Méthodes de Diagnostic
microbiologique
A- Méthodes diagnostiques basées sur la croissance bactérienne
• Les méthodes diagnostiques établies sur les
caractéristiques culturales sont très
importantes pour l'identification de la plupart
des micro-organismes pathogènes.
I- Isolement des agents pathogène à partir des échantillons cliniques:
• En cas de suspicion d'infection chez un patient, des échantillons biologiques sont prélevés et adressés au laboratoire de microbiologie pour analyses microbiologique et/ou immunologique, et/ou moléculaire .
• Les échantillons peuvent être de toutes sortes : sang, urine, fèces, crachat, liquide céphalo-rachidien ou pus prélevé à partir d'une plaie. Un écouvillon stérile peut servir pour prélèver le site infecté.
• Cet écouvillon est ensuite déchargé à la surface d'une gélose et/ou dans un milieu de culture liquide ; ce milieu est ensuite incubé.
• Des biopsies tissulaires peuvent être également
prélevées et mises en culture de la même manière.
• Une fois le micro-organisme isolé et identifié, le clinicien doit s'assurer de sa réelle mise en cause dans la maladie infectieuse diagnostiquée.
• C'est pour cela que les conditions de réalisation des prélèvements sont primordiales. Les risques de contamination doivent être évités par la réalisation de l'asepsie.
• De plus, les conditions de prélèvements doivent permettre d'optimiser l'inoculum prélevé.
• Enfin, certaines précautions sont indispensables
par rapport aux exigences culturales des micro-
organismes, comme le maintien de l'anaérobiose
pour les bactéries anaérobies strictes. Une fois
prélevés les échantillons doivent être mis en
culture le plus rapidement possible.
Les milieux de culture
• La culture constitue une part importante de la microbiologie médicale, grâce au choix des milieux de culture et des conditions d'incubation appliquées pour l'isolement des micro-organismes à partir des échantillons biologiques.
• La plupart des micro-organismes importants en clinique peuvent être cultivés, donc isolés et identifiés, et cela grâce à la grande variété des milieux de culture existants.
• La plupart des échantillons cliniques sont d'abord
cultivés sur des milieux non sélectifs, comme les géloses
au sang qui permettent la croissance de la plupart des
organismes aérobies et anaérobies facultatifs.
• L'utilisation des milieux d'enrichissement, qui contiennent des facteurs permettant la croissance des micro- organismes exigeants, est souvent nécessaire ; c'est par exemple le cas pour l'isolement de Neisseria gonorrhoeae, agent responsable de l'urétrite gonococcique ou de Salmonella spp agent des salmonelloses.
• Certains milieux sont dits sélectifs car ils permettent, grâce à l'addition de composés dans le milieu, de favoriser la croissance de certains micro-organismes, tout en inhibant la croissance d'autres micro- organismes.
• Enfin, les milieux différentiels sont des milieux
spécialisés qui permettent l'identification des micro-
organismes à partir des caractéristiques culturales
révélées sur ces milieux.
Le sang
• La bactériémie correspond à la présence de bactéries dans le sang .
• Ce phénomène est rare chez l'individu sain, arrivent occasionnellement et de manière transitoire en réponse à des actes invasifs, lors de soins dentaires ou lors de traumatismes.
• La présence prolongée de bactéries dans le sang est généralement indicatrice d'infection systémique.
• Les bactéries les plus fréquemment retrouvées dans le
sang sont les entérobactéries, notamment Escherichia
coli ou Klebsiella pneumoniae, les cocci Gram positif
comme Staphylococcus aureus et Streptococcus
pyogenes, et le bacille Gram négatif Pseudomonas
aeruginosa.
• La septicémie ou sepsis est une infection générale grave de l'organisme qui résulte de l'association d'une bactériémie et d'un syndrome de réponse inflammatoire systémique.
• Les signes cliniques sont souvent une hyperthermie accompagnée de frissons et d'accélération du rythme respiratoire. Les formes les plus graves sont le sepsis sévère (sepsis avec dysfonctionnement aigu d'un ou plusieurs organes vitaux comme les reins, le cœur ou les poumons) et le choc septique, caractérisé par une hypotension artérielle majeure.
• Les hémocultures sont le seul moyen d'isoler et d'identifier l'agent causal ; le diagnostic et le traitement dépendent alors de la bonne réalisation des cultures du sang.
• La procédure standard de culture du sang, appelée hémoculture consiste à prélever aseptiquement 20 mL de sang veineux et à les injecter dans deux flacons, dits d'hémoculture, qui contiennent à la fois des anticoagulants et du milieu de culture conventionnel.
• Un des flacons est incubé en aérobiose, l'autre en
anaérobiose. L'incubation se fait à 35 °C et la
lecture des flacons se fait plusieurs fois par heure
pendant au moins cinq jours, ceci le plus souvent
grâce à des systèmes automatisés.
• La majorité des micro-organismes ayant une réelle signification clinique sont détectés dans les deux premiers jours, alors que d'autres, plus exigeants, le sont entre le troisième et le cinquième jour d'incubation.
• Certains systèmes d'hémoculture emploient des agents chimiques lysant les globules rouges et les globules blancs de manière à libérer les pathogènes intracellulaires.
• Des indicateurs de croissance détectent les
microorganismes présents dans les flacons
d'hémoculture, puis l'observation microscopique et
la réalisation de subcultures les identifient.
• Les automates d'hémoculture détectent la croissance microbienne par l'augmentation de la production de dioxyde de carbone ou par turbidimétrie, une lecture étant réalisée toutes les dix minutes.
• Sur l'ensemble des prélèvements de sang, un taux de contamination, incompressible, est attendu ; celui-ci est de l'ordre de 2 à 3 %.
• Les contaminants les plus courants appartiennent à la flore cutanée normale, comme Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes ou les bactéries corynéformes.
• Cependant, ces contaminants sont aussi occasionnellement responsables d'infections touchant le système cardiaque (endocardite bactérienne subaiguë) ou peuvent coloniser des dispositifs intravasculaires tels que les valves cardiaques artificielles.
• C'est pourquoi, la validation clinico-microbiologique est indispensable pour une bonne interprétation des résultats d'hémoculture.
Les urines
• Les infections du tractus urinaire sont très fréquentes, notamment chez les femmes. Sachant que les agents impliqués dans ce type d'infection proviennent le plus souvent de la flore digestive normale (Escherichia coli par exemple), l'analyse cyto-bactériologique des urines requiert de grandes précautions.
• Dans la plupart des cas, l'infection des voies urinaires se fait par voie ascendante après colonisation progressive de l'urètre jusqu'à l'infection de la vessie.
• Les infections urinaires sont aussi la première cause
d'infections nosocomiales.
• Une infection urinaire significative implique en général au moins 105 bactéries par millilitre d'urines recueillies au milieu du jet après lavage soigneux de la sphère génitale externe.
• En l'absence d'infection, une contamination du prélèvement apporte moins de 103 bactéries par millilitre.
• Les agents pathogènes urinaires les plus courants
sont des entérobactéries, avec notamment E. coli,
qui compte pour plus de 90 % des cas. Les autres
bactéries habituellement retrouvées sont Klebsiella,
Enterobacter, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus
saprophyticus et Enterococcus faecalis.
• Neisseria gonorrhoeae, agent de l'urétrite gonococcique, ne se développe pas dans l'urine en elle-même, mais sur l'épithélium urétral et est diagnostiqué par d'autres méthodes.
• Un examen microscopique direct des urines permet de
dépister la présence anormale de bactéries, c'est-à-dire
une bactériurie. Cependant, cette bactériurie est
plus communément dépistée au moyen de
bandelettes urinaires qui testent certains paramètres
témoins de la croissance bactérienne et de l'infection
.• Ainsi, la détection des entérobactéries peut être objectivée par la mise en évidence de nitrites (activité nitrate réductase propre aux entérobactéries) dans l'urine, cette réaction n'étant positive qu'au-delà d'un certain seuil (>
105 par millilitre), ce qui permet ainsi l'utilisation de ce test comme un moyen simple de dépistage des infections urinaires.
• Sur les bandelettes urinaires, d'autres tests sont associés : détection de l'activité estérase (des leucocytes), et de l'activité peroxydase (présente chez une grande variété de bactéries ).
• Une mise en culture de l'urine doit suivre une bandelette urinaire positive. En cas de bactériurie, une coloration de Gram peut être réalisée directement à partir des échantillons urinaires, de manière à identifier les caractéristiques morphologiques des pathogènes.
• Sont retrouvés entre autres des bacilles Gram négatif (enterobactéries), des cocci Gram négatif (Neisseria) ou des cocci Gram positif (Staphylococcus, Enterococcus).
• La coloration de Gram ou d'autres méthodes de coloration sont souvent utiles pour la détection des bactéries directement dans les échantillons biologiques.
• Pour la culture des échantillons urinaires, on utilise deux types de milieux :
• l) géloses au sang non sélectives et
• 2)milieux sélectifs pour les enterobactéries, comme le milieu Mac Conkey ou le milieu à l'éosine et au bleu de méthylène(milieu EMB) .
• Ces derniers milieux permettent la différenciation initiale entre les souches d'entérobactéries fermentant le lactose et celles ne le fermentant pas, tout en inhibant la croissance des bactéries Gram positif telles que Staphylococcus spp.
(contaminant cutané classique).
• Avec l'expérience, une identification présomptive de la bactérie, fondée sur la couleur et la morphologie des colonies obtenues sur les milieux , est possible.
• Une telle identification doit être étayée par des tests complémentaires, et le diagnostic microbiologique doit être la conjonction cohérente de tous les tests réalisés.
• La culture d'urine peut être quantitative par comptage des colonies retrouvées sur les milieux ensemencés après inoculation d'un volume urinaire calibré, généralement à 1uL.
• Finalement, si aucune culture bactérienne n'est obtenue malgré des signes urinaires fonctionnels persistants, il faut envisager la recherche de bactéries de croissance difficile comme Neisseria gonorrhoeae, de bactéries intracellulaires comme Chlamydia trachomatis, de bactéries de croissance lente comme Mycobacterium tuberculosis, ou enfin de bactéries anaérobies
Les fèces
• Un recueil et une conservation appropriés des fèces sont importants pour l'isolement des pathogènes intestinaux.
• Durant la conservation, l'acidité fécale augmente si bien que le délai entre le recueil de l'échantillon et la mise en route de l'analyse bactériologique doit être le plus court possible.
• Ceci est particulièrement important pour l'isolement de Shigella et Salmonella, deux genres sensibles aux pH acides.
• Les selles fraîchement émises sont placées dans un pot (contenant éventuellement un tampon phosphate destiné à contrecarrer l'acidification) adapté au transport jusqu'au laboratoire.
• Les selles hémorragiques ou glaireuses (pus) et les selles de patients suspects sont ensemencées sur différents milieux sélectifs adaptés à l'isolement de bactéries spécifiques
• De nombreux laboratoires utilisent également
des milieux différentiels et spécifiques, avec des
conditions d'incubation adaptées à l'identification
d'Escherichia coli 0157:H7 et de Campylobacter,
deux bactéries pathogènes intestinales majeures
transmises généralement par les aliments et l'eau
contaminés.
Les plaies et abcès
• Les infections survenant sur des plaies traumatiques à la suite de morsures humaines ou animales, de brûlures, de coupures ou de la pénétration de corps étrangers, doivent être documentées par des échantillonnages soigneusement réalisés ;
• l'interprétation des résultats obtenus exige des précautions.
• En effet, la flore locale colonise souvent les plaies et les abcès, et les écouvillonnages de telles lésions sont fréquemment souillés.
• Pour les abcès et autres types de lésions purulentes, la meilleure méthode de prélèvement est l'aspiration à l'aide d'une seringue et d'une aiguille stérile après désinfection préalable de la peau.
• Les lésions purulentes profondes sont prélevées chirurgicalement par la réalisation de biopsie(s).
• Une grande variété de pathogènes est associée à ce type de lésions purulentes, parmi lesquels figurent de nombreuses bactéries anaérobies.
• Les conditions de prélèvements, de transport et de culture en aérobiose et en anaérobiose sont donc primordiales pour une bonne évaluation microbiologique de ce type d'infection.
• Les pathogènes que révèlent fréquemment les prélèvements de pus sont des entérobactéries, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, et des bactéries anaérobies comme Bacteroides et Clostridium.
• Les milieux habituellement utilisés sont les géloses au sang, les milieux spécifiques des entérobactéries et des milieux au sang additionnés de composés spécifiques et d'agents réducteurs nécessaires à l'isolement des bactéries anaérobies strictes.
• Une coloration de Gram permet d'observer de tels échantillons directement au microscope.
Prélèvements génitaux et diagnostic microbiologique des infections à Neisseria gonorrhoeae
• Chez les hommes, l'écoulement urétral purulent est le symptôme classique de l'infection sexuellement transmissible (IST) appelée urétrite gonococcique ou gonorrhée .
• En l'absence d'écoulement urétral, un prélèvement est réalisé à l'aide d'un écouvillon stérile fin inséré dans la partie antérieure de l'urètre et ensemencé le plus rapidement possible sur un milieu adapté à la culture de Neisseria gonorrhoeae.
• De manière alternative, un recueil des premières urines du matin est possible pour la recherche de ce pathogène.
• Chez les femmes, devant la suspicion d'IST, il est nécessaire de réaliser à la fois un prélèvement du col utérin et de l'urètre.
• La mise en œuvre des procédures adaptées est décisive pour le diagnostic microbiologique d'infection à N. gonorrhoeae (ou gonocoque) colonise les muqueuses uretrales, du col utérin, de l'anus, de la gorge et des conjonctives.
• Cette bactérie est sensible à la dessiccation et se transmet ainsi presque exclusivement par contact direct entre personnes.
• Les mesures de santé publique pour contrôler les cas de gonococcie passent par l'identification des porteurs asymptomatiques, ce qui nécessite le recours à des analyses microbiologiques.
• N. gonorrhoeae se présente comme un diplocoque Gram négatif, parfois pléiomorphe. Aucun autre micro-organisme similaire morphologiquement ne se retrouve dans la flore du tractus urogénital.
• Ainsi, l'examen direct d'un frottis vaginal ou cervical montrant après coloration de Gram des diplocoques Gram négatif est en faveur d'une urétrite gonococcique.
• Dans un tel cas, l'examen microscopique des sécrétions purulentes montre fréquemment des diplocoques Gram négatif phagocyté par les neutrophiles . Certains laboratoires analysent les échantillons génito-urinaires pour la recherche de N. gonorrhoeae (et de Chlamydia trachomatis) en utilisant des sondes nucléiques ou l'amplification par PCR.
• Les milieux non sélectifs d'enrichissement de N. gonorrhoeae contiennent du sang cuit et sont appelés géloses « chocolat » en raison de leur couleur marron foncé.
• Ce milieu est rendu sélectif par addition de la vancomycine, de la nystatine, du triméthoprime et de la colistine ; ces quatre antibiotiques inhibent la croissance des bactéries de la flore normale, mais pas celle de N. gonorrhoeae.
• Les milieux inoculés sont incubés à 37 °C en atmosphère aérobie humide contenant entre 3 et 7 % de CO2 nécessaire à la croissance du gonocoque.
• Les boîtes sont examinées après 24 à48 heures de culture et testées pour la recherche de l'oxydase, car toutes les espèces de Neisseria sont oxydase positif.
• L'identification définitive nécessite la détermination
d'un panel complémentaire de tests phénotypiques
(utilisation des sucres) et/ou des tests immunologiques
ou moléculaires.
Les cultures des bactéries anaérobies
• Les bactéries anaérobies strictes sont des causes fréquentes d'infection. L'isolement et l'identification des pathogènes anaérobies nécessitent des méthodes de culture et d'isolement spécifiques.
• En général, les milieux pour les anaérobies ne diffèrent pas de ceux utilisés pour les bactéries aérobies, excepté :
• l) qu'ils sont habituellement plus riches en constituants organiques,
• 2) qu'ils contiennent des agents réducteurs (cystéine ou thioglycolate le plus souvent) et
• 3) qu'ils possèdent des indicateurs redox.
• Les procédures de maniement et de traitement des échantillons sont élaborées de manière à exclure toute contamination par l'oxygène, celui-ci étant toxique pour les bactéries anaérobies strictes.
• Dans l'organisme, il existe différentes niches naturellement anoxiques (par exemple, certaines portions de la cavité buccale ou le tractus intestinal bas), dont les constituants habituels de la flore locale sont en partie des bactéries anaérobies strictes.
• Par ailleurs, d'autres sites anatomiques peuvent devenir anoxiques, à la suite de destruction tissulaire (par plaie ou traumatisme) qui conduit à la réduction de l'apport sanguin et donc au manque en oxygène. Ce phénomène favorise alors l'installation de bactéries anaérobies strictes.
• De manière générale, les bactéries anaérobies strictes, appartenant aux flores normales, sont des pathogènes opportunistes.
• Il existe cependant deux exceptions majeures : Clostridium tetani (responsable dutétanos) et Clostridium perfringens (responsable de la gangrène gazeuse et d'intoxication alimentaire), toutes deux capables de former des endospores, formes de résistance bactérienne retrouvées dans les sols.
• Les méthodes de culture en anaérobiose cumulent le problème habituel de la contamination des prélèvements et celui du maintien d'une atmosphère strictement anoxique.
• Les échantillons cliniques prélevés par aspiration à la
seringue ou par biopsie doivent être immédiatement
placés dans un tube dépourvu d'oxygène(possibilité
d'utiliser une solution contenant un agent réducteur
comme le thioglycolate et un indicateur rédox comme
la résazurine, laquelle se colore en rosé en présence
d'oxygène).
• La seringue peut servir de système de transport à condition d'enlever l'aiguille et de bien boucher la seringue.
• Pour l'incubation en anaérobiose, les boîtes de Pétri sont placées dans une jarre, où l 'anoxie est obtenue par remplacement de l'air par un mélange N2-CO2 dépourvu d'oxygène, ou par ajout de composés consommant l‘O2 présent dans la jarre.
• Par exemple, il y a production de H2 qui, en présence d'un catalyseur comme le palladium, se combine à l' 02 libre pour former de l'H2O.
• D'autres alternatives existent, comme l'utilisation de
milieux de culture qui contiennent des agents
réducteurs ou l'utilisation de « boîtes à gants »
anaérobies remplies d'un gaz dépourvu d'O2 comme le
N2 ou l'H2 .
Méthodes d’identification basées sur les caractéristiques de croissance
• Si les primocultures, c'est-à-dire les cultures issues de l'ensemencement des prélèvements biologiques, montrent une croissance de bactéries, le travail du microbiologiste médical est alors de les identifier.
• Les méthodes d'identification utilisées sont
celles basées sur les caractéristiques de
croissance.
• Après primoculture, les bactéries à identifier sont habituellement repiquées en subculture sur des milieux permettant la mise en évidence de différents tests biochimiques.
• La plupart des tests biochimiques sont
actuellement réalisés à l'aide de kits
miniaturisés appelés galeries d'identification
biochimique.
• Les systèmes d'identification rapide des entérobactéries sont souvent utilisés car ces bactéries sont fréquemment impliquées dans les infections urinaires et digestives. Des galeries d'identification rapide sont également disponibles pour d'autres groupes ou espèces bactériennes.
• Par exemple, des galeries d'identification ont été développées pour Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae et Mycobacterium tuberculosis.
• Des galeries d'identification des levures Candida albicans et Cryptococcus neoformans existent également .
La résistance aux antimicrobiens
• L'isolement des micro-organismes pathogènes permet de confirmer le diagnostic clinique et d'adapter le traitement antimicrobien.
• La question de la détermination de la résistance aux antimicrobiens est un problème aigu de santé publique.
• La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) se fait par la méthode de diffusion en milieu gélose (antibiogramme).
• Les procédures pour la détermination de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques sont régies par des documents émanant des divers comités nationaux reconnus par l'OMS :
• pour les États-Unis, le National Commutée for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ;
• pour la France, le Comité de l'antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM).
B- Méthodes immunologiques de diagnostic clinique
• Les techniques d'immunoanalyse sont largement utilisées pour la recherche spécifique de micro-organismes pathogènes ou de constituants caractéristiques de ces pathogènes.
• Ces tests sont utilisés pour confirmer l'existence d'une infection lorsque l'agent responsable ne peut être identifié en culture ou n'est pas cultivable.
• Quand les méthodes de culture ne sont pas disponibles en routine ou sont difficiles à mettre en œuvre, notamment pour de nombreuses infections virales, dont l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH),
• les techniques d'immunoanalyse constituent un moyen efficace et relativement simple pour l'identification spécifique de pathogènes.
• Des anticorps spécifiques de pathogènes sont utilisés in vitro pour le diagnostic de maladies infectieuses.
• L'identification de l'agent responsable se fait,
dans certains cas, par la recherche de la réponse
immune humorale ou cellulaire développée par
l'organisme du patient en réaction à l'infection ;
dans d'autres cas par l'utilisation de tests
diagnostiques à base d'anticorps spécifiques de
l'agent infectieux.
Titres anticorps, tests cutanés et diagnostic des maladies infectieuses
• La mesure du titre (quantité) des anticorps spécifiques de l'agent infectieux suspecté permet le diagnostic d'une maladie. le titre des anticorps spécifiques du pathogène doit être élevé. Ce titre peut être mesuré par des techniques de précipitation, d'agglutination ou par d’autres méthodes immunologiques.
• La procédure classique consiste à préparer des dilutions en série du sérum du patient, le« titre anticorps » correspond à la dilution la plus forte à laquelle la réaction antigène- anticorps est détectable.
• Une seule mesure du titre des anticorps ne peut être utilisée pour affirmer une infection active.
• Ainsi, pour confirmer le diagnostic d'une infection aiguë, il est essentiel de montrer une augmentation du titre des anticorps sériques entre la phase aiguë et la phase de convalescence de la maladie.
• Cette augmentation du titre des anticorps est la meilleure preuve que la maladie est liée à l'agent infectieux suspecté.
• Dans certains cas cependant, la seule présence
d'anticorps spécifiques peut suffire au diagnostic
de l'infection.
• Toutefois, les infections ne sont pas toutes à l'origine d'une immunité systémique.
• Si un pathogène reste très localisé dans l'organisme
hôte, l'induction d'une réponse immune peut être
faible, sans augmentation du titre des anticorps,
alors que le pathogène prolifère abondamment au
site de l'infection. L'infection par Neisseria
gonorrhoeae, bactérie responsable de l'urétrite
gonococcique, n'entraîne pas de réponse immune
systémique ou protectrice, la réinfection d'un
individu guéri est donc possible.
• Les tests cutanés
permettent aussi de détecter l'exposition à un pathogène.• Le test cutané à la tuberculine consiste en l'injection intra- dermique d'un dérivé purifié protéique de Mycobacterium tuberculosis. Une réaction inflammatoire positive se manifeste par un érythème et une induration atteignant leur développement maximal quarante huit heures après l'injection ; elle révèle une infection active ou une exposition préalable à Mycobacterium tuberculosis. Ce test identifie les phénomènes d'hypersensibilité retardée.
• Les tests cutanés sont utilisés en routine pour le diagnostic de la tuberculose, de la lèpre, d'un certain nombre de maladies fongiques et d'autres infections dans lesquelles la réponse anticorps est faible ou inexistante.
• Réactions antigène-anticorps in vitro : sérologie
• La sérologie est l'étude des reactions antigène-anticorps .
• Les réactions sérologiques sont à la base de tous les tests immunodiagnostiques.
• Les principes de la réaction antigène-anticorps résident dans l'interaction spécifique de déterminants antigéniques avec la région variable de la molécule anticorps.
• Divers tests sérologiques sont utilisés pour l'identification d'antigènes, ils dépendent des propriétés de l'antigène et des conditions choisies pour la réaction.
Anticorps polyclonaux et monoclonaux
On peut identifier 2 types d’anticorps: des anticorps polyclonaux et un anticorps monoclonal.
Anticorps polyclonaux:
- un mélange complexe d'immunoglobulines isolées du sérum sanguin. Ces anticorps reconnaissent une série d'épitopes différents.
- Ils possèdent une large gamme de sélectivités et affinités. Ceci peut donner lieu à des réactions croisées ou à des interférences dans un essai immunologique.
Anticorps monoclonal:
- anticorps spécifique sécrété par les hybridomes produits grâce aux méthodes de la technologie des hybridomes (impliquant des cultures cellulaires)
- Il se lie à un épitope particulier .
- Les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques et possèdent des
propriétés plus reproductibles. Ils sont les anticorps de choix pour les essais analytiques.
• La neutralisation
• La neutralisation est l'interaction in vivo ou in vitro d'un anticorps avec un antigène, conduisant à la réduction ou à l'inhibition de l'activité biologique de l'antigène.
• Un anticorps spécifique est capable de neutraliser une toxine microbienne en bloquant la partie active de la toxine [cas des exotoxines bactériennes].
• Un antisérum neutralisant une toxine est une antitoxine. Elles sont utilisées dans le traitement du botulisme, du tétanos et de la diphtérie, toutes ces maladies étant liées à la production d'exotoxines bactériennes.
• Certains virus peuvent aussi être neutralisés par des anticorps spécifiques. Les anticorps spécifiques de l'hémagglutinine et de la neuraminidase des virus de la grippe empêchent l'adsorption des virus sur les récepteurs des cellules hôtes.
• La précipitation
• La précipitation est la formation d'un complexe insoluble résultant de l'interaction d'un anticorps soluble avec un antigène soluble.
• Les réactions de précipitation sont facilement analysables in vitro ; ce sont des tests sérologiques permettant la quantification de concentrations en anticorps.
• Les proportions des deux substances réactives doivent
être optimales, un excès d'anticorps ou d'antigène
conduisant à la formation de petits complexes immuns
solubles.
• Réactions avec précipitation:
• Les réactions avec précipitation sont basées sur un principe semblable aux réactions par
agglutination; la différence étant que l’antigène est une espèce moléculaire soluble au lieu d’une particule (bactérie ou cellules).
• À un certain rapport Ac/Ag, le complexe anticorps et antigènes devient insoluble et précipite.
• Quantité de précipité formé en fonction de la quantité d’antigène ajoutée pour une concentration totale d’anticorps fixe
• Les réactions de précipitation en gels d'agarose ou tests d' immunodiffusion (ou « immunodiffusion double » ou « réaction d'Ouchterlony ») étudient la spécificité des réactions antigène-anticorps
• Les solutions d'antigène et d'anticorps sont déposées dans des puits percés dans le gel et diffusent, des lignes de précipitation apparaissant. Les interactions moléculaires de deux antigènes différents avec un antisérum peuvent être évaluées par l'observation des lignes formées.
• Si les deux antigènes sont identiques, il se forme une seule ligne de précipité (ligne d'identité). Si les puits adjacents contiennent un antigène commun et l'un des puits un second antigène, une ligne d'identité partielle apparaît.
• L'immunodiffusion est un outil de recherche en biochimie pour évaluer les relations entre des protéines issues de sources différentes.
• Agglutination
• L'agglutination est une réaction entre un
antigène et un anticorps spécifique qui forme
un agglutinat visible. Simples d’utilisation, très
spécifiques, peu coûteux, rapides et
relativement sensibles, ces tests sont
largement utilisés en laboratoire de diagnostic
clinique et biologique
• l'agglutination directe
• L’agglutination directe est le résultat de
l'interaction d'un anticorps soluble avec un
antigène de surface cellulaire ou une autre
particule insoluble. On utilise ces réactions
pour la classification des antigènes de surface
des bactéries et des globules rouges
(érythrocytes).
• L'agglutination passive
• L'agglutination passive est l'agglutination d'antigènes ou d’anticorps solubles, adsorbés ou couplés chimiquement soit à des cellules, soit à des billes de latex ou à des particules de charbon.
La cellule ou la particule se définit dans ce cas comme un porteur inerte.
• Les réactions d'agglutination passive ont une
sensibilité pouvant être jusqu'à cinq fois
supérieure à celle des tests d'agglutination
directe.
• L'identification de souches cliniques de Staphylococcus aureus par agglutination avec une spécificité proche de 100 % en est un exemple; le test est réalisé en seulement trente secondes.
• D'autres tests d'agglutination de billes de latex permettent l'identification de différents streptocoques B-hémolytiques du groupe A de Lancefield (Streptococcus pyogenes), B, C, D, F et G Neisseria gonorrhoeae et Neisseria menigitidis, Haemophilus influenza, Escherichiacoli 0157:117, des virus responsables de gastroentérites (rotavirus, adénovirus) et les champignons Cryptococcus neoformans et Candida albicans.
• La sensibilité et la spécificité des tests d'agglutination passive sont souvent élevées. Aucun équipement coûteux ni de compétence particulière ne sont nécessaires pour leur mise en œuvre, ce qui en fait des tests adaptés aux programmes de dépistage à grande échelle, utilisés largement en diagnostic clinique et en recherche.
Anticorps fluorescents
• Des marqueurs fluorescents peuvent modifier les anticorps chimiquement pour la détection d'antigènes à la surface cellulaire.
• Les techniques de fluorescence
• Des marqueurs fluorescents peuvent être liés de façon covalente à des anticorps : la rhodamine B, qui fluoresce en rouge, l'isothiocyanate de fluorescéine, qui fluoresce en jaune-vert.
• Ce marquage ne modifie pas la spécificité de l'anticorps, mais permet la lecture avec un microscope à fluorescence.
Les anticorps fluorescents liés à une cellule émetttent une fluorescence lorsqu'ils sont excités par une lumière de longueur d'onde définie. La lumière fluorescente émise est le plus souvent rouge-orange ou jaune –vert en fonction du marqueur utilisé
• Ces anticorps fluorescents permettent l'identification de micro-organismes directement dans les prélèvements pathologiques (in situ), sans passer par des techniques d'isolement et de culture. On parle de marquage fluorescent direct ou indirect.
• Dans la technique directe, l'anticorps, dirigé contre l'antigène de surface, est lié de façon covalente au marqueur fluorescent.
• Dans la technique indirecte, la présence d'un anticorps
non fluorescent à la surface cellulaire est détectée par
un anticorps fluorescent dirigé contre l'anticorps non
fluorescent.
Marquage direct Marquage indirect
• Les applications
• le diagnostic de légionellose est mis en œuvre par marquage du tissu pulmonaire avec des anticorps fluorescents spécifiques des antigènes de paroi de Legionella pneumophila.
• un antigène de capsule de Bacillus anthracis confirme le diagnostic d'anthrax.
• L’infection par Bordetella pertussis, agent de la coqueluche.
• Les tests de fluorescence directe sont aussi utilisés dans le diagnostic d'infections virales identifiés au sein de prélèvements avec des anticorps spécifiques par immunofluorescence directe.
• L'utilisation des techniques à base d'anticorps fluorescents n'est cependant pas dénuée de pièges, comme des marquages non spécifiques lors de réactions croisées entre antigènes de surface de diverses espèces bactériennes,
Tests immunoenzymatique (ELISA) et dosages radio-immunologiques (RIA)
• Les tests immunologiques utilisés en diagnostic doivent avoir une forte sensibilité et donc la capacité de détecter de très faibles quantités de complexes antigène-anticorps. Par leur forte sensibilité, les tests ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) et RIA
(radioimmunoassay) sont largement utilisés.
• Dans ces tests, des enzymes et des radio-isotopes
marquent respectivement les anticorps. La
fixation covalente de ces molécules sur les
anticorps diminue la quantité de complexes
antigène-anticorps requise pour être détectés.
Les tests ELISA
• La liaison covalente enzyme-anticorps utilisée dans les tests ELISA n'altère ni l'activité catalytique de l'enzyme ni la spécificité de l'anticorps.
Généralement ces enzymes sont la peroxydase, la phosphatase alcaline et la B-galactosidase.
• Chacune catalyse des réactions produisant des substances colorées qui sont détectées à des taux très faibles par un spectrophotomètre. Ces tests immunologiques sont fortement spécifiques et surtout sensibles.
• La méthode ELISA directe détecte des antigènes, et
la méthode ELISA indirecte détecte des anticorps.
• Des procédés ELISA rapides utilisent des réactifs adsorbés sur un support matériel comme des bandelettes de papier, des membranes plastiques ou de nitrocellulose, ou des bâtonnets en plastique (dipstick).
• Une réaction colorée apparaît sur ces supports en un temps très court.
• Ces tests rapides servent au diagnostic d'urgence de maladies infectieuses comme l'infection par le VIH ou l'angine streptococcique.
• Ces tests ont l'intérêt de ne pas nécessiter de compétences techniques pour être mis en œuvre.
• Les résultats sont alors obtenus in situ, limitant les délais de prise en charge du patient. L'inconvénient de ces tests est leur moindre spécificité par rapport aux tests plus élabores. Aussi ces tests doivent-ils le plus souvent être confirmés par une technique standard.
Test Eliza direct
• Les tests ELISA VIH
• Des outils de criblage sensibles, spécifiques, rapides et peu coûteux sont requis pour tester des sérums d'individus exposés au VIH ou pour s'assurer de l'absence de risque de transmission du VIH lors d'une transfusion sanguine ou de produits sanguins.
• Ces tests sont des ELISA indirects recherchant des anticorps anti-VIH dans le sérum.
• Une réaction positive indique que les anticorps présents dans le sérum du patient reconnaissent les antigènes VIH.
Des sérums contrôles (VIH positif et négatif) sont inclus en parallèle du sérum du patient pour établir la spécificité.
Test Eliza indirect: recherche d’anticorps anti-VIH
• Le test ELISA VIH est une technique rapide, très sensible, spécifique pour la recherche d'une exposition au VIH.
• Les tests ELISA conviennent au dépistage en série et
sont facilement automatisables. Dans certaines
conditions, ce test peut néanmoins donner des
résultats faussement positifs qu'une technique
différente doit confirmer, le plus souvent une
technique de Western blot (ou immunoblot). Une
technique Western blot VIH positive associée à un
ELISA VIH positif est la preuve d'une infection par le
VIH.
• Les autres tests ELISA d'importance clinique
• Des centaines de tests ELISA sont utilisés en clinique.
• Des ELISA directs détectent des toxines bactériennes (toxine cholérique, d'Escherichia coli entéropathogènes et de Staphylococcus aureus), des virus (rotavirus, virus des hépatites, de la rubéole, de la rougeole, des oreillons et les parainfluenza).
• Des tests ELISA indirects détectent des anticorps sériques antibactériens : Salmonella, Yersinia, Brucella, rickettsies, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae , Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi et Treponema pallidum .
• Et aussi pour la détection de levures (Candida) et de divers parasites agents
• les tests ELISA sont largement utilisésen raison de la rapidité de leur mise en œuvre, de leur faible coût, d'absence de déchets radioactifs et de leur longue durée de conservation.
• La forte sensibilité de ces tests en fait un important outil immuno- diagnostique.
• les analyses radio-immunologiques (RIA)
• La technique de RIA utilise des isotopes radioactifs comme conjugués d'anticorps ou d'antigènes, et non des enzymes comme pour les tests ELISA.
• L'isotope iode 125 (125 I) est souvent utilisé, le marquage se faisant en effet sans modification de la spécificité des anticorps ou des antigènes.
• Les tests RIA mesurent des quantités très faibles de protéines sériques telles que l'hormone de croissance,
• Le RIA est aussi sensible que l'ELISA et une mise en œuvre rapide.
• L'équipement pour la détection de la radioactivité est néanmoins spécialisé et cher. Des quantités importantes de déchets radioactifs sont engendrées, et la décroissance de la radioactivité (demi-vie) des radio- isotopes restreint les dates limites d'utilisation des trousses de réactifs.
• Ainsi les tests RIA sont utilisés seulement quand les tests ELISA ne sont pas suffisamment adaptés ou sensibles. Le RIA est préféré à l'ELISA pour la quantification de protéines sériques, certains composants du sérum inhibant certains substrats enzymatiques des ELISA ou des interactions antigène-anticorps.
• Procédés d'immunoblot
• Les techniques d'immunoblot utilisent des anticorps pour l'identification discriminante de protéines spécifiques de certains pathogènes, même dans des mélanges complexes comme le sang ou les lysats cellulaires.
• Trois techniques sont utilisées :
• l) séparation des protéines sur gel de polyacrylamide ;
• 2) transfert des protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon ;
• 3) identification des protéines par des anticorps spécifiques.
• L'association des deux dernières étapes correspond à la
technique de western blot (protéines), distincte de celle
du Southern blot (ADN) ou du northern blot (ARN).
• Lors de la première étape de l'immunoblot, un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les protéines sont alors séparées en bandes distinctes, chacune représentant une seule protéine d'un poids moléculaire donné .
• Les protéines sont transférées sur une
membrane. Les anticorps dirigés contre certains
composants du pathogène sont alors ajoutés. La
radioactivité est détectée après exposition de la
membrane à un film d'autoradiographie.
Western blot ou Immunoblot
• L'identification d'une protéine d'un pathogène donné est alors possible en comparant la position des bandes colorées respectives de l'échantillon et du contrôle.
• Les techniques d'immunoblot détectent soit des antigènes (mise en évidence directe du pathogène)
• ou des anticorps (mise en évidence indirecte
d'une exposition au pathogène).
C- Méthodes de diagnostic moléculaires
• Des techniques moléculaires extrêmement sensibles, sont disponibles et largement utilisées pour la détection de pathogènes.
• Elles ne dépendent pas de la détection de la réponse immune dirigée contre le pathogène, ni de l'isolement ou de la croissance du pathogène,
• méthodes souvent difficiles à réaliser.
• Les techniques moléculaires utilisent les caractères génotypiques plutôt que phénotypiques pour l'identification de pathogènes. L'intérêt des méthodes de diagnostic génétique ou de détection des acides nucléiques réside en différents points :
• 1)les acides nucléiques peuvent être aisément isolés de tissus infectieux ;
• 2) il est possible de les visualiser et de les quantifier ;
• 3) la séquence nucléotidique du génome d'un pathogène est unique, ainsi son analyse conduit avec certitude à son identification;
• 4) les séquences peuvent être amplifiées pour
augmenter la quantité de matériel disponible pour
l'analyse.
• Les diagnostics utilisant des sondes nucléiques
• Un des plus puissants outils analytiques disponibles pour les microbiologistes médicaux est l'hybridation d'acides nucléiques.
• Au lieu de détecter un organisme complet ou ses produits, l'hybridation détecte la présence de séquences ADN spécifiques d'un organisme donné.
• Les sondes d'acides nucléiques correspondent généralement à de l'ADN simple brin complémentaire d'une séquence unique d'un gène d‘interêt.
• Si un micro-organisme présent dans un échantillon clinique contient des séquences ADN ou ARN complémentaires de la sonde, la séquence de la sonde peut s'hybrider formant ainsi une molécule double brin, (après préparation appropriée de l'échantillon pour l'obtention de l'ADN simple brin du micro- organisme )
• La sonde est marquée par une molécule traçante (isotope radioactif, enzyme ou composé fluorescent permettant la détection de son hybridation à une cible donnée.
• Les sondes d'acides nucléiques présentent différents avantages par rapport aux immunoanalyses.
• Les acides nucléiques sont plus stables que les protéines à de fortes températures et à des pH élevés, et sont plus résistants aux solvants organiques et autres produits chimiques.
• Par cette relative stabilité chimique, les techniques utilisant des sondes nucléotidiques peuvent identifier des organismes qui ne sont plus vivants.
• Certaines sondes nucléiques sont plus spécifiques que les
anticorps et détectent des différences d'un seul
nucléotide entre deux séquences d'ADN.
• Les sondes utilisées en laboratoire de diagnostic clinique
• Dans la plupart des cas, les cultures sur boîtes de Pétri ou les fragments de tissus infectés sont traités avec des produits alcalins puissants, pour lyser les cellules et dénaturer partiellement l'ADN afin d'obtenir des molécules simple brin.
Le mélange est apposé sur une matrice (bâtonnet filtre) ou laissé en solution, puis marqué par une sonde.
• L'hybridation est menée à une température permettant la formation d'un complexe stable entre les séquences homologues de l'ADN cible et de l'ADN de la sonde.
• Un lavage élimine les sondes non hybridées, l'hybridation étant quantifiée grâce à la molécule marquée liée à la sonde (mesure de radioactivité, d'activité enzymatique ou de fluorescence, selon le marqueur).
• Des sondes nucléotidiques sont commercialisées pour l'identification de micro-organismes pathogènes majeurs comme Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis et Mycobacterium tuberculosis.
• En plus de leur utilisation en diagnostic clinique,
les sondes moléculaires ont des applications dans
le domaine de l'industrie alimentaire ainsi que
dans les organismes de contrôle de la nourriture :
recherche de pathogènes tels que Salmonella ou
Staphylococcus
Les diagnostics moléculaires utilisant la PCR (polymerase chain reaction)
• Des oligonucléotides spécifiques et de très courte séquence (généralement de quinze à vingt-quatre nucléotides) servent d'amorces pour l'amplification par PCR de l'ADN de pathogènes donnés. La PCR amplifie l'ADN environ un milliard de fois. En théorie, elle permet la visualisation d'une seule molécule d'ADN issue d'une seule cellule bactérienne.
• Par exemple, les amorces dont les séquences sont spécifiques d'un gène d'un micro-organisme donné peuvent servir à tester l'ADN issu de tissus potentiellement infectés, même si ce micro-organisme ne peut être ni visualisé ni cultivé.
• Ces méthodes ont un intérêt majeur pour l'identification d'infections virales et intracellulaires.
• Actuellement, de nombreux tests sont des PCR en temps réel.
Cette technique nécessite l'utilisation d'amorces marquées par des fluorochromes.
• Les automates de PCR en temps réel ont des systèmes optiques de précision qui suivent, à chaque cycle, l'incorporation d'amorces ou de sondes marquées dans les produits de PCR. Une courbe d'amplification permet de visualiser en temps réel cette incorporation, ce qui permet de s'affranchir des étapes de détection comme l'électrophorèse.
• La technique de RT-PCR (Reverse-Transcriptase PCR)
permet par exemple de suivre l'évolution de l'infection
par le VIH. Cette méthode inclut une étape préalable
de production d'ADNc directement à partir de l'extrait
d'ARN de l'échantillon à analyser.
• Diagnostic virologique
• l'identification et le diagnostic des infections virales est différent de celle des infections bactériennes.
• Les virus sont tous des parasites intracellulaires obligatoires, ne peuvent pas être directement cultivés sur des milieux artificiels, mais doivent croître dans des cellules de mammifères.
• La microscopie permet l'observation directe des virus
ou de leur effet cytopathique ; divers tests in vitro,
directs ou indirects, sont disponibles pour
l'identification des virus pathogènes.
• La croissance des virus in vitro
• la culture des virus à partir de prélèvements cliniques est plus difficile, plus longue et plus spécialisée que la culture de la plupart des bactéries pathogènes.
• Les cultures cellulaires utilisés pour la croissance des virus sont des lignées cellulaires humaines à durée de vie longue (cellules immortalisées), croissant rapidement et se divisant indéfiniment dans les milieux de culture cellulaire.
• Les virus peuvent aussi se répliquer sur des cellules de rein de singe Rhésus. Ce sont des cellules primaires qui meurent après un nombre limité de divisions cellulaires et ne peuvent être maintenues indéfiniment en laboratoire. Elles supportent la croissance de nombreux virus pathogènes et représentent un intérêt majeur pour l'isolement initial de virus inconnus (15 à 30 % d'infections respiratoires aiguës n'ont pas d'étiologie connue).
• La microscopie électronique
• Le diagnostic virologique peut aussi être fait par microscopie électronique.
Les virus présentent des caractéristiques morphologiques différentes visualisées en microscopie électronique à partir d'échantillons cliniques .
• Des méthodes de centrifugation et filtration doivent préalablement concentrer et séparer les particules virales des tissus humains.
• Bien que moins fiable que les méthodes immunologiques ou de sondage nucléique, l'observation de particules virales d'une morphologie
spécifique dans un tissu humain donné est prédictive d'une infection.
• Des anticorps spécifiques de virus peuvent être utilisés pour augmenter la sensibilité et la spécificité de la technique : des anticorps agglutinants
permettent l'agrégation des particules virales, qui sont alors plus facilement différenciées des débris cellulaires.
• Des anticorps conjugués à des métaux lourds favorisent aussi la visualisation des virus en microscopie électronique.
• L'utilisation de la microscopie électronique est néanmoins limitée par le coût et la complexité du microscope.
