Cuvillier , B. O. Malavaud Soulié , Lunardi , J.-B. Beauval , M. Roumiguié ,M. P. receptor expression Mechanisms of castration resistance: Intratumoral hypoxia stimulates theandrogen du récepteur aux androgènes intratumorale stimulel’expression Mécanismes

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ARTICLE ORIGINAL

Mécanismes de résistance à la castration : l’hypoxie intratumorale stimule

l’expression du récepteur aux androgènes

Mechanisms of castration resistance: Intratumoral hypoxia stimulates the androgen receptor expression

P. Lunardi

^a^,∗

, J.-B. Beauval

^a

, M. Roumiguié

^a

, M. Soulié

^a

, O. Cuvillier

^b

, B. Malavaud

^a

aDépartementd’urologie,d’andrologieetdetransplantationrénale,1,avenueJ.-Pouilhès, 31059Toulouse,France

bInserm,institutdepharmacologieetdebiologiestructurale,205,routedeNarbonne, 31077Toulouse,France

Reçule26février2015;acceptéle7janvier2016 DisponiblesurInternetle16février2016

MOTSCLÉS Cancerdela prostate; Hypoxie; Sphéroïdes tumoraux; Récepteuraux androgènes

Résumé

But.—L’expressiondesgènesdépendantdel’hypoxiecontrôlel’adaptationdumicroenvironnement à l’initiation, la promotionet la progression tumorale. L’objectif de l’étude était d’observerl’inﬂuencedel’hypoxiesurl’expressiondurécepteurauxandrogènes(RA),àl’aide d’un modèle original de sphéroïdesmulticellulaires obtenus àpartir de cellules tumorales prostatiqueshormono-indépendantes.

Matériel.—Deux lignées cellulairesd’adénocarcinome prostatique de faiblesensibilité aux androgènesontétéutiliséesaﬁndegénérerdessphéroïdestumorauxmulticellulaires(STM).

Lesconditionsetladuréed’incubationconditionnaientlatailledéﬁnitivedesSTM etlegra- dientd’hypoxieintrinsèque.L’expressionduRAétaitétudiéeparimmunohistochimie(IHC)et lasécrétiondePSAdoséedanslemilieudeculture.

Résultats.—LemarquageIHCduRAétaitcaractériséparungradientdécroissantdelapéri- phérie verslecentredesSTM (moinsintenseenzonecentralehypoxique), correspondantà unetranslocationnucléaireduRAactivé.Cegradientétaitd’autantplusmarquéqueladurée d’incubationenmilieuhypoxiqueétaitprolongée.L’hypoxieentraînaituneaugmentationsigni- ﬁcativedel’expressionduRAà6hdeprivationd’oxygène.CetteactivationduRAétaitcorrélée

∗Auteurcorrespondant.

Adressee-mail:lunardi.p@chu-toulouse.fr(P.Lunardi).

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àune augmentation de l’activitétranscriptionnelle desgènes cibles, avec notamment une sécrétionaccruedePSA.

Conclusion.—Cette démonstration de l’activation, de l’augmentation d’expression et de l’activitétranscriptionnelledurécepteurauxandrogènesparl’hypoxieestlapremièreàavoir étéfaiteavecunmodèleoriginald’hypoxieplusprochedelaréalitéquelesmodèlesprécé- dents,c’est-à-direprochedel’hypoxietissulaireobservéedanslestumeursprimitives.

Niveaudepreuve.— 4.

KEYWORDS Prostatecancer;

Hypoxia;

Tumorspheroids;

Androgenreceptor

Summary

Purpose.—Tumor hypoxiaanditsbiologicalconsequence lead tomicroenvironmentadapta- tionoftumorinitiation,promotionandprogression.Theaimofthestudywastoobservethe inﬂuenceofhypoxiaontheexpressionoftheandrogenreceptor(AR),usinganoriginalmodel ofmulticellularspheroidsobtainedfromcastration-resistantprostatetumorcells.

Material.—Twohumancastration-resistantprostatecancercelllineshavebeenusedtogene- ratemulticellulartumorspheroids(MTS).Theconditionsanddurationofincubationmodulated theﬁnalsizeoftheMTSandtheintrinsichypoxiagradient.TheexpressionofARwasstudied byimmunohistochemistry(IHC)andsecretionofPSAmeasuredintheculturemedium.

Results.—TheIHCexpressionofARwascharacterizedbyadecreasinggradientfromtheper- ipherytothecenterofMTS(lessintenseincentralhypoxiczone),correspondingtoanuclear translocationofactivatedAR.Thisresultwasproportionallycorrelated withthedurationof hypoxicincubationperiod.HypoxiacausedsigniﬁcantincreaseinARexpressionat6hofoxy- gendeprivation.ThisactivationofARwascorrelatedwithtranscriptionalactivityincreaseof targetgenes,includingincreasedsecretionofPSA.

Conclusion.—Thisdemonstrationofactivation,increasedexpressionandincreasedtranscrip- tionalactivityofARbyhypoxiaistheﬁrsttohavebeenmadewithanoriginalmodelofhypoxia, closertorealitythanpreviousmodels,i.e.closetotissuehypoxiaobservedinprimaryprostate cancer.

Levelofevidence.— 4.

Introduction

Leconceptdecancerdeprostaterésistant àlacastration (CPRC)aaujourd’huisupplantéceluid’hormono-résistance car il a été observé, dans les conditions de suppression androgénique,quel’activitédesrécepteursauxandrogènes (RA)persiste ouestréactivée.Plusieurstravaux mesurant l’activitéduRAoul’expressiond’enzymesimpliquéesdans lesvoiesdelasynthèsedesandrogènesontpermisdemettre enévidencediversmécanismesmoléculairespouvantexpli- querlaréactivationduRAdansleCPRC[1,2].

L’hypoxie est caractéristique des tumeurs solides, et ses conséquences (expression des gènes dépendant de l’hypoxie)contrôlent l’adaptationdumicroenvironnement à l’initiation, la promotion et la progression tumorale [3,4]. Il est actuellement établique les facteurs clefs de l’adaptationaustresshypoxiquesontlesfacteursdetrans- cription inductibles par l’hypoxie ou Hypoxia Inductible Factors(HIF)[5,6].Lefacteur HIF-1␣est surexprimédans denombreuxcancers: la proliférationrapide des cellules

tumoralesetlamauvaisearchitecturedusystèmevasculaire tumoralentraînentlaformationdezoneshypoxiquesausein delatumeurpermettantlastabilisationdessous-unités␣.

Cettesurexpressionestcorréléeàunmauvaispronosticet àunéchecdelaradio-etchimiothérapie[7].

Un des effets les plus précoces de la privation d’androgènes s’observe au niveau des capillaires prosta- tiquesentraînant de manièretrès rapide une hypoxiepar diminutiondudébitsanguinauniveaulocal[8].Cependant, au-delàd’unepériodevariabledeprivationandrogénique, onassisteàune diminutiondel’hypoxie localedueà une néo-angiogenèse elle-même médiée par l’hypoxie [9]. En effet,auniveauprostatique,l’hypoxieentraîneunestabili- sationdeHIF-1quipeutalorsselieràl’élémentderéponse àl’hypoxie(HRE)situésurlesgènesciblesinductiblespar l’hypoxie,entraînant l’activationtranscriptionnelledeces derniers [10]:onassiste alorsà unesynthèse devascular endothelialgrowthfactor(VEGF)ainsiqu’uneaugmentation del’activitétranscriptionnelleduRA,d’autantplusimpor- tantequ’elleestsuivieinvitrod’uneré-oxygénationmimant

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lanéo-angiogenèse[11].Mitanietal.[12]ontdémontrésur unmodèle2Dqu’àunefaibleconcentrationdeDHTmimant lestadederésistanceàlacastration,l’hypoxie augmente latransactivationliganddépendantduRAviaHIF-1.Cepen- dant,cestravauxportentsurl’étudedelignéescellulaires tumoralesenmonocouche,c’est-à-diredansdesconditions decroissancesensiblementdifférentesdelacroissancetis- sulaire.

L’objectif de l’étude était d’observer l’inﬂuence de l’hypoxie sur l’expression du RA sur un modèle 3D plus prochedelaréalité,enseservant dumodèleoriginaldes sphéroïdestumorauxmulticellulaires(STM)obtenusàpartir decellulestumoralesprostatiquesimmortalisées.

Matériel et méthodes

Cultures cellulaires et génération des sphéroïdes

Leslignéeshumainesd’adénocarcinomeprostatique22Rv1 (sociétéATCC,Molsheim,France)etC4-2B(sociétéViromed Laboratories,Minnetonka,États-Unis),parordredécroissant desensibilitéauxandrogènes,étaientutilisées.Leslignées cellulaires étaient cultivées enmilieu RPMI(Roswell Park MemorialInstitutmedium,Lonza)supplémentéà10%deSVF (sérum deveau fœtal,Gibco)dansdes ﬂasquesde75cm³ (Corning).

Pour générer des sphéroïdes, les cellules cultivées en monocouche étaient détachées par protéolyse à la tryp- sine aﬁn de générer une suspension de cellules isolées, etréparties dans des puits individuelssur des plaques de 96puits(1000cellulesparpuits,dansunvolumede100␮l).

Laformationdessphéroïdesétaitalorsinitiéeparcentrifu- gationdesplaquesà1200rotationparminute(rpm)pendant 6min. Cette méthode permettait d’obtenir dans chaque puits un sphéroïdedont lavariation detaille était quasi- ment nulle. Les plaques étaient enfin incubées dans des conditionsdeculturestandardà37^◦C,5%deCO2dansdes incubateurshumidifiés,enmilieuRPMIpendant7et14jours afin d’obtenirdes sphéroïdesd’environ 400et900microns (±10%)respectivement.

Conditions expérimentales 2D

Lesconditionsexpérimentalesdeculture cellulairemono- coucheétaientréaliséesparensemencementdeplaquesde 10cmdediamètre.Lorsdupassagedescellules,onréalisait uncomptagecellulairesurlamedeNeubaueraprèsrécupé- rationducontenudesﬂasquesaﬁnd’ensemencerlesplaques dans du milieu RPMI supplémenté en SVF. Vingt-quatre heuresaprès,onréalisaitalors2conditionsexpérimentales pourchaquelignée:

• culturedansunechambreàhypoxie(0,01%O2,5%CO2, 37^◦C)pendant6heures(2plaquesparlignée)et24heures (2plaquesparlignée);

• contrôle normoxiqueavec culture enmilieu standard à 6et24heures.

Lescellules étaientgrattées,centrifugées à400g pen- dant3minà4^◦C,puislesculotscongelésimmédiatement pour analyse ultérieure par western blot de l’expression protéiquedeHIF-1␣etRA.

Conditions expérimentales 3D

Lesplaquesdesphéroïdesétaientcultivéesennormoxieou enhypoxie:

• cultureennormoxiedessphéroïdesrécupérésetﬁxésà J7etJ14;

• cultureenhypoxiedesphéroïdesàJ7deleurcroissance pendant 30min, 3heures, 8heures et 24heures avant récupérationetﬁxation.

Avant la récupération, chaque sphéroïde était incubé 2heures à 37^◦C avec du pimonidazole (Hypoxyprobe^®), unesondechimiquesefixantdemanièrepréférentielleau niveaudeszoneshypoxiques.Lessphéroïdesgénérésetmis encultureétaientprélevésàlapipettedans chaquepuits auxdifférentstempsprécédemmentdécrits.Aprèslavage, laprocéduredifféraitselonlatechniqued’analyseIHCulté- rieure: fixation à la formaline (Sigma) pendant 2h à 4^◦C pourcryosection (5␮m), oufixation au paraformaldéhyde (PFA,Sigma)pendant1h30à4^◦C,pourmiseenparaffineet réalisationdecoupesde3à5␮métaléessurlamedeverre.

Afin de réaliser les marquages immunohistochimiques (IHC), lescoupes de sphéroïdes étaléessur lames étaient réhydratées 30min dans du PBS 1X, post-fixées 20min à laformaline,lavéesànouveau 15minau PBS1X, bouillies 30min au tampon citrate 10mmol/L (pH6) si la restitu- tiond’antigénicitéétaitnécessaire,pré-incubéesdansune solutionde blocage (BSA 1% etTriton 0,5% dans PBS 1X) pendant 45min, incubées avec l’anticorps primaire pour la nuit puis avecl’anticorps secondaire pendant 1heure, etenfinincubéesau DAPI0,1␮g/ml pendant10min (marquage des noyaux) avant montage sur lame. Les lames étaienttraitéesavecdifférentsfluorochromesetanticorps primairesafind’étudierparimmunofluorescence:DAPI(ADN cellulaire), anticorps anti-PARP clivée (apoptose), anticorpsanti-Ki67(prolifération),anticorpsanti-pimonidazole (Hypoxyprobe^®), anticorps anti-RA (récepteur aux andro- gènes). Leslames ont enfin été observées au microscope optiqueclassique(Tableau1).

Dosage du PSA sécrété par les sphéroïdes

Aumomentdelarécupérationdes sphéroïdesàJ7deleur croissance après culture en normoxie ou en hypoxie, le liquide surnageant était prélevé dans chacun des puits (100␮L par puits). Le surnageant de 20sphéroïdes était additionnéaﬁnd’obtenir unequantitédeliquidesufﬁsant (2mL)pour réaliser un dosage duPSA sur automate,puis congeléavantanalyse.

Critères d’évaluation

L’existence d’une hypoxie intrinsèque au sein des sphé- roïdeslesplusvolumineuxaétéévaluéeparl’existenced’un gradientdemarquageentrelecentreetlapériphérie,c’est- à-direuneﬁxationplusimportantedesmarqueursd’hypoxie etd’apoptose aucentre dusphéroïdeetau contraireune ﬁxation plus importante des marqueurs de prolifération cellulaireenpériphérie. Les expériencesIHC ontcherché à mettre en évidence une corrélation entre l’hypoxie et l’expressionduRAenobservantlesconcordancesdeloca- lisation des marquages aux anticorps. L’anticorps anti-RA

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Tableau1 Anticorpsutilisésenimmunohistochimie(IHC)surcoupecongelée.

Prolifération Apoptose Hypoxie RA

Anticorps KI67(H-300)Santa Cruz

PARP-1(Cleavedp25) Epitomics

Hypoxyprobe-1PlusKit AR441Abcam Cible(Pm) KI67(395kDa) PARPc(25kDa) pO2<10mmHg RA(110kDa) Acprimaire(dilution) IgG(1/100) IgG(1/500) IgG(100mMolincubé2h) IgG(1/25) Acsecondaire

(dilution)

Texasredanti-rabbit (1/400)

FITCgreenanti-mouse (1/100)

Texasredmouse (1/400)

utiliséétait dirigé contre unépitope situé sur lazone de changementconformationnelleduRAlorsqu’ilestactivéet transloquédanslenoyau.Lorsqu’unmarquagedifférentiel étaitretrouvé,undémasquagedes antigènesétaitréalisé afin d’affirmer que la disparition du marquage était bien dueàunemodification deconformationduRA.Desexpé- riencesdemiseenhypoxiedesphéroïdesintrinsèquement non hypoxiques ont été réalisées pour recréer artificiel- lement ces résultats, et observer l’effet de la durée de miseenhypoxiesur la modificationdu marquage (utilisa- tiondulogicielNDPView,mesurantl’épaisseurmoyennede lazone marquéedans unesériedesphéroïdesplacésdans lesmêmeconditions).Delamêmefaçon,l’influencedela duréed’hypoxiesurl’expressiondelaquantitédeprotéines RAaétéévaluéeparwesternblot,ainsiquelasécrétionde PSAdanslesurnageant.

Analyse statistique

La signiﬁcativité statistique des résultats a été évaluée grâce au test de Student. La signiﬁcativité a été admise lorsquep<0,05,etlescalculsontétéréalisésà l’aidedu logicielPrism(GraphPad).

Résultats

Résultats immunohistochimiques (IHC)

Lessphéroïdesétaientsortisdeleurmilieudecultureetmis enlameàJ7etJ14aﬁnd’obtenir2groupesdetaillediffé- rente:environ400␮mpourlesJ7,etenviron900␮mpour lesJ14. Pourlessphéroïdesà J7, iln’existait pasdegra- dient deprolifération ou d’apoptose: le marquage PARPc (apoptose) et pimonidazole (hypoxie) étaient nuls, tandis quelemarquageKI67(prolifération)étaithomogène.Pour lessphéroïdesàJ14, lesmarquagesontpermis demettre enévidenceungradientdeproliférationavecleKI67,ainsi qu’un gradient d’apoptose avec PARP clivée (Fig. 1). Ce gradientdeproliférationetd’apoptoseétaitcorréléàune moindredisponibilitéenoxygèneaucentredessphéroïdes, demanièreintrinsèquelorsquelatailledeceux-cidépasse les500␮menviron.Ainsilesmarquagesd’apoptoseparPARP clivéeetd’hypoxieparpimonidazoleétaientsuperposables aucentredusphéroïde(Fig.2).

Ilexistaitauseindessphéroïdesunecorrélationinverse observée entre marquage du RA et hypoxie. Pour les sphéroïdes à J7 (<500␮m, sans gradient d’hypoxie), un marquagehomogèneparl’anticorpsanti-RAétaitretrouvé danslesphéroïde.Iln’existaitpasdegradientdemarquage

d’hypoxie, de prolifération, d’apoptose ou de RA, quel que soitle typecellulaire,pour unetaille de 400microns (résultats non présentés). À l’inverse pour les sphéroïdes àJ14(>750␮m),ungradient demarquagedécroissant de la périphérieversle centre aétéétabli pourl’expression duRA,moinsintenseenzone centralehypoxique(Fig.3).

Lemarquage redevenaithomogèneaprèsdémasquage des antigènes (échantillons bouillis dans du tampon citrate pH6pendant30min)quiendéstructurantlesprotéinesde leurconformation3Drendaitànouveauaccessibleauxanti- corpsdesépitopesmasquésjusqu’alors(Fig.4).

LessphéroïdesàJ7(nonhypoxiques)étaientensuitepla- césdansuneenceinteàhypoxieetrécupérésà30min,3h, 8h et24h.Seulslessphéroïdesà24hd’hypoxien’ontpas pu être récupérés car ils étaientdélités pardésolidarisa- tiondescellules.Aprèsinclusionenparafﬁne,lesmarquages d’hypoxie etdu RAétaientréalisésaux différents temps.

Plus les sphéroïdes étaient exposés à une hypoxie, plus le gradient de marquage du RA s’accentuait: les cellules lesplus centralesperdaient le marquage rapidement(dès 30min) et cette zone s’étendait au fur et à mesure que l’hypoxieperduraitducentreverslapériphérie.Nousavons regroupé plusieurs sphéroïdes récupérés chacun à 30min, 3het8hrespectivementaﬁnd’analyserlesimagesàl’aide dulogicielNDPView. L’épaisseurmoyennedelacouronne périphérique exprimantle marquage duRAétait mesurée pour5sphéroïdesàchaquecondition(Fig.5 et6).

Analyse des protéines

Pour chaque condition expérimentale deculture standard 2D(normoxie6het24h,hypoxie6het24h),l’analysedes protéines par western blot a permis d’étudier les varia- tions d’expressiondu RAetdeHIF-1␣, principalreﬂet de l’hypoxie.

Lacomparaisonde l’expression duRA etde HIF-1␣ en normoxie(Nx)etenhypoxie(Hx) selonlesconditionspré- cédemmentdécrites,montraitquel’hypoxie entraîneune augmentation de HIF-1␣ proportionnelle à sa durée. En comparaisonaveclesconditionsnormoxiques,l’expression duRAdanslalignéeC4-2Bétaitaugmentéede80%après 6hd’hypoxieetrestestableà24hd’hypoxie(Fig.7).Dans la lignée 22rv1, l’expression du RA était augmentée de 40% après 6h d’hypoxie et diminuait de 30% après 24h d’hypoxie.

Dosage du PSA sécrété

Aﬁn de corréler cette expression différentielle du RA en zone hypoxique à une augmentation de l’activité

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Figure1. CoupesdesphéroïdesC4-2BàJ7(àgauche)etJ14(àdroite):marquagedeprolifération(Ki67).J7(400␮m):grossissement 20×.A.MarquageDAPI(noyaux).B.Marquagedeprolifération(Ki67).C.Fusiondesimages.J14(900␮m):grossissement10×.D.Marquage DAPI(noyaux).E.Marquagedeprolifération.F.Fusiondesimages.

transcriptionnelle, l’effetdel’hypoxie surla sécrétionde PSApar lessphéroïdes étaitobservé. LePSA étant sécré- téepar lescellulesprostatiquesenréponse àl’activation dupromoteur dugène cible aprèstranslocation nucléaire duRAactivé,lafaisabilitédecedosagedanslemilieu de culturesurnageantdessphéroïdesatoutd’abordétévéri- ﬁé,enconditionnormoxiqueàJ7etJ14,etencontrôlant l’absence de l’enzyme en situation basale dans le milieu deculture(RPMI1640+10%SVF):leliquidesurnageantdes STM22rv1contenaituntauxdePSAégalà31ng/mLàJ7et 213,7ng/mL à J14; le liquide surnageant des STM C4-2B contenaitquantàluiuntauxdePSA1141ng/mLàJ7etde 8102,5ng/mLàJ14.

Puiscedosageétaitréaliséensituationhypoxiquedansle surnageantdesphéroïdesC4-2BàJ7(intrinsèquementnon hypoxiques).Cesderniersétaientplacésdansuneenceinte àhypoxieetprélevésà30min,3h,8het24h.Pourchaque condition,lemêmedosageétaitréaliséàdestempsiden- tiquessur des surnageant desphéroïdes àJ7encondition

normoxique. Il existait une augmentation signiﬁcative de sécrétion du PSA par les sphéroïdes placés en hypoxie à partirde3h(p<0,005)comparativementaugroupetémoin normoxique(Fig.8).

Discussion

Le modèle des sphéroïdes tumoraux multicellulaires (STM)

Lacroissancetumoraleintègredanssadynamiquedesinter- actionscomplexes entrecellulestumorales,évoluantdans unenvironnementbiochimiqueétroitement dépendantde laproximitéd’unevascularisationefﬁcace(pH,pPO2,nutri- ments). Les mécanismes de contrôle du cycle cellulaire sontégalementtributairesdesinteractionscellule—cellule etcellule—matriceextracellulaire [13].Diverses avancées technologiques permettent aujourd’hui de reproduire en

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Figure2. CoupesdesphéroïdesàJ14issusdeslignées22rv1(àgauche)etC4-2B(àdroite).A.MarquageDAPI.B.Marquagedeszones hypoxiquesparlepimonidazole(vert).C.MarquagedeszonesapoptotiquesavecPARPclivée(rouge).Grossissement10×.

culture certaines des étapes fondamentales de la crois- sancetri-dimensionnelle[14].LesSTMpermettenteneffet d’étudierlesinteractions(entre cellules ouentrecellules etmatriceextracellulaire)dansunmodèle3Dreproduisant en culture une grande partie de la complexité tumorale.LesSTMlorsqu’ils atteignentune taille supérieureà 500microns, élaborent un gradient progressif de cellules enproliférationsimilaireàceluiobservédanslesmicroré- gionsnonvasculariséesd’unetumeuretdesesmétastases [15].Lescellulesendivisionsontsituéesdans lescouches extérieuresetlescellulesquiescentesdans larégioncen- traleavecunepression partielleenoxygèneetunapport ennutrimentmoindres.Ce modèlepermetdoncd’étudier l’hypoxieàuneéchelleplusprochedumodèletissulaireque cellulaire.

Si les STM intègrent les interactions intercellulaires et un gradient de disponibilité en oxygène et en nutri- ments, ils n’intègrent pas les interactions entre cellules et stroma/matrice extracellulaire rencontrées dans les tumeurs solides primitives. De même, il n’existe aucune structurevasculaireauseindessphéroïdes,etl’onconnaît l’importancedesinteractions entrevaisseauxettumeurs.

Ceci constitue donc encore la principale limite de ce modèle. L’absence de vascularisation peut cependant constituerunmodèleprochedecertainesmicro-métastases osseusesprostatiques,avasculairescarn’ayantpasencore développédenéo-vaisseaux.

Relation entre récepteur aux androgènes (RA) et hypoxie

Lesétudes IHCmenées surles sphéroïdesà J7 (<500␮m, sans gradient d’hypoxie) et J14 (>500␮m, avec gradient d’hypoxie) mettaient en évidence un marquage différen- tielduRAprédominantenzonenonhypoxique.Cegradient d’expression du RA sur les sphéroïdes à J14avait une épaisseur moyenne d’environ 200␮m, ce qui correspond à la profondeur maximale de pénétration tissulaire de l’oxygène:ilexistaitdoncuneprobablerelationdecauseà effetentrehypoxieetexpressionduRAàceniveau.Cette

«disparition»dumarquage duRAenzonehypoxique pou- vaitêtreinterprétéededeuxfac¸ons:puisqu’àl’étatbasal le RAmonomérique est ensituation cytoplasmique et en attented’unligand,soitleRAétaitmoinsprésentauniveau

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Figure3. CoupesdesphéroïdeC4-2BàJ14sansdémasquagedesantigènes.A.DAPI(bleu).B.Hypoxie(vert).C.RA(rouge).D.Fusiondes imagesBetC.Grossissement10×.

descellulescentraleshypoxiques,soitl’épitopequerecon- naîtl’anticorpsanti-RA étaitmoinsaccessibleàceniveau enraisond’unchangementdeconformation(dimérisation) et/oud’unetranslocationnucléaireparactivationdurécep- teur.Cettehypothèseétaitétayéeparlefaitquel’épitope reconnuparl’anticorpsutilisésesitueauniveaududomaine N-terminal(NTD)durécepteur participantau changement

destructure3Ddelaprotéinelorsdesonactivation.Lorsque l’expérienceétaitrenouveléeendémasquantlesépitopes, onconstataitlaréapparitiondumarquage.LeRAétaitdonc bienprésentauniveaudeszoneshypoxiques,maismassive- mentactivéàceniveauettransloquéauniveaudunoyau.

Cesrésultats étaientappuyés parla mise enhypoxie des sphéroïdesàJ7:onobservaitunediminutionprogressivedu

Figure4. CoupesdesphéroïdesC4-2BàJ14avecdémasquagedesantigènes.A.DAPI(bleu).B.Hypoxie(vert).C.RA(rouge).Grossissement 10×.

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Figure5. CoupesdesphéroïdesC4-2BàJ7aprèsmiseenhypoxie 30min,3het8h.LesimagesontététraitéesaveclelogicielNDP Viewaﬁndemesurerl’épaisseurdelazoneexprimantleRAenfonc- tiondeladuréedemiseenhypoxie,etdecomparerl’évolutionde cetteépaisseur avec5sphéroïdes pourchaque tempsd’hypoxie.

Cetteﬁgurenemontrequ’unexempledechaque.A.Marquagedu RAaprès30mind’hypoxie.B.MarquageduRAaprès3hd’hypoxie.

C.Marquage du RA après 8hd’hypoxie. Grossissement 20×. Les sphéroïdeslaissés24henhypoxien’ontpaspuêtrerécupéréscar désagrégés.

marquageduRAaucentredusphéroïdeproportionnelleàla duréedemiseenhypoxie.

Enplusdel’activationduRA,lesétudes2Dmontraient quantàellesquel’hypoxieentraînaituneaugmentationde l’expressionduRAde80%danslalignéeC4-2Betde40% dans la lignée22rv1, à 6h deprivation d’oxygène. Cette augmentation du nombre de RA rapide dès 6h d’hypoxie faitseposerlaquestiondesonorigine:synthèsedenovoou

Figure6. Proﬁld’évolutiondumarquageRAenfonctiondutemps demiseenhypoxiedessphéroïdesC4-2BàJ7.Lessphéroïdessont placésdansuneenceinteàhypoxiependant30min,3h,et8het l’épaisseurdeleurcouronnedemarquageduRAaétémesuréeet comparée(moyennede5expériencesindépendantes)(**:p<0,01,

***:p<0,001).

libérationd’unpoolpré-synthétisé?L’épuisementduphéno- mèneà24hd’hypoxietraduituntrèsprobablemécanisme complexe etmultifactoriel.D’autres expériencesutilisant des inhibiteursdela synthèsedes protéinesserontnéces- sairesaﬁnderépondreàcettequestion.

Enﬁn, cette activation ainsi que cette augmentation d’expressionmédiée par l’hypoxie setraduisaientenpra- tique par une augmentation de sécrétion du PSA par les sphéroïdes placés en hypoxie comparés à ceux laissés en normoxie. Ceci permettait de supposer que les effets précédemment observés étaient des phénomènes actifs d’adaptation à l’hypoxie cellulaire,se traduisant par une augmentationdel’activitétranscriptionnelledeséléments deréponseauxandrogènes(ARE)situésauniveaudespro- moteursdesgènescibles.

Figure7. ExpressionduRAdanslalignéeC4-2B.Lescellulesont étéplacéesdansuneenceinteàhypoxie(0,1%O2)pendant6het 24h,avecungroupetémoinnormoxique(21%O2)àchaquefois.

Laquantiﬁcationdel’hypoxieauniveaucellulaires’estfaitepar détectiondeHIF-1␣.LetauxdeRAestanalysépourchaquecondi- tion,lesgelsontétéquantiﬁésetlesfacteursdemultiplicationsont indiqués.

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Figure8. SécrétiondePSAparlessphéroïdesC4-2BàJ7placés ennormoxie(Nx)eten hypoxie(Hx).Lessphéroïdessontplacés dansuneenceinteàhypoxie(0,1%O₂)àJ7deleurcroissance,avec ungroupetémoinlaisséennormoxie(21%O₂),pendant30min,3h, 8het24h.LesurnageantestrécupéréetlePSAdosécomparati- vement(moyennede3expériencesindépendantes)(*:p<0,005).

A.ProﬁldesécrétionduPSAaucoursdutemps.B.Comparaisondes quantitéssécrétéesàchaquetemps.

Conclusion

L’activationduRA,l’augmentationdesonexpressionetde son activité transcriptionnelle par l’hypoxie étaient déjà connues grâce aux précédents travaux sur des modèles 2D, avec une hypoxie cellulaire induite. Le modèle uti- lisé,plus proche del’hypoxie tissulaireobservée dans les tumeurs primitives, tend à conﬁrmer l’idée qu’au niveau des tumeurs solides prostatiques, et particulièrement au niveau des métastases osseuses, l’hypoxie intratumorale contribuedemanièreimportante auxmécanismesadapta- tifsderésistancesàlacastration. Cependant,uneanalyse transcriptionnelle (qPCR du RA, HIF, VEGF, PSA) serait intéressante pour soutenir lesrésultats avancés par cette approcheprotéomique.

Déclaration de liens d’intérêts

Lesauteursdéclarentnepasavoirdeliensd’intérêts.

Références

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