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EXCLUSIF À ILLUMINA Nº 15066493 Rév. A FRA Février 2015
Nº de référence SY-401-9002DOC
Guide du système HiSeq
MD3000
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Table des matières
Table des matières iii
Chapitre 1 Vue d’ensemble 1
Introduction 2
Composants du système HiSeq 3000 3
Consommables pour le séquençage 6
Démarrer le système HiSeq 3000 7
Logiciel HiSeq 3000 8
Ressources supplémentaires 13
Chapitre 2 Réalisation d’une analyse de séquençage 15
Introduction 16
Flux de travail de séquençage 17
Saisir les paramètres d’analyse 18
Charger et amorcer des réactifs 22
Charger la Flow Cell de séquençage 29
Surveiller l’analyse 33
Chapitre 3 Procédures après analyse 35
Introduction 36
Décharger et peser des réactifs 37
Réaliser un lavage de maintenance 38
Réaliser un lavage à l’eau 41
Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie 43
Inactivité de l’instrument 44
Arrêter l’instrument 45
Chapitre 4 Real-Time Analysis 47
Introduction 48
Présentation de RTA v2 49
Flux de travail de l’analyse temps réel 51
Fichiers de sortie de séquençage 55
Numérotation des plaques 56
Chapitre 5 Dépannage 57
Introduction 58
Problèmes possibles de configuration de l’analyse 59
Réaliser une vérification de la fluidique 60
Suspendre ou arrêter une analyse 61
Possible réhybridation du primer de lecture 1 63
Index 65
Assistance technique 69
Guide du système HiSeq 3000
iii
C h a p itr e 1
Guide du système HiSeq 3000
1
Chapitre 1 Vue d’ensemble
Vue d’ensemble
Introduction 2
Composants du système HiSeq 3000 3
Consommables pour le séquençage 6
Démarrer le système HiSeq 3000 7
Logiciel HiSeq 3000 8
Ressources supplémentaires 13
V u e d ’e n s e m b le Introduction
Le système HiSeqMDassocie une ingénierie innovante et la chimie SBS éprouvée pour définir de nouveaux critères en matière de débit, de simplicité et de rentabilité.
Le système HiSeq 3000 est doté des fonctionnalités suivantes :
} Imagerie à double surface : le système HiSeq 3000 utilise un système d’épifluorescence à deux caméras et quatre capteurs avec une technologie de numérisation de pointe pour permettre une imagerie à double surface.
} Flow Cell modélisée : le système HiSeq 3000 utilise une Flow Cell modélisée qui permet de générer des amplifiats de séquençage dans un arrangement ordonné, ce qui améliore les lectures de sortie et les données générées.
} Réfrigérant pour réactifs haute capacité : le compartiment de réactifs est un réfrigérant haute capacité qui contient suffisamment de réactifs pour la réalisation de toute
l’analyse de séquençage.
} Fluidique intégrée pour les analyses à lectures appariées : la fluidique appariée intégrée fournit des réactifs à partir du compartiment de réactifs vers la Flow Cell pour la resynthèse de la lecture 2 et le séquençage indexé.
} Options de contrôle de l’interface : l’interface logicielle de l’instrument vous permet de configurer une analyse et d’utiliser l’instrument à l’aide de l’écran tactile ou du clavier intégré.
} Définition des bases en temps réel : le logiciel de l’instrument extrait les intensités des images et réalise la définition des bases par score de qualité sur l’ordinateur de
l’instrument, ce qui permet de surveiller les indicateurs de qualité au cours de l’analyse et d’économiser du temps durant l’analyse ultérieure des données.
L’analyse en aval des données de séquençage peut être effectuée avec le logiciel d’analyse d’Illumina ou avec un logiciel tiers sur une infrastructure personnalisée.
} Connectivité à BaseSpace : le système HiSeq 3000 intègre une option d'envoi en temps réel des données sur la santé et le séquençage recueillies par l’instrument à la solution de génomique en nuage BaseSpace, en vue de simplifier l’analyse et le contrôle qualité de l’instrument.
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Guide du système HiSeq 3000
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Composants du système HiSeq 3000
Le système HiSeq 3000 comprend l’instrument, l’écran, l’ordinateur de contrôle de l’instrument et les accessoires, comme le clavier, la souris et le lecteur de code à barres.
L’instrument compte quatre compartiments principaux : le module optique, le
compartiment de Flow Cell, le compartiment fluidique et le compartiment de réactifs. L’état de fonctionnement de l’instrument est indiqué dans une barre d’état illuminée.
Figure 1 Composants externes
A Module optique : contient les composants optiques qui permettent l’imagerie à double surface de la Flow Cell et l’imagerie simultanée de A, C, G et T à l'aide de
l’épifluorescence. Le faisceau laser d’excitation passe à travers l’objectif et la fluorescence est recueillie à travers le même objectif.
B Compartiment de la Flow Cell : contient la platine de la Flow Cell commandée par dépression, qui maintient la Flow Cell en place pendant les analyses de séquençage.
C Compartiment fluidique : contient les pompes fluidiques qui envoient les réactifs à la Flow Cell, puis au conteneur de déchets.
D Barre d’état: indique l’état de l’instrument à l’aide de trois couleurs. Le bleu indique que l’instrument effectue une analyse, l’orange qu’il nécessite une surveillance et le vert, qu’il est prêt à commencer l’analyse suivante.
E Compartiment des réactifs : contient les supports des réactifs requis pour les analyses de séquençage et la solution de lavage pour les lavages de l’instrument.
Compartiment des réactifs
Le compartiment de réactifs est un réfrigérant pour réactifs haute capacité qui contient deux supports de réactifs : un pour les réactifs SBS et un pour les réactifs d’indexage et appariés. Les poignées du dispositif d’aspiration abaissent les dispositifs d’aspiration dans les flacons de réactif.
} Support de réactifs SBS : situé en position centrale, à droite du support apparié.
Il contient des flacons coniques de 250 ml. Les positions numérotées correspondent aux connexions sur une valve sélectrice de réactifs interne.
} Support de réactifs d’indexage et appariés : situé dans la position de gauche.
Il comporte une rangée de positions numérotées dans laquelle se trouvent des flacons coniques de 15 ml contenant les réactifs appariés et d’indexage.
} Réfrigérant pour réactifs : le réfrigérant pour réactifs accueille les supports de réactifs et se maintient à une température interne de 2 °C à 8 °C.
V u e d ’e n s e m b le
Figure 2 Compartiment des réactifsA Poignées du dispositif d’aspiration
B Support de réactif pour les réactifs d’indexage et appariés C Support de réactifs pour les réactifs SBS
Compartiment de Flow Cell
Le compartiment de Flow Cell contient la platine de Flow Cell, la station thermique, le système de décompression et les connexions fluidiques menant à la Flow Cell.
Figure 3 Platine de Flow Cell
A Flow Cell
B Levier de Flow cell
La Flow Cell est positionnée sur la platine de Flow Cell, qui entre et ressort du champ d’action du module optique. Les ports d’entrée et de sortie de la Flow Cell sont orientés vers le bas et maintenus par un vide sur le portoir de Flow Cell. Le levier de Flow Cell éclairé en face du portoir de Flow Cell contrôle la décompression. Le voyant du levier de Flow Cell devient vert lorsque le joint de décompression est hermétique.
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Guide du système HiSeq 3000
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Flow Cell modélisée
La Flow Cell utilisée sur le système HiSeq 3000 est une Flow Cell modélisée comportant des milliers de nano-puits ordonnés. Les puits sont intégrés au verre de la Flow Cell et permettent de générer des amplifiats de séquençage dans un arrangement ordonné. Les amplifiats sont alignés de manière groupée, ce qui permet d’améliorer le nombre de lectures de sortie ainsi que la quantité de données générées. La Flow Cell modélisée contient huit rainures et deux témoins par rainure, et elle possède les mêmes dimensions générales qu’une Flow Cell HiSeq à débit élevé.
La Flow Cell modélisée est fournie dans la HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit et livrée sèche dans un emballage d’aluminium. Dans l’emballage d’aluminium, la Flow Cell est conditionnée dans un étui de protection à rabat en plastique.
Figure 4 Exemple d’amplifiats sur une Flow Cell modélisée
V u e d ’e n s e m b le Consommables pour le séquençage
Le séquençage sur le système HiSeq 3000 nécessite des réactifs et d’autres consommables fournis dans des trousses Illumina.
Consommables fournis par l’utilisateur
Consommable Fournisseur Utilisation
Lingettes imbibées
d’alcool isopropylique à 70 % ou
d’éthanol à 70 %
VWR, nº de référence 95041-714 Fournisseur de laboratoire général
Nettoyage de la Flow Cell et de la platine de Flow Cell.
Bonbonne, au moins 6 litres Fournisseur de laboratoire général
Préparation de la solution de lavage de maintenance.
Tubes de centrifugeuse, 250 ml Corning, nº de référence 430776 Lavage de maintenance et lavage à l’eau de
l’instrument.
Tubes coniques, 15 ml Corning, nº de référence 430052 Collecte et mesure des volumes de déchets.
Lavage de maintenance et lavage à l’eau de
l’instrument.
Tubes coniques, 50 ml, autonomes (en option)
Corning, nº de référence 430921 Stockage des Flow Cells.
Gants jetables, sans talc Fournisseur de laboratoire général
Utilisation générale.
Tissu de laboratoire peu pelucheux
VWR, nº de référence 21905-026 Nettoyage du portoir de Flow Cell.
Papier optique, 10,1 × 15,2 cm (4 × 6 po)
VWR, nº de référence 52846-001 Nettoyage de la Flow Cell.
Extrémités de pipettes, 200 µl Fournisseur de laboratoire général
Fractionnement des volumes de réactifs.
Extrémités de pipettes, 1 000 µl Fournisseur de laboratoire général
Fractionnement des volumes de réactifs.
ProClin 300, 50 ml Sigma-Aldrich, nº de référence 48912-U
Lavage de maintenance de l’instrument.
Tween 20, liquide visqueux, 100 ml
Sigma-Aldrich, nº de référence P7949
Lavage de maintenance de l’instrument.
Brucelles en plastique à bout carré
McMaster-Carr, nº de référence 7003A22
Retrait des joints de la Flow Cell.
Eau de laboratoire, 18 M Ohm Millipore Supports de réactifs SBS et PE, positions contenant du PW1.
Lavage de l’instrument.
D é m a rr e r le s y s tè m e H iS e q 3 0 0 0
Guide du système HiSeq 3000
7
Démarrer le système HiSeq 3000
1 Démarrez l’ordinateur de contrôle de l’instrument.
2 Connectez-vous au système d’exploitation à l’aide du nom d’utilisateur et du mot de passe par défaut.
• Nom d’utilisateur : sbsuser
• Mot de passe : sbs123
Patientez jusqu’à ce qu’il soit chargé. Si les valeurs par défaut ne fonctionnent pas, consultez l’administrateur de votre installation pour connaître le nom d’utilisateur et le mot de passe spécifiques de votre site.
3 Mettez l’interrupteur principal sur la position ON (activé). Lorsque vous êtes face à l’instrument, l’interrupteur se situe du côté gauche.
4 Attendez au moins une minute que les dispositifs de l’instrument soient correctement configurés et que le lecteur de l’instrument appelé DoNotEject (Ne pas éjecter)
s’initialise. Une fenêtre s’ouvre lorsque le disque est initialisé. Fermez la fenêtre. Si la fenêtre ne s’ouvre pas, regardez dans Poste de travail pour trouver le lecteur
DoNotEject (Ne pas éjecter).
REMARQUE
N’éjectez jamais le lecteur flash DoNotEject (Ne pas éjecter) situé à l’intérieur du châssis de l’instrument et ne modifiez jamais les fichiers qu’il contient. Ce lecteur contient des fichiers de configuration du matériel et s’initialise à chaque mise sous tension de l’instrument.
5 Pour assurer un espace disque adéquat, archivez sur un emplacement réseau les données issues des analyses précédentes présentes sur l’ordinateur de l’instrument.
6 Ouvrez le HiSeq Control Software (HCS) en utilisant l’icône de raccourci située sur le bureau de l’ordinateur. L’initialisation du logiciel de commande prend quelques minutes. Lorsque le logiciel est initialisé, l’écran de bienvenue s’affiche et l’icône d’initialisation apparaît dans le coin inférieur droit de l’écran.
Meilleures pratiques pour l’utilisation de l’instrument et de l’ordinateur de commande
} Ne mettez pas l’ordinateur sous tension lorsque l’instrument est en marche. Mettez toujours l’ordinateur sous tension avant d’allumer l’instrument.
} Ne mettez pas l’instrument hors tension lorsque le logiciel de commande de l’instrument est en marche.
} Attendez une minute après avoir éteint l’instrument avant de le remettre en marche.
} Branchez les câbles USB de l’instrument, du moniteur et du clavier à l’arrière de l’ordinateur avant de mettre ce dernier sous tension.
} Branchez le lecteur de codes à barres et la souris aux ports USB situés à l’avant de l’ordinateur.
V u e d ’e n s e m b le Logiciel HiSeq 3000
Trois applications logicielles sont installées sur l’ordinateur de l’instrument :
} Logiciel de commande HiSeq 3000 : l’interface du HiSeq Control Software (HCS) vous guide tout au long des étapes de configuration d’une analyse de séquençage. Au cours de l’analyse, le logiciel de commande exploite le matériel de l’instrument, contrôle la fluidique, définit les températures et présente un récapitulatif visuel des statistiques de qualité.
} Logiciel Real-Time Analysis : intégré au le logiciel de commande, Real-Time Analysis (RTA) effectue la définition de base et associe un score de qualité à chaque base pour chaque cycle. Pour en savoir plus, consultez la sectionReal-Time Analysisà la page 47.
} Logiciel Sequencing Analysis Viewer : le logiciel Sequencing Analysis Viewer (SAV) fournit des statistiques détaillées de qualité.
Interface du logiciel de commande du système HiSeq 3000
L’écran de bienvenue fournit des commandes pour démarrer une analyse de séquençage, laver l’instrument et effectuer une vérification du système. Lorsqu’une analyse est terminée, le logiciel vous invite à démarrer le lavage de l’instrument. Une fois le lavage terminé, le logiciel revient à l’écran de bienvenue.
Figure 5 Écran de bienvenue
A Bouton de menu de l’écran de bienvenue B Panneau de l’interface principale
C Indicateurs d’activité
Commandes de l’écran de bienvenue
L’écran de bienvenue comprend les commandes Séquençage, Lavage et Vérification.
} Sequence(Séquençage) : sélectionnezSequence(Séquençage) pour procéder à la configuration d’une nouvelle analyse de séquençage.
Figure 6 Options de la commande Sequence (Séquençage)
L o g ic ie lH iS e q 3 0 0 0
Guide du système HiSeq 3000
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} Wash(Lavage) : sélectionnezWash(Lavage) pour lancer un lavage à l’eau ou un lavage de maintenance de l’instrument.
Figure 7 Options de la commande Wash (Lavage)
• Water Wash(Lavage à l’eau) : le lavage à l’eau envoie de l’eau dans le système afin de le rincer. Un lavage à l’eau est requis si l’instrument n’a pas été utilisé pendant au moins un jour. Un lavage à l’eau constitue une option après une analyse de séquençage. Consultez la sectionRéaliser un lavage à l’eauà la page 41.
• Maintenance Wash(Lavage de maintenance) : le lavage de maintenance envoie du Tween 20 et du ProClin 300 dans le système pour le rincer. Ce lavage est requis tous les 10 jours et est recommandé après une analyse de séquençage. Consultez la sectionRéaliser un lavage de maintenanceà la page 38.
} Check(Vérification) : sélectionnezCheck(Vérification) pour ouvrir l’écran de vérification de la fluidique et vous assurer que le flux est correct lors de l’installation de l’instrument ou du dépannage de la fluidique.
Indicateurs d’activité et de capteurs
L’écran de bienvenue contient une série d’icônes situées en bas à droite qui indiquent l’activité de l’instrument et l’état de composants spécifiques selon les capteurs de l’instrument.
Figure 8 Indicateurs d’activité
De gauche à droite, les indicateurs d’activité représentent les moteurs X, Y et Z, la fonctionnalité de l’électronique, la caméra, le système fluidique et les fonctions de traitement.
Figure 9 Indicateurs de capteurs
De gauche à droite, les indicateurs de capteur représentent la température de la
Flow Cell A, la température du réfrigérant pour réactifs, l’état du nuage BaseSpace et la température de la Flow Cell B.
V u e d ’e n s e m b le
Icônes d’état
Une icône d’état située dans le coin supérieur droit de chaque écran présente les changements de conditions, les erreurs ou les avertissements lors des étapes de configuration de l’analyse et lors de l’analyse.
Icône d’état
Nom de l’état Description
État correct Aucun changement. Le système est normal.
Information À titre d’information. Aucune action n’est requise.
Attention Information qui nécessite peut-être votre attention.
Avertissement Les avertissements n’interrompent pas une analyse, mais ils requièrent peut-être une intervention avant de continuer.
Erreur En règle générale, les erreurs interrompent l’analyse et requièrent une intervention avant de poursuivre l’analyse.
Lorsqu’un changement de condition se produit, l’icône associée clignote afin de vous alerter. Pour résoudre l’alerte, sélectionnez l’icône afin d’ouvrir la boîte de dialogue d’état, qui contient une description générale du problème. SélectionnezAcknowledge(Accusé de réception) pour accepter le message etClose(Fermer) pour fermer la boîte de dialogue.
Menu de l’écran de bienvenue
Le bouton de menu de l’écran de bienvenue, situé en haut à gauche de l’écran de bienvenue, fournit les options suivantes :
} View(Affichage) : fournit des options permettant d’afficher l’interface en plein écran ou dans une fenêtre, ou de réduire l’interface.
} Tools(Outils) : permet d’accéder à la fenêtre Options et à l’option Show Log file (Afficher le fichier journal) :
• Options(Options) : dans la fenêtre Options (Options), définissez les paramètres d’analyse par défaut. Consultez la sectionFenêtre Options du menu.
• Show Log File(Afficher le fichier journal) : répertorie toutes les erreurs qui se produisent dans le logiciel de commande. Utilisez ce fichier journal à des fins de dépannage.
} Scanner : active la commande servant à initialiser manuellement le logiciel.
} About(À propos) : fournit des renseignements sur le matériel de l’instrument, les versions de logiciels et les coordonnées de l’assistance technique.
} Exit(Quitter) : ferme l’interface du logiciel de commande.
Fenêtre Options du menu
La fenêtre Options du menu fournit des paramètres pour définir le modèle d’identifiant d’analyse, les emplacements de dossiers par défaut, un serveur LIMS, le nom et le mot de passe de l’utilisateur, et si des renseignements sur l’état de l’instrument doivent être envoyés à Illumina.
L o g ic ie lH iS e q 3 0 0 0
Guide du système HiSeq 3000
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Figure 10 Fenêtre Options du menu
} Run ID Template(Modèle d’identifiant d’analyse) : le modèle de nom utilisé pour nommer les dossiers d’analyse.
} Default Output Folder(Dossier de sortie par défaut) : dossier de sortie par défaut.
REMARQUE
Illumina recommande un emplacement réseau pour les dossiers de sortie. Vous pouvez toutefois indiquer un emplacement sur le lecteur O:\, à condition que l’emplacement ne soit pas le même que celui du dossier HiSeq Temp. N’utilisez pas le lecteur S:\; il est réservé au fonctionnement de l’instrument.
} Default Temp Folder1(Dossier temporaire par défaut 1) : emplacement pour l’écriture des fichiers temporaires pendant une analyse. Le dossier HiSeq Temp est écrit sur le lecteur O:\.
} Run Setup Folder(Dossier de configuration de l’analyse) : emplacement des formulaires d’échantillon LIMS.
} LIMS Server(Serveur LIMS) : nom du serveur pour les interactions avec le système Illumina LIMS pris en charge.
} LIMS User Name(Nom d’utilisateur LIMS) : nom d’utilisateur utilisé lors de l’authentification sur Illumina LIMS.
} LIMS Password(Mot de passe LIMS) : mot de passe utilisé lors de l’authentification sur Illumina LIMS.
} Send instrument health information to Illumina to aid technical support(Envoyer les renseignements de l’état de l’instrument pour faciliter l’assistance technique) : autorise l’instrument à envoyer des renseignements à BaseSpace pour chaque analyse. Tous les renseignements restent confidentiels. Illumina recommande l’activation de cette fonctionnalité.
Options de suspension et d’abandon dans HiSeq 3000
Les options permettant de suspendre ou d’abandonner une analyse sur le système HiSeq 3000 sont différentes de celles de certains autres instruments HiSeq. Si vous choisissez d’arrêter une analyse, vous n’aurezpasla possibilité de reprendre l’analyse.
Pour plus de renseignements, consultez la sectionSuspendre ou arrêter une analyseà la page 61.
Espace disponible sur le disque
Au début de l’analyse, le logiciel contrôle l’espace disque disponible sur le lecteur O:\ local (lecteur de sortie). Avant qu’une analyse puisse commencer, au moins 2 To doivent être disponibles.
V u e d ’e n s e m b le
Si l’espace disque descend sous le seuil de sécurité en cours d’analyse, le logiciel interrompt l’analyse et met la Flow Cell en état de sécurité. L’analyse reprend automatiquement lorsqu’un espace disque suffisant est disponible.Illumina recommande un formatage rapide du lecteur O:\ après l’achèvement d’une analyse pour nettoyer le lecteur en vue d’une analyse ultérieure. Pour plus de
renseignements, consultez la sectionEffectuer un formatage rapide du lecteur de sortieà la page 43.
Présentation de la feuille d’échantillons
La feuille d’échantillons est un fichier au format *.csv généré par l’utilisateur et qui contient des renseignements sur l’analyse de séquençage. Lorsque l’analyse commence, le logiciel copie la feuille d’échantillons dans le dossier d’analyse, où elle sera utilisée par la suite pour l’analyse.
Les feuilles d’échantillons sont facultatives, sauf si vous utilisez BaseSpace pour effectuer l’analyse des données. Utilisez Illumina Experiment Manager (IEM) pour créer une feuille d’échantillonsavantde lancer l’analyse.
R e s s o u rc e s s u p p lé m e n ta ir e s
Guide du système HiSeq 3000
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Ressources supplémentaires
Les documents suivants sont disponibles en téléchargement sur le site Web d’Illumina.
Ressource Description
Guide de préparation du site pour les systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence 15066492_
FRA)
Fournit les spécifications relatives à l’espace du laboratoire, les exigences électriques et les considérations environnementales.
Guide de sécurité et de conformité des systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence 15066491_
FRA)
Fournit des renseignements concernant l’étiquetage de l’instrument, les certifications de conformité et les questions de sécurité.
Fichier de rapport de laboratoire HiSeq 3000 (référence 15067970)
Fournit un enregistrement interactif des types d’analyse, des numéros de lot de réactifs, des poids des réactifs et des volumes distribués pour une analyse à Flow Cell double ou simple.
Guide de référence des trousses d’amplifiats HiSeq 3000/4000 (référence 15066495)
Fournit une description des contenus des trousses d’amplifiats ainsi que des instructions pour la préparation des
consommables avant de commencer l’analyse de séquençage.
Guide de référence des trousses SBS HiSeq 3000/4000
(référence 15066494)
Fournit une description des contenus des trousses SBS ainsi que des instructions pour la préparation des consommables avant de commencer l’analyse de séquençage.
Consultez la page d’assistance du système HiSeq 3000 sur le site Web d’Illumina pour accéder à la documentation, aux téléchargements de logiciels, à la formation en ligne et aux foires aux questions.
C h a p itr e 2
Guide du système HiSeq 3000
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Chapitre 2 Réalisation d’une analyse de séquençage
Réalisation d’une analyse de séquençage
Introduction 16
Flux de travail de séquençage 17
Saisir les paramètres d’analyse 18
Charger et amorcer des réactifs 22
Charger la Flow Cell de séquençage 29
Surveiller l’analyse 33
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e Introduction
Pour effectuer une analyse sur le HiSeq 3000, préparez tous les réactifs, puis suivez les indications du logiciel pour configurer l’analyse. Les étapes de configuration de l’analyse consistent à entrer les paramètres de l’analyse, charger et effectuer l’amorçage des réactifs, charger la Flow Cell et procéder à une vérification de la fluidique.
Consultez la page des spécifications du système HiSeq 3000 sur le site Web d’Illumina pour en savoir plus sur la durée des analyses ainsi que sur les autres spécifications de performances.
Consommables pour le séquençage
Nom de la trousse du système HiSeq 3000 Nº de référence HiSeq 3000/4000 SBS Kit (300 cycles) FC-410-1003 HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) FC-410-1002 HiSeq 3000/4000 SBS Kit (50 cycles) FC-410-1001
Préparation de la Flow Cell et des réactifs
Avant de configurer l’analyse,préparez tous les réactifs nécessaires à celle-ci : réactifs SBS, réactifs d’indexage et réactifs appariés. Lors de la configuration de l’analyse, chargez tous les réactifs lorsque le logiciel vous y invite. Il n’est pas nécessaire de revenir à l’instrument au moment de l’analyse pour charger des réactifs.
Laissez la Flow Cell emballée reposer à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant de retirer l’emballage en aluminium.
Pour plus de renseignements, consultez les guides de préparation des réactifs suivants : } Guide de référence des trousses d’amplifiats HiSeq 3000/4000 (référence 15066495) } Guide de référence des trousses d’amplifiats SBS HiSeq 3000/4000 (référence 15066494)
F lu x d e tr a v a il d e s é q u e n ç a g e
Guide du système HiSeq 3000
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Flux de travail de séquençage
Préparez la Flow Cell et les réactifs en vue de l’analyse.
Consultez la sectionPréparation de la Flow Cell et des réactifsà la page 16.
Saisissez les paramètres de l’analyse en suivant les indications de l’interface du logiciel de commande.
Pesez les réactifs. Chargez les réactifs SBS pour la lecture 1 et la lecture 2, les réactifs d’indexage (le cas échéant) et les réactifs appariés.
Avec une Flow Cell utilisée, vérifiez que le flux est correct.
Amorcez les réactifs SBS et mesurez les déchets d’amorçage.
Chargez une Flow Cell HiSeq 3000/4000 modélisée en amplifiats et vérifiez que le débit est correct.
Démarrez l’analyse de séquençage.
[Facultatif]Après le cycle 2, inspectez le rapport de la première base, puis continuez la lecture 1.
Une fois l’analyse terminée, déchargez et pesez les réactifs.
Réalisez un lavage de l’instrument.
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e Saisir les paramètres d’analyse
Sur l’écran de bienvenue, sélectionnezSequence(Séquençage).
L’interface du logiciel de commande vous indique les étapes à suivre pour configurer l’analyse. Les étapes de configuration de l’analyse sont organisées dans trois onglets : Run Configuration (Configuration de l’analyse), Pre-Run Setup (Configuration avant analyse) et Initiate Run (Lancer l’analyse).
} Les écrans de configuration de l’analyse contiennent des listes déroulantes, des cases à cocher ou des champs de texte pour les paramètres de l’analyse. Utilisez le lecteur de code à barres portatif pour balayer l’identifiant de la Flow Cell ou de la trousse de réactifs, ou entrez l’identifiant à l’aide du clavier de l’écran tactile. L’icône du clavier est située à droite des champs de texte.
} SélectionnezNext(Suivant) pour passer à l’écran suivant ouBack(Retour) pour revenir à l’écran précédent.
} À tout moment pendant les étapes de configuration de l’analyse, sélectionnezCancel (Annuler) pour abandonner la configuration de l’analyse et revenir à l’écran de bienvenue.
Écran Storage (Stockage)
1 SélectionnezConnect to BaseSpacepour connecter l’analyse à BaseSpace.
2 Sélectionnez un paramètre pour BaseSpace :
• Storage and Analysis(Stockage et analyse) : envoie les données de l’analyse à BaseSpace pour une surveillance à distance et une analyse secondaire. Cette option requiert une feuille d’échantillons.
REMARQUE
Avant de sélectionner cette option, assurez-vous que votre bande passante réseau est suffisante pour envoyer des données d’analyse à BaseSpace. Pour plus de
renseignements, consultez leGuide de préparation du site pour les systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence 15066492_FRA).
• Run Monitoring Only(Surveillance de l’analyse uniquement) : envoie uniquement les fichiers InterOp à BaseSpace, ce qui vous permet de surveiller votre analyse à distance.
REMARQUE
Par défaut, le logiciel compresse les fichiers de définitions de bases (BCL) et compartimente les scores de qualité, afin de réduire l’espace de stockage utilisé. Le compartimentage des scores de qualité regroupe ces derniers selon un large éventail de valeurs sans que cela ait une incidence sur leur précision ou leurs performances.
3 Connectez-vous à BaseSpace avec l’adresse électronique et le mot de passe de votre compte MyIllumina.
4 SélectionnezBrowse(Parcourir) pour sélectionner l’emplacement de dossier de sortie de votre choix.
Il est nécessaire de préciser un dossier de sortie même si vous utilisez BaseSpace pour le stockage et l’analyse.
5 Confirmez que le réglage des miniatures estSave All Thumbnails(Enregistrer toutes les miniatures). Le logiciel enregistre automatiquement toutes les miniatures. Une miniature est un échantillon d’images en provenance de nombreuses plaques dans chaque colonne de plaques, ou témoin, combinées en une seule image miniature.
S a is ir le s p a ra m è tr e s d ’a n a ly s e
Guide du système HiSeq 3000
19
6 SélectionnezNext(Suivant).
Écran Flow Cell Setup (Configuration de la Flow Cell)
L’écran Flow Cell Setup (Configuration de la Flow Cell) contient des renseignements sur la Flow Cell utilisée pour l’analyse. Tous les champs sont obligatoires.
1 Procédez au balayage du code à barres de la Flow Cell ou saisissez l’identifiant
(numéro de code à barres) de la Flow Cell à séquencer. L'identifiant de la Flow Cell sert à déterminer le type de Flow Cell ainsi que la compatibilité des réactifs.
2 Vérifiez que le type de Flow Cell correspond àHiSeq 3000/4000 PE Flow Cell. Le type de Flow Cell est sélectionné automatiquement selon l’identifiant de la Flow Cell.
3 Saisissez le nom de l’expérience. Le nom de l’expérience apparaîtra sur chaque écran pour aider à identifier l’analyse en cours.
4 Saisissez un nom d’utilisateur.
5 SélectionnezNext(Suivant).
Écran Advanced (Paramètres avancés)
1 [Facultatif]Cochez la caseConfirm First Base(Confirmer la première base).
Un rapport de la première base est généré automatiquement pour chaque analyse après le cycle 2 et placé au niveau de la racine du dossier de l’analyse. En sélectionnant cette option, vous pouvez confirmer le rapport avant de procéder à l’analyse. Dans le cas contraire, l’analyse continue sans afficher la boîte de dialogue de confirmation.
2 [Facultatif]Sur l’image de la Flow Cell, sélectionnez toutes les rainures que vous souhaitez retirer de l’analyse. Toutes les rainures sont incluses par défaut.
REMARQUE
L’alignement PhiX s’exécute automatiquement pour toutes les rainures.
3 SélectionnezNext(Suivant).
Écran Recipe (Formule)
Une formule est générée automatiquement à partir des renseignements saisis dans l’écran Recipe (Formule).
1 Sélectionnez l’option correspondant au type d’index :
• No Index(Sans index) : effectue une analyse à lecture appariée sans index.
• Single Index(Un seul index) : effectue une analyse à lecture appariée avec une lecture d’indexage.
• Dual Index(Double index) : effectue une analyse à lecture appariée avec deux lectures d’indexage et une resynthèse des paires de bases appariées.
• Custom(Personnalisé) : effectue une analyse à lecture appariée avec un nombre personnalisé de cycles pour les lectures d’index.
2 Entrez le nombre de cycles de la lecture 1 et la lecture 2.
Si vous avez sélectionné l’option d’indexageCustom(Personnalisé), saisissez le nombre de cycles pour chaque lecture d’index. Les longueurs de lectures peuvent ne pas être identiques.
3 Vérifiez les paramètres de chimie par défaut suivants. Ces champs sont automatiquement remplis en fonction du type d’index sélectionné.
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e
a SBS :HiSeq 3000/4000 SBS Kit(Trousse SBS HiSeq 3000/4000) : indique la chimie SBS utilisée pour la lecture 1 et la lecture 2.b Index :HiSeq 3000/4000 Sequencing Primer(Primer de séquençage
HiSeq 3000/4000) ouHiSeq 3000/4000 Dual Index Sequencing Primer(Primer de séquençage à index double HiSeq 3000/4000) : indique la chimie utilisée pour les lectures d’index.
c PE turnaround(Rotation des paires de bases appariées) :HiSeq 3000/4000 PE (PE HiSeq 3000/4000) ouHiSeq 3000/4000 PE Dual Index(PE à double index HiSeq 3000/4000) : indique la chimie utilisée pour la resynthèse des paires de bases appariées.
4 Cochez la caseExisting Recipe (Formule existante) pour utiliser une formule personnalisée. Dans le cas contraire, laissez le logiciel créer une formule en fonction des renseignements que vous fournissez dans les écrans de configuration de l’analyse.
Illumina vous recommande d’utiliser l’assistant de création de formules, afin de concevoir votre formule à partir des renseignements que vous saisissez dans l’écran Recipe (Formule).
Écran Sample Sheet (Feuille d’échantillons)
Les feuilles d’échantillons sont facultatives, sauf si vous utilisez BaseSpace pour effectuer l’analyse des données.
1 SélectionnezBrowse(Parcourir) pour sélectionner l’emplacement de la feuille d’échantillons.
2 SélectionnezNext(Suivant).
Écran Reagents (Réactifs)
L’écran Reagents (Réactifs) enregistre des renseignements sur la trousse de réactifs utilisée pour votre analyse.
1 Dans le champ Reagent Kit ID (Identifiant de la trousse de réactifs), effectuez le balayage de l’identifiant de code à barres de la trousse de réactifs SBS ou saisissez-le.
2 Dans le champ PE Reagent Kit ID (Identifiant de la trousse de réactifs PE), effectuez le balayage de l’identifiant de code à barres de la trousse de réactifs PE ou saisissez-le.
3 Sélectionnez la trousse de réactifs SBS à utiliser pour l’analyse :
• Sélectionnez300 Cyclespour une trousse de 300 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 318 par défaut.
• Sélectionnez150 Cyclespour une trousse de 150 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 168 par défaut.
• Sélectionnez50 Cyclespour une trousse de 50 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 67 par défaut.
REMARQUE
Le champ Cycles Remaining (Cycles restants) est rempli automatiquement en fonction de l’identifiant de la trousse de réactifs SBS. Le logiciel effectue le décompte du nombre de cycles entrés. Lorsqu’il reste peu de cycles, le logiciel vous invite à charger de nouveaux réactifs.
4 SélectionnezPrime SBS Reagents(Amorcer les réactifs SBS) pour amorcer les réactifs.
Amorcez toujours les réactifsavantde charger une Flow Cell en amplifiats.
5 SélectionnezNext(Suivant).
S a is ir le s p a ra m è tr e s d ’a n a ly s e
Guide du système HiSeq 3000
21
Écran Review (Révision)
1 Vérifiez les paramètres de l’analyse sur l’écran Review (révision).
2 SélectionnezNext(Suivant) pour continuer ouBack(Retour) pour modifier les paramètres.
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e Charger et amorcer des réactifs
Après avoir saisi les paramètres de l’analyse, chargez les réactifs SBS, d’indexage et appariés pour l’analyse, puis amorcez les réactifs dans le système fluidique. Le logiciel vous guide dans ces étapes dans une série d’écrans de l’onglet Pre-Run Setup
(Configuration avant analyse).
Consommables fournis par Illumina
} Huit bouchons verseurs
Consommables fournis par l’utilisateur
} Flacon de 250 ml (Corning, nº de référence 430776)
} Tubes coniques de 15 ml (Corning, nº de référence 430052) } Eau de laboratoire
REMARQUE
Pour préparer le rinçage après analyse à la fin d’une analyse de séquençage, chargez 25 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire dans la position 2.
Le rinçage après une analyse ne remplacepasle lavage de l’instrument après analyse.
Charger les réactifs SBS
1 Retournez chaque flacon plusieurs fois pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés.
2 Débouchez chaque flacon de réactif et remplacez le bouchon par un bouchon verseur.
ATTENTION
Après avoir manipulé le flacon de mélange de clivage HT (HCM), jetez vos gants et remplacez-les par une nouvelle paire.
3 Enregistrez le poids de chaque réactif sur le formulaire de suivi du laboratoire.
REMARQUE
La pesée des réactifs avant et après une analyse de séquençage confirme que les réactifs sont correctement distribués.
4 Ouvrez la porte du compartiment de réactifs.
5 Relevez les dispositifs d’aspiration du support de réactifs de séquençage en procédant comme suit :
a Tirez la poignée vers vous, puis levez-la.
b Relâchez la poignée du dispositif d’aspiration dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée du dispositif d’aspiration soit bien logée dans la fente.
6 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment de réactifs.
7 Placez chaque tube de réactif sur le support, dans la position numérotée pertinente.
Veillez à ce que l’extrémité conique du flacon repose dans l’encoche située à la base du support.
C h a rg e r e t a m o rc e r d e s ré a c tif s
Guide du système HiSeq 3000
23
Position Réactif Description
1 HIM Mélange d’incorporation HT
2 PW1 25 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire
3 HSM Mélange de balayage HT
4 HB1 Tampon SBS HT 1
5 HB2 Tampon SBS HT 2
6 HB2 Tampon SBS HT 2
7 HCM Mélange de clivage HT
8 HB2 Tampon SBS HT 2
Tableau 1 Positions des réactifs SBS
8 Ajoutez 25 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire au flacon en position 2.
9 Faites glisser le support de réactifs dans le compartiment des réactifs, en alignant le support sur le guide surélevé du plancher du compartiment.
10 Abaissez les dispositifs d’aspiration dans les flacons de réactif de séquençage comme suit :
a Tirez la poignée du dispositif d’aspiration vers vous, puis baissez-la.
b Inspectez les dispositifs d’aspiration pour vérifier qu’ils ne se sont pas pliés une fois abaissés dans les bouchons verseurs.
c Relâchez la poignée du dispositif d’aspiration dans la fente située à la base de la rainure.
11 Cochez la casePW1 (25 ml) loaded(PW1 [25 ml] chargé).
Charger les réactifs d’indexage et appariés
1 Retournez chaque flacon plusieurs fois pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés.
2 Enregistrez le poids de chaque réactif sur le formulaire de suivi de laboratoire.
3 Relevez les dispositifs d’aspiration du support de réactifs apparié en procédant comme suit :
a Tirez la poignée vers vous, puis levez-la.
b Relâchez la poignée dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée demeure solidement dans la fente.
4 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment des réactifs, à l’aide de la poignée du support.
5 Placez des tubes coniques de 15 ml contenant 10 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire dans les positions 12, 18 et 19 du support apparié.
6 Retirez les bouchons sur chacun des tubes de réactifs et placez le tube sur le support dans la position numérotée pertinente ou selon l’étiquette de couleur correspondante.
Position Réactif Description
10 HRM Mélange de resynthèse HT
11 HLM2 Mélange de linéarisation HT 2
12 PW1 10 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire Tableau 2 Positions des réactifs appariées
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e
Position Réactif Description
13 HAM Mélange d’amplification HT
14 HPM Prémélange d’amplification HT
15 HDR Mélange de dénaturation HT (contient du formamide)
16 HP11 Mélange de primer, lecture 2
17 HP14* Mélange de primers dʼindexage 18 PW1 10 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire 19 PW1 10 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire
*HP14 n’est nécessaire que pour les analyses indexées. Si le HP14 n’est pas utilisé, chargez un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de PW1 ou d’eau de laboratoire.
7 Faites glisser le support de réactifs dans le compartiment des réactifs, en alignant le support sur le guide surélevé du plancher du compartiment.
8 Abaissez les dispositifs d’aspiration dans les tubes de réactifs appariés comme suit : a Tirez la poignée vers vous, puis baissez-la.
b Inspectez les dispositifs d’aspiration pour vérifier qu’ils ne se sont pas pliés une fois abaissés dans les tubes.
c Relâchez la poignée dans la fente située à la base de la rainure.
9 SélectionnezNext(Suivant).
Amorcer les réactifs
Les étapes d’amorçage des réactifs comprennent le nettoyage du portoir de Flow Cell, le chargement d’une Flow Cell d’amorçage, la vérification du flux et le lancement de l’amorçage.
Nettoyer le portoir de Flow Cell
1 Ouvrez la porte du compartiment de Flow Cell.
ATTENTION
Ne placez pas les fluides sur la porte du compartiment de Flow Cell ou sur la platine de Flow Cell quand la porte est ouverte. Renverser un produit dans cette zone peut endommager l’instrument.
2 Vérifiez que le levier de Flow Cell est en position OFF (désactivé).
Figure 11 Levier de Flow Cell en position 0
3 Enfilez une nouvelle paire de gants en latex sans talc.
C h a rg e r e t a m o rc e r d e s ré a c tif s
Guide du système HiSeq 3000
25
4 Si une Flow Cell provenant d’une analyse précédente est présente, retirez-la et mettez-la de côté dans un tube de tampon de stockage ou dans de l’eau de laboratoire pour l’empêcher de sécher. Elle peut être utilisée pour vérifier que le flux est correct avant de charger la Flow Cell en amplifiats.
5 À l’aide d’une lingette alcoolisée ou d’un tissu non pelucheux imprégné d’éthanol ou d’isopropanol, essuyez soigneusement la surface du portoir de Flow Cell jusqu’à ce qu’elle soit propre.
ATTENTION
Veillez à ce que l’alcool ne s’écoule pas dans les trous de décompression ou autour des collecteurs. Utilisez si besoin un chiffon de laboratoire peu pelucheux pour sécher la platine.
6 Inspectez le portoir de Flow Cell pour vous assurer qu’il ne contient pas de peluche et que les trous de décompression ne sont pas obstrués.
Figure 12 Emplacements des trous de décompression
Charger une Flow Cell d’amorçage
À partir de l’écran Load Priming Flow Cell (Charger la Flow Cell d’amorçage), chargez une Flow Cellutiliséepour l’étape d’amorçage. Après avoir chargé une Flow Cell utilisée, vérifiez que la décompression est en cours.
REMARQUE
Illumina vous recommande d’utiliser la Flow Cell d’une analyse précédente pour l’amorçage des réactifs en vue d’une analyse ultérieure ou d’un lavage de l’instrument post-analyse.
1 Rincez la Flow Cell utilisée avec de l’eau de laboratoire. Séchez la Flow Cell à l’aide d’un chiffon destiné au nettoyage des lunettes ou d’un chiffon non pelucheux.
2 Nettoyez la Flow Cell à l’aide de lingettes alcoolisées et d’un chiffon destiné au nettoyage des lunettes.
REMARQUE
Ne retirez pas et ne remplacez pas les joints de la Flow Cell pendant cette étape.
3 Placez la Flow Cell utilisée sur le portoir, en orientant les ports d’entrée et de sortievers le baset le code à barres vers la droite. Assurez-vous que la flèche qui indique le sens du flux, située sur le bord gauche de la Flow Cell, est orientée vers l’instrument.
4 Faites glisser doucement la Flow Cell vers les broches de guidage supérieure et de droite jusqu’à ce qu’elle s’enclenche.
REMARQUE
Retirez votre main de la Flow Cell avant d’enclencher l’interrupteur de décompression, afin d’éviter la déviation de l’alignement à terme.
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Figure 13 Flow Cell positionnée contre les broches de guidage supérieure et de droite A Broche de guidage supérieureB Broches de guidage de droite
5 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour engager la décompression et maintenir la Flow Cell en place. Lorsqu’un voyant vert clignote sur le levier de Flow Cell, la décompression est en cours. Si le voyant du levier n’est pas vert, reportez- vous à la sectionProblèmes possibles de configuration de l’analyseà la page 59.
Figure 14 Levier de Flow Cell en position 1
6 Attendez environ cinq secondes, puis passez lentement le levier de Flow Cell en position 2 (extrême droite). Lorsque le levier de Flow Cell est vert et ne clignote plus, cela signifie que les collecteurs sont en place et que la Flow Cell est prête à être utilisée.
Figure 15 Levier de Flow Cell en position 2
7 Assurez-vous de cocher la caseVacuum Engaged(Décompression en cours) dans l’écran de chargement de la Flow Cell d’amorce, puis sélectionnezNext(Suivant).
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Guide du système HiSeq 3000
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Vérifier que le flux est correct
La vérification du flux permet de confirmer que la Flow Cell et les joints sont correctement installés et que le collecteur est engagé.
1 Sélectionnez la solution 2 (laboratory-grade water [eau de laboratoire]) dans la liste déroulante.
ATTENTION
Utilisez de l’eau pour vérifier que le flux est correct sur une Flow Cell utilisée uniquement.
N’utilisez jamais d’eau pour vérifier que le flux est correct sur une Flow Cell en amplifiats.
2 Vérifiez les valeurs par défaut suivantes :
• Volume :250
• Aspirate Rate (Taux d’aspiration) :250
• Dispense Rate (Taux de distribution) :2000 3 SélectionnezPump(Pompe).
4 Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les voies et de fuites à proximité des collecteurs.
Si vous observez des bulles en excès, vérifiez que les joints ne sont pas obstrués, réduisez le taux d’aspiration à 100 et pompez 125 µl d’eau supplémentaires vers la Flow Cell. Si le problème persiste, retirez la Flow Cell, répétez les étapes de nettoyage, puis rechargez la Flow Cell.
Positionner les tubes et démarrer l’amorçage
1 Retirez les huit tubes d’évacuation du conteneur à déchets.
Ne retirez pas les tubes de la pompe de condensation ou de la pompe d’amorçage appariée.
Figure 16 Positionner les tubes
A Tubes d’évacuation de la Flow Cell pour les positions des réactifs 1 à 8 B Tubes de pompe de condensation (ne pas retirer)
C Tubes de pompe d’amorçage appariée (ne pas retirer)
2 Placez chaque tube d’évacuation dans un tube vide distinct de 15 ml. Les déchets d’amorçage sont recueillis et mesurés après la phase d’amorçage.
3 SélectionnezStart Prime(Démarrer l’amorçage). L’écran d’amorçage s’affiche et l’étape d’amorçage démarre. Vous pouvez surveiller la progression de l’étape d’amorçage depuis l’écran d’amorçage.
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e
4 Lorsque l’étape d’amorçage est terminée, mesurez les déchets d’amorçage récupérés et confirmez que le volume de chaque tube est de 1,75 ml pour un total de14 ml. Le total est calculé comme suit :
• 250 µl pour chaque position SBS, sauf pour la position 2 (250 × 7 = 1,75 ml)
• 1,75 ml pour chaque rainure (1,75 × 8 = 14 ml)
5 Enregistrez les résultats sur le formulaire de suivi de laboratoire.
6 Replacez le tube d’évacuation dans le conteneur à déchets avant de continuer.
7 SélectionnezNext(Suivant).
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Guide du système HiSeq 3000
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Charger la Flow Cell de séquençage
Les étapes pour charger la Flow Cell en amplifiats comprennent le retrait de la Flow Cell d’amorçage, le nettoyage du portoir de Flow Cell, le nettoyage de la Flow Cell, le
chargement de la Flow Cell et la confirmation que le flux est correct.
Consommables fournis par l’utilisateur
} Chiffon sec destiné au nettoyage des lunettes } Lingettes imbibées d’alcool ou d’éthanol à 70 % } Chiffon de laboratoire peu pelucheux
} Une paire de plastistats
Retirer la Flow Cell utilisée
1 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour libérer les collecteurs.
Figure 17 Levier de Flow Cell en position 1
2 Passez doucement le levier de Flow Cell en position 0 pour désengager le joint de décompression et libérer la Flow Cell.
Figure 18 Levier de Flow Cell en position 0
3 Soulevez la Flow Cell utilisée du portoir de Flow Cell.
Nettoyer le portoir de Flow Cell
1 Enfilez une nouvelle paire de gants en latex sans talc.
2 À l’aide d’une lingette alcoolisée ou d’un tissu non pelucheux imprégné d’éthanol ou d’isopropanol, essuyez soigneusement la surface du portoir de Flow Cell jusqu’à ce qu’elle soit propre.
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ATTENTIONVeillez à ce que l’alcool ne s’écoule pas dans les trous de décompression ou autour des collecteurs. Utilisez si besoin un chiffon de laboratoire peu pelucheux pour sécher la platine.
Figure 19 Inspectez les trous de décompression
3 Inspectez le portoir de Flow Cell pour vous assurer qu’il ne contient pas de peluche et que les trous de décompression ne sont pas obstrués.
Charger la Flow Cell de séquençage
REMARQUE
Ne remplacez pas les joints de collecteur.
1 Placez la Flow Cell sur le portoir, en orientant les ports d’entrée et de sortievers le bas et le code à barres vers la droite. Assurez-vous que la flèche située sur le bord gauche de la Flow Cell est orientée vers l’instrument.
2 Faites glisser doucement la Flow Cell vers les broches de guidage supérieure et de droite jusqu’à ce qu’elle s’enclenche.
Figure 20 Flow Cell positionnée contre les broches de guidage supérieure et de droite
A Broche de guidage supérieure B Broches de guidage de droite REMARQUE
Retirez votre main de la Flow Cell avant d’enclencher l’interrupteur de décompression, afin d’éviter la déviation de l’alignement à terme.
3 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour engager la décompression et maintenir la Flow Cell en place. Lorsqu’un voyant vert clignote sur le levier de Flow Cell, la décompression est en cours. Si le voyant du levier n’est pas vert, reportez- vous à la sectionProblèmes possibles de configuration de l’analyseà la page 59.
C h a rg e r la F lo w C e ll d e s é q u e n ç a g e
Guide du système HiSeq 3000
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Figure 21 Levier de Flow Cell en position 1
4 Attendez environ 5 secondes, puis passez doucement le levier de Flow Cell en position 2. Lorsque le voyant du levier de Flow Cell est vert et ne clignote pas, les collecteurs sont en place et la Flow Cell est prête à être utilisée.
Figure 22 Levier de Flow Cell en position 2
5 Assurez-vous de cocher la caseVacuum Engaged(Décompression en cours) dans l’écran Load Sequencing Flow Cell (Charger la Flow Cell de séquençage).
Vérifier que le flux est correct
La vérification du flux permet de confirmer que la Flow Cell et les joints sont correctement installés et que le collecteur est engagé.
1 Sélectionnez la solution 5 dans la liste déroulante.
2 Vérifiez les valeurs par défaut suivantes :
• Volume :250
• Aspirate Rate (Taux d’aspiration) :250
• Dispense Rate (Taux de distribution) :2000 3 SélectionnezPump(Pompe).
4 Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les voies ou de fuites à proximité des collecteurs.
Si des bulles d’air sont présentes en trop grand nombre, vérifiez qu’il n’y a pas d’obstruction dans les joints de collecteur, puis répétez le processus en utilisant la solution 6 pour éviter d’appauvrir la position 5. Réduisez le taux d’aspiration à 100, puis injectez 250 µl supplémentaires vers la Flow Cell.
5 SélectionnezNext(Suivant). Assurez-vous que le levier de Flow Cell est vert, puis fermez la porte du compartiment de Flow Cell.
6 Vérifiez que les casesVacuum Engaged(Décompression en cours) etDoor Closed (Porte fermée) sont cochées, puis cliquez surNext(Suivant).
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e
7 SélectionnezStart(Démarrer) pour lancer l’analyse de séquençage.S u rv e ill e r l’a n a ly s e
Guide du système HiSeq 3000
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Surveiller l’analyse
Surveillez les indicateurs d’analyse sur l’écran Run Overview (Aperçu de l’analyse), y compris la fluidique et l’imagerie.
Figure 23 Écran Run Overview (Aperçu de l’analyse)
A Barre de progression : surveillez le nombre de cycles effectué.
B Image de la Flow Cell : surveillez les rainures qui ont été imagées.
C Graphique de la fluidique : développez la section de la fluidique pour surveiller les étapes de la chimie.
D Configuration de l’analyse : contrôlez les paramètres de l’analyse actuelle.
E Graphique d’analyse : surveillez les scores de qualité par cycle.
F Graphique d’images : surveillez les intensités par cycle. Une seule image miniature est affichée pour chaque témoin numérisé. Toutes les autres images n’apparaissent pas dans l’interface du logiciel.
Rapport de la première base
Si vous avez sélectionné l’optionConfirm First Base(Confirmer la première base) lors de la configuration de l’analyse, la boîte de dialogue de confirmation de la première base s’ouvre automatiquement une fois l’imagerie du deuxième cycle terminée. L’analyse s’interrompt à cette étape.
1 Révisez le rapport de la première base dans la boîte de dialogue de confirmation.
2 Si les résultats vous conviennent, sélectionnezContinue(Continuer).
Visualiseur d’analyse de séquençage
Le visualiseur d’analyse de séquençage affiche des indicateurs de séquençage générés au cours de l’analyse de séquençage. Les mesures apparaissent sous forme de tracés, de graphiques et de tableaux. Le visualiseur d’analyse de séquençage s’ouvre
automatiquement une fois que les indicateurs d’analyse sont disponibles.
SélectionnezRefresh(Actualiser) à tout moment pendant l’analyse pour afficher les indicateurs métriques à jour.
Pour plus de renseignements, consultez leGuide de l’utilisateur du visualiseur d’analyse de séquençage (référence 15020619).
R é a li s a ti o n d ’u n e a n a ly s e d e s é q u e n ç a g e
Procédures après analyse
Une fois l’analyse terminée, déchargez et pesez les réactifs, puis effectuez un lavage de l’instrument. Pour en savoir plus, reportez-vous à la sectionProcédures après analyseà la page 35.
C h a p itr e 3
Guide du système HiSeq 3000
35
Chapitre 3 Procédures après analyse
Procédures après analyse
Introduction 36
Décharger et peser des réactifs 37
Réaliser un lavage de maintenance 38
Réaliser un lavage à l’eau 41
Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie 43
Inactivité de l’instrument 44
Arrêter l’instrument 45
P ro c é d u re s a p rè s a n a ly s e Introduction
Les procédures après analyse comprennent le retrait et la pesée des réactifs, ainsi qu’un lavage de l’instrument. Un lavage à l’eau est requis après chaque analyse, mais vous pouvez effectuer un lavage de maintenance à la place. Illumina recommande un lavage de maintenance.
Les lavages réguliers de l’instrument assurent des performances continues de la manière suivante :
} Rinçage de tous les résidus de réactif et d’échantillon des tubes fluidiques et des dispositifs d’aspiration.
} Prévention de l’accumulation de sel et de la cristallisation dans les tubes fluidiques et les dispositifs d’aspiration.
} Prévention de la contamination croisée par l’analyse précédente.
REMARQUE
Un lavage à l’eau est réalisé à la fin de chaque analyse dans le but de laver le système et de vérifier la fluidique. Lors de la configuration d’une analyse, le logiciel vérifie qu’un lavage à l’eau ou un lavage de maintenance a été effectué dans les dernières 24 heures. Un lavage de maintenance est requis tous les 10 jours. Lorsque le délai de 10 jours s’est écoulé après le dernier lavage de maintenance, le logiciel vous invite à en effectuer un autre.
D é c h a rg e r e t p e s e r d e s ré a c tif s
Guide du système HiSeq 3000
37
Décharger et peser des réactifs
REMARQUE
Traitez les réactifs comme des déchets chimiques. Mettez au rebut les réactifs conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région.
1 Ouvrez la porte du compartiment de réactifs.
2 Relevez les dispositifs d’aspiration du support de réactifs SBS et du support apparié en procédant comme suit :
a Tirez la poignée du dispositif d’aspiration vers l’extérieur.
b Soulevez la poignée du dispositif d’aspiration tout en la tirant vers l’extérieur.
c Relâchez la poignée du dispositif d’aspiration dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée du dispositif d’aspiration demeure de manière sécurisée dans la fente.
3 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment des réactifs, à l’aide de la poignée du support.
4 Retirez chaque flacon du support de réactifs et enregistrez le poids sur le formulaire de suivi de laboratoire.
Consultez la page d’aide de HiSeq 3000 sur le site Web d’Illumina pour télécharger un formulaire de suivi de laboratoire interactif.
AVERTISSEMENT
Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région.Pour plus de renseignements, consultez la fiche signalétique de cette trousse, à votre disposition sursupport.illumina.com/sds.html.
P ro c é d u re s a p rè s a n a ly s e Réaliser un lavage de maintenance
Le lavage de maintenance est requis tous les 10 jours, mais est facultatif après une analyse de séquençage. Illumina vous recommande d’effectuer un lavage de maintenance après chaque analyse de séquençage.
L’écran Load Gasket (Charger le joint) s’ouvre et vous invite à effectuer un lavage de maintenance tous les 10 jours. Remplacez les joints dans les collecteurs avant et arrière avant d’effectuer le lavage.
Un lavage de maintenance dure environ deux heures et demie et consiste à laver le système à l’aide d’une solution préparée de Tween 20 et de ProClin 300.
Consommables fournis par l’utilisateur
} Lingettes imbibées d’éthanol
} 8 flacons de 250 ml (Corning, nº de référence 430776) } 10 tubes de 15 ml (Corning, nº de référence 430052) } Eau de laboratoire
} ProClin 300 (Sigma-Aldrich, nº de référence 48912-U) } Tween 20 (Sigma-Aldrich, nº de référence P7949)
Préparer la solution de lavage de maintenance
Préparez 5 litres de solution de lavage de maintenance pour l’utilisation sur un instrument.
La solution peut être conservée jusqu’à 30 jours à température ambiante et être utilisée jusqu’à 3 fois pendant cette période.
1 Préparez 250 ml de Tween 20 à 10 % en combinant les volumes suivants et en ajoutant d’abord l’eau :
• Eau de laboratoire (225 ml)
• Tween 20 (25 ml)
2 Placez un barreau d’agitateur dans une bonbonne vide ayant une contenance minimale de six litres.
3 Combinez les volumes suivants dans la bonbonne, en versant d’abord l’eau :
• Eau de laboratoire (750 ml)
• Tween 20 à 10 % (250 ml)
• ProClin 300 (1,5 ml)
Ces volumes donnent environ une solution de Tween 20 à 2,5 % et une solution de ProClin 300 à 0,15 %.
4 Placez la bonbonne sur une plaque d’agitation et agitez jusqu’à ce que la solution soit parfaitement mélangée.
5 Ajoutez à la solution quatre litres d’eau de laboratoire. Ces volumes donnent environ une solution de Tween 20 à 0,5 % et une solution de ProClin 300 à 0,03 %.
6 Continuez l’agitation jusqu’à ce que la solution soit parfaitement mélangée.
7 Mettez-la de côté dans un conteneur fermé et à température ambiante jusqu’à ce que vous soyez prêt à remplir les tubes et les flacons de réactifs de solution de lavage ou à les réapprovisionner.
