Diplomarbeit. Titel: La quantification de l α-tocophérol dans l huile d olive

(1)

Diplomarbeit

Zur Erlangung des akademischen Grades einer Magistra der Pharmazie

an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl-Franzens-Universität Graz

Titel:

La quantification de l‘α-tocophérol dans l’huile d’olive

Vorgelegt von:

Agnes Lüftenegger Graz, September 2013

(2)

I Remerciements

Ce mémoire résulte de mon séjour Erasmus à l’Université Montpellier I.

Je souhaite remercier M. Michel Larroque pour la mise à disposition du poste de stage et Mme Delphine Margout pour son encadrement. De plus, je remercie Mme Sylvie Munier et Mme Lidwine Grosmaire pour la collaboration, et M. Eric pour répandre du bon humour.

J’exprime mes remerciements à Mme Perrin, Mme Ibrahim et ma consœur Stefanie pour m’encourager dans n’importe quelle situation.

Enfin, j’adresse mes plus sincères remerciements à M. Ao. Univ.-Prof. Mag. Dr. rer. nat.

Martin Schmid pour la possibilité de faire le stage à Montpellier, ses efforts et son encadrement.

Gewidmet meinen Eltern

(3)

II

(4)

III TABLE DES MATIERES

A – PARTIE THEORIQUE ... 1

1 L’OLIVIER ET L’HUILE D’OLIVE ... 1

1.1 La situation botanique de l’espèce « Olea europaea » ... 2

1.2 La fabrication de l’huile ... 4

1.3 Le classement des huiles d’olive ... 5

1.4 La composition de l’huile d’olive ... 6

La partie saponifiable – Critères de pureté déterminés ... 6

1.4.1 La partie insaponifiable ... 7

1.4.2 1.5 Les effets bénéfiques sur la santé humaine ... 7

Le régime méditerranéen, l’huile d’olive et ses polyphénols ... 7

1.5.1 La composition de la matière grasse et ses bénéfices ... 8

1.5.2 L’α-tocophérol et son activité antioxydante ... 9

1.5.3 2 L’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE ... 11

2.1 Le principe de la chromatographie ... 11

2.2 La Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) ... 13

2.3 La Chromatographie en phase gazeuse (CPG) ... 14

2.4 La détection par spectrométrie UV/VIS ... 15

2.5 La détection par Spectrométrie de Masse (SM) ... 15

3 OBJECTIVES ... 16

B – PARTIE EXPERIMENTALE ... 17

1 INTRODUCTION ET PROBLEMATIQUE ... 17

2 MATERIEL ... 18

2.1 Réactifs ... 18

2.2 Les échantillons des huiles d’olive ... 19

Les huiles italiennes ... 19

2.2.1 Les huiles tunisiennes ... 21 2.2.2

(5)

IV

Les huiles du commerce ... 24

2.2.3 2.3 L’appareillage ... 25

La Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) ... 25

2.3.1 La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) ... 25

2.3.2 L’équipement supplémentaire ... 26

2.3.3 3 METHODES ... 27

3.1 Le choix d’une méthode d’étalonnage ... 27

3.2 La préparation des échantillons ... 30

3.3 Les conditions de la CLHP ... 31

3.4 L’exploitation des chromatogrammes ... 32

3.5 Les problèmes rencontrés au cours des analyses ... 34

3.6 La validation de la méthode chromatographique ... 35

Identité ... 35

3.6.1 Linéarité ... 36

3.6.2 Répétabilité ... 37

3.6.3 3.7 La validation de la méthode d’extraction ... 38

3.8 La quantification de l’α-tocophérol par CPG-SM ... 39

4 RESULTATS ET DISCUSSION ... 42

4.1 L’analyse par CLHP-UV ... 42

La concentration d’α-tocophérol dans les huiles italiennes ... 42

4.1.1 La concentration d’α-tocophérol dans les huiles tunisiennes ... 45

4.1.2 La concentration d’α-tocophérol dans les huiles commerciales ... 48

4.1.3 La comparaison des résultats ... 48

4.1.4 4.2 L’étude de la photo-oxydation de l’α-tocophérol ... 51

4.3 Les résultats de l’analyse par CPG-SM ... 56

C RESUME... 63

D BIBLIOGRAPHIE ... 64

(6)

1 A – PARTIE THEORIQUE

1 L’OLIVIER ET L’HUILE D’OLIVE

Figures 1et 2: L’olivier - Olea europaea L.

(7)

2 1.1 La situation botanique de l’espèce « Olea europaea » ^1–5

Règne Plantae

Embranchement Magnoliophyta Sous-embranchement Magnoliophytina

Classe Magnoliopsida

Sous-classe Dialypetales

Ordre Lamiales

Famille Oleaceae

Genre Olea

Espèce Olea europea L.

La famille des oléacées se compose d’environ 600 espèces en 24 genres qui sont naturellement présents dans tous les continents.

Ils existent 35 espèces d’arbustes et d’arbres du genre Olea. L’espèce europaea est la seule espèce qui produit des olives comestibles qui sont utilisées pour la production d’huile. Il existe de nombreuses variétés de cette espèce. Elles diffèrent par leur grandeur et par celle de leurs fruits, par la teneur en huile, la saveur, la composition chimique, le temps de maturation et par d’autres facteurs. Certaines d’entre elles, par exemple l’Ascolano et la Sevillano, produisent des olives très grandes à petit noyau et à une teneur en huile faible, ce qui le rend moins intéressantes pour la production de l’huile que pour la production d’olives de table.

D’autres espèces, telles que la Picholine et la Lucques, sont plus petites mais contiennent plus d’huile. Pour cela, elles sont utilisées pour produire de l’huile.

L’origine

L’olivier sauvage a son origine dans l’Asie Mineure ou il pousse dans des forêts denses. En outre, il est répandu dans toutes les régions de climat tempéré, surtout dans les pays autours du bassin méditerranéen.

(8)

3 De nos jours, il est cultivé dans les pays suivants :

Europe : Espagne, Italie, France, Portugal, Albanie, Monténégro, Grèce, Chypre Asie : Turquie, Liban, Syrie, Jordanie, Iran, Iraq, Japon, Chine

Afrique : Tunisie, Algérie, Maroc, Égypte, Afrique du Sud Amérique : États-Unis, Mexique, Pérou, Chili, Argentine, Uruguay Océanie : Australie, Nouvelle-Zélande

La morphologie

L’olivier est un petit arbre d’une hauteur de 6 à 8 mètres qui peut atteindre un âge de plusieurs centaines d’années. Son tronc est tortueux, l’écorce grisâtre et crevassée.

Les feuilles sont blanc argenté sur la face inférieure et vertes grisâtres sur la face supérieure.

Elles poussent opposées et elles sont persistantes, coriaces et lancéolées. Les fleurs, petites, blanches, et à quatre pétales, sont réunies en grappes dressées. La période de fleuraison commence en avril et dure jusqu’à la fin de juin, dépendant de l’emplacement et du climat.

Le fruit

L’olive est une drupe de forme ovale constituée d’un péricarpe et d’un endocarpe. Elle pèse de 2 à 12 g, bien que certaines variétés puissent peser jusqu’à 20 g. Le péricarpe comprend deux parties : l’épicarpe (la peau) et le mésocarpe (la pulpe) qui représente environ 65-83 % du poids total. L’endocarpe, le noyau, représente 13 % à 30 % du poids total. L’épicarpe est couvert de cire, son couleur passe de vert clair à noir quand le fruit mûrit.

La composition chimique moyenne de l’olive est la suivante:

 Eau 50 %

 Huiles 22 %

 Polyphénols 1,5 %

 Protéines 1,5 %

 Sucres 18 %

 Cellulose 5,5 %

 Minéraux (cendres) 1,5 %

D’autres constituants importants sont les pectines, les acides organiques, les pigments et les glycosides de phénols.

(9)

4 Les olives immatures sont vertes car elles contiennent encore beaucoup de chlorophylle. Les huiles produites à partir de ces fruits sont riches en polyphénols et en arômes, la saveur est légèrement amère et piquante.

Au début de la véraison quand la couleur des olives est rouge-violette, la teneur en polyphénols atteint le niveau maximum. Les olives mûres deviennent graduellement noires, leur teneur en polyphénols et en chlorophylle décline et celle en caroténoïdes augmente. Les huiles des fruits récoltés tard sont dorées et à saveur douce. Le rendement en huile est le plus haut.

À l’état brut, les olives sont immangeables à cause de leur saveur amère. Elles sont soumises à un processus de fermentation ou traitées à la lessive ou à l’eau salée pour les rendre comestibles.

1.2 La fabrication de l’huile ^1,4

Principalement, la production de l’huile est faite en cinq étapes:

 Nettoyage de fruits

 Broyage

 Malaxage

 Séparation de l’eau et de la matière solide

 Filtration

Dans la première étape, les feuilles sont enlevées par un ventilateur d’extraction et les olives sont lavées à l’eau courante. Ensuite, elles sont broyées. Les cellules sont détruites et les gouttelettes de l’huile sont libérées des vacuoles. Cette opération s’effectue à l’aide de moulins en pierre, ce qui présente la méthode traditionnelle, ou avec des broyeurs à marteaux ou à disques, ce qui est la pratique plus moderne.

La pâte obtenue est remuée pendant 20-45 minutes. Pendant ce temps-là, les gouttelettes d’huile se réunissent et grandissent. Le malaxage est une étape fondamentale pour augmenter le rendement d’extraction. Plus il est long, plus haut est le rendement. Certes, la qualité et la durée de conservation sont affectées parce que l’oxydation est favorisée si le malaxage prend plus de temps.

Après, l’huile est séparée de la margine (l’eau de végétation) et des grignons (la matière solide, les noyaux etc.). Pour y parvenir, il existe une méthode traditionnelle et une méthode

(10)

5 moderne. La méthode traditionnelle d’extraction se sert des presses hydrauliques. De nos jours, on utilise des systèmes de centrifugation continue.

Finalement l’huile est nettoyée par filtrage aux filtres en maille, par décantation ou par centrifugation verticale à haute vitesse.

Des informations plus précises se trouvent au chapitre « Échantillons ».

1.3 Le classement des huiles d’olive ⁶

En 2008, le Conseil Oléicole Internationale (COI), une organisation intergouvernementale, a fixé les critères pour les degrés de qualité des huiles d’olive. Ce règlement est de rigueur pour les États de l’Union Européenne. Voici un extrait du règlement du classement des huiles d’olives :

1) « Les huiles d’olives vierges sont produites aux moyens mécaniques ou physiques et sans d’autres traitements entraînants une altération ou détérioration de l’huile. Les étapes de production ne consistent que de lavage, de décantation, de centrifugation et de filtrage.

 Huile d’olive extra vierge : Son acidité libre, exprimée dans l’acide oléique, ne doit pas dépasser 0,8% en poids et ses caractéristiques organoleptiques doivent être conformes à la norme.

 Huile d’olive vierge : acidité libre inférieure à 2% en poids, caractéristiques organoleptiques conformes à la forme

 Huile d’olive vierge courante : acidité libre inférieure à 3,3% en poids, caractéristiques organoleptiques conformes à la forme

 Huile d’olive lampante (inapte à la consommation sous sa forme d’origine) : acidité libre supérieure à 2% et caractéristiques organoleptiques conformes à la norme. Destinée au raffinage ou à une utilisation non-alimentaire.

2) L’huile d’olive raffinée provient du raffinage de l’huile d’olive vierge et présente une acidité libre inférieure à 3,3% et des caractéristiques organoleptiques conformes à la norme.

(11)

6 3) L’huile d’olive constituée d’un mélange d’huile d’olive raffinée et d’huile d’olive vierge présente une acidité libre inférieure ou égale à 1% en poids et est apte à la consommation.

4) Les huiles des grignons d’olives sont obtenues par l’extraction par solvants ou par des moyens physiques à partir de grignons d’olives. Elles sont destinées au raffinage ou à une utilisation non-alimentaire. L’huile de grignon d’olives raffinée, à une acidité libre inférieure ou égale à 0,3% en poids, est apte à la consommation.

L’huile de grignon d’olives consiste d’un mélange d’huiles de grignon d’olives et d’huile d’olive vierge, son acidité libre ne doit pas dépasser 1% en poids et ses caractéristiques organoleptiques doivent être conformes à la norme. »

1.4 La composition de l’huile d’olive ²

L’huile d’olive est principalement composée d’une partie saponifiable qui représente à peu près 98% du poids total et des composées insaponifiables qui représentent le part restant.

La partie saponifiable – Critères de pureté déterminés ⁷ 1.4.1

La partie saponifiable se compose de triacylglycéroles et contient aussi des acides gras libres, du glycérol, des phosphatides, des pigments, des composants aromatiques, des stérols et des morceaux d’olives en quantités très petites. Les triglycérides sont produits par estérification de trois molécules d’acides gras libre avec une molécule de glycérol. Ils constituent la principale réserve d’énergie pour l’homme. La composition des acides gras varie selon la variété, le degré de maturité du fruit, le lieu de culture et avec d’autres facteurs.

Selon l’COI, la composition des acides gras dans l’huile d’olive doit correspondre à la suivante (% en masse d’esters méthyliques) :

Acide myristique < 0.03

Acide palmique 7.50 - 20.00

Acide palmitoleique 0.30 - 3.50

Acide margarique < 0.30

Acide margaroléique < 0.30

(12)

7

Acide stéarique 0.50 - 5.00

Acide oléique 55.00 - 83.00

Acide linoléique 3.50 - 21.00

Acide linolénique < 1.00

Acide arachidique < 0.60

Acide gadoléique < 0.40

Acide béhénique < 0.20

Acide lignocérique < 0.20

En outre, la teneur en acides gras trans ne doit pas dépasser 0,05% pour les huiles vierges, leur teneur totale en stérols ne doit pas dépasser 1000 mg/kg. Ensuite, l’indice de peroxyde ne devrait être supérieur à 20 meq O2/kg et la teneur en cire ne doit pas dépasser 250 mg/kg.

La partie insaponifiable ^1,8,9 1.4.2

Outre la matière grasse, l’huile d’olive contient environ 2% des composants mineurs qui sont essentiels pour son parfum délicat et unique, et pour ses effets bénéfiques sur la santé humaine. On peut les séparer en tocophérols, phénols, composés aromatiques, hydrocarbures et stérols. L’α-tocophérol, l’isoforme la plus active du Vitamine E, est contenu à une teneur moyenne de 25 mg/100g. Les autres tocophérols et tocotriénols ne sont contenus que en traces. Ensuite, on trouve l'acide vanillique, l'acide gallique, l'acide coumarique, l'acide caféique, le tyrosol, l'hydroxytyrosol et l’oléocanthale qui appartiennent au groupe d’acides phénoliques et dérivés. Par ailleurs, l’huile d’olive contient des lignanes comme le pinorésinol et l’acétoxypinorésinol, les flavones apigénine et lutéoline et les sécoiridoides oleuropéine et ligustroside. Le groupe des pigments comprend les caroténoïdes, le phéophytine et la chlorophylle. La quantité de ces substances varie en fonction de facteurs divers comme la variété, la nature du terrain, les conditions climatiques et le procès d’extraction.

1.5 Les effets bénéfiques sur la santé humaine

Le régime méditerranéen, l’huile d’olive et ses polyphénols ^10–12 1.5.1

Le régime méditerranéen se comprend comme une alimentation riche en fruits et légumes, et une consommation fréquente de poisson et de l’huile d’olive. La dernière sert comme source

(13)

8 principale de graisse qui représente un part considérable de l’apport calorique quotidien.

Associé à un risque diminué de maladies cardiovasculaires et d’autres maladies de civilisation, le régime méditerranéen est considéré comme le plus bénéfique pour la santé humaine. Aussi l’obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l’hypertension sont moins répandus dans les pays du bassin méditerranéen. Il y a des études nombreuses qui ont montrées que les composés dans l’huile d’olive peuvent réduire le risque de maladie cardiaque coronaire, prévenir des divers types de cancer et modifier les réponses immunes et les affections inflammatoires. De plus, il y a des preuves que le mélange de ses polyphénols, notamment le tyrosol et l’oleuropéin, inhibe l’oxydation du LDL (low density lipoprotein ; lipoprotéine à densité faible). L’oxydation du LDL peut causer des lésions aux vaisseaux sanguins est des maladies cardiovasculaires, aux étapes ultérieures. Aussi l’oléocanthal est d’interêt particulier, car ce composant est un inhibiteur des deux enzymes cyclooxygénase, le COX-1 et le COX-2. Il donc agit anti-inflammatoire et analgésique. Aussi des effets puissants chemo-préventives, anti-oxydants et anti-cancereux ont été prouvés pour l’ensemble des polyphénols dans l’huile d’olive.

La composition de la matière grasse et ses bénéfices ^13,14 1.5.2

Avec un pourcentage de 75% d’acides gras mono-insaturés, 15% d’acides gras saturés et 10%

d’acides gras polyinsaturés, le profil d’acides gras de l’huile d’olive rapproche celui du lait maternel et est facilement assimilé par l’organisme. L’huile d’olive est pratiquement dénuée de cholestérol et contient des acides gras saturés à bas degré. C’est une composition unique et optimale pour la santé humaine.

Le composant lipidique principal est l’acide oléique, constituant 55-83% de la partie saponifiable. Il s’agit d’un acide gras omega-9 mono-insaturée qui joue un rôle indiscutable pour la prévention des maladies cardiovasculaire, de l’artériosclérose, de l’ostéoporose et de plusieures pathologies digestives et hépatobiliaires. En résistant l’attaque des radicaux libres, l’acide oléique empêche des dommages liés aux processus d’oxydation.

Les acides gras polyinsaturés comme l’acide linoléique et linolénique sont essentiels à l’homme. Ils agissent fortement réactif stimulant sur le métabolisme. Cependant, un excès de ces mêmes substances peut élever le risque de cancer. Comme l’huile d’olive contient 10%

(14)

9 des acides gras polyinsaturés, elle est une des huiles les plus appropriées parmi les huiles végétales pour l’utilisation quotidienne.

L’α-tocophérol et son activité antioxydante ^15–18 1.5.3

1.5.3.1 Introduction - Les radicaux libres et les antioxydants

Les radicaux libres sont des molécules fortement réactives car ils possèdent un électron non- apparié. En attaquant les autres molécules, ils provoquent des réactions en chaîne et la formation d’autres radicaux. Dans le corps humain, ils sont produits par des facteurs endogènes, lors des processus physiologiques, la chaîne respiratoire par exemple. En outre, les facteurs exogènes sont tels que la lumière UV, la fumée des cigarettes, l’alcool, les médicaments ou aussi les produits alimentaires. Les radicaux libres sont considérés comme substances dangereuses car ils peuvent léser des cellules et des tissus. Dans une huile, ils provoquent la peroxydation des lipides et accélèrent le rancissement.

Les antioxydants protègent les autres substances de l’oxydation. Ils réagissent avec les radicaux libres et les rendent inoffensifs. Normalement, les radicaux libres ne causent pas de dommages sévères grâce à la protection par les antioxydants. Mais lors d’une balance gênée, il est probable qu’il se produit du « stress oxydatif » et entraînera, pour son part, une détérioration de la fonction des cellules. Pour s’en protéger, le corps se sert des systèmes endogènes et exogènes. Le système endogène consiste en enzymes et protéines divers, par exemple les peroxydases, le système exogène en caroténoïdes, flavonoïdes, d’autres substances végétales secondaires et en vitamines C et E. Cette dernière est connue pour son activité antioxydante très puissante.

1.5.3.2 L’α-tocophérol

L’α-tocophérol appartient à la famille des vitamines E, un groupe de 8 substances liposolubles. Il s’agit de l’α-, β-, γ- et δ-tocophérol et de l’ α-, β-, γ- et δ- tocotriénols, dont l’

α-tocophérol est la forme biologique la plus active et la plus répandue.

(15)

10 Graphique 1: L’α-tocophérol ¹⁹

Cette molécule est composée d’un noyau 6-chromanol et d’une chaîne latérale isoprénoïde de 16 atomes de carbone. Les formes naturelles ont la configuration R,R,R ; par contre la vitamine E synthétique est un mélange racémique de 2 à 8 isomères géométriques pour chacune de ces formes. Le potentiel vitaminique de la forme naturelle est beaucoup plus important.

Du point de vue physiologique, son fonction est la protection des acides gras polyinsaturés contre la peroxydation lipidique dans les membranes des érythrocytes, les cellules immunitaires, et le cholestérol-LDL. En plus, il montre des effets anti-inflammatoires, anti- thrombotiques et analgésiques en inhibant l’activité de la cyclooxygénases-2, la phospholipase A2, la protéine kinase C, la production de thrombine et de TNF-α. Il a été identifié aussi un potentiel immunostimulant et anti-cancérogène. Ce dernier effet est basé sur l’impact de l’α-tocophérol sur l’expression génique et la modulation de la transduction cellulaire des signaux.

Une carence de vitamine E se manifeste par les symptômes suivants :

 Nervosité et irritabilité

 Sang : tendance élevée d’hémolyse des érythrocytes

 Peau : vieillissement accéléré à cause d’une activité élevée de l’enzyme MMP-1 qui dégrade le collagène

 Système immunitaire : vulnérabilité aux infections

 Risque accru pour la maladie d'Alzheimer, le diabète de type II et le cancer de la prostate

(16)

11 2 L’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE^20,21

2.1 Le principe de la chromatographie

La chromatographie est une méthode qui permet d’identifier, de séparer et de quantifier les constituants d’un mélange. Grâce à ses nombreuses possibilités d’application, elle est l’une des méthodes les plus employées dans la chimie analytique. La séparation d’un mélange est atteinte par les affinités diverses de ses composants à deux phases non miscibles, dites la phase stationnaire et la phase mobile. Les substances sont identifiées par leur temps de rétention, qui est reproductible dans des conditions identiques. Il existe plusieurs types de chromatographie qu’on peut classifier par le type d’interaction ou la technique de réalisation.

Le classement selon le type d’interaction :

 Chromatographie d’adsorption

 Chromatographie de partage

 Chromatographie d’échange d’ions

 Chromatographie d’exclusion stérique

Le classement selon la technique de réalisation :

 Chromatographie sur papier

 Chromatographie sur Couche Mince (CCM)

 Chromatographie sur colonne

 Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP)

 Chromatographie en Phase Supercritique (CPS)

Si la phase stationnaire est polaire, on utilise une phase mobile apolaire. C’est la chromatographie en phase normale. La chromatographie en phase inversée demande une phase stationnaire apolaire et une phase mobile polaire.

(17)

12 La réalisation d’une chromatographie se fait comme suit :

La phase stationnaire est immobilisée sur une plaque ou à l’intérieur d’une colonne. À son tête, l’échantillon à examiner est appliqué. La phase mobile en est déplacée traversalement et entraîne la migration des composées. Le résultat est le chromatogramme, une représentation graphique de la concentration en analyte en fonction de temps de rétention.

Les méthodes utilisées dans cette étude sont la CLHP et la CPG.

(18)

13 2.2 La Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP)

Figure 2: Principe de la CLHP

La CLHP est une technique de chromatographie dans laquelle la phase stationnaire est immobilisée dans un colonne de séparation à une longueur de 5-30 cm et un diamètre intérieur de 1,5-8 µm. Comme phase stationnaire, l’alumine, l’oxyde de zirconium, des polymères organiques et le gel de silice sont les matériaux les plus utilisés.

La solution à examiner est injectée dans la colonne par un échantillonneur automatique. La phase mobile en est déplacée traversalement à l’aide de pompes à une pression atteignant 400 bars et un débit de 0,1-5 ml/min. Afin de créer un gradient d’élution variant au cours de temps, la composition de la phase mobile peut être changée automatiquement à partir de plusieurs solvants.

Un détecteur indique les changements de la composition de la phase mobile à la sortie de la colonne. Il fournit un signal électronique proportionnel à la quantité de substance détectée. Ce signal est converti en une courbe de concentration en fonction du temps par des programmes d’ordinateur.

(19)

14 2.3 La Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Figure 3: Principe de la CPG

La CPG, basée sur la chromatographie d’absorbance ou de partage, est une méthode pour analyser des espèces chimiques à l’état gazeuse. Généralement, elle est limitée aux espèces chimiques qui sont convertibles en état gazeux sans se décomposer. Pour certaines autres il existe la possibilité de les convertir en dérivés vaporisables.

Une installation de CPG se compose d’un injecteur, un four thermostaté, une colonne qui se trouve dans celui-là, et un détecteur. La colonne, ayant une longueur de 1 m à plus de 100 m, contient la phase stationnaire. Comme phase mobile, appelée gaz vecteur, l’hélium, le diazote et le dihydrogène sont utilisés. La pression dans la colonne est stabilisée avec précision par un système mécanique ou électronique afin d’assurer un débit de gaz constant. Le débit et la pression du gaz déterminent sa viscosité et sa vitesse. Ces deux paramètres ont une grande influence sur la dispersion des composés dans la phase stationnaire et leur diffusion dans la phase mobile, autant que la température. Cependant, la nature du gaz n’est pas déterminante pour la distribution des solutés, car il n’y a pratiquement pas d’interaction entre le gaz et le soluté.

(20)

15 2.4 La détection par spectrométrie UV/VIS

Les détecteurs UV mesurent l’absorption des radiations lumineuses par une matière. Le domaine spectral entre 185 et 400 nm est appelé UV. Le principe de ce type de détecteurs est basé sur les interactions entre les photons de la source lumineuse avec les électrons de liaison des molécules. S’appuyant sur la loi de Lambert et Beer, l’intensité de l’absorption est proportionnelle à la concentration d’une substance présente dans l’échantillon.

Afin d’adapter la détection en suivant les besoins, ces détecteurs permettent soit d’enregistrer l’absorbance à plusieurs longueurs d’onde, soit de capter tout un domaine de longueurs d’ondes sans interrompre l’analyse. On obtient alors un grand nombre de spectres pour une seule analyse. Les détecteurs UV à barrette des diodes fournissent le chromatogramme ainsi que les renseignements spectraux qui servent à s’assurer de l’identité des substances étudiées.

2.5 La détection par Spectrométrie de Masse (SM)

La spectrométrie de masse est basée sur la détermination des masses des molécules ou atomes présents dans l’échantillon étudié. Grace à son sensibilité extrême et son vaste champ d’application, elle est un moyen irremplaçable dans l’analyse structurelle.

La première étape d’analyse est la transformation d’une petite quantité du composé en ions.

Cela est effectué par bombardement avec des électrons, des atomes ou des photons. Les fragments sont focalisés et accélérés dans un champ électronique et/ou magnétique. Un analyseur permet de séparer les ions selon leur rapport masse/charge. Finalement, les ions accèdent à un détecteur qui fournit des signaux proportionnels à leurs charges. Le spectre de masse présente les abondances des ions formés, classés selon leur rapport masse/charge. Ce spectre permet l’identification univoque d’une substance puisque sa fragmentation est caractéristique et reproductible.

(21)

16 3 OBJECTIVES

Le but de ce travail est d’optimiser une méthode pour la séparation et la quantification de l’α- tocophérol dans l’huile d’olive par CLHP couplée à un détecteur UV. En utilisant cette méthode, nous voulons analyser des échantillons d’huiles provenant de la Tunisie, de l’Italie et de la France et les comparer en vue de leur teneur en α-tocophérol. Comme il s’agit d’une substance photosensible, il sera exploré à quel degré sa concentration est diminuée dans des huiles exposées à la lumière. Finalement, nous voulons séparer l’α-tocophérol aussi par CPG et le détecter par SM, car cette méthode est avantageuse pour l’analyse des huiles.

(22)

17 B – PARTIE EXPERIMENTALE

1 INTRODUCTION ET PROBLEMATIQUE

L’objectif primaire était de trouver une méthode rapide et précise pour déterminer la teneur en α-tocophérol dans l’huile d’olive effectué par CLHP. Plusieurs groupes des chercheurs ont déjà trouvé des solutions pour cette problématique. Parmi eux, la plupart a utilisé une dilution de l’huile, suivie par injection directe. Une injection directe de l’huile diluée avec l’hexane dans l’HPLC est possible mais peut causer plusieurs problèmes : Elle peut contaminer et abîmer la colonne avec lipides, ce qui cause des pics fantôme, des lignes de base instable et diminuera la durée de vie de la colonne. Telles sont les raisons pour lesquelles une extraction des substances recherchées est le meilleur choix.

Sachant que l’α-tocophérol est une substance lipophile, il faut trouver un solvant qui est assez lipophile pour extraire tout l’α-tocophérol de l’huile mais qui n’est pas miscible avec l’huile.

L’acétonitrile est le solvant le plus approprié.

Afin d’extraire tout l’α-tocophérol de l’huile au solvant il faut agiter les échantillons préparés assez fort mais sans induire la formation d’une émulsion non séparable. Pour atteindre cet objectif, nous avons choisi d’effectuer l’extraction manuellement.

En outre, nous avons choisi un système de CLHP en phase inverse avec diphenyle comme phase stationnaire et acétonitrile comme phase mobile. Ce faisant, les interactions π-π et les interactions hydrophobes des groupes phényle entraînent la séparation de l’α-tocophérol.

(23)

18 2 MATERIEL

2.1 Réactifs

 α-Tocophérol (substance de référence) (±)-α-Tocophérol

(Vitamin E*DL-all-rac- α-Tocophérol Synthetic; ≥96% (HPLC)) Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne

 n-Hexane : Utilisé pour la préparation de la solution mère a) Carlo Erba Reagents, Val de Reuil, France b) N-Hexane ACS – for analysis –Reag. Ph Eur.

 Acétonitrile

« Acetonitrile Chromasolv® gradient grade for HPLC ≥99.9% » Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne

 Phtalate de Dibutyle:

« Phthalsäuredibutylester, +99% »

Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne

(24)

19 2.2 Les échantillons des huiles d’olive

Les huiles italiennes 2.2.1

Ces huiles sont obtenues en laboratoire selon un mode opératoire non divulgué.

Échantillon Saison de

Production Variété d’Olive Mode d’Extraction

2A 2011/2012 Coratina Extraction

expérimentale

traditionnelle

expérimentale

traditionnelle

expérimentale

traditionnelle

expérimentale

traditionnelle

expérimentale

traditionnelle

1 2011/2012 Coratina Contrôle

49 2012/2013 Ogliarola, Majatica,

Coratina, Leccino

Extraction expérimentale

Coratina, Leccino

Extraction traditionnelle

Coratina, Leccino

(25)

20

Coratina, Leccino

Coratina, Leccino Contrôle

(26)

21 Les huiles tunisiennes

2.2.2

Echantillons Provenance Mode d’extraction Variété d’olive

N1 Drean (région d’El-

Taref)

Pilote au laboratoire (oléodoseur)

N2 Jijel Pilote au laboratoire

(oléodoseur) Limli

N3 Skikda Pilote au laboratoire

(oléodoseur)

N4 Oued Souf Pilote au laboratoire

(oléodoseur)

N5 Skikda Pilote au laboratoire

(oléodoseur)

Chétoui algérienne

N6 Sfax (Tunis) Pilote au laboratoire

(oléodoseur)

Chétoui algérienne

N7 El-Taref Pilote au laboratoire

(oléodoseur)

O1 Oued Souf Usine (extraction

continu)

G1 Guelma Continu

G2 Guelma Continu

T1 Bouhadjar Continu

J1 Jijel Continu

T4 Bouhadjar Continu (50% olive

verte

B1 Bougous (El- asfour) Continu

B2 Bougous Traditionnel

B3 Bougous Traditionnel

Ces huiles sont été élaborées selon trois méthodes différentes.

(27)

22 2.2.2.1 Mode d’extraction pilote au laboratoire

L’extraction a été effectuée à l’aide d’un oléodoseur à l’institut de l’olivier Sfax, Tunis en décembre 2012.

L’oléodoseur est un extracteur pilote d’huile d’olive destiné aux laboratoires et muni d’un broyeur, d’un support pour le malaxage de la pâte d’olive avec vis sans fin, ce qui fait apparaître l’huile en surface. La pâte est ensuite centrifugée à l’aide d’une centrifugeuse et recueillie.

Figure 4

Figure 5

Figure 6

Photos personnelles, prises lors de l’extraction au laboratoire en Tunisie/Sfax.

(28)

23 2.2.2.2 Mode d’extraction continue

C’est un mode d’extraction par des machines du type Rapanelli^® (au niveau de l’usine) qui travaillent en continu. Elles réalisent toutes les étapes de la fabrication de l’huile automatiquement :

o Lavage o Broyage o Malaxage

o Séparation de l’huile de l’eau de végétation par système de centrifugation

Figure 7 (www.rapanelli.it)

2.2.2.3 Mode d’extraction traditionnelle (appelé discontinue)

Le broyage des olives s’effectue à l’aide d’une meule en pierre. La pâte obtenue est déposée dans des scourtins en fibre d’alfa. Les scourtins sont des paillets, fabriqués des matériaux différents, qui servent à filtrer la pâte d’olives. Ils sont empilés l’un sur l’autre, un pressage mécanique est appliqué et l’huile obtenue coule dans des bassins.

Figure 8

(29)

24 Figure 9

Les huiles du commerce 2.2.3

Huile Origine Traitement

Variété Picholine Française Extraction à froid Variété Lucques Française Extraction à froid Huile d’olive extra

vierge commerciale

Espagnole Extraction à froid

Les huiles Picholine et Lucques sont fabriquées dans des moulins selon le mode d’extraction continue en entreprise (Moulin de Clermont l’Hérault – France). L’huile d’olive extra vierge commerciale d’origine espagnole était obtenue dans un supermarché local, il s’agit d’un produit de la gamme de propre marque.

(30)

25 2.3 L’appareillage

La Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) 2.3.1

Pompe: SP Thermo Separation Products Spectra System P4000 Injecteur: SP Thermo Separation Products AS3000

Colonne: Varian Pursuit XRs 5 Diphenyle Phase stationnaire: Diphenyl Taille de particules: 5 µm

Longueur : 150 x 4.6 mm diamètre intérieur Température du four à colonne : 30°C

Détecteur d’UV: Thermo Finnigan Spectra System UV6000LP (Détecteur d’UV à barrette des diodes)

La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 2.3.2

CPG: Thermo Finnigan TRACE GC Ultra

Injecteur automatique : AIAS 3000

Colonne : SGE BPx5 0,25µm ; 30m x 0,25mm Détecteur de spectrométrie de masse :

Thermo Finnigan DSQ

Trace Quadripol Impact électronique 70eV

(31)

26 L’équipement supplémentaire

2.3.3

 Balance de précision : Denver Instrument M310

 Tubes hémolyses 5ml

 Pipettes diverses : Eppendorf

 Vortex : Bioblock Scientific IKA^®

 Centrifugeuse : Legallais Centro 8 – BL

 Vials pour CLHP en verre et plastique : Supelco, Bellefonte, USA

(32)

27 3 METHODES

3.1 Le choix d’une méthode d’étalonnage

Afin de déterminer la concentration d’une substance dans un échantillon, les signaux de l’appareil sont comparés à une base de référence car il faut tenir compte de l’influence du procédé analytique aux résultats.

Ils existent trois méthodes d’étalonnage : la détermination par rapport à un étalon externe, l’étalonnage interne et la méthode des ajouts dosés.

Dans l’étalonnage externe, la valeur obtenue est comparée à une droite d’étalonnage qui était formée sur la base de la substance d’intérêt, mais séparément de l’analyse des échantillons.

L’étalonnage interne consiste à comparer la surface du pic de l’analyte à celle d’une substance différente ajoutée dans l’échantillon. Cette méthode permet de compenser des irrégularités d’appareillage, par exemple le volume d’injection.

Dans la méthode des ajouts dosés un échantillon est analysé seul ainsi que surchargé avec la substance recherchée en plusieurs quantités connues. La droite des valeurs obtenues permet à déterminer la concentration de l’analyte dans l’échantillon sans ajout. Cette méthode permet de s’affranchir l’effet de matrice des échantillons, dans notre cas la matière grasse de l’huile d’olive.

Graphique 2: Principe de la méthode par ajouts dosés

(33)

28 Quant à la chimie analytique, on entend sous le terme matrice tous les composés dans un échantillon sauf l’analyte. La matrice peut avoir de l’influence perturbatrice sur la qualité d’analyse et sur les résultats qui en découleront; cet effet est également appelé effet de matrice. Il est défini comme le changement des signaux du détecteur, soit positif, soit négatif, lors de l’analyse de l’échantillon par rapport à l’analyse d’un standard seul. ²² Une raison possible est la co-elution des composantes de la matrice qui perturbe la détection. En ce qui concerne l’huile d’olive, il s’agit d’une matrice assez complexe à cause de la composition lipidique très variée qui comporte des propriétés chimiques aussi très différentes.

Tableau 1: Signaux du détecteur à l’analyse d’un extrait et un étalon externe Aire Pic

Concentration tocophérol Extrait Etalon externe

0 287877 36402

0,024 327374 248644

0,048 363217 476201

0,07 401803 801072

0,091 447421 1031337

0,111 471579 1255900

Graphique 3 : Gammes d’étalonnage d’un extrait d’α-tocophérol et une solution d’α- tocophérol dans de l’acetonitrile

0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 1400000

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Surface

C_α-T ajoutée (mg/ml)

Extrait huile Etalon externe

(34)

29 La graphique 3 montre la différence entre l’analyse d’une série des concentrations d’α- tocophérol solubilisés dans de l’acétonitrile, et celle des extraits des huiles surchargées avec les mêmes concentrations. Les réponses de l’appareil et les pentes des droites, qui en dérivent, sont fortement différentes. On en déduit que la matrice des échantillons, la matière grasse des huiles, supprime les signaux qui résultent de l’analyse. C’est la raison pour laquelle la méthode d’étalonnage par ajouts dosés est la seule possible pour notre recherche.

L’enrichissement des huiles est obtenue par une solution mère à 10 g/L d’α-tocophérol dans de l’hexane, celle-ci doit être miscible à l’huile pour constituer un milieu parfaitement homogène. Cette solution mère concentrée nous permet d’ajouter des volumes très faibles à l’huile.

La graphique 4 montre les droites qui résultent de la surcharge des huiles G1, J 1, O1, N1 et N2 avec 200 µg et 400 µg d’α-tocophérol par ml, respectivement. Les droites sont toutes parallèles. Cela nous dit que les surfaces des pics augmentent proportionnellement à la quantité en α-tocophérol ajoutée, et que les concentrations de l’analyte, l’α-tocophérol, s’échelonnent sur la plage de linéarité.

Graphique 4: Lignes droites des ajouts dosés

0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Surface

Concentration ajoutée (mg/ml)

G1 J1 O1 N1 N2

(35)

30 3.2 La préparation des échantillons

Afin d’éviter la dégradation de l’α-tocophérol, tous les échantillons sont gardés à l’abri de la lumière et à température ambiante jusqu’à l’analyse. La détermination de la teneur en α- tocophérol est effectuée comme suit :

Une solution mère d’α-tocophérol de la concentration 10g/L est préparée dans de l’hexane. La solution est gardée dans un flacon en verre brun à 4°C.

 1 ml d’huile est pipeté trois fois dans des tubes en verre de 5 ml.

 Le deuxième et le troisième tube sont surchargés avec soit 200 µg et 400 µg de la solution mère de l’α-tocophérol.

 On mélange la solution avec Vortex pendant 30 secondes.

 2 ml de l’acétonitrile sont ajoutés dans chaque tube. Les tubes sont gardés à l’abri de la lumière et puis ils sont extraits manuellement pendant 10 minutes.

 Apres l’extraction, le mélange est centrifugé pendant une minute à 3500 rpm.

 Environ 1ml de l’acétonitrile (phase supérieure) est pipeté dans une petite fiole en verre appropriée à l’échantillonneur automatique et fermé.

Tableau 2 : Préparation des échantillons Échantillon

(ml)

Solution mère de l’α- tocophérol10g/L (ml)

Acétonitrile (ml)

Concentration finale de l’α-tocophérol ajouté

(mg/ml))

Huile pure 1 0 2 0

Huile

surchargée 1 1 0,02 2 0,196

Huile

surchargée 2 1 0,04 2 0,385

Chaque échantillon est injecté trois fois de suite, suivi par une injection de l’ACN pur pour éviter les effets mémoire.

(36)

31 3.3 Les conditions de la CLHP

Pompe :

o Phase Mobile : Acétonitrile 100%

o Flux 0.50 ml/min

Détecteur :

o Temps de montée : 2 secondes

o Longueur d’ondes minimale : 220 nm oLongueur d’ondes maximale : 350 nm o Fente : 2 nm

o Taux de balayage : 1 Hz o Largeur de bandes : 5 nm o Taux de données : 10 Hz o Lampe à deutérium

Injecteur:

o Viscosité d’échantillon : normal o Type d’injection : Push Loop ™

(37)

32 3.4 L’exploitation des chromatogrammes

Les chromatogrammes sont analysées par le logiciel « Chromquest 4.2.34 ; Version 3.1.6 ».

Les pics sont intégrés pour déterminer les surfaces et la valeur moyenne des trois analyses est calculée. À partir de ces trois points, une ligne droite est faite et l’équation est calculée avec Microsoft Excel 2010^®. Le point d’intersection entre cette ligne droite et l’axe X est calculé.

Comme la pente de la droite correspond à la quantité de l’α-tocophérol ajouté, le point zéro spécifie la concentration initiale dans l’huile. Ensuite, la vraie concentration est calculée par la multiplication de la valeur par deux, car l’extraction est effectuée en relation acetonitrile : huile de 2 :1.

Utilisant la méthode, comme décrit plus haut, le temps de rétention de l’α-tocophérol est de 5,4 minutes. En injectant 5µL d’une solution fille de la concentration 0,25g/L la surface du pic s’élève à 3,2*10^{^6}. Le détecteur à barrette de diode nous permet de tracer le spectre d’absorbance de l’α-tocophérol afin de choisir, pour le dosage, la longueur d’onde d’absorbance maximale. L’α-tocophérol présente l’absorbance maximale à une longueur d’onde de 285 nm. (Voir les graphiques 5, 6 et 7)

Graphique 5: Chromatogramme d’une solution fille de tocophérol de 0,25mg/ml

(38)

33 Graphique 6 : Spectre UV de l’α-tocophérol (en haute à droite)

Graphique 7: Chromatogramme d’un extrait d’huile non surchargé

(39)

34 3.5 Les problèmes rencontrés au cours des analyses

Après un certain nombre d’analyses, la colonne perd en efficacité, entraînant une ligne de base instable et une modification du temps de rétention. Le pic de l’α-tocophérol interfère alors avec d’autres pics (graphique 8).

Graphique 8

Un autre problème dans la quantification de l’α-tocophérol est dû au fait qu’il est difficile de tracer une ligne de base fiable lorsque les surfaces de pics sont très faibles. Ceci entraîne une variabilité des résultats.

Pic de l’α-tocophérol

(40)

35 3.6 La validation de la méthode chromatographique

Identité 3.6.1

Graphique 9 : Documentation du temps de rétention

Temps de Rétention moyen : 5,428 min

Ecart type : 0,01696

CV% : 0,312 %

La variance (CV%) du temps de rétention est très faible ce qui nous permet de valider l’identification de l’ α-tocophérol par le temps de rétention. Mais ce critère n’est pas suffisant et nous nous sommes aidés du spectre d’absorption dans l’UV pour vérifier la pureté du pic.

Là encore, les informations fournies ne peuvent pas être fiables à 100 %. La certitude de l’identification devra se faire par CLHP couplée à un spectromètre de masse.

0,000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000

1 25 49 73 97 121 145 169 193 217 241 265 289 313 337 361 385 409 433 457 481 505 529 553 577 601 625 649 673 697 721 745 769

Temps de Rétention (min)

Nombre des échantillons injectés

Evolution du Temps de Rétention

(41)

36 Linéarité

3.6.2

5 volumes différents de la solution mère d’α-tocophérol dilués à l’acétonitrile sont mesurés et les surfaces des pics intégrées. On obtient une relation linéaire entre la concentration et la réponse de l’appareil.

Tableau 3: Chromatographie d’une série des concentrations Concentration d’α-

tocophérol

Surface du pic

0,024 327374

0,048 363217

0,07 401803

0,091 447421

0,111 471579

Graphique 10: Validation de la linéarité

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Surface

Concentration d'α-tocophérol (mg/ml)

(42)

37 Répétabilité

3.6.3

Une solution fille à partir de la solution mère de tocophérol est analysée 5 fois et les surfaces des pics sont comparées.

Concentration d’α-tocophérol dans la solution fille : 0,25 g/L Tableau 4: Répétabilité de l'analyse chromatographique

Réalisation N° Surface du pic

1 3225445

2 3404115

3 3372403

4 3594685

5 3132541

Graphique 11

Moyenne: 3345838

Ecart Type: 177494

CV%: 5,30%

0 1000000 2000000 3000000 4000000

1 2 3 4 5

Réalisation N°

Surface

(43)

38 3.7 La validation de la méthode d’extraction

L’ensemble du processus d’analyse est répété 3 fois pour plusieurs échantillons d’huiles et la variance est calculée.

Tableau 5: Variance des analyses répétées

Échantillon CV%

B2 15,04%

B3 29,35%

G1 21,20%

T1 9,07%

T2 22,71%

O1 12,36%

Picholine 19,66%

Lucques 21,68%

(44)

39 3.8 La quantification de l’α-tocophérol par CPG-SM

L’ajustage de l’appareil : Programme de température:

Température initiale : 120°C - pendant 1 min Gradient de température : 10°C/min

Température finale : 300°C pendant 1 min Mode : Split 1/20

Gaz porteur : Hélium Débit du gaz : 1,5ml/min

Détecteur de Spectrométrie de masse :

Mass transfer line temperature: 300°C Mass list mass range: 40-600

Cette étude a été réalisée dans le but de confirmer la présence d’-tocophérol dans les échantillons par une méthode d’identification plus spécifique (spectrométrie de masse), couplée à une chromatographie en phase gazeuse.

Afin de réaliser un dosage, nous avons utilisé la méthode de l’étalonnage interne (phtalate de dibutyle - DBP). Une solution mère (SM) du phtalate de dibutyle à 0,200 g/L est préparée dans de l’acétonitrile.

Une solution fille (SF) d’α-tocophérol à 0,200 g/L est préparée dans de l’acétonitrile à partir de la solution mère à 10g/L.

Afin de quantifier les échantillons, une courbe de calibration a été préparée selon le tableau 6.

Comme représenté par la graphique 11, les résultats obtenus mettent en évidence la relation linéaire entre la concentration de l’α-tocophérol (allant de 0,02 mg/ml à 0.1mg/ml) et les réponses du détecteur.

(45)

40 Tableau 6: Courbe de Calibration de l'α-Tocophérol dans de l’acétonitrile

Concentration α-tocophérol (mg/ml)

Concentration DBP (mg/ml)

CαT / CDBP

Surface α-tocophérol / surface DBP

0 0,004 0 0

0,02 0,004 5 1,58

0,04 0,004 10 2,8

0,06 0,004 15 4,16

0,1 0,004 25 5,7

Graphique 12 : Gamme d’étalonnage de l’-tocophérol

La détermination de la teneur en α-tocophérol dans les huiles d’olive par CPG-SM est effectuée en utilisant des extraits d’acetonitrile des huiles. La procédure de préparation des échantillons est la même que celle des échantillons de la CLHP. Il s’agit d’une méthode par ajout dosé.

0 1 2 3 4 5 6 7

0 5 10 15 20 25 30

Surface tocopherol / Surface DBP

C α-tocophérol / C DBP

(46)

41 La préparation des échantillons :

3 échantillons de chaque fois 1 ml de l’huile sont surchargés avec 0, 20 µL ou 40 µL de la SF d’α-tocophérol. Ils sont bien mélangés sur Vortex et ensuite extraits à 2 ml d’acétonitrile manuellement pendant 10 minutes.

1 ml de chaque extrait est supplémenté par 10 µL de SM de l’étalon interne. Après 5 secondes de Vortex, les échantillons ont été injectés selon la méthode décrite précédemment.

Tableau 7: Préparation des échantillons SF α-

tocophérol (µL)

Volume SM DBP

(µL)

ACN (µL)

Concentration α-tocophérol

(mg/ml)

Concentration DBP (mg/ml)

C_T/C_EI (mg/ml)

1 100 10 880 0.1 0,002 50

2 60 10 920 0.06 0,002 30

3 40 10 940 0.04 0,002 20

4 20 10 960 0.02 0,002 10

L’exploitation des résultats : Mode de calcul:

La droite d’étalonnage obtenue correspond à une droite d’étalonnage interne qui permet de déterminer un ratio de concentration (concentration de l’α-tocophérol divisée par la concentration d’étalon interne). La concentration de l’α-tocophérol obtenue reflète la concentration de α-tocophérol dans une huile non surchargée, diluée au ½ lors de son extraction.

(47)

42 4 RESULTATS ET DISCUSSION

4.1 L’analyse par CLHP-UV

La concentration d’α-tocophérol dans les huiles italiennes 4.1.1

Nom de l’échantillon C α-T (mg/ml) Nom de l’échantillon C α-T (mg/ml)

2A 0,292 58 0,296

3A n.a. 61 0,327

5A 0,265 62 0,25

6A 0,212 65 n.a.

8A 0,715 66 n.a.

9A 0,266 69 0,256

11A 0,299 70 0,493

13A 0,200 73 0,36

16A 0,302 74 0,24

17A 0,298 77 0,117

1 0,243 78 0,29

4 0,236 48 0,35

7 0,255 52 0,301

10 0,302 56 n.a.

15 0,306 60 0,297

49 0,403 64 0,227

50 0,67 68 0,347

53 0,331 72 0,334

54 0,434 76 n.a.

57 0,204

Concentration moyenne : Tous les échantillons : 0,322 mg/ml Extraction expérimentale : 0,355 mg/ml Extraction traditionnelle : 0,332 mg/ml Extraction contrôle : 0,282 mg/ml

(48)

43 Résultats affichés selon la méthode d’extraction :

Graphique 13

Graphique 14

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

2A 5A 8A 11A 16A 49 53 57 61 65 73 77

C tocophérol (mg/mL)

N° huile

Extraction experimentale

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

6A 9A 13A 17A 50 54 58 62 70 74 78

N° huile

Extraction traditionelle

(49)

44 Graphique 15

Graphique 16

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

1 4 7 10 15 48 52 60 64 68 72

N° huile

Extraction contrôle

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400

Extraction contrôle

C α-tocophérol (mg/ml)

Concentrations d'α-tocophérol affichées

selon méthode d'extraction

(50)

45 La concentration d’α-tocophérol dans les huiles tunisiennes

4.1.2

Nom de l’échantillon C α-T (mg/ml) Nom de l’échantillon C α-T (mg/ml)

N1 0,390 G2 0,477

N2 0,217 T1 0,671

N3 0,503 T2 0,62

N4 n.a. T3 0,329

N5 n.a. T4 0,479

N6 0,693 J1 n.a.

N7 0,540 B1 0,392

O1 0,504 B2 0,543

G1 0,381 B3 0,413

Concentration moyenne : Tous les échantillons : 0,477 mg/ml Extraction pilote : 0,469 mg/ml Extraction traditionnelle : 0,478 mg/ml Extraction continue : 0,482 mg/ml

(51)

46 Résultats affichés selon la méthode d’extraction :

Graphique 17

Graphique 18

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800

N1 N2 N3 N6 N7

Nom huile

Extraction "Pilote au laboratoire"

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

O1 G1 G2 T1 T2 T3 T4

Nom huile

Extraction continue

(52)

47 Graphique 19

Graphique 20 : Résultats affichés selon la méthode d’extraction

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

B2 B3

Nom huile

Extraction traditionelle

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600

Pilote au laboratoire (oléodoseur)

Continu Traditionel

C α-tocophérol (mg/mL)

Concentrations d'α-tocophérol affichés selon la

méthode d'extraction

(53)

48 La concentration d’α-tocophérol dans les huiles commerciales

4.1.3

Huile Origine Traitement C α-tocophérol

(mg/ml)

Picholine Française Extraction à froid 0,226

Lucques Française Extraction à froid 0,133

Huile d’olive extra vierge commerciale

Espagnole Extraction à froid

0,276

La comparaison des résultats 4.1.4

Graphique 21 : La teneur en α-tocophérol dans les échantillons selon leur pays d’origine

Selon l’enquête nutritionnelle CIQUAL⁹, la teneur moyenne en α-tocophérol dans une huile d’olive est 0,250 mg/ml. En regardant les résultats, on remarque en première vue que les concentrations trouvées sont très fortes. Ce fait peut être considéré de deux perspectives différentes :

D’un côté, on pourrait mettre en cause la fonctionnalité de l’analyse. D’autre côté, nous devons saisir que tous conditions, par exemple le stockage des fruits au soleil après la récolte, peuvent avoir un impact considérable sur la composition chimique de l’huile.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Tunisie Italie France Espagne Moyenne

mg/mL