : 1 lre méthode : détermination des pKa et du pffi 1. Principe

Pour déterminer le pKa_1,on ajoute à lllle solution d' AA dont le titre est connu, un volume précis d'un acide fort RH qui, lors de sa dissociation totale donne une concentration R- en acide. Une partie des protons servira à déplacer l'équilibre A+.:======= A± vers la gauche. Il apparaît on excès de

Ir.

En

absence del' A.A, la concentration en protons serait égale à [Rl(l'acide fort se dissocie complètement).

En

présence de l'acide aminé, la concentration en protons est

[Ir].

Il s" ensuit

que:

[Ai

= [Rl - [Ir]

Soit la concentration totale en acide aminé :

C=[Ai+[Al (1)

Si onposex _ [AJ

= [Rl-[Ir]

- - -

c

^C

Les équations (1) et (2) donnent x

=

^{[Ai+ [Ai}

[H-]

L'équation d' Anderson donne:

(2)

d'où [Ai [AJ

X

pKa1

=

pH+ Log - - 1 -

x

Le

même raisonnement à partir de l'équilibre A± +

OK

déterminer le

pKai

en ajoutant des OIL

2. Matériel et réactifs - Solution de glycine à 0,08 M

- NaOH0,2N

- HClN

. - Formol à 35 %

Solutions étalon pH 4 et pH 7 - Burette de 50 ml

- Becher de 100 ml - Becher de 50 ml

= - - - - 1-x

X

14

(14)

- Barreau aimanté - pH-mètre

- Electrode de verre - Agitatem magnétique - Pipette de 2 ml - Pipette de l O ml

3.Manipnlation

3.L Détermination du pKa1 Mettre dans un bécher de 50 ml :

- 20 ml de glycine 0,08 M - un barreau all:nanté

- placer le bécher sur le bloc d'agitation. Mettre en marche l'agitation (attention: la vitesse d'agitation doit être minimale pour ne pas casser l'électrode et évitez de toucher au bouton température de l'agitateur).

- ajuster l'électrode de manière à ce que la sphère plonge entièrement dans la solution. Lire le pH.

- Verser 0,3 ml de HCl IN à l'aide d'une pipette de 2 ml et noter le pH. Continuer à verser l'acide chlm:h.ydrique à raison de 0,1 ml jusqu'à pH= 2 en notant à chaque fois le pH. La lecture du pH se fait après avoir arrêté l'agitation.

pKa1 +pKa2

On conserve cette solution pom déterminer le pHi

= - - - ,

(pH pour lequel la 2

charge nette de l' AA est nulle) et le pKa2.

Exemple : On ajoute 0,4 ml d'HCl 0,958 N à 20 ml d'une solution 0,08 M de glycine et on note un pH = 2,85

HCLversé

[R-]. [H+] - A - ^X

(ml) pH pt'] [Rl C ^x= 1-X Log I-x pKa1

C 0,3

0,4 2,85 0,0014 0,0188 0,0784 0,222 0,286 -0,S44 2,306

0,5

Calculs:

a/ pH= Log I/[It'] = 2,85 ⇒

1/[Ir]

⁼⁷⁰⁸⇒ [Ir]= 0,0014 éq/1

15

- -- ----·- --- ^-

(15)

0,4 n+

h/Pour [R.1: on a versé

-W--

x 0,958 éq. n dans 20 ml, ce qui donne un volume final de 20,4ml.

Donc

[Rl =

0,4. 0,958 ln3

=

0 0188 , /l

lô3 .

20,4 . u- ' eq cl C

=

0,08 . 20 _

20,4

. [R-1-

[H+]

dix_

- C

e/ X 0,222

- - -

1-x 1-0,222

=

0,0784M

0,0188-0,0014 0,0784 0,286

fi Log

l _

X X - 0,544

=

0,222

pKa1

=

pH

+ Log l

X

=

2,85 - 0,544

=

2,306 -X

Pour avoir un pKa1 précis, il est conseillé de faire ce type de calcul pour 3 pH différents et e:osoite prendre la moyenne.

3.2. Détermination du pBi et du pKa2

· Remplir la burette avec de la soude 0,2 N et commencer la titration en rajoutant ml par ml dans le bécher contenant l'acide aminé précédemment acidifié en notant à chaque fois le pH jusqu'à pH= 11.

a/ Détermination du pli

Tracer la courbe expérimentale pH en fonction du volume de NaOH rajouté.

Utiliser la méthode des tangentes pour déterminer le point d'équivalence.

L'allure de la combe, les différentes formes d'ionisation ainsi que l'effet tampon vous seront expliqués par l'enseignant.

b/ Détermination du pKa2

Sur la courbe, tracer un nouvel axe de coordonnées passant par le pHi, et à partir de la valeur du pKa1 calculée, retrouver par symétrie la valeur du pKa2.

16

(16)

IV. 2lme Méthode: détermination des PKa2 et PKa1 1. Introdncfion

Cette titration se fait en présence du formol ( ou formaldéhyde) qui provoque la transformation de la fonction amine en dimétbanolamine.

coo- coo·

R·CH<-; ^+2H-c(:-- R·CH<N<CRJ)H

CHf>H

+w

Cette seconde méthode permet une détermination précise du point d'équivalence (ou point de neutralisation totale del' AA).

2. Manipulation

- dans un bécher de 50 ml, introduire 20 ml de la solution de glycine - ajouter 1ml de fonnol ^à35 %

- agiter

- placer l'électrode dans la solution - noterlepH

- remplir la burette avec la solution de NaOH 0,2 N - titrer avec la soude

- noter le pH pom chaque volume de soude rajouté ( de 0,2 ml en 0,2 ml) jusqu'à pH

=

12 - tracer cette deuxième courbe sur le même papier millimétré en prenant la droite passant

par le point d'équivalence comme nouvel axe de coordonnées .. déterminer levohnne d'équivalence {par la méthode des tangentes) - déterminer le pKa2 et le pKa1 par cette méthode

comparer les valeurs obtenues par ces 2 méthodes en apportant vos critiques

17

Ï" - --- - - -·· -- - - -- -·- - -·-

(17)

SEANCE III

- REACTIONS COLOREES DES PROTEINES ET - DES ACIDES AMINES

18

- -

^- - - - - ----·-·- - - - - ^.- •--· ^- ^-- - ··-·· .

(18)

REACTIONSCOLOREESDESPROTEINESETDESACIDESAMINES

Les réactions colorées des protéines, exceptée celle de Biuret, ne sont pas données par la protéine elle-même, mais par les acides aminés qui la composent.

Certains acides aminés étant complètement absents de certaines protéines, on essaie un certain nombre de réactions colorées sur la solution étudiée.

3 solutions inconnues (A, B, C) seront étudiées : vous aurez à déterminer la nature de ces solutions ( acides aminés, protéines ou autres).

1 - Réaction de Biuret

Cette réaction caractérise la liaison peptidique; elle s'applique donc ^àl'analyse qualitative des protéines et des peptides.

Mode opératoire :

Mettre successivement dans 3 tubes à essai : - 2 ml de la solution A

- 2_

rru

de la solution B - 2 ml de la solution C

Ajouter dans chaque tube 2 ml d'une solution de NaOH à 10%.

Mélanger et rajouter goutte à goutte une solution de sulfate de cuivre à 1 %.

Noter la coloration.

La coloration bleue violette est spécifique de la liaison peptidique (-CO-NH-).

Conclure pour chaque solution inconnue.

2 - Réaction à la ninhydrine

La ninhydrine en excès et à chaud, réagit avec l~-~-~jdes _élIDÎnés libres en développant une coloration violette. Cette réaction est couramment utilisée pour caractériser et doser les acides aminés. Sa spécificité n'est cependant pas absolue puisque certains composés possédant une fonction amine primaire réagissent également. La proline et la __ cystéine donnent une C?loration jaune.

19

(19)

Mode Opératoire

- 2 ml de la solution B - 2 ml de la solution C

Ajouter dans chaque tube quelques gouttes d'une solution ~coolique~.de oiobydri.µe à 1 %.

Chauffer au bain-marie bouillant durant 10 minutes.

Noter la coloration obtenue.

Conclure sur le contenu de chaque solution étudiée.

3 - Réaction Xanthoprotéique

Cette réaction est caractéristique des noyaux aromatiques des acides aminés et des résidus aminoacyls. L'acide nitrique réagit sur les cycles -aromatiques en formant des dérivés nitrés jaunes. Cette coloration s'accompagne d'un précipité de dénaturation lorsqu'on opère sur une protéine.

Mode opératoire

2 ml de la solution B - 2 ml de la solution C

Ajouter dans chaque tube 0.5 ml d'acide nitrique concentré sous la hotte (Attention, réactif dangereux, utiliser une propipette ).

Chauffer au bain-marie bouillant quelques minutes (2 à 3 mn).

Noter la coloration.

Lorsqu'on est en présence de noyaux aromatiques, une coloration jaune se développe.

Refroidir et ajouter doucement quelques gouttes de lessive de soude pour alcaliniser.

. ^·~ . ^.

La coloration jaune vire à l'orange. Ce phénomène est dû à la présence de noyaux aromatiques qui donnent des dérivés benzéniques nitrés sous l'action de l'acide nitrique.

Conclure pour chaque solution testée.

20

(20)

.... .,....

4 - Réaction de Millon

La réaction de Millon est caractéristique de la fonction phénol de la tyrosine et du résidu tyrosyl.

2 ml de la solution B - 2 ml de la solution C

Ajouter 1 ml de réactif de Millon ( ne pas pipeter à la bouche) et chauffer doucement au bec Benzène en maintenant le tube à essai incliné vers la vitre de la paillasse avec une pince en bois.

La coloration rouge brique indique la présence de la tyrosine.

Conclure pour chaque solution testée.

5 - réaction d' Adamkiewiez

Cette réaction caractéristique du noyau indole est spécifique du tryptophane. Les composés indoliques donnent avec certains aldéhydes (A. Glyoxylique ... ) en milieu acide à froid, une coloration violette.

Ajouter dans chaque tube 2 ml de réactif glyoxylique et agiter.

Ajouter doucement sur la paroi de chaque tube maintenu incliné, sous la hotte, 2 ml d'acide sulfurique concentré sans mélanger. (attention, réactif dangereux, utiliser une pro-pipette).

Noter le résultat obtenu.

Conclure.

21

/ - - -- -- ~ - - - -- - -- - - -- -- - - --- - -

(21)

6 - Formation de sulfure de plomb

Cette réaction est caractéristique de la fonction thiol de la cystéine et de résidu cystéique. La coloration noirâtre, due à la formation de sulfure de plomb indique la présence de la cystéine.

Mode opératoire

Mettre successivement

dans

3 tubes à essai : - 2 ml de la solution A

Ajouter dans chaque tube 2 ml de soude à 40%. Faire bouillir au bain-marie pendant 2 mn.

Ajouter quelques gouttes d'acétate neutre de plomb.

N ~ le résultat obtenu.

Conclure.

7- Précipitation des protéines

_ _ .· _ . _. 4

plup;u:t des protéines précipitent, dénaturées par-chauffage à e1mllition. Les acides forts (minéraux et organiques), provoquent une dénaturation irréversible des protéines par la brutale baisse de pH qu'ils entraînent

Les sels des mé1aux. lourds: Pb2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, ... dénaturent aussi les protéines.

Les sels neutres (ex. Sulfate d'ammonium, Sulfate de magnésium) précipitent les protéines, à température ambiante, sans dénaturation.

Mode opératoire a/ les acides

a-1/ Acide organique

Mettre dans un tu.be à essai 2 ml de la solution de protéine précédemment identifiée.

~ .

Ajouter 1ml de TCA à 30%. Noter le résultat obtenu. .

a-2/ Acide minéral

Opérer de la même façon en ajoutant quelques gouttes d'acide nitrique concentré {Attention, réactif dangereux, utiliser une propipette).

22

- - - ~ - - - -

(22)

b/ Les sels de métaux lourds :

Mettre dans un tube à essai 2 ml de la solution de protéine précédemment identifiée.

Ajouter quelques gouttes d'acétate de Plomb.

Noter le résultat obtenu. Conclure.

d Les solvants organiques ·

Opérer de la même façon en ajoutant quelques gouttes d'éthanol à 90° ou de butanol ou d'acétone.

d/ Action de la chaleur :

. Mettre dans un tube à essai 2 ml de la solution de protéine.

Alcaliniser avec quelques gouttes de NaOH IN (utiliser le papier pH pour estimer le pH).

Chauffer à ébullition.

Noter le résultat.

Acidifier par HCI IN.

Conclure.

23

(23)

SEANCE IV

REACTIONS D'IDEN'fIFICATION DES GLUCIDES

24

- - - -

--- - - - ---- -·-·-·· ··--- - . ·-

(24)

REACTIONS D'IDENTIFICATION DES GLUCIDES

1- Définition.

Les glucides sont des composés organiques comportant des fonctions carbonylées (aldéhyde ou cétone) et des fonctions alcool.

II-Classification

Les

glucides comprennent deux grands groupes de substances : les oses et les osides.

1-Les oses

Ce sont des composés glucidiques qui ne peuvent pas être hydrolysés en molécules plus simples. Ils sont classés selon deux critères :

1.1 le nombre de leur atome de carbones :

On distingue ainsi, les trioses, tetroses, pentoses, hexoses, heptoses, qw possèdent respectivement 3, 4, 5, 6 et 7 atomes de carbone.

1.2 la nature de la fonction carbonyle :

les aldoses possèdent une fonction aldéhyde. Leur formule générale est :

,,f'o

R-CHOH-C

"'-tt

Les cétoses possèdent une fonction cétone. Leur formule générale est : 0

11

R-C-~OH

Remarques : La forme cyclique des oses est la plus stable

Il existe des dérivés des oses : acides uroniques, désoxyoses, osamines, acides uroniques.

II. Les osides

Ils résultent de la combinaison de plusieurs molécules d'oses, ou d'oses avec des composés non glucidiques. Les osides libèrent des oses par hydrolyse en milieu faiblement acide. Les osides sont subdivisés en :

25

(25)

1-- -

ExemJ!les de guelgues oses :

CHO CHO CHO CHO CHf'H

OH HO OH OH ⁰

HO HO

OH OH

OH HO OH

OH OH OH OH OH

CHf)H CHj)H C~OH C~OH CHf)H

Aldose Aldose Aldose Aldose Cétose

Pentose Pentose Hexose Hexose Hexose

ribose arabinose glucose galactose fructose

♦ Holosides:

Ce sont des composés dont l'hydrolyse acide ne libère que des oses. Les holosides résultent de la condensation de (n) oses par liaison glycosidique entre la fonction carbonyle d'un ose et un groupement OH porté par un autre ose.

► Si n < 10, ce sont des oligoholosides (oligosides ou oligosaccharides).·

Exemples:

Maltose

fff:PH

^ylif)H

0 (H.OB:)

H OH H OH

fHPH

Saccharose

0

OH H

► Si n > 10 , ce sont des polyholosides (polyosides ou polysaccharides):

Exemples : L'amidon, le glycogène , la cellulose.

- - --·----^- ^{- -·-}^·•·-^- ^·- ^·- ^····^-

26

(26)

♦ Les hétérosides (glycosides):

Ce sont des composés dont l'hydrolyse acide libère une ou plusiems molécules d'oses, et tme substance non glucidique appelée Aglycone

Exemples : glycoprotéines, glycolipides.

III. Manipulation :

Le but de cette manipulation est l'identification qualitative des glucides inconnus à l'aide de réactions chimiques caractéristiques.

1. Réaction de Molish : 1.1. Principe

Cette réaction permet de caractériser la présence d'un glucide : ose ou oside

En milieu concentré, le glucide est déshydraté en un composé furfuralique qui se condense avec l'a naphtol en formant un composé coloré en violet.

CH-CH

R -·

~

^{~ - ~ O}

\ / "H

0 CH-. -CH

+

l

lr'\__OH

_\. _~

~ /

'> .,

'\. ^.

/ , a-naphtol

'" ^\~ ^_

^_/

^//

CH-CH

11 11

R--C C--CH ^{R - ~} ^{~ - -}

!_/r~OH

\ / 1 '~->=(

\0/ ^Il

('

^{/ ~}

l

~ / '.,_j'

1 J

li .

0

0 H /' '\

\.:, ·--~ //

Le composé résultant possède 8 doubles liaisons conjuguées.

27

- - - ' - - - -- - -· ^{··•-- --·}^··- ^-^·^{- ---} --- - - - -·.---- --_,

(27)

1.2. Réactifs

- Solution de sucre inconnu

- Solution-alcoolique d' a naphtol à 5%

- Solution sulfurique (H2S04) concentré.

1.3. Mode opératoire

Dans un tube à essai, introduire 5 ml de la solution de sucre et 5 gouttes d'une solution d' a.-naphtol à So/ ... Agiter. Pipeter à l'aide d'une propipette 3 ml d'acide sulfinique et

le laisser couler doucement le long de la paroi du tube incliné afin de former une couche sous le mélange.

1.4. Résultats

L'apparition d'un anneau violacé au niveau de la séparation des deux liquides révèle la présence d'un glucide en solution.

N.B: Une coloration verte apparaît dans le liquide inférieur. Cette coloration est due à l'action de H2SO4 sur l'a. naphtol.

2. Réaction à Piode.

2.1. Principe

L'iode est adsorbé sur les chaînes 1-4 d'a· glucose, à raison de 2 molécules par tour d~ spire. La coloration obtenue est due aux phénomènes de résonance qui se produisent quand des atomes d'iode viennent se placer au niveau de l'axe des portions hélicoïdales de macromolécules comme l'amidon ^etle glycogène.

2.2. Réactifs - Solution de sucre inc:on:nu - Acide chlorhydrique à 15%

- Solution d'iode iodure : Lugo!

2.3. Mode opératoire

Dans un tube à essai, introduire 2 ml de la solution de sucre et 0.2 ml d'HCl 15%

(ne pas pipeter àJa bouche).

28 - - -- - - -- - --- - ----·--------- · .

(28)

Mélanger et ajouter 2 gouttes de réactif iodo-ioduré. Eviter un excès de ce réactif qui masquerait le virage de la teinte.

2.4. Résultats

Pour le glycogène, la coloration est brun acajou. Pour l'amioon , elle est bleu- noir. La coloration disparaît au chauffage (destruction du complexe d'adsorption), et réapparaît après refroidissement (refroidir sous le robinet d'eau). Ce phénomène est théoriquement réversible.

3. Réaction de Bial 3.1. Principe

Cette réaction permet l'identification des pentoses.

En milieu acide chlorhydrique concentré, les pentoses sont déshydratés et se condensent avec l'Orcinol et donnent un produit de couleur verte.

CII--CH

Pentoses __ H_C_l_

. /;o

CH C - C ' 7 '

+

\ / "B

0

CH--ru M

eu

c -<'--lhœ ^-H,o

\ / 1

\==,i ^{3H'Fe ...}

O H

1

CH-CH ·

OH

Le composé résultant est coloré et possède 6 doubles liaisons conjuguées.

3.2. Réactifs - Solution de sucre inconnu

- Réactif de Bial (solution d'Orcinol à 2% dans l'acide chlorhydrique concentré).

29

(29)

3.3. Mode opératoire

Dans un tu.be à essai, mettre 0.5 ml de réactif de Bial et 1 goutte de la solution de sucre inconnu. Chauffer au bec benzène pendant 5 minutes.

3.4. Résultats

Une coloration verte immédiate indique la présence d'un pentose.

4. Réaction de Seliwanoff 4.1. Principe

Cette :réaction permet de caractériser les cétoses.

En milieu acide chlorhydrique concentré et à chaud, les cétoses sont plus rapidement déshydratés que les aldoses en dérivés furfuraliques (oxyméthyl-furfural) qoi se condensent avec le résorcinol en donnant un composé de couleur rouge cerise. Le produit formé précipite en milieu aqueux. M3ïs il est soluble dans l'alcool.

CH-CH

OH

Cétose ^HCl

~0 H ~

CH C - C ~

+ \f '-OH

\ · / "'CHJ>H ~

0

Ox:yméthyl-furfural

H+

Le composé résultant est coloré et possèdent 6 doubles liaisons conjuguées.

4.2. Réactifs

- Solution de sucre inconnu

- Acide chlorltydrique concentré (HCl)

30

(30)

- Solution alcoolique de Résorcinol à2%

4.3. Mode opératoire

Dans un tube à essai, introduire 3 ml de solution de sucre et 2 ml d'HCl concentré {ile pas pipter à la bouche). Introduire 2 ml de solution alcoolique de Résorcinol à 2%. Mélanger et mettre dans un bain-marie bouillant pendant 5 minutes.

4.4. Résultats

Les cétohexoses donnent une coloration rouge cerise. Les aldohexoses donnent, après isomérisation, une coloration orangée.

5. Détermination des sucres réducteurs 5.1. Réduction de la liqueur de Fehling

a/Principe

Le principe repose sur la réduction à chaud, de l'hydroxyde cuivrique Cu(OH)2 en oxyde cuivreux: Cu20. Le cuivre passe de l'état bivalent à l'état monov~ent en donnant tme coloration rouge brique.

R-CHO

+

2Cu0

+

KOH

b/ Mode opératoire

Dans tm tube à essai, mettre 2 ml de la solution de sucre, ajouter 2 ml de liqueur de fehling. Mélanger et porter au bain-marie bouillant pendant 5 minutes . Conclure.

Exemples de sucre réducteurs: le glucose, le fructose, l'arabinose,le xylose, le maltose, le lactose.

la fin de chaque séance.

1

une

N.B.

comptes rendus doivent être rendus

la fin de chaque séance.

assure

SEANCEI

TP D'INITIATION

· SEANCE D'INITIATION

pm

=

=

PH-METRIE DE LA GLYCINE

SEANCE II

I.

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1

1-

[H1.[A1

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[Hl - - - -

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- - - - · - - - -

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R·CH<-; +2H-c(:-- R·CH<N<CRJ)H

CHf>H

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=

Ï" - --- - - -·· -- - - -- -·- - -·-

SEANCE III

- REACTIONS COLOREES DES PROTEINES ET - DES ACIDES AMINES

- -

-Kai [H1 = &1 . ^Ka:.z

⁼

R·CH<-; ^+2H-c(:-- R·CH<N<CRJ)H

'" ^\~ ^_

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