Local bioavailability of topical dermatological formulations in vivo, in Man

(1)

UNIVERSITÉ DE GENÈVE Section de pharmacie

Laboratoire de pharmacie galénique

FACULTÉ DES SCIENCES

Professeur Richard GUY

Local Bioavailability Of

Topical Dermatological Formulations In Vivo , In Man

THÈSE

présentée à la Faculté des sciences de l'Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences,

mention sciences pharmaceutiques

par Ingo ALBERTI de Davesco-Soragno (TI)

Thèse no. 3195

Genève

Atelier de reproduction de la section de physique 2000

(2)

Acknowledgements

I would like to express my particular gratitude to all the persons herein mentioned, for their inva- luable scientific, technical, financial or moral contributions to this work.

Prof. Richard Guy, the director of my thesis, for giving me the opportunity to work in his re- search group, for initiating me to the complex yet fascinating world of skin research, and for his invariably pertinent comments on my work.

Prof. Pierre Buri, for his incredible humanity and generosity, for giving me the opportunity to work at Pharmapeptides, and for accepting to be a member of the jury.

Dr. Yogi Kalia, my supervisor, for his infinite competence in mathematics, and for always being available to discuss my work.

Dr. Aarti Naik, for her useful suggestions and for her help in infrared spectroscopy.

All my lab mates, for sharing with me these years of intense academic activity, particularly Nabi- la, Catherine, Renata, Katrin, Diego, Gus.

All the colleagues at Pharmapeptides, namely Grégoire, Clara, Rocio, Sergio, Hiro, Begoña, Yves, Nathalie, Danielle, Flo C., Flo M., Stéphane, Evelyne, Emmanuelle.

Mr. Werner Klöti, for his tremendous ability to rehabilitate our scientific equipment, and for his kindness, as well as Mr. Eric Vuffray, for his mechanical assemblies.

The external experts, for accepting to judge this work, namely

Prof. Jean-Paul Marty, Dr Christian Surber, Dr Jean-Daniel Bonny.

Novartis Pharma, for financial support.

My family, for their presence despite the long distance separating us.

To all those I have forgotten to mention, I hope you will forgive me.

(5)

Executive summary

Context

he growing interest in generic drugs is currently fostered by the forthcoming transition, during the next eight years, of more than 170 drugs to off-patent status. This will offer to pharmaceutical companies new opportunities to re-formulate generic drugs in improved dosage forms that optimize drug bioavailability and increase patient compliance.

This is particularly relevant for topical dermatological drugs, for which improved penetration capacity through the stratum corneum absorption barrier is of greatest concern. As- sessment of the in vivo local cutaneous bioavailability of skin-targeted drugs is therefore a major issue in the development of topical dermatological formulations, for it serves as a basis for bioequivalence evaluation between a reference and a generic drug formulation.

Many pharmacodynamic or pharmacoki- netic approaches for in vivo assessment of local cutaneous bioavailability are currently available, but there is a growing need for more universal and economic methods.

Among these, the direct measurement of the

drug concentration in the skin is gaining much importance.

This thesis is based on that approach, in particular using the tape stripping technique, which consists of the sequential removal from the treated site of very thin layers of stratum corneum, by the application and removal of an adhesive tape. The method has the advan- tage of being simple, painless, and relatively non-invasive. Furthermore, due to the reser- voir capacity of stratum corneum, drug levels are substantial and correlate with the absorbed amount.

Structure of the thesis

An overview of the stratum corneum fea- tures relevant to stripping of this layer and to the local assessment of drug bioavailability is first presented in CHAPTER 1. Subsequently, a comprehensive review of the literature about various aspects of tape stripping as well as other relevant methods of skin sampling is reported in CHAPTER 2.

The first part of the experimental section of the thesis includes the essential mathemati-

T

(6)

cal models pertinent to the drug transport and accumulation into the stratum corneum, de- rived from Fick's laws of diffusion (CHAP- TER 3). The fundamentals of the analytical techniques and procedures used as well as the specific experimental protocols are detailed in CHAPTER 4. This section describes the tape stripping technique, the transepidermal water loss (TEWL) technique for the determination of the relative drug position within the membrane, the high performance liquid chroma- tography (HPLC) method for the analysis of the model drug (the antifungal terbinafine) in

the tapes, and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, for drug analysis in the skin.

All of these tools have been subsequently implemented on healthy volunteers. In particular, many parameters affecting the local stratum corneum bioavailability have been addressed: presence of penetration enhancers in the formulation (CHAPTER 5), influence of vehicles (CHAPTER 6), effect of treatment time (CHAPTER 7), and effect of occlusion (CHAPTER 8).

(7)

Résumé en français

Contexte

intérêt grandissant pour les médi- caments génériques est actuellement encouragé par le fait que, dans les prochaines huit années, le brevet sera échu pour plus de 170 médicaments. Cela offrira aux com-pagnies pharmaceutiques de nouvel- les oppor-tunités pour améliorer la formulation de ces génériques afin que leur biodispo- nibilité soit optimisée, ce qui en fin de compte encoura-gera la compliance des malades.

Cela est particulièrement pertinent pour les topiques dermatologiques, pour lesquels une meilleure capacité de pénétration à travers la barrière d'absorption qu'est la couche cornée est d'une grande importance. L'évaluation de la biodisponibilité locale cutanée in vivo des topiques dermatologiques prend ainsi une importance grandissante lors du dévelop- pement de ces formes médicamenteuses, puisqu'elle sert de base pour l'évaluation de la bioéquivalence entre un générique et le médi- cament original.

Actuellement, diverses approches pharma- codynamiques ou pharmacocinétiques pour l'évaluation de la biodisponibilité locale cuta- née in vivo sont disponibles, mais il y a un

besoin grandissant de méthodes plus univer- selles et économiques. Parmi celles-ci, la mesure directe de la concentration du médica- ment dans la peau est en train de prendre de l'importance.

La présente thèse est basée sur cette appro- che, en particulier par l'utilisation de la technique de "tape stripping" qui consiste à enle- ver du site traité des portions très minces de couche cornée par l'application et l'enlève- ment répétés d'une bande adhésive. Cette mé- thode a l'avantage d'être simple, indolore et relativement non-invasive. De plus, les concentrations des médicament dans cette couche de peau sont non seulement substan- tiels à cause de sa capacité de rétention, mais ils sont également corrélés avec les concentrations que l'on retrouve dans les couches plus profondes.

Structure de la thèse

La thèse est structurée en huit chapitres, qui seront résumés plus bas individuellement, mais dont nous donnons un aperçu ci-après.

Dans le CHAPITRE 1, une vue d'ensemble des caractéristiques de la couche cornée ayant

L’

(8)

un rapport avec la technique de délaminage ainsi qu'avec la biodisponibilité locale sera présentée. Ensuite, dans le CHAPITRE 2, sera exposée une revue de la littérature concernant différents aspects de la technique de "tape stripping" ainsi que d'autres techniques de prélèvement d'échantillons de peau.

La section expérimentale de la thèse com- prend d'abord les modèles mathématiques utilisés pour déterminer le transport et l'accumulation de médicaments dans la couche cor- née, dérivés des lois de diffusion de Fick (CHAPITRE 3). Ensuite, quelques notions de base et les conditions spécifiques des techniques analytiques utilisées seront détaillées dans le CHAPITRE 4. Ces notions concernent la technique de "tape stripping", la technique de perte insensible d'eau (TEWL), l'analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) d'un médicament modèle (l'antimycosique terbinafine) dans les bandes adhésives, ainsi que l'analyse du médicament directement dans la peau par spectroscopie infrarouge à transformées de Fourier (FTIR).

Tous ces outils ont été appliqués sur des volontaires sains. En particulier, plusieurs paramètres ayant une incidence sur la biodis- ponibilité locale dans la couche cornée ont été étudiés: présence dans la formulation d'un promoteur de pénétration (CHAPITRE 5), influence des véhicules (CHAPITRE 6), effet du temps de traitement (CHAPITRE 7), ainsi qu'effet de l'occlusion (CHAPITRE 8).

Chapitre 1

Aspects importants de la couche cornée

Dans ce chapitre d'introduction, nous avons abordé quatre aspects importants: la structure et l'organisation de la couche cornée, son origine et sa différenciation, ainsi que le rôle des cornéocytes et des lipides matriciels extracellulaires.

Le modèle classique de structure de la couche cornée (la couche la plus superficielle de l'épiderme) comporte deux compartiments:

d'une part les cornéocytes, d'autre part les lipides matriciels. L'épaisseur de cette couche varie en fonction de la localisation ana- tomique, mais dans les avant-bras, elle mesure 10-20 µm pour 15-25 couches de cellules empilées.

Les cornéocytes sont des cellules mortes aplaties qui constituent 90% du poids de la couche. Ils sont constitués essentiellement de kératines fibreuses, non fibreuses et de lipides. Leur origine se trouve dans la couche basale de l'épiderme, où ils sont formés à partir de cellules germinales. Ils s'appellent alors kératinocytes. Ils migrent ensuite vers la surface, poussés par les cellules sous-jacentes, et traversent trois phases de différenciation: phase épineuse, granulaire et finalement cor-née, avant d'être exfoliés par des mécanismes sub- tiles.

Les lipides matriciels, distribués en feuil- lets autour des cornéocytes, sont constitués de bicouches d'un mélange de lipides parti-

(9)

culiers, spécifiques de la couche cornée. Ils comportent environ 40% de dérivés du cho- lestérol, 40% de céramides, 10% d'acides gras libres et le restant 10% d'autres lipides. L'arrangement compact de ces molécules très al- longées et linéaires a pour effet une grande stabilité se traduisant par une résistance à la perméation de molécules exogènes, dont les médicaments.

La connaissance de la structure et du rôle de la couche cornée permet de mieux com- prendre les raisons de l'utilité de la technique de "tape stripping" pour l'évaluation de la biodisponibilité locale. En effet lors de cette technique, on enlève plusieurs couches de cornéocytes à la fois dans les portions super- ficielles. Cette opération n'est pas douloureu- se, car les cellules sont mortes et retenues par des structures lâches (les cornéosomes) ainsi que par les lipides matriciels extracellulaires.

En enlevant quelques portions de couche cor- née après avoir appliqué un médicament à la surface, on retire aussi les lipides qui les en- veloppent, qui contiennent le médicament pénétré. On peut ainsi le doser et déterminer sa distribution fine au sein de la membrane, ce qui permet d'en déterminer la biodisponibilité locale.

Chapitre 2

Méthodes de prélèvement de la peau

Ce chapitre est une revue de la littérature concernant les techniques les plus courantes de prélèvement d'échantillons de peau humaine dans le but de déterminer la biodisponibili- té locale de médicaments appliqués à la surface.

L'intérêt de ces méthodes réside dans le fait que pour les médicaments topiques qui ont pour cible la peau, la biodisponibilité classique mesurée dans le compartiment sys- témique n'est pas un bon indicateur de l'effi- cacité d'action locale. En plus, les taux plas- matiques sont la plupart du temps en-dessous des limites de détection des méthodes utili- sées en routine analytique, à cause des faibles quantités appliquées à la surface de la peau (quelques dizaines de microgrammes par cen- timètre carré) et en dose finie (c'est-à-dire sans apport continu, mais en dose unique).

Pour ces raisons, le développement de topiques dermatologiques génériques ou non continue de nécessiter des études cliniques fort coûteuses, alors que l'accessibilité de la peau permet, contrairement à d'autres organes cibles, de prélever des échantillons de tissus directement au site d'application.

La technique de "tape stripping" de la couche cornée est à placer dans ce contexte, car sa faisabilité a été démontrée et son côté pra- tique permet d'effectuer des études de biodis- ponibilité locale facilement et à coût relative-

(10)

ment contenu. Si l'on réunit l'ensemble des bandes adhésives contenant le médica-ment pénétré et retiré séquentiellement, après extraction on obtient une mesure du réservoir de substance dans la couche cornée. La même opération répétée sur des sites cutanés multi- ples et à des temps d'application différents permet d'établir un profil "pharmacodermato- cinétique" fort utile pour déterminer la bio- disponibilité locale. Cela est également possible si on dose séparément les bandes adhési- ves, comme cela a été réalisé dans la thèse présente, ou si on le dose directement dans la peau, en le traçant par spectroscopie infrarouge à transformées de Fourier avant chaque prélèvement de couche cornée.

D'autres techniques de prélèvement de la couche cornée sont discutées, notamment par lamelle de microscope induite de colle cya- noacrylate, qui permet également de prélever des follicules pileux (étude d'anti-acnéiques).

Le prélèvement des autres couches de la peau est bien évidemment plus invasif, même s'il permet de déterminer la distribution d'un médicament absorbé dans plusieurs couches, comme c'est le cas de l'emporte-pièce, qui peut descendre jusqu'au derme. Finalement, en recueillant le liquide intercellulaire (par formation d'une cloque ou introduction d'un cathéter) on peut doser le médicament au fond de l'épiderme ou du derme.

Chapitre 3

Modèles mathématiques

Dans ce chapitre nous avons présenté les modèles mathématiques utilisés dans nos étu- des. Ils sont tous basés sur la loi de Fick de diffusion passive. Cette loi est applicable dans la couche cornée, biomembrane particulière dépourvue d'activité métabolique signifi- cative, vu que les cornéocytes sont des cellules mortes, donc sans activité méta-bolique propre. D'autre part, les spécificités des lipides matriciels intercellulaires en font un compartiment passif et inerte, car leur composition particulière ainsi que leur structure com- pacte et organisée permettent de les considé- rer comme un milieu où tout transport chimi- que obéit non pas à des lois biologiques, mais à des lois biophysiques et physico-chimiques.

Le transport et la rétention de toute substance (que ce soit un médicament ou tout simplement l'eau) peut être conceptualisé en considérant le milieu de passage comme étant homogène, puisqu'on considère actuellement que les cornéocytes sont quasi-imperméables.

Si on assume que les propriétés des lipides sont identiques en tout point de la membrane (ce qui est une bonne approximation), on peut considérer le système isotrope, ce qui permet d'appliquer la loi de Fick aussi bien pour les molécules qui traversent la couche cornée de l'extérieur vers l'intérieur que pour celles qui la traversent dans le sens inverse.

(11)

Dans le premier cas, nous sommes dans la situation de pénétration d'une substance exo- gène (un médicament). Comme sa ciné-tique de transport dépend de ses interactions physico-chimiques (coefficients de partage et de diffusion) avec le véhicule et la couche cor- née, sa distribution dans la membrane (profil de concentration) à un instant donné permet de déduire ces proprié-tés, et ainsi discriminer deux formulations de composition différente.

Dans le chapitre, la démarche pour l'obtention de la solution de la loi de Fick qui décrit le profil de concentra-tion est présentée. Par intégration de ce profil de 0 à 1 (surface et fond de la couche cornée) on peut aussi obtenir le réservoir de médicament, c'est-à-dire la quantité totale (sur une surface donnée) à un instant donné.

Dans le deuxième cas, nous sommes dans la situation de "fuite" d'une molécule endogè- ne de l'épiderme vers l'extérieur, à travers la couche cornée. C'est le cas de l'eau, qui, mal- gré sa petite taille, ne traverse pas facilement la matrice lipidique intercellulaire. Si lors du

"tape stripping" on mesure le flux de chaque couche nouvellement mise à jour, on peut extrapoler cette valeur en cas d'absence totale de la barrière, ce qui permet de déterminer l'épaisseur apparente de la couche cornée, utile pour la détermination relative de la position dans le profil de concentration du médi- cament.

Chapitre 4

Techniques analytiques et procédures Les principes des techniques et des procé- dures utilisées lors de ce travail, ainsi que les conditions spécifiques sont exposées dans ce chapitre.

Le "tape stripping" est une technique sen- sible à de nombreux paramètres. Il est donc important de pouvoir les caractériser afin d'optimiser la technique. Une étude prélimi- naire évaluant ces paramètres est présentée dans cette section.

La perte insensible d'eau (TEWL, pour

"transepidermal water loss") est une technique biophysique qui permet de mesurer le flux (ou taux d'évaporation) d'eau libre qui traverse la peau et qui apparaît à la surface. Il s'agit d'une technique non-invasive utilisée également en dermatologie clinique pour évaluer la récupé- ration de la fonction barrière de la peau, par exemple en cas de brûlures, dermatites ou psoriasis. Le principe de fonctionnement est basé sur la première loi de Fick, dans laquelle le flux d'eau (ou taux d'évaporation) est pro- portionnel au gradient de pression partielle.

Ce dernier peut être facilement déterminé à l'aide d'un senseur qui mesure à la fois l'hu- midité relative et la température à une faible distance de la surface cutanée. Un deuxième senseur placé en-dessus du premier mesure ces mêmes paramètres, permettant ainsi d'éta- blir le gradient de pression partielle de vapeur d'eau.

(12)

La spectroscopie infrarouge à transformées de Fourier (FTIR) est une technique classique en chimie analytique, qui utilise les vibrations de valence moléculaires comme identificateur spécifique d'une liaison. Un traitement avancé du signal par des algorythmes utilisant les transformées de Fourier, ainsi qu'une architecture interne comportant un interféro-mètre et un laser de référence font de cet appareil un outil très performant permettant d'enregistrer une large plage de fréquence infrarouge en quelques secondes. Dans nos études, nous avons utilisé un montage qui permet d'utiliser le rayon infrarouge en réflectance totale atté- nuée (ATR) plutôt qu'en transmittance, ce qui permet l'enregistrement de signaux sur un corps opaque. Dans notre cas, il s'agissait du bras d'un volontaire traité avec un topique dermatologique contenant un médicament (l'antimycosique terbinafine) absorbant dans l'infrarouge à une fréquence de 774 cm^-1. Des spectres successifs ont été enregistrés au cours de la procédure de "tape stripping", afin de déterminer le profil de concentration de la terbinafine dans la couche cornée.

Enfin, la technique de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a aussi été présentée, car elle a permis, après extraction appropriée à partir des bandes adhésives, de doser la terbinafine absorbée.

Chapitre 5

Effet de promoteurs sur la biodisponibilité locale de topiques dermatologiques

Cette étude a pour but d'évaluer, à l'aide de la spectroscopie infrarouge à transformées de Fourier à réflectance totale atténuée (ATR- FTIR), la biodisponibilité de la terbinafine dans la couche cornée de sujets humains.

Quatre sites cutanés situés sur les faces internes des avant-bras de cinq volontaires sains ont été traités pendant 2 heures par une des quatre formulations dont la base était consti- tuée de 50% d'éthanol et 50% de myristate d'isopropyle. Trois de ces formulations conte- naient également un promoteur de pénétra- tion: soit l'acide oléique à 5%, soit la 2- pyrrolidone à 10%, soit l'urée à 1%. Le profil de concentration de la terbinafine dans la couche cornée a été établi par des mesures spec- troscopiques infrarouges répétées, pendant que la membrane était partiellement enlevée par bande adhésive. Cette méthode a été vali- dée par analyse chromatographique liquide à haute performance (HPLC) de la terbinafine extraite à partir des bandes adhésives. Des mesures de perte insensible d'eau (TEWL) ont aussi été effectuées, permettant ainsi d'estimer facile-ment l'épaisseur de la couche cornée.

Les profils de concentration de la TBF ont été ajustés par régression à la solution adaptée de la deuxième loi de Fick de diffusion, permettant ainsi de déterminer les paramètres

(13)

caractéristiques de diffusion et de partage du médicament pénétré. Cette analyse a permis de comparer l'efficacité des différentes formulations testées par rapport au contrôle ne contenant pas de promoteur. Alors que la formulation contenant 5% d'acide oléique a significativement augmenté la biodisponibilité de terbinafine dans la couche cornée, les autres formulations n'ont pas permis un accrois- sement de la libération apparente.

En conclusion, une méthodologie facile et relativement non-invasive pour l'évaluation d'un aspect important de la biodisponibilité topique de médicaments a été décrite. Les méthodes analytiques utilisées (spectroscopie infrarouge et HPLC) ont permis d'estimer la biodisponibilité aussi bien relative qu'absolue du médicament dans la couche cornée, et pourraient donc être utiles pour la détermina- tion délicate de la bioéquivalence entre formulations topiques dermatologiques.

Chapitre 6

Effet de véhicules sur la biodisponibilité lo- cale de topiques dermatologiques

Le but de cette étude était de déterminer la disponibilité d'un médicament topique, la terbinafine, dans la couche cornée humaine in vivo, après administration dans des formu- lations contenant du myristate d'isopropyle et de l'éthanol.

Les faces internes des avant-bras de volontaires ont été traitées pendant 4 heures avec la terbinafine, à une concentration d'un quart de saturation, dans un des trois véhicules sui- vants: myristate d'isopropyle, éthanol, et un mélange 50:50 v/v de ces deux solvants. Au terme du temps d'application, l'excès de formulation sur les sites traités a été soigneuse- ment nettoyé, et la couche cornée a été partiellement enlevée à l'aide de bande adhésive.

La terbinafine a été quantifiée dans la couche cornée par (a) extraction des bandes adhésives suivie d'analyse chromatographique liquide à haute performance (HPLC) et (b) spectroscopie infrarouge à réflectance totale atténuée (ATR-FTIR) de la surface de peau enlevée séquentiellement par bande adhésive.

Le profil de concentration de la terbinafine dans la couche cornée (c'est-à-dire la concentration du médicament en fonction de la pro- fondeur de la membrane) a été ajustée par régression à la solution appropriée de la deuxième loi de Fick de diffusion, permettant ainsi de déduire le coefficient de partage du médicament entre la couche cornée et le véhi- cule (K), ainsi que le paramètre de diffusion caractéristique (D/L², où D est la diffusivité de la terbinafine dans la couche cornée d'épaisseur L).

En conclusion, alors que la valeur de D/L² de laTBF, pour les trois véhicules, est restée essentiellement constante, le partage du médi- cament dans la couche cornée était significativement dépendant de la formulation. Aussi

(14)

bien les données semi-quantitatives obtenues par spectroscopie infrarouge que les résultats plus rigoureux obtenus par HPLC confirment ces déductions.

Chapitre 7

Effet du temps d'application sur la biodispo- nibilité locale de topiques dermatologiques

Le but de cette étude était d'abord de dé- terminer, et ensuite de prédire la biodisponibi- lité cutanée in vivo d'un médi-cament modèle, la terbinafine. Plus précisé-ment, l'objectif était de démontrer que l'absorption de terbinafine par la couche cornée, suite à un court contact, peut être utilisée pour prédire le profil dénommé "dermatopharmacocinétique" du médicament au cours du temps.

Les faces internes des avant-bras des volontaires ont été traitées pendant 0.5, 2 et 4 heures avec une solution de terbinafine dans un mélange de myristate d'isopropyle et d'éthanol. Après l'application, la couche cor- née des sites traités a été partiellement enle- vée par bande adhésive de manière séquentiel- le, et ensuite analysée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) afin de quantifier la terbinafine. Le profil de concentration en fonction de l'épaisseur de la couche cornée a été ajusté par régression à un modèle basé sur la deuxième loi de Fick de diffusion, pour ainsi déduire le paramètre de diffusion

caractéristique (D/L², où D est la diffusivité effective du médicament à travers la couche cornée d'épaisseur L) et le coefficient de partage (K) du médicament entre la couche cor- née et le véhicule. Aussi, le profil de concentration a été intégré mathématiquement sur toute l'épaisseur de la couche cornée, afin d'obtenir la quantité totale de terbinafine dans la barrière à chaque instant.

Alors que K n'était pas affecté par le temps, le paramètre de diffusion était significativement plus élevé à 30 minutes qu'à 2 et 4 heures. Cela pourrait être dû à un effet "burst"

à des temps courts, attribuables à l'absorption et à la perméation d'éthanol. Cependant, mê- me lorsqu'on a utilisé D/L² à 30 minutes pour prédire la quantité totale de terbinafine dans la couche cornée à 2 et/ou 4 heures, l'accord entre théorie et expérience était remarquable- ment bon.

Une seule expérience à temps court pourrait suffire pour construire au moins une par- tie du profil dermatopharmacocinétique dans la couche cornée par rapport au temps, propo- sé récemment comme objectif et mesure quantitative de la biodisponibilité et de la bioéquivalence cutanées.

(15)

Chapitre 8

Effet de l'occlusion sur la biodisponibilité locale de topiques dermatologiques

L'occlusion de la peau par un pansement imperméable est un moyen habituel pour augmenter la pénétration et la biodisponibilité cutanée d'un médicament topique. On admet généralement que l'hydratation est respon- sable de cet effet. L'objectif de cette étude était d'établir si des conditions d'occlusion normales (c'est-à-dire pendant une durée rai- sonnable de 6 heures) étaient une stratégie adéquate pour augmenter la biodisponibilité cutanée de produits topiques.

Plusieurs surfaces de peau de 22.5 cm² si- tuées sur les faces internes des avant-bras de volontaires ont été traitées avec soit une pommade émolliente, soit un gel, ceci dans des conditions ouverte (exposé aux conditions ambiantes) ou fermée (couvert par un pansement imperméable). Chaque formulation contenait 1% (m/m) d'un composé lipophile modèle. Après 6 heures, la formulation a été retirée et le médicament pénétré a été récupé- ré par "tape stripping". L'extraction et l'analyse par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) du composé à partir des bandes adhésives ont permis d'obtenir un profil de concentration en fonction de la profon-

deur de la couche cornée. L'ajustement par régression des données expérimentales à la solution adéquate de la deuxième loi de Fick de diffusion, ainsi que l'intégration mathéma- tique de celle-ci, ont permis d'estimer le partage, la diffusivité et le réservoir du composé dans la couche cornée.

Un traitement à dose unique pendant 6 heures sous occlusion par un pansement n'a pas augmenté de manière nette la biodisponi- bilité cutanée du composé lipophile. L'occlusion de la pommade n'a augmenté aucun des paramètres mentionnés ci-dessus, alors que le gel sous occlusion n'a montré qu'un meilleur partage. Cependant, la pommade a montré un meilleur partage et une meilleure biodisponi- bilité cutanée que le gel en condition ouverte, ce qui suggère un impact supérieur de la formulation plutôt que de l'occlusion.

En conclusion, l'occlusion aurait probable- ment pu montrer son effet à des temps d'application plus longs, mais les effets du véhicu- le ont été plus précoces. Par conséquent, une formulation appropriée est recommandée comme alternative à l'occlusion, et serait cer- tainement plus efficace et cosmétiquement plus attrayante qu'un pansement occlusif. Cet- te méthode offre un outil puissant pour analy- ser le comportement de pénétration des formulations cutanées topiques et de leur interac- tion avec la peau humaine hydratée in vivo.

(16)

An overview of the human stratum corneum

Structure and organization

he human stratum corneum, the out- ermost layer of the epidermis, is a stratified squamous epithelium with a highly organized yet heterogeneous structure. The main elements are the corneocytes, flattened and cornified dead cells which are embedded in a lipid continuous matrix distributed in lamellar sheets (Figure 1).

The gross composition of the stratum

corneum is presented in Table I, and the detailed structure in Figure 2. The corneocytes are composed mainly of insoluble bundled keratins (~70%), predominantly involucrin, and lipid (~20%) encased in a thick cell envelope, accounting for about 5% of the stratum corneum weight. The intercellular region consists mainly of specific lipids (~10%), including ceramides, cholesterol derivatives and fatty acids.

T

Table I: Gross composition of human stratum corneum. Compiled from [1].

Components % (w/w) Biochemical composition

Cell membranes 5 Lipids and nonfibrous proteins

Cell contents 85 Lipids, fibrous proteins, nonfibrous proteins Intercellular materials 10 Lipids and nonfibrous proteins

Figure 1: Simplified model of the stratum corneum, in which the corneocytes can be compared to bricks embedded in a mortar made of a continuous lipid phase arranged into sheets. From [2].

(17)

Figure 2: Schematic representation of human stratum corneum with successive magnifications up to the ultrastructural organization of the corneocytes. (Drawing by J.E. McKie)

(18)

Origin and differentiation

The stratum corneum is the final product of epidermal differentiation, and originates in the lower layers of the epidermis, where the single cells migrate up to the skin surface in a continuous differentiation process.

In a cross-section of the epidermis (Figure 3), four morphologically distinct cell layers may be distinguished, corresponding to each phase of cellular differentiation. In the basal layer, the cells are cuboidal in shape, verti- cally aligned in one single layer, and recog-

nizable by their prominent nucleus and their keratin filaments, and are therefore called keratinocytes. The division of these cells gen- erates all the cells of the epidermis. From the two keratinocytes obtained at each mitosis, one stays anchored to the basal lamina by the means of a specialised junction, the hemides- mosome, whereas the second migrates upwards to the skin surface undergoing further divisions and differentiation steps. The junction between the suprabasal keratinocytes is ensured by desmosomes.

In the next phase of differentiation within the spinous layer, the keratinocytes become more round in shape, are connected by a greater number of desmosomes than the basal cells, and contain prominent tonofilaments of keratin, visible as prickles on the membrane surface.

As differentiation proceeds, keratinocytes migrate upwards into the granular layer, where they become flatter and keratohyalin granules as well as lamellar bodies [2,4] appear in the cytoplasm. The former produce the matrix keratins of the corneocytes. The latter appear as vesicles with a single bounding membrane filled with stacks of flattened disks and are the site of the synthesis of the intercellular lipids of the stratum corneum. At the interface with the cornified layer, their membrane fuses with the apical plasma membrane of the keratinocyte (Figure 4), and their lamellar disks are extruded into the intercelllar space [5], and subsequently rearranged to

Figure 3: Schematic representation of a cross-section of the epidermis, showing some characteristic elements: (A) nucleus, (B) desmosone, (C) hemidesmo- some, (D) keratohyaline granule, (E) lamellar body.

From [3].

(19)

form the broad multilamellar lipid sheets (discussed in details in the lipids section).

Concomitantly, the nucleus and the cellular machinery degenerate, as the cytoplasm is progressively filled with the matrix keratins.

Furthermore, the desmosomes are structurally transformed into corneosomes [7], which pro- vide a looser cohesion between the cells.

At this stage, the transit time of a keratinocyte is of approximately two weeks [3].

Role of the corneocytes

Morphologically, the individual cells of the stratum corneum are roughly hexagonal in shape and overlap at the edges with

neighbouring cells [9], as shown in Figure 5.

A cross-section (Figure 6) reveals a compact and regular arrangement of columned stacks with overlapping edges [9,10]. These cells are approximately 20-40 µm in diameter and 0.5 µm in thickness, and are separated about 0.1 µm (Figure 2). Many authors have attempted to measure total thickness of the stratum corneum and the number of cell layers [11-13]. Depending on the method used, the thickness can vary from 10 to 20 µm, and obviously also depends on the anatomical

Figure 4: Schematic representation of the extrusion of the lamellar disks from the lamellar bodies into the intercellular space of the stratum corneum. Rearrange- ment in continuous sheets leads to the constitution of the lipid matrix. From [6]

Figure 5: Electron micrograph of an upper view of mouse ear stratum corneum cells, after impregnation with silver. The bar reprsents 20 µm. From [9]

Figure 6: Electron micrograph of a cross-section of alkali-expanded mouse ear stratum corneum. Note the regular stack of cells. From [8].

(20)

localisation [12], as shown in Figure 7, where the number of stacked cells ranges from 15 to 25 corneocytes.

In our work, we have used the method described in CHAPTER 3 in order to evaluate the apparent thickness, based on measure- ments of barrier function by transepidermal

water loss. The method is not to be considered as an absolute measure, but allows rapid and non-invasive relative depth of stripping to be assessed.

In relation to the whole skin, the stratum corneum contributes only ~1% of the total thickness, but due to the particular condensed organization and rather lipophilic composition it accounts for the major skin resistance to the

permeation of most drugs. Furthermore, compared to other biological membranes, the permeability of the cornified layer is unusu- ally low. The reason for this, is that topically applied compounds must permeate through the tortuous intercellular spaces filled with lipids rather than through the almost imper- meable corneocytes [14], which significantly extends the diffusional pathlength. This was shown by Potts and Francoeur [15], who showed that diffusional pathlength for water was approximately 50 times the sample thickness. Accordingly, water permeability was shown to be 1000 times lower than through a simple phospholipid bilayer. A tenfold differ- ence was attributed to the particular composition of the intercellular lipids.

However, in some circumstances the apparent diffusional pathlength may be dramati- cally reduced, for instance when the stratum corneum is fully hydrated. Pellett et al. [16]

showed that the apparent diffusional pathlength of a hydrophilic compound (cyanophe- nol) was very close (~30 µm) to the stratum corneum thickness, and this was attributed to the possible facilitated transport of the compound through the hydrated polar head groups of the intercellular lipids. These results were recently called into question by Bunge et al.

[17], who proved by mathematical analysis that the assumptions of Pellett et al. would inevitably lead to a value of pathlength close to the membrane thickness.

Figure 7: Mean thickness and mean number of cell layers of the human stratum corneum from 4 body regions. Each bar represents a composite mean value obtained from six subjects. Electron micrograph seg- ments are 6635× magnifications. From [12].

(21)

Another important role of the corneocyte is desquamation, which is the final process of stratum corneum turnover, and allows continuous renewal of the barrier membrane.

Loosening of corneocytes before shedding from the surface is a gradual process involv- ing biochemical and structural differentiation.

A subtle equilibrium must be maintained between desquamation and cohesion, for it is an essential prerequisite for stratum corneum stability. Any excess leads to a pathological state, resulting in the increase of the compartment thickness, as shown in Figure 8. In normal skin, the turnover rate is about two weeks [3], but in retention hyperkeratosis (e.g., recessive x-linked ichthyosis) a failure in desquamation leads to an increase of the

transit time with subsequent increase in thickness, which results clinically in a scaly ap- pearance of the skin. In recessive x-linked ichthyosis, the major role of the enzyme cholesterol sulfatase was disclosed [18]. In a normal cornified layer, cholesterol sulfate plays an important role in corneocyte cohesion by forming intercellular bridges through complexes with divalent cations [3]. Before desquamation, it is degraded into cholesterol by the enzyme cholesterol sulfatase, thus al- lowing shedding of the corneocytes. Congeni- tal lack of the enzyme leads to an accumulation of cholesterol sulfate [19-21], and subsequent accumulation of the cohesive lipid, as shown in Figure 9.

Figure 8: Schematic representation of transit times through epidermal compartments in normal skin, compared to retention hyperkeratosis and hyperproliferative states. From [3]

(22)

In hyperproliferative states (e.g., psoriasis) the basal epidermal cell layers divide at an excessive rate, provoking an expansion of the epidermal compartment, in addition to a more rapid transit which results in the expansion of the stratum corneum and incomplete differentiation (Figure 8). Altough psoriasis has been extensively studied [22,23], the immunologi- cal mechanisms involved are still not well understood.

Another significant determinant in cohesion/desquamation is proteolysis of the corneosomes. The role of corneosomes was em- phasized by Chapman et al.[7], who showed that by sequentially tape stripping the same skin site the strength of cohesion gradually decreased from the deeper stratum corneum towards the skin surface, as shown in Figure 10. This fall-off in cohesion was mirrored by

a decrease in the number of corneosomes across the stratum corneum. Accordingly, trypsin digestion produced a significant loss in corneocytes, whereas lipid extraction only resulted in minor loss of cohesion, as previously reported [24].

The loose attachment of the corneocytes and the positive gradient of cohesion from the surface to the distal layer of stratum corneum are of relevance for the tape stripping technique. The loose cohesion allows removal of sequential layers (or clusters) of cells without complete removal of the membrane, thus ena- bling a subtle concentration-depth profile of an absorbed drug to be determined from the individual tape-strips, as performed in our work. However, as a result of the cohesion gradient, the first strips remove more corneocytes (Figure 11) [25] and consequently more thickness but not necessarily more mass of material (Figure 12) [13].

Figure 9: Levels of steroid sulfatase (SS) and choles- terol sulfate (CSO₄) in the basal/spinous, granular and cornified layer of the epidermis in recessive x-linked ichthyosis patients (RXLI) and normal subjects. From [21].

Figure 10: Sequential stripping on the same skin site. Cohesion strenght gradually increases from the skin surface downwards through the disjunctum (strips 1-7), plateauing in the compactum (strips 8- 10). From [7]

(23)

Therefore, these discrepancies require that the amount of stratum corneum removed by each strip be quantified. Expression of depth as a function of tape strip number would be erroneous.

Role of the lipids

In comparison to other tissues, the stratum corneum intercellular spaces occupy a large volume fraction: 10% of the total volume ver- sus 0.5-1.5% in other tissues [26]. It reveals the important role of these lipids, which is confirmed by the high level of lipid synthesis in the epidermis which, although making up only 10% of the skin's mass, accounts for 25- 30% of the total cutaneous activity (which corresponds to 20-25% of total body lipid synthesis) [27].

The composition of stratum corneum lipids is unique (Table II), since unlike other biological membranes, they contain almost no phospholipids, but contain a large amount of ceramides and almost the same amount of cholesterol derivatives [28]. Six classes of ceramides, designated from 1 to 6 (Figure 13) have been isolated and identified in human stratum corneum [8]. Their structures contain long-chain bases, N-acetylated by different fatty acids.

These lipids are organized in a mixture of compact structure (Figure 14), and are arranged to form lamellar bilayers (Figure 15), whose morphology has been widely

Figure 11: Typical profile obtained by sequentially tape stripping a constant area of skin on the flexor forearm of one subject, showing decrease of corneocyte release from the upper layers to the deepers.

From [25].

Figure 12: Effect of tape stripping on removed stra- tum corneum volume (µg/cell layer/cm²) and thickness (µm/cell layer). From [13].

(24)

investigated using electron microscopy [4]

and whose molecular ultrastructure has been studied using x-ray diffraction [30]. Because of its long chain, ceramide 1, an acylcera- mide, may function as a "molecular rivet", stabilizing the intercellular lipid lamellae.

There is also strong evidence to indicate that the intercellular lamellae are further stabi- lized by the chemical links between the long- chain ceramides and glutamate residues on the corneocyte protein envelope [24].

A lipid mixture would be expected to have a lower melting point than the respective pure lipids. However, the stratum corneum lipid phase, which consists of a great number of components, shows endothermic phase transitions at the relatively high temperatures of 75°C and 85°C (Figure 16) as measured by differential scanning calorimetry [31,32].

These were interpreted as melting proc- esses or as transitions from the liquid-

Figure 14: Model for the structure of bilayer intercel- lular stratum corneum lipids. From [35].

Figure 13: Representative structures of the six main fractions of human stratum corneum ceramides. From [8].

Table II: Composition of human stra- tum corneum lipids in weight percent- age. From [29].

Lipid % (w/w)

Cholesterol derivatives 38.8

Cholesterol 26.9

Cholesterol esters 10.1 Cholesterol sulfate 1.9

Ceramides 41.1

Ceramide 1 3.2

Ceramide 2 8.9

Ceramide 3 4.9

Ceramide 4 6.1

Ceramide 5 5.7

Ceramide 6 12.3

Fatty acids 9.1

Others 11.1

Figure 15: Model for the packed arrangement of inter-

(25)

crystalline to the isotropic state. These high melting temperatures indicate that the lipids of the stratum corneum are arranged with a high degree of order and in a high density.

Lower transitions have been identified at 40°C, and were initially attributed to melting of sebaceous lipids. It has been recently shown that they rather represent a solid-to-

fluid phase change for a discrete subset of stratum corneum lipids [33]. Thus, intercellular lipids coexist in different physical states:

crystalline, gel, and liquid [34].

This highly ordered and stable lipid structure, together with the previously mentioned tortuous architecture of the corneocytes is responsible for the effective barrier to both penetration of exogenous chemical compounds and water loss from the epidermis.

However, extensive infrared spectroscopic studies have shown that chemical compounds such as penetration enhancers are likely to perturb this structure by increasing the lipid disorder (Figure 17) thereby reducing the diffusional resistance of the barrier membrane.

Evidence of this effect was shown, among others, for oleic acid [38,39] and other fatty acids [40], ethanol [41], Azone^® [42], and phospholipids [43].

Figure 16: Differential scanning calorimetric profile of human stratum corneum, showing the characteristic endothermic phase transitions associated to melting of sebaceous lipids (T1=40°C), melting of bilayer lipids (T2=75°C and T3=85°C), and protein denaturation of intracelllar keratin (T4=107°C). From [37].

Figure 17: Model for the penetration enhancer induced fluidization of the intercellular lipids. Small and polar mole- cules such as ethanol are believed to affect the polar heads of the lipids, whereas lipophilic compounds such as oleic acid, other fatty acids, phospholipids, and Azone^® are likely to insert into the alkyl chains. From [35].

(26)

References

1. Scheuplein RJ, Blank IH. Permeability of the skin.

Physiol Rev 1971; 51:702-747.

2. Landmann L. The epidermal permeability barrier.

Anat Embryol Berl 1988; 178:1-13.

3. Williams ML. Lipids in normal and pathological desquamation. Adv Lipid Res 1991; 24:211-262.

4. Elias PM. Epidermal barrier function: intercellular lamellar lipid structures, origin, composition and metabolism. J Control Rel 1991; 15:199-208.

5. Elias PM, Menon GK. Structural and lipid biochemical correlates of the epidermal permeability barrier. Adv Lipid Res 1991; 24:1-26.

6. Walters KA. Penetration enhancers and their use in transdermal therapeutic systems.In: Hadgraft J, Guy RH (eds.) Transdermal drug delivery. New York:

Dekker, 1989:197-245.

7. Chapman SJ, Walsh A, Jackson SM, Friedmann PS.

Lipids, proteins and corneocyte adhesion. Arch Dermatol Res 1991; 283:167-173.

8. Wertz PW, Downing DT. Stratum corneum: biological and biochemical considerations.In: Hadgraft J, Guy RH (eds.) Transdermal drug delivery. New York: Dekker, 1989:1-22.

9. Mackenzie IC, Linder JE. An examination of cellular organization within the stratum corneum by a silver stanning method. J Invest Dermatol 1973; 61:245- 250.

10. Menton DN, Eisen AZ. Structure and organization of mammalian stratum corneum. J Ultrastruct Res 1971; 35:247-264.

11. Therkildsen P, Haedersdal M, Lock-Andersen J, De Fine Olivarius F, Poulsen T, Wulf HC. Epidermal thickness measured by light microscopy: a metho- dological study. Skin Res Technol 1998; 4:174-179.

12. Holbrook KA, Odland GF. Regional differences in the thickness (cell layers) of the human stratum corneum: an ultrastructural analysis. J Invest Der- matol 1974; 62:415-422.

13. Anderson RL, Cassidy JM. Variation in physical dimensions and chemical composition of human stratum corneum. J Invest Dermatol 1973; 61:30- 32.

14. Albery WJ, Hadgraft J. Percutaneous absorption: in vivo experiments. J Pharm Pharmacol 1979;

31:140-147.

15. Potts RO, Francoeur ML. The influence of stratum corneum morphology on water permeability. J In- vest Dermatol 1991; 96:495-499.

16. Pellett MA, Watkinson AC, Hadgraft J, Brain KR.

Comparison of permeability data from traditional diffusion cells and ATR-FTIR spectroscopy. Part II: determination of diffusional pathlengths in syn- thetic membranes and human stratum corneum. Int J Pharm 1997; 154:217-227.

17. Bunge AL, Guy RH, Hadgraft J. The determination of a diffusional pathlength through the stratum corneum. Int J Pharm 1999; 188:121-124.

18. Elias PM. Epidermal lipids, barrier function, and desquamation. J Invest Dermatol 1983; 80:44s-49s.

19. Ranasinghe AW, Wertz PW, Downing DT, Mac- kenzie IC. Lipid composition of cohesive and des- quamated corneocytes from mouse ear skin. J In- vest Dermatol 1986; 86:187-190.

20. Long SA, Wertz PW, Strauss JS, Downing DT.

Human stratum corneum polar lipids and desquamation. Arch Dermatol Res 1985; 277:284-287.

21. Shah VP, Behl CR, Flynn GL, Higuchi WI, Schae- fer H. Principles and criteria in the development and optimization of topical therapeutic products.

Skin Pharmacol 1993; 6:72-80.

22. Baker BS, Fry L. The immunology of psoriasis. Br J Dermatol 1992; 126:1-9.

23. Van de Kerkhof PC, van Erp PE. The role of epidermal proliferation in the pathogenesis of psoriasis. Skin Pharmacol 1996; 9:343-354.

24. Wertz PW, Swartzendruber DC, Kitko DJ, Madison KC, Downing DT. The role of the corneocyte lipid

(27)

envelopes in cohesion of the stratum corneum. J In- vest Dermatol 1989; 93:169-172.

25. King CS, Barton SP, Nicholls S, Marks R. The change in properties of the stratum corneum as a function of depth. Br J Dermatol 1979; 100:165- 172.

26. Grayson S, Elias PM. Isolation and lipid biochemical characterization of stratum corneum membranes complexes: implication for the cutaneous permeability barrier. J Invest Dermatol 1992; 78:128-135.

27. Elias PM. Stratum corneum architecture, metabolic activity and interactivity with subjacent cell layers.

Exp Dermatol 1996; 5:191-201.

28. Lampe MA, Williams ML, Elias PM. Human epidermal lipids: characterization and modulations during differentiation. J Lipid Res 1983; 24:131-140.

29. Brain KR, Walters KA. Molecular modeling of skin permeation enhancement by chemical agents.In:

Walters KA, Hadgraft J (eds.) Pharmaceutical skin penetration enhancement. New York: Dekker, 1993:389-416.

30. Bouwstra JA, Gooris GS, Bras W. New insights in the lipid structure of the skin barrier.In: Gurny R, Teubner A (eds.) Dermal and transdermal drug delivery. Stuttgart: Wiss.Verlagges. 1993:67-90.

31. Potts RO. Physical characterization of the stratum corneum: the relationship of mechanical and barrier properties to lipid and protein structure.In: Hadgraft J, Guy RH (eds.) Transdermal drug delivery. New York: Dekker, 1989:23-57.

32. Golden GM, Guzek DB, Harris RR, McKie JE, Potts RO. Lipid thermotropic transitions in human stratum corneum. J Invest Dermatol 1986; 86:255- 259.

33. Gay CL, Guy RH, Golden GM, Mak VHW, Fran- coeur ML. Characterization of low-temperature lipid transitions in human stratum corneum. J Invest Dermatol 1994; 103:233-239.

34. Ongpipattanakul B, Francoeur ML, Potts RO. Po- lymorphism in stratum corneum lipids. Biochim Biophys Acta 1994; 1190:115-122.

35. Barry BW. Lipid-protein-partitioning theory of skin penetration enhancement. J Control Rel 1991;

15:237-248.

36. Landmann L. The epidermal permeability barrier:

comparison between in vivo and in vitro lipid structures. Eur J Cell Biol 1984; 33:258-264.

37. Barry BW. Mode of action of penetration enhancers in human skin. J Control Rel 1987; 6:85-97.

38. Mak VHW, Potts RO, Guy RH. Percutaneous penetration enhancement in vivo measured by attenuated total reflectance infrared spectroscopy. Pharm Res 1990; 7:835-841.

39. Naik A, Pechtold L, Potts RO, Guy RH. Mecha- nism of oleic acid-induced skin penetration enhancement in vivo in humans. J Control Rel 1995;

37:299-306.

40. Golden GM, McKie JE, Potts RO. Role of stratum corneum lipid fluidity in transdermal drug flux. J Pharm Sci 1987; 76:25-28.

41. Bommannan D, Potts RO, Guy RH. Examination of the effect of ethanol on human stratum corneum in vivo using infrared spectroscopy. J Control Rel 1991; 16:299-304.

42. Lin SY, Duan KJ, Lin TC. Microscopic FT- IR/DSC combined system used to investigate the thermotropic behaviour of lipid in porcine stratum corneum after pretreatement with skin penetration enhancers. Skin Res Technol 1996; 2:186-191.

43. Yokomizo Y. Effect of phosphatidylglycerol on the in vitro percutaneous drug penetration through the dorsal skin of guinea pigs, and analysis of the molecular mechanism, using (ATR-FTIR) spectroscopy. Int J Pharm 1997; 147:219-231.

(28)

In Vivo Methods for the Assessment of Topical Drug Bioavailability

Ingo Alberti,^1,2 Yogeshvar N. Kalia,^1,2 Richard H. Guy^1,2,3

1Centre Interuniversitaire de Recherche et d'Enseignement "Pharmapeptides", Campus universitaire, F-74166 Archamps (France); ²Laboratoire de Pharmacie Galénique, Section de Pharmacie, University of Geneva, CH-1211 Genève 4 (Switzerland); ³To whom correspondence should be addressed.

Published as part of review paper in Pharmaceutical Research 2008, Vol. 25, No. 1, 87-103.

Abstract

This paper reviews some current methods for the in vivo assessment of local cutaneous bioavailability in humans after topical drug application. After an introduction discussing the widespread use of generic dermatological products and the limited in vivo methodologies available for bioequivalence assessment, the focus turns to the relevance of studies on human subjects and the definition of local bioavailability. The available techniques are then reviewed in detail, with particular emphasis on the tape stripping methodology, which is currently the subject of much debate. Two approaches are discussed: the assessment of local drug bioavailability from (i) the removed tape-strips and (ii) the tape-stripped skin. A very recent and promising dermatokinetic technique, microdialysis, is also described. Other techniques of limited use such as the skin biopsy, the suction blister, and the follicle removal technique are also mentioned.

Keywords: Cutaneous bioavailability; Cutaneous drug concentration; Tape stripping; Skin microdialysis; Skin biopsy;

Suction blistering; Dermatopharmacokinetics.

Introduction

The generics' appeal

he escalating cost of drugs is one of the principal reasons for the widespread use of generic drugs, and has been encouraged by the relaxation of regulatory requirements. Topical dermatological formulations are obviously subject to the same concerns, the most marketed generics in this field including corticosteroids, antiacneic, antifungal, antibiotic and antiviral agents. A general consequence, is that during the last two decades most countries have brought in

legislation adapted to generics. The purpose of these regulations is to offer more economic drugs to the market, by eliminating the costly and possibly unnecessary requirements for duplicate safety and efficacy studies. Manu- facturers have to document pharmaceutic and therapeutic equivalence (bioequivalence) of the generic drug in relation to the original:

any shorter and cheaper procedure will thereby allow the approval process to be ac- celerated. In reality, pharmaceutical equivalence methods are much easier to implement than bioequivalence methods, since they may be realized in a completely controlled envi-

T

(29)

ronment (i.e., where all the physicochemical parameters, such as temperature, concentration, and pH are known). In contrast, bioequivalence methods, when applied to human beings, are more difficult and complicated to carry out in a controlled fashion, since the environmental and intrinsic parameters (e.g., the individual pharmacological response) are often not constant or not known. This obviously makes difficult the interpretation of the results, since a high degree of variability im- plies, for a study to reach a sufficient statisti- cal certainty, that the number of subjects be increased, which consequently raises the cost of the study.

Furthermore, each class of therapeutic agents needs a particular methodology for the bioavailability/bioequivalence assessment, which additionally complicates the procedures of drug development. Currently, two main strategies are used and accepted: the first is indirect, and concerns pharmacodynamic measurements of the pharmacological response to the drug within the skin, for example the induced vasoconstriction effect of corticosteroids [1], or the erythema-induced effect of nicotinates for the evaluation of non- steroidal anti-inflammatory drugs [2]. Yet, this strategy is somewhat arbitrary, since those are surrogate effects which are related to the primary pharmacological effect but do not strictly characterize the real efficacy of the drug.

For drugs which do not exert any measurable pharmacological in vivo effect, a second and more direct strategy is available, which involves pharmacokinetics measurement of the drug concentration in the skin itself. In vivo methods concerning this strategy will be discussed in this paper, since they appear to be more universal, and governmental regulatory agencies are interested in promoting them, since they could be implemented with respect to a large array of drugs, and will possibly limit expensive and time-consuming comparative clinical trials to assess bioequivalence of a generic drug.

Relevance of studies on human subjects In order to approve original or generic topical dermatological products, the regulatory administrations require bioavailability/bioequivalence studies. For example, in the U.S., the FDA also demands, in vivo studies along with in vitro studies, for original products and for generics based on post-1962 approved drugs [3,4]. This is not surprising, since even if in vitro studies on human skin may give an estimate of the penetration behaviour of a drug at an early stage of development, they remain a surrogate predictor of drug performance in vivo. This is not to say that in vitro testing should be skipped: its use- fulness remains obvious for comparative

(30)

pharmaceutical evaluations of formulations containing original or generic drugs.

However, the data preference for in vivo bioavailability/bioequivalence, is due to the lack of a satisfying correlation between in vivo and in vitro models [5], since in vitro techniques subject the skin to conditions not seen in vivo or in clinical application: absence of dermal blood clearance, overhydration of the skin layers, degradation of the tissue and modification of the metabolic activity [6]. In particular, for lipophilic molecules (log [oc- tanol/water partitioning] values bigger than 3), the presence of the aqueous dermis in vitro acts as an artificial barrier retaining those permeants, whereas in vivo they are more ef- ficiently removed by the dense capillary net- work immediately below the dermo- epidermal junction.

Furthermore, the in vitro conditions lead to a higher variability of skin permeability than in vivo. In a comprehensive comparison of a number of data sets, Southwell and co- workers [7] showed that intra-specimen variability was higher in vitro (43%) than in vivo (27%), as well as inter-specimen variability, which was found to be higher in vitro (66%) than in vivo (45%).

However, local cutaneous bioavailability/bioequivalence studies performed on human subjects have some drawbacks: they are very expensive and time-consuming, both in the pre-clinical and clinical stages of development of an original or generic drug. In ad-

dition, many in vivo methods are more or less invasive, so that animal models are sometimes preferred. This could explain why, except for clinical trials, methods for in vivo local cutaneous bioavailability/bioequiva-lence assessment are relatively difficult to find in the literature, even if in the last decade less invasive (or less painful) approaches have been devel- oped, as will be reported in this paper.

Assessment of local bioavailability/

bioequivalence in cutaneous drug delivery The effectiveness of a topical dermatological formulation is usually evaluated, in vivo, in terms of the cutaneous bioavailability of the drug, which is a regulatory requirement for marketing approval, and which is used as a basis for bioequivalence comparisons.

Strictly speaking, bioavailability is defined as the measure of both the true and total amount of drug reaching the general circulation from an administered dosage form [8]. The concept was originally intended for oral drugs, de- signed for exerting a systemic effect, and therefore releasing the active moiety in the blood at a significant rate and extent, thus generating measurable levels. It was then ex- tended to other dosage forms generating con- sistent and sustained drug blood levels, such as transdermal delivery devices, which are locally applied, but are intended to release the drug in the systemic circulation and treat dis- eases located far from the skin. They have