UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
Mémoire
présenté par
Ramatoulaye Thiaba SAMBA
Maitre ès-Sciences Naturelle:
pour l'obtention du
DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES
SUJET:
r Contribution à la caractérisation du mutant sans sites de nodulation
caulinaires de Sesbania rostrata Brem.
Soutenu le 29 Avril 1994
devant la Commission d'Examen composée de :
Président: M. Amadou Tidiane BA Professeur, UCAD Membres: Mme Marie-M. Spencer BARRETO Chargée de cours, UCAD
M. Ibrahima NDOYE Assistant, UCAD
M. Bernard DREYFUS Directeur de Recherche, ORS TOM
M. Phillipe deLAJUDIE Chercheur, ORSTOM
JRJEMJEJRCCTIJEMJENl'§
Le
tra.va.i,L qui, fa.i,t L'objet cie ce mémoi,re a. été effectué en pa.rti,e a.uciépa.rtement cie Bwwgi,e Végéta.Le cie L'uni,versi-té
Chei,h,h Ânta. Di,op cieDa.~r
et en pa.rtie a.u La.bora.toi,re cie M-wrobwwgie cies SoLs ciu Centre cie Recherche ORSTOM--'LSRÂ cie
D~r.Je remercie très si,ncèrement M-onsi,eur Âma.ciou Tmmne BÂ, Professeur et chef ciu ciépa.rtement cie Bi,oLogi,e Végéta.Le, cie
m'a.voi,r a.utori,sé li.m'i,nscri,re en DEA. et cie
m'a.voi,r fa.i,t L'honneur ci'a.ccepter cie présmer cejury. Je Le remercie éfJa.Lement pour L'i,nté.rêt constant qu'iL a.ccorcie
li.mes prwccupa.twns, ses conseUs m'ont toujours été. utiLes.
J'expri,me ma.
vi,ve gra.ti,tucie li.M-a.cia.me M-a.ri,e M-a.cieLei,ne SPENCER BÂRRETO, cha.rgée cie cours
li.L'Uni,versi,té, cie
m'a.voi,r i,ni,Hé li.La.
recherche et cie
m'a.voir orienté. vers Le La.bora.toire cie M-wrobwwgie ciesSoLs. Je La. remercie éfJa.Lement cie L'inté.rêt qu'eU€. a. toujours porté. Ii. mon
tra.va.iL et Lui exprime. toute ma. sympa.thie.Toute ma. reconna.issa.nce
va.Ii. M-onsieur 'Lbra.hima. NDOYE, Âssistant
li.L'Université, pour Le temps qu'U
m'a. toujours a.ccorcié ma.Lgré sesprwccupa.twns. Je Le remercie vivement pour Les mociifwa.twns qu'iL a.
a.pporté. Ii. La. rédactwn cie ce tÏocument.
Je tiens
li.exprimer ma. respectueuse reconna.issa.nce
li.M-onsieur Berna.rci DREyFUS, Directeur ciu La.bora.toire, pour son a.cceuH et son souHen consta.nt
pencia.nt toute La. ciuré.e. cie mon sta.ge. Je Le remercie éfJa.Lementpour ses compétences qui m'ont été. très bénéfiques et son esprit écLa.iré.
Je Hens
li.exprimer ma. profoncie 9ra.Htucie
li.M-onsieur PhiLLipe De LÂJUD'LE, chercheur
li.L'ORSTOM-, cie m'a.voir fa.it profi-ter cie ses conna.issa.nces scienHfiques et cie sa. ri9ueur. Son souci incontesté ciu
tra.va.U bien fa.i-t a. bea.ucoup contribué li.L'a.bouHssement cie cette
recherche. Je Lui exprime ma. pLus vive reconna.i,ssa.nce.M-es remerciements
vont li.M-onsieur M-a.ma.ciou aUEyE, chercheur a.u M-'LRCEN /'LSRÂ pour ses conseUs pra.tiques et L'inté.rêt qu'iL a. porté. Ii. mon
tra.va.U.Je Hens a. remercier M-onsieur DÂNSO cie L'Âgence 'Lnterna.Hona.Le a.
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L'En~r9i-~ Atomi-qu~ Ii~ Vi-~nn~
qui-
a p~nni-s Ii~facUi-œr
c~ travaU par Laréali-satwn Iiu
liosa9~lie
L'azot~ i-sotopi-qu~.Qu'U
trouv~i-ci-
L'~xpr~sswnlie
ma vi-v~ r~onnai-ssanc~.n~s r~m~rc~m~ntsvont ~a~m~ntà nonswur J~n narc LE:BLÂ..NC pour sa lii-sponibUt-ti ~t s~s cons~Us prati-qu~sm'ont été. i-nIii-spensab~s.
Je
r~m~rci-~ é9aL~m~nt nonsi-~ur :Bi-~nv~nu SAn:BOU, ch~rch~ur aL"Lnsti-tut
Ii~s Sc~nc~s Ii~ L'Envi-ronn~m~ntpour
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Sou~èyeet à sa famtUe Âmes frères et sœurs
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Mots clés:
Sesbania rostrata,mutant, fixation d'azote, ARA, ISN, SDS-PAGE, greffage.IRIESUMIE
Suj et :
Caractérisation du mutant sans sites de nodulation caulinaires deSesbania rostrata.Sesbania rostrata est une légumineuse tropicale qui présente une double nodulation racinaire et caulinaire. Les nodules caulinaires se forment au niveau de sites prédéterminés, qui sont des primordia racinaires, caractéristiques de la plante. Dans le but d'étudier les gènes de la plante responsables de la nodulation caulinaire, une mutagénèse à l'éthyl méthane sulfonate a été effectuée sur des graines deSesbania rostrata et a donné un mutant dépourvu de ces sites de nodulation caulinaires.
L'évaluation de la fixation d'azote du mutant a été effectuée par différentes méthodes et sous deux régimes hydriques. Les résultats ont montré que comparéeà la fixation racinaire de la plante
sauvage (originale), la fixation du mutant n'est pas affectée par la mutation; au contraire elle est améliorée sur sol drainé. Par ailleurs nous avons noté que la fixation de la plante sauvage est plus importante sur sol inondé grâce probablementàses nodules caulinaires.
Une analyse comparée des protéines totales par SDS-PAGE des deux phénotypes n'a pas montré de différences qualitatives, mais quantitatives.
Un microgreffage croisé entre les deux phénotypes semble montrer un effet inductif de l'apex du mutant sur la croissance de la racine sauvage.
Prénom: RAMA TOULAYE THIABA Nom SAMBA
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§OMMAKRJE
1. INTRODUCTION
1II. MATERIELS ET METHODES
51. CULTURE DES BACTERIES 5
1.1. Milieux de culture de la souche ORS 571 5
1.2. Isolement des bactéries à partir des nodules 5
2. CULTURE DES PLAN'TES 5
2.1. Milieux de culture 5
2.1.1. Milieu JENSEN 5
2.1.2. Sol stérile 6
2.1.3. Milieu Murashige& Skoog (MS) 6
2.2. Méthodes de culture et d'inoculation des plantes 6
2.2.1. Germination des graines 6
2.2.2. Culture des plantes en tubes GIBSON 6
2.2.3. Culture des plantes sur sol stérile 7
2.2.4. Bouturage 7
2.2.5. Inoculation des plantes 7
2.2.5.1. Inoculation des racines 7
2.2.5.2. Inoculation des tiges 8
2.2.6. Technique d'autofécondation " 8
3. EVALUATION DE LA FIXATION SYMBIOTIQUE DE L'AZOTE 8
3.1. Mesure de l'Activité Réductrice de l'Acétylène (ARA) 8
3.1.1. Principe 8
3.1.2. Conditions expérimentales 9
3.1.3. Méthode de mesure 9
3.1.4. Méthode de calcul 10
3.2. Quantification de l'azote fixé 10
3.2.1. Conditions expérimentales l0
3.2.2. Dosage de l'azote total 11
3.2.2.1. Minéralisation 11
3.2.2.2. Titrage 11
3.2.2.3. Calcul de la teneur en azote des échantillons 12
3.2.3. Méthode par différence de rendements 12
3.2.4. Méthode de dilution isotopique 12
3.2.4.1. Principe de la méthode isotopique 12
3.2.4.2. Méthode de calcul 13
3.3. Analyses statistiques 14
4. TECHNIQUE DU MICROGREFFAGE 14
5. COUPES MICROSCOPIQUES 14
5.1. Dissection du matériel végétaL 14
5.2. Fixation 15
5.3. Déshydratation 15
5.4. Inclusion 15
5.4.1. Préparation de la résine d'inclusion 15
5.4.2. Imprégnation 15
5.4.3. Inclusion et polymérisation 16
5.5. Microtomie et microscopie 16
6. ANALYSE DES PROTEINES TOTALES 16
6.1. Purification des protéines végétales 16
6.2. Dosage des protéines 17
6.2.1. Préparation de la gamme étalon 17
6.2.2. Dosage des extraits de protéines 17
6.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide 17
6.3.1. Principe de l'électrophorèse 17
6.3.2. Electrophorèse en une dimension: SDS-PAGE 18 6.3.2.1. Préparation des gels de polyacrylamide 18
6.3.2.2. Préparation des échantillons 19
6.3.2.3. Migration 19
6.3.3. Electrophorèse en deux dimensions 19
6.3.3.1. Première dimension (isoélectrofocalisation) 20
6.3.3.2. Deuxième dimension 20
6.3.4. Révélation 21
6.3.4.1. Coloration au bleu de Coomassie R250 21
6.3.4.2. Coloration au nitrate d'argent 21
6.3.5. Séchage des gels 21
III. RESULTATS ET DISCUSSION
221. EVALUATION DE LA FIXATION D'AZOTE CHEZ DEUX PHENOTYPES
MUTANTETSAUVAGEDESESBANIA ROSTRATA 22
1.1. Estimation de la fixation d'azote par la mesure de l'activité nitrogénase chez deux phenotypes deSesbania rostrata soumis à différents traitements 22
1.1.1. Plantes culti vées en serre .. " 22
1.1.1.1. Mesures d'ARA totale et spécifique 23
1.1.1.2. Mesures des poids secs 26
1.1.2. Plantes cultivées en tubes GIBSON 26
1.1.2.1. Mesures d'ARA totale et spécfique 27
1.1.2.2. Comparaison des poids secs 29
1.2. Quantification de la fixation d'azote chez deux phenotypes deSesbania rostrata
soumisàdifférents traitements 29
1.2.1. Par la méthode par différence de rendement '" 29 1.2.2. Par la méthode de la dilution isotopique (méthode 15N) 32
1.2.3. Comparaison des poids secs 35
2. ANALYSE COMPAREE DES PROTEINES TOTALES DE TROIS PHENOTYPES
DESESBANIA ROSTRATA 35
3. COMPARAISON DE LA CROISSANCE RACINAIRE DE MICROGREFFES CROISEES ENTRE PLANTES SAUVAGE ET MUTANT DESESBANIA
ROSTRATA 36
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
38V. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
39AIE
ARA
ARNm BSA Fig.
h
ha ISRA m M
min.
mM
nmoles
N
üRSTüM
lLTISl'E DES AJBRIEVTIAl'TIONS
Acide Indole Butyrique
Activité Réductrice de l'Acétylène Acide Ribonucléique messager Bovin serum albumin
figure heure hectare
Institut Sénégalais de Recherches Agricole mètre
molaire minute rnillimolaire nanomoles normal
Institut Français de Recherches Scientifiques pour le Développement en Coopération
plv poids/volume
rpm rotation par minute
SDS sodiumdodécylsulfate
TEMED tétraméthyléthylénediarnine
V volts
v/v volume/volume
YL Yeast Lactate
JlI rnicrolitres
Jlmol rnicromole (10-6mole)
Il
[1
il Il il :1 1
:1
1 1 1 1
1
1 1 1
1 1 1 1
1
1
I. INTRODUCTION
Dans les pays sahéliens, l'agriculture est surtout limitée par un déficit pluviométrique mais aussi par l'épuisement des sols, notamment en azote. Cet épuisement des sols est généralement dû àdes monocultures intensives. Pour maintenir la fertilité des sols et améliorer la production, les agriculteurs utilisent des engrais azotés. Mais ces intrants présentent des inconvénients, qui sont leur coût trés élevé et leur action polluante (après lessivage) sur les eaux souterraines. Une alternative pour ces agriculteurs disposant de faibles revenus est l'utilisation des systèmes fixateurs biologiques. En effet, il existe dans le sol des microorganismes capables de réduire l'azote moléculaire (N2 ) atmosphérique, non utilisable par les végétaux, en ammoniac (NH3).
Ces diazotrophes sont, soit des fixateurs libres (non-symbiotiques) des genres Azotobacter, Klebsiella, Azospirillum, Pseudomonas, Beijrinckia, Clostridium ... etc, soit des fixateurs symbiotiques tels que les rhizobiums (genres Rhizobium, Bradyrhizobium et Azorhizobium)
• associés à certaines légumineuses et aux plantes du genre Parasponia, les actinomycètes du genre Frankia associés à des non-légumineuses (comme les genres Casuarina et Alnus) , les cyanobactéries du genreAnabaena associées àla fougère aquatique Azolla .
La symbiose légumineuses/Rhizobium est une interaction complexe au terme de laquelle les légumineuses développent sur leur système racinaire des nodules. Ces nodules racinaires aux formes multiples sont des organes spécialisés à l'intérieur desquels les bactéries, sous forme de bactéroïdes, synthétisent la nitrogénase, enzyme qui catalyse la réduction de l'azote moléculaire en ammoniac. La nitrogénase est constituée de deux sous-unités très sensibles à l'oxygène. Le flux d'oxygène dans les nodules est régulé par un pigment rouge analogue à l'hémoglobine animale, la léghémoglobine, qui n'existe que dans les nodules fixateurs. La léghémoglobine est une hémoprotéine dont la partie protéique (la globine) et la partie hème sont respecti vement synthétisées par la plante et la bactérie associée (Dénarié et Truchet, 1979).
L'azote n'est pas le seul substrat possible pour la nitrogénase qui peut réduire d'autres substrats tels que l'acétylène et les protons (WittYet Minchin, 1988). Cette propriété de la nitrogénase à réduire l'acétylène est utilisée pour mesurer le pouvoir fixateur des symbioses existantes, selon une méthode dite de l'Activité Réductrice de l'Acétylène (ARA).
Beaucoup de légumineuses présentent des nodules racinaires (Arachis hypogaea, Phaseollls vulgaris, Glycine max, Pisum sativll1n, Acacia albida, Viciafaba, ... etc), mais la présence de nodules caulinaires n'a été signalée que dans quelques genres comme Neptunia (Schaede, 1940), Aeschynomene (Yatazawa et Yoshida, 1979 ; Alazard et Duhoux, 1988), Sesbania rostrata (Dreyfus et Dommergues, 1981). Ces nodules de tige sont formés au niveau de sites prédéterminés qui sont des primordia racinaires. Suivant la structure anatomique de ces sites, les légumineuses à nodules caulinaires sont classées en trois groupes (Dreyfus et al. ,
1984 ; Alazard et Duhoux, 1988) : le groupe Sesbania rostrata et Aeschynomene afraspera dont les sites sont constitués d'ébauches racinaires qui percent l'épiderme de la tige, le groupe Aeschynomene elaphroxylon et Neptunia oleracea avec des ébauches racinaires enfoncéesrl,lnS
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·.~.f··Tl.·· •• , •• ~.• \ ~. . ··'t ... ·ILJ. • ...." .~••••
Photo 1: Morphologie de la tige de Sesbania rostrata sauvage (A) et Mutant (B). N : nodules caulinaires.
2
les tissus corticaux de la tige, un groupe intermédiaire entre les deux premiers où les ébauches racinaires sont recouvertes par une ou quelques assises de cellules épidermiques.
Sesbania rostrata Brem. est une légumineuse tropicale annuelle des sols hydromorphes (Berhaut, 1976) appartenant à la sous-famille des Papilionoideae et à la tribu des Papiliolloideae- Robinieae (Goldblatt, 1981). Au Sénégal, elle est répartie aux abords des fleuves Casamance, Sine et Saloum, dans la vallée du fleuve Sénégal et dans les mares temporaires du Ferlo pendant l'hivernage.
C'est une espèce herbacée ayant une grande vitesse de croissance, sa hauteur pouvant atteindre 2 à 4 mètres en 3 mois. Elle est très sensible à la photopériode et sa croissance est fortement affectée en période de jours courts. Elle vit dans les zones humides et supporte parfaitement l'inondation, ce qui explique qu'on la trouve généralement dans les bas fonds (Ndoye, 1990 ; Becker etal., 1992). Elle est caractérisée par la présence de sites de nodulation caulinaires disposés régulièrement sur des lignes génératrices parallèles à l'axe de la tige et constitués d'un dôme de cellules épidermiques percé par un primordium racinaire (Duhoux, 1984). Ces sites peuvent se différencier soit en racines adventives lorsqu'ils sont immergés dans de l'eau ou une atmosphère très saturée en eau (Barreto, 1987), soit en nodules (plante A, photo 1) lorsqu'ils sont infectés par des rhizobiums spécifiques (Duhoux, 1984). Deux genres bactériens Rhizobium et Azorhizobium, sont capables d'induire des nodules chez Sesbania rostrata (Dreyfus et Dommergues, 1981). Azorhizobium caulinodans type ORS 571 présente en outre la capacité de fixer l'azote en culture pure dans certaines conditions.
La présence des nodules caulinaires chez cette espéce, en augmentant le nombre de nodules de la plante, augmente également son potentiel fixateur d'azote. La fixation de Sesbania rostrata est estimée à 60-270 kg d'azote par hectare selon le site (Becker, 1990). Son potentiel fixateur très élevé et sa capacité de se développer sur des sols submergés ayant une forte teneur en azote combiné font de cette espèce un engrais vert très efficace en riziculture inondée permettant dans certains cas de doubler, voire tripler le rendement de la récolte de riz (Rinaudo etaI., 1983; Dreyfus et al., 1985; Ndoye et Dreyfus, 1988; Becker, 1990; Becker etaI., 1992; Matoh etaI., 1992).
Chaque étape de la symbiose est sous le contrôle génétique des deux partenaires. Identifier les gènes des plantes et des bactéries qui interviennent dans chaque étape du processus est nécessaire pour élucider les bases moléculaires de la symbiose et reste un préalable à l'amélioration des symbioses existantes et à la production de nouvelles symbioses fixatrices.
La mutagénèse est une puissante technique dans la caractérisation des opérons, des gènes et de leurs produits, et la création de mutants est la première étape essentielle pour la détermination de la fonction du gène (Quandt et al., 1993). L'identification des gènes intervenant dans la symbiose nécessite la sélection de mutants de la bactérie et de la plante-hôte affectés dans leurs propriétés symbiotiques. Les mutants bactériens sont obtenus généralement, soit par les techniques de mutagénèse dirigée par utilisation d'éléments transposables tels que le transposon Tn5 (Kang etal., 1992 ; Chattopadhyay et Lodha, 1993) ou le bactériophage Mu (Van Vliet et
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3
cd., 1978), soit par isolement de mutants spontanés avec l'utilisation de substances chimiques telles les antibiotiques. L'obtention de mutants végétaux est plus difficile; néanmoins certains mutants ont été obtenus par l'utilisation de radiations (Peng J. et Harberd, 1993) telles les rayons gamma qui ont permis d'isoler un mutant de Sesbania rostrata présentant une phase végétative allongée (Joshua et Ramani, 1993), ou d'agents chimiques tel l'éthyl méthane sulfonate (EMS) qui a permis d'isoler des mutants supernodulants, non nodulant, ou à nodulation incfffecti ve chez Plzaseolus vulgaris (Pedalino et al., 1992), Sesbania rostrata (Tomekpe etal., 1988 ; De Lajudie, 1988), Glycine max, PiSU111 sativum, Arachis hypogea, Medicago saliva, TrifoliulIl pratense et Trifolium ùzcamatu111 (Caetano-Anollés et Gresshoff, 1991). Ces différentes techniques de mutagénèse n'aboutissent pas toujours aux mêmes types de mutation pour les mêmes graines avec un même produit. Ainsi, l'utilisation de l'EMS chez Phaseolus vulgaris a généré des mutants atteints différemment dans leur nodulation et dans leur fixation d'azote, allant de l'absence totale de nodules à la supernodulation (Caetano-Anollés et Gresshoff, 1991 ; Park et Buttery, 1992 ; Pedalino etal., 1993).
L'étude des processus symbiotiques a largement bénéficié, ces derniers temps, de l'apport de la génétique et de la biologie moléculaire. Ainsi de nombreuses études ont été effectuées sur le partenaire bactérien, et de nombreux gènes impliqués dans la nodulation et la fixation d'azote identifiés (Dénarié et Truchet, 1979 ; Long, 1989 ; Caétano-Anollés et Gresshoff, 1991 ; Meglas etal., 1993). Par contre, l'identification des gènes symbiotiques végétaux est moins avancée du fait de la complexité du génome et de la durée nécessaire aux expérimentations.
Cependant, l'utilisation des mutants affectés différemment dans leurs propriétés symbiotiques a permis d'identifier quelques gènes végétaux. Ainsi 14 gènes contrôlant la nodulation ont été identifiéschezPisum sativum (Weeden etal., 1990). Par ailleurs, d'autres gènes ont été mis en évidence chezGlycine max L. Merr. (Williams and Lynch, 1954), chezPhaseolus vulgaris (Park et Buttery, 1989), chezSesbania rostrata (De Lajudie, 1988), particulièrement les gènes codant pour les nodulines notamment les léghémoglobines (Dénarié et Truchet, 1979).
Concernant la symbiose Sesbania rostrata/Azorlzizobium, de nombreux travaux ont été effectués sur le partenaire bactérien et à présent on connait plusieurs de ses gènes impliqués dans la nodu1ation et la fixation d'azote (Dreyfus etal., 1988 ; Goethals, 1993). Cependant très peu de travaux ont été effectués sur le partenaire végétal. Néanmoins, les études de De Lajudie et Huguet (1988) ont mis en évidence des nodulines chezSesbania rotrata.
Dans le but d'étendre l'étude sur le rôle du partenaire végétal dans la symbioseSesbania rostrata/Azorlzizobium, une mutagénèse à l'Ethyl Méthyl Sulfonate (EMS) a été effectuée au laboratoire de Microbiologie des Sols du centre ISRA-ORSTOM de Bel Air (1988), sur des graines de Sesbania rostrata et a permis après germination d'isoler deux mutants: un mutant sans sites de nodulation caulinaire (plante B, photol) et un mutant insensible à la photopériode.
Le mutant sans sites est caractérisé par une absence totale des sites de nodulation sur la tige et des modifications au niveau de la morphologie et de la croissance racinaire, se traduisant par des racines secondaires réduites et un pivot plus développé par rapport à celui de la plante sauvage. Les études de génétique classique menées sur le mutant sans sites ont montré que cette mutation est monogénique et dominante, que la plante est allogame et que ce caractère sans
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1 ,4
sites présente des nuances allant de l'absence totale de sites à la présence de quelques sites. Un modèle a été proposé: le système de régulation ferait intervenir un gène majeur ayant subi la mutation et plusieurs autres gènes mineurs responsables de la variété phénotypique (De Lajudie etat., 1992).
Une approche moléculaire par analyse des produits de traduction in vitro des ARN messagers extraits de tiges non infectées de plantes mutantes ct sauvages a permis de voir des différences quantitatives et qualitatives entre les deux phénotypes (De Lajudie etof., 1992).
Sima (1991) a mis en évidence une différence dans la croissance racinaire de la plante du mutant et de la plante sauvage, mais également la non-transmission du caractère sans sites de nodulation par greffage. Sima avait également mis en évidence la nodulation racinaire du mutant qui semblait avoir une incidence positive sur sa croissance (poids sec total). Cependant, aucune donnée du potentiel fixateur du mutant n'a été signalée.
L'objectif de ce travail était donc de poursuivre les études précédentes du mutant sans sites de nodulation caulinaires dans le but de mieux le caractériser.
Tout d'abord, nous avons cherché à mettre en évidence l'impact de la mutation sur le pouvoir fixateur de la plante du mutant par rapport à la plante sauvage d'une part par des méthodes estimatives et d'autre part par des méthodes quantitatives.
Ensuite nous avons essayé de confirmer au niveau des protéines totales, les différences déjà rapportées au niveau des ARNmessagers par De Lajudieetat. (1992).
Enfin nous avons cherché, par greffage croisé entre les deux phénotypes, à mettre en évidence la présence, dans la plante, d'un facteur circulant (hormone, etc ... ) qui serait l'expression du gène responsable de la mutation.
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1 1
5
II. MATERIELS ET METHODES
1. CULTURE DES BACTERIES
Dans nos expériences nous avons utilisé la souche ORS 571 d'Azorhizobium caulinodans réputée la plus performante pour la nodulation des racines et des tiges deSesbania rostrata (Dreyfus etal. , 1988 ; Ndoye, 1990).
1.1. Milieux de culture de la souche
ORS
571Le milieu YL est utilisé pour la croissance de la souched'Azorhizobium caulinodans ORS 571 (Dreyfus et al., 1982). Il contient par litre: lOg DL-sodium lactate; 1,67g K2HP04 ; 0,87g KH2P04 ; O,lg MgS04, 7H 20 ; 0,05g NaCI; 0,04g CaCI2, 2H20 ; lOmg FeCI), 6H20;
5mg Na 2Mo04, 2H20 ; 2,5mg MnS04, H20; 0,7mg ZnS04, 7H20 ; 0, 14mg CoS0 4, 7H20;
0,12mg CuS04, 5H 20 ; 0,03mg H)B03 ; 19 Extrait de levure (DIFCO) ; Ig (NH4)2S04. Le milieu ajusté à pH=6,8 est autoclavé à 120°C pendant 20 minutes.
Le
milieu YLA est le milieu YL solidifié par l'addition de 15g d'agar par litre.1.2. Isolement des bactéries
à
partir des nodulesDe jeunes nodules frais prélevés de racines ou de tiges de Sesbania rostrata sont désinfectés superficiellement par immersion dans une solution d'éthanol à 70% (5min.). Après plusieurs rinçages successifs àl'eau distillée stérile, les nodules sont plongés dans une solution d'HgCl2à0,1 % (4 min.) et ensuite rincés abondammentàl'eau distillée.
Aprés la désinfection, les nodules sont écrasés dans une goutte d'eau distillée stérile; une anse trempée dans le broyat sert à ensemenser par épuisement une boite de Petri (milieu YLA) qui est ensuite gardéeàl'étuve (30°C) pendant 24 heures.
2. CULTURE DES PLANTES
2.1.
Milieux de culture2.1.1.
MilieuJENSEN
Le milieu dit de Jensen (Vincent, 1970) est utilisé pour la culture des plantes en milieu hydroponique en tubes. Il contient par litre: 0,2g K 2HP04 ; 0,2g MgS0 4(7H20) ; 0,2g NaCI ;
Ig CaP04 ; 0,14g FeCI)(6H20) ; 2,86g H3B03 ; 2,03mg MnS0 4(4H20) ; 0,22mg ZnSOi7H20 ) ; 0,08mg CuS04(5H20) ; 0,09mg N~Mo04(H20); 20g d'agar . Le pH est ajusté à 6,7 avant stérilisation du milieu par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes.
"
il
1----_
PlantuleCapuchon en aluminium
Bouchon d'arrosage
1---
Tube 220 x 22~---I--- Eau distillée Milieu Jensen en --t--~--gélose inclinée
Fieure 1. Schéma d'un tube Gibson.
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1
1 1
1
6
2.1.2. Sol stérile
Le sol utilisé est celui de la station ORSTOM-ISRA de Bel Air dont les caractéristiques physico-chimiques sont les suivantes: Argile 3,8% ; Limon fin 1,4% ; Limon grossier 0,7% ; Sable fin 48,4% ; Sable grossier 44,5% ; pH (eau) 7,7; pH (KCI) 7,0 ; Carbone 4% ; Azote 0,26% ; P20Stotal 0,37% ; P20Sassimilable 0,28% (Rinaudo et Moudiongui, 1985).
Le sol est légèrement humidifié et stérilisé par autoclavage à 120°C en deux temps, d'une durée d'une heure chacun. Ce sol est ensuite mélangé à des billes de polystyréne et réparti dans des pots ou des gaines en plastique.
2.1.3. Milieu Murashiee & Skooe (MS)
Le milieu dit de Murashige & Skoog (1962) est utilisé pour la croissance in vitro de boutures, de microgreffes et de jeunes germinations de Sesbania rostrata. Il contient par litre:
des macroéléments (l,65g NH4N03 ; 1,9g KN03;0,4g CaCI2, 2H20 ; 0,37g MgS04 , 7H20;
0,17 KH2P04 ) ; des microéléments (6,2mg H3B03 ; 22,3mg MnS04 , 4H20; 8,6mg ZnS04 , 4H20 ; 0,83mg KI ; 0,25mg Na2Mo04 , 2H20 ; 0,025mg CuS04 , 5H20 ; 0,025mg CoCI2,6H20) ; du Fer EDTA (37,3mg N~EDTA ; 27,8mg FeS04,7H20) ; des vitamines (lOOmg Myo-inositol ; 0,5mg Acide nicotinique ; 0,5mg Hel-pyridoxine; O,lmg Hel-Thiamine
; 2mg Glycine) et du saccharose 20gll. Le pH du milieu est ajusté à 5,7-5,8 et additionné de 8gll d'agar avant autoclavage à120°C pendant 20 minutes.
2.2. Méthodes de culture et d'inoculation des plantes
2.2.1. Germination des eraines
Les graines de Sesbania rostrata sont désinfectées et scarifiées dans H2S04 concentré pendant une heure. Les graines, rincées abondamment dans l'eau distillée, sont mises à gonfler dans de l'eau stérile pendant 4heures et déposées ensuite dans des boîtes de Pétri contenant de l'eau gélosée à 0,8%. Les boites sont gardées à 30°C à l'obscurité et à l'envers afin d'éviter que les jeunes racines ne s'enfoncent dans l'agar.
2.2.2. Culture des plantes en tubes GIBSON
La technique a été décrite par GIBSON en 1963 (voir figure 1). Les germinations de 24 heures (l à 2 cm de long) sont mises en culture dans des tubes à essai contenant du milieu Jensen (gélose nutritive) incliné, et munis d'un capuchon constitué de trois feuilles d'aluminium percées de deux trous; le premier, d'un diamétre d'environ 5 mm, est fermé par un bouchon en caoutchouc et permet d'ajuster et d'inoculer le milieu ; le deuxième, d'un diamétre d'environ 2 mm permet d'introduire la racine, la partie aérienne de la plante restant au dessus du capuchon.
, 1
1
1
1 r
7
Pour éviter le déssèchement des enveloppes cotylédonnaires et faciliter leur libération spontanée, les plantes sont gardées en atmosphére humide pendant 24 heures avant d'être mises sous éclairage continu (3000 lux).
Etant donné que les plantes qui ne subissent que l'inoculation des tiges se fanent avant l'apparition des sites caulinaires, on ajoute à l'eau d'arrosage du KN03 à 3mM. Après 5 jours, les premiers sites apparaissent et la solution de KN03est éliminée et remplacée par de l'eau distillée stérile. Les plantes ne sont inoculées qu'après 48 heures dans l'eau stérile afin que l'azote préalablement absorbé soit complétement assimilé.
2.2.3. Culture des plantes sur sol stérile
Aprés germination des graines, les jeunes plantules de 48 heures sont repiquées dans des pots (18 x 16 cm) ou dans des seaux (16 x 15 cm) contenant 2kg de sol stérile de Bel Air mélangé à des billes de polystyréne (pour l'aération), à raison de trois plantes par pot. Au bout d'une semaine on démarie les plantes pour ne laisser qu'une plante par pot. Durant les deux premières semaines, les plantes sont arrosées avec de l'eau stérile afin de réduire les risques de contamination. A la 2ème semaine le traitement hydrique est appliqué: le traitement inondé consiste à maintenir en permanence une lame d'eau en surface et le traitement drainé consiste à arroser le sol de telle sorte qu'il n'y ait pas d'excès d'eau en surface.
Sesbania rostrata étant une espèce très sensible à la photopériode et dont la croissance est fortement ralentie en période de jours courts, la photopériode (11-12 heures) est allongée à 16 heures grâceàun éclairage électrique (3000 lux). Les plantes sont maintenues en serre pendant 50 jours avant la récolte.
2.2.4. Bouturage
Pour effectuer des boutures de plantes sauvages, des fragments de tiges à quatre nœuds portant des primordia racinaires sont immergés par leur partie basale dans de l'eau. Après 48h, des racines adventives apparaissent et les boutures sont placées dans le sol.
Dans le cas des boutures de plantes mutantes, les fragments fraîchement coupés sont saupoudrés à leur partie basale d'une poudre d'AIB à 8% (commercialisée sous le nom de Rhizopon) avant d'être placés en terre.
2.2.5. Inoculation des plantes
2.2.5.1. Inoculation des racines
L'inoculation des racines en tubes GIBSON se fait une semaine après repiquage des plantes, par 3 gouttes/tube d'une culture de la souche d'ORS 571 en phase de croissance exponentielle (109bactéries/ml), déposées de façon aseptique à l'aide d'une pipette Pasteur.
Les plantes en pots sont inoculées par 5mllpot de la même culture, le jour même du
, i
i i , 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1.
1.
1.
1.
8
repiquage des plantes.
2.2.5.2. Inoculation des tiees
L'inoculation des tiges se fait dès l'apparition des premiers sites caulinaires par badigeonnage à l'aide d'un petit pinceau ou d'un coton-tige imbibés d'une culture liquide de la souche ORS 571 en phase exponentielle de croissance.
2.2.6. Technique d'autofécondation
Dans le but de disposer de plantes d'une plus grande homogénéité génétique, on procéde à une série d'autofécondations afin d'obtenir des plantes sauvages et mutantes qui sont "frères et sœurs" dans la même génération.
Dès leur apparition, les boutons floraux sont soigneusement enfermés dans des sachets en plastique transparent, ou en papier sulfurisé. Dès son ouverture, la fleur est pressée entre le pouce et l'index au niveau de la carène (les deux pétales inférieures soudées) ; celle-ci s'ouvre en laissant apparaitre les étamines. Les étamines sont ensuite secouées à l'aide d'un pinceau afin de laisser s'échapper les grains de pollen qui peuvent alors tomber sur le stigmate et féconder l'ovule. Les inflorescences autofécondées sont ensuite marquées par des fils de couleurs différentes et recouvertes à nouveau.
Lorsque les petites gousses apparaissent, le sac est enlevé et le fil laissé jusqu'à la récolte.
3. EVALUATION DE LA FIXATION SYMBIOTIOUE DE L'AZOTE
3.1. Mesure de l'Activité Réductrice de l'Acétylène (ARA)
La méthode de l'ARA est une méthode indirecte de mesure de l'activité de la nitrogénase, complexe enzymatique responsable de la fixation de l'azote.
3.1.1. Principe
La nitrogénase est l'enzyme qui catalyse la réduction biologique de l'azote atmosphérique in vitro selon la réaction:
Cette enzyme est capable de réduire d'autres substrats caractérisés par une triple liaison, dont l'acétylène qu'elle réduit en éthylène selon la réaction:
C2H2 +2H+ +2e- • C2H4
Lorsque les organes fixateurs d'azote sont incubés dans une atmosphère contenant au moins 10% d'acétylène, les autres substrats (N2' H+) de la nitrogénase sont inhibés. Et la quantité d'éthylène formé dans ces conditions, pendant un temps donné, correspond au flux
1 1
1 1 1 1 1 1 1
1 1 1
1 1 1
1
9
total d'électrons transférés par la nitrogénase.
Le principe du calcul de l'ARA est basé sur le rapport du nombre de moles de C2H4 sur le nombre de moles de N2fixé. Ce rapport est trés variable car la réduction de l'azote est couplée d'une production d'H2, utilisant une partie de l'énergie destinée à la fixation d'azote. Ceci constitue une perte d'énergie réduisant l'efficacité de la fixation d'azote. Par ailleurs l'activité de la nitrogénase diminue au cours du temps d'incubation et en fonction des conditions environnementales (variations journalières par exemple) et des facteurs intrinséques.
3.1.2. Conditions expérimentales
L'expérience des plantes cultivées en serre consiste en l'étude de 3 facteurs: le phénotype de Sesbania rostrata (sauvage, mutant), le régime hydrique (inondé, drainé), l'inoculation (inoculé, non inoculé). Le dispositif expérimental comporte 6 traitements avec 10 répétitions et 2 régimes hydriques:
Traitement 1 et 5 : plantes sauvages non inoculées (SNI) Traitement 2 et 6 : plantes sauvages, racines inoculées (SIR) Traitement 3 et 7 : plantes sauvages, tiges inoculées (SIT)
Traitement 4 et 8 : plantes sauvages, racines et tiges inoculées (SIRT) Traitement 9 et Il : plantes mutantes non inoculées(MNn
Traitement 10 et 12 : plantes mutantes, racines inoculées (MIR)
Dans l'expérience des plantes cultivées en tubes GIBSON nous avons étudié l'effet de deux facteurs sur l'activité nitrogénase : le phénotype (sauvage, mutant) et l'inoculation (inoculé, non inoculé). Le dispositif expérimental comporte 6 traitements avec 10 répétitions chacun:
Traitement 1 : plantes sauvages non inoculées (SNI) Traitement 2 : plantes sauvages, racines inoculées (SIR) Traitement 3 : plantes sauvages, tiges inoculées (SIT)
Traitement 4 : plantes sauvage, racines et tiges inoculées (SIRT) Traitement 5 : plantes mutantes non inoculées (MNI)
Traitement 6 : plantes mutantes, racines inoculées (MIR)
3.1.3. Méthode de mesure
La mesure de l'ARA (Hardy et al., 1973) a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse sur chromatographe Varian Aerograph série 1400 équipé d'une colonne en acier inoxydable de 120 cm x 0,2 mm remplie de sphérosil XOB 075. Les températures ont été les suivantes: injecteur 120°C; colonne 75°C; détecteur à ionisation de flamme 150°C. Le débit de gaz vecteur a été de 40 ml/mm.
Ainsi les tiges et/ou racines portant des nodules sont coupées et mises dans des flacons- sérum de 250 ou 500 ml ou dans des tubes à essai (18cm) fermés hermétiquement. Ensuite, l'acétylène (1/10edu volume) est injecté dans le flacon et l'ensemble est incubé àla température
3.1.4. Méthode de calcul
v V 1
hxA
1 hxA x
x 22.400 106
x
0,5106 x 0,5 22.400
Pour un échantillon de volume V (ml), dont on a injecté un volume v (ml) au chromatographe et qui donne un pic de X
=
hl X Al' la quantité d'éthylène totale produite est donc:hl=hauteur du pic C2H4 en cm h
=
hauteur du pic standard en cm Al=atténuation due àl'échantillon A=atténuation due au témoin standard V= volume du flacon d'incubation en mlv= volume injecté dans le chromatographe (0,5ml)
L'ARA totale est exprimée en~molesou en nmoles de C2H/h/plante.
L'ARA spécifique est exprimée en ~molesou en nmoles de C2H/h/gramme de nodules secs.
La conversion des hauteurs de pics d'éthylène en nanomoles de C2H4 se fait par référence àun étalon standard, constitué d'éthylène dilué au 111 000. La concentration de cette dilution est donc de : 106 nmoles/ 22.400 C2H4
L'injection au chromatographe de 0,5 ml de cette dilution donne un pic de hauteur : h x A (A=facteur d'atténuation; h=pic mesuré en cm)
Les hauteurs de pics étant proportionnelles aux quantités injectées, un pic de lcm correspondà ambiante pendant 30 min. ou Ih. Puis des échantillons gazeux de 0,5 ml sont prélévés de chaque flacon et injectés dans le chromatographe. La quantité d'éthylène est mesurée par le pic enrégistré.
1 10
1 1 1 1
1
1 1 1 1 1
n
[ 1
3.2. Quantification de l'azote fixé
3.2.1. Conditions expérimentales
Notre expérience consiste en l'étude de l'effet de 3 facteurs sur la fixation d'azote: le phénotype de Sesbania rostrata (sauvage, mutant), le régime hydrique (inondé, drainé), l'inoculation (inoculé, non inoculé). Le dispositif expérimental est le même que celui décrit dans l'expérience de mesure d'ARA sur les plantes cultivées en serre (Cf. paragraphe 3.1.2.).
Les plantes sont cultivées dans des seaux étanches contenant du sol de Bel Air stérilisé.
L'engrais marqué est appliquéà la 2e semaine sous forme d'une solution de ('5NH4)2S04 avec
NH3 + HCI
3.2.2.1. Minéralisation
3.2.2.2. Titra2e
Le dosage de l'azote total se fait selon la méthode du micro Kjeldhal (Rinaudo, 1970) selon laquelle les échantillons de poudre végétale sont minéralisés et titrés par l'acide sulfurique (H2S04 )·
3.2.2.3. Calcul de la teneur en azote des échantillons 3.2.2. Dosa2e de l'azote total
excès isotopique de 10,9%, à la dose de 20 mg/pot, ce qui correspond à 20 kg d'azote par hectare. La fertilisation phosphopotassique consiste en l'application de 0,14 g de K2HP04 par pot, ce qui correspond à 140 kg/ha.
Les plantes sont récoltées au 50ejour après le repiquage. Les échantillons séchés et pesés sont ensuite broyés en une fine poudre destinée au dosage de l'azote.
I l
Il s'agit de réduire l'azote organique contenu dans 50 mg de poudre végétale en sulfate d'ammonium en faisant agir H2S04 concentré en présence du catalyseur (Sélénium+Sulfate de Cuivre) anhydre selon la réaction:
La réaction se fait à chaud à l'aide d'un appareil chauffant à 350°C pendant une à deux heures selon le type d'échantillon.
Le titrage se fait avec un distillateur Büchi série 1200. Le sulfate d'ammonium est déplacé par 25 ml de soude (NaOH) lON pour donner de l'ammoniaque selon la réaction:
Cet ammoniaque est capté par l'acide borique 2% afin qu'il puisse être titré avec l'acide chlorhydrique (HCI) N/28 :
La quantité d'acide versée pour chaque échantillon permet de calculer la teneur en azote de l'échantillon.
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1
1 1 1
1
1 1
1
12
3.2.4. Méthode de dilution isotopique
3.2.4.1. Principe de la méthode isotopique 3.2.3. Méthode par différence de rendements
,
N%
x
PS100 N total (en grammes)
=
Dans la nature, l'azote est un mélange de deux isotopes stables 14N et 15N. Les techniques de marquage isotopique artificiel par 15N conduisent à l'expression des compositions isotopiques en abondance absolue ou en excès isotopique. Cet excès se définit comme la différence entre l'abondance isotopique (teneur en atomes 15N exprimée en pourcentage) de l'échantillon et celle d'un étalon de référence. Pour l'azote, l'étalon de référence sera l'azote de l'air dont l'abondance isotopique est 0,366
±
0,004. L'excès isotopique sera donc égal à :e%
=
Aéchant.llon - A air=
Aéchantilion - 0,366La méthode de la dilution isotopique consiste à enrichir l'azote du sol de 15N par ajout d'un engrais marqué. Elle est basée sur le fait que les plantes non fixatrices (non inoculées) utilisent l'azote du sol et l'engrais marqué alors que les plantes fixatrices (inoculées) utilisent en plus l'azote de l'air, ce qui dilue l'azote marqué au sein de la plante fixatrice. La détermination du rapport en 15N des plantes inoculées aux plantes non inoculées permet l'estimation de l'azote fixé, ceci du fait que l'enrichissement en 15N est moindre chez la plante fixatrice deNz.
La quantité d'azote fixée est mesurée par la différence entre la teneur en azote total des plantes fixatrices (inoculées) et des plantes non fixatrices (non inoculées), en prenant comme postulat que les plantes inoculées et non inoculées absorbent la même quantité d'azote du sol.
Cette condition n'étant pas toujours remplie, on peut toutefois s'en rapprocher lorsque le sol utilisé est très pauvre en azote minéral (cas du sol de l'ORSTOM Bel Air).
Les plantes ayant reçu la même quantité d'engrais, on calcule la différence entre la teneur en azote total de chaque plante fixatrice et celle de la moyenne de la teneur en azote total des plantes non inoculées (Ndoye, 1990).
La masse atomique de l'azote étant de l4g, 1 ml d'acide N/28 fera déplacer 14128
=
0,5mg d'azote. Les échantillons pris étant de 50 mg, pour 100 mg on aura:
N%
=
_-=-0.z.:,5:...:.x:....-:v----=-=x:...:.l-=-0-=-0_50
L'azote total (N total) contenu dans chaque échantillon est exprimé par :
v= volume d'acide utilisé pour chaque échantillon
N%
=
pourcentage d'azote contenu dans 100 mg de poudre végétale PS=
poids sec de l'échantillon en grammes~I
• l'
1 1
1
1
1 1
1 1 1 1
1
1
1 1 1
1 1
1 ..1
1
13
3.2.4.2. Méthode de calcul
Le postulat de base de cette méthode est que l'isotope 15N soit accessible de manière identique aux plantes témoins et fixatrices et que celles-ci utilisent dans les mêmes proportions l'azote du sol et l'azote de l'engrais. Si l'on désigne par:
% Ndfso : le pourcentage de l'azote de la plante dérivé du sol pour les plantes non fixatrices d'azote
% Ndffo : le pourcentage de l'azote de la plante dérivé de l'engrais pour les plantes non fixatrices d'azote
% Ndfsn : pourcentage de l'azote de la plante dérivé du sol pour les plantes fixatrices de
N
2% Ndffn : pourcentage de l'azote de la plante dérivé de l'engrais pour les plantes fixatrices de N2
on peut écrire:
%Ndffo
%Ndfso
=
%Ndffn%Ndfsn
(1)
Si Y = %Ndfa : le pourcentage de l'azote de la plante dérivé de la fixation dans la plante fixatrice d'azote atmosphérique, on peut écrire:
- pour la plante non fixatrice d'azote
% Ndfso +% Ndffo
=
100 (2)-pour la plante fixatrice d'azote
% Ndfsn +% Ndffn= 100 (3) On tire des trois équations:
) x
100atom %15N excess (fn) atom %15N excess (fo) (1-
=
y=% Ndfa= %Ndffn
%Ndffo
Si "atom %15N excess" (fo)
=
excès isotopique dans les plantes non fixatrices atom %15N excess (fn)=excès isotopique dans les plantes fixatrices.On peut écrire, étant donné que les mêmes quantités d'engrais marqué de façon identique ont été appliquées dans les deux cas:
%Ndffn
%Ndffo et donc,
y = %Ndfa= ( 1 _ atom %15N excess (fn) ) x 100 atom % 15N excess (fo)
Les valeurs individuelles de Ndfa pour chaque plante fixatrice sont calculées à partir des valeurs individuelles "atom %15N excess (fn)" et de la moyenne des valeurs "atom %15N excess (fo)" des plantes non fixatrices.
La quantité d'azote fixé par plante est calculée comme suit :
N2 fixé (g/plante) _ Y _
- -
%Ndfa100
x
N =
y100
xN
14
N
=
la teneur en azote total de chaque plante.Par ailleurs on a calculé pour les plantes fixatrices et non fixatrices:
a
-% Ndff
=
atom % 15N excess (plante) atom %15N excess (engrais)x 100
-% Ndfs
=
100 - (% Ndfa+% Ndff)3.3. Analyses statistiques
Toutes les mesures d'ARA, d'azote et de poids secs ont été analysées statistiquement et la comparaison des moyennes faite par le test de Newman et Keuls (Snedecor et Cochran, 1957) au seuil de 5%.
4. TECHNIOUE DU MICROGREFFAGE
Le microgreffage est effectué selon la technique décrite par Detrez etal., (1992) pour Faidherbia albida.
Toutes les opérations s'effectuent en conditions de stérilité, sous la hotte. Des jeunes plantes issues de germinations de 48 heures sont débarrassées de leurs cotylédons et la base de leur apex taillée en biseau. Cet apex biseauté est intercalé dans une fente latérale effectuée sur la racine d'une autre plante, celle-ci ayant au préalable été débarrassée de sa partie supérieure.
L'ensemble est ensuite introduit dans des tubes à essai contenant du milieu MS (Murashige &
Skoog, 1962) et recouverts par des bouchons en plastique translucide. Les tubes sont incubés dans la chambre de cultureàune température de 30°C sous éclairement de 3000 lux.
La croissance racinaire est mesurée quotidiennement pendant 20 jours. Les mesures obtenues permettent de tracer la courbe de croissance racinaire des greffes.
Les greffes de 20 jours sont ensuite tranférées en serre dans des gaines de sol stérile.
Lorsqu'elles atteignent environ 1,5 m de haut, elles sont transférées dans des buses afin de suivre leurs éventuelles modifications morphologiques. Le transfert des greffes de la chambre de culture à la serre (sevrage) constitue un choc pour les plantes et occasionne de nombreuses pertes.
5. COUPES MICROSCOPIOUES
5.1. Dissection du matériel végétal
Les tiges sont coupées en petits fragments de 2 à 3 mm de longueur portant la zone à observer. La dissection se fait sous une loupe binoculaire et les fragments de tiges sont plongés dans une solution fixatrice contenant: 2,5% glutaraldéhyde ; 0,2 M de cacodylate de sodium;
2,5 mM de chlorure de calcium (pH =7,2).
15
5.2. Fixation
Les échantillons recueillis sont fixés dans 10mlde solution fixatrice (Cf. paragraphe 5.1) pendant 30 min. sous vide, puis pendant 1heure30min. à la pression atmosphérique dans une nouvelle solution fixatrice. Après 3 rinçages successifs d'une heure chacun avec un tampon de cacodylate de sodium 0,3 M additionné de 2,5mMde CaCl2 (pH
=
7,2), les échantillons sont plongés pendant 1h dans une solution contenant 2% de tétroxyde d'osmium OS04 mélangé à du tampon cacodylate 0,2 M.5.3. Déshydratation
Les échantillons fixés sont rapidement lavés à l'eau distillée (3 rinçages) puis déshydratés dans des bains successifs d'éthanol de concentration croissante (25%, 50%, 70%, 90%, 1 heure pour chaque bain), et ensuite dans 3 bains successifs d'éthanol absolu (une heure chacun). Les échantillons sont enfin plongés dans 2 bains de 15 minutes dans de l'oxyde de propyléne.
5.4. Inclusion
5.4.1. Préparation de la résine d'inclusion
La résine d'inclusion utilisée est l'Epon 812, encore appelé le glycidyl éther 100. Le mélange d'inclusion est composé d'une solution A, préparée en mélangeant 62ml de glycidyl éther 100 et 100mlde DDSA (CI6H2603' Anhydride Dodécényl Succinique) et d'une solution B, constituée d'un mélange de 100 ml de glycidyl éther 100 et 89 ml de MNA anhydre (Nadic Méthyl Anhydride, CloHIOC3)' La préparation des deux solutions se fait à la température ambiante. Le mélange d'inclusion est obtenu avec deux volumes de la solution A plus 1 volume de la solution B auquel on ajoute un durcisseur, le DMP30 (2% v/v) 2,4,6-tris (Diméthyl Amino Méthyl) Phénol.
5.4.2. Impré2nation
Les échantillons sont imprégnés progressivement dans des mélanges s'enrichissant en mélange d'inclusion et s'appauvrissant en oxyde de propylène: (1) dans 3 volumes d'oxyde de propyléne + 1volume de mélange d'inclusion; (2) dans 1volume d'oxyde de propyléne + 1volume de mélange d'inclusion; (3) dans 1volume d'oxyde de propyléne + 3 volumes de mélange d'inclusion; (4) dans la résine pure: 3 bains d'lheure chacun
à
la température ambiante.1
f
1 1 1
1 1
1
16
5.4.3. Inclusion et polymérisation
Les échantillons imprégnés sont déposés dans une goutte d'Epon au fond d'une gélule en gélatine. Chaque échantillon est orienté sous une loupe binoculaire et le volume de la gélule est complété avec le mélange d'inclusion. Les gélules sont enfin placées pendant 48 h dans une étuve à 60°C où s'effectue la polymérisation de la résine.
5.5. Microtomie et microscopie
Après polymérisation les blocs (en forme de gélules) sont taillés de sorte que l'échantillon inclus soit situé au sommet d'une pyramide. Chaque gélule taillée est positionnée sur le porte objet d'un ultramicrotome de type Ultracut E Reichert Jung.
Les sections sont effectuées avec des couteaux de verre fabriqués à l'aide d'un knifcmaker LKB type 7800. Les coupes semi-fines obtenues ont une épaisseur moyenne de 1
à
2 /.:lm.Elles sont ensuite sèchées sur des lames histologiques à l'étuve (60°C), puis colorées selon la méthode de Huber etal. (1968) par la fushine basique et le bleu de méthylène pour mettre en évidence les structures méristématiques (sites).
Les sections ainsi colorées sont observées au microscope photonique Olympus Vanox équipé d'un module automatique de prise de vues PMlO AD.
6. ANALYSE DES PROTEINES TOTALES
6.1. Purification des protéines végétales
Trois méthodes d'extraction ont été testées et les résultats obtenus nous ont permis d'adopter la méthode suivante.
300 mg de matériel végétal (la partie constituée des 5 à 7cm supérieurs de la plante) sont congélés à -80°C pendant une nuit dans des mortiers recouverts de parafilm. Après broyage à sec, la poudre obtenue est mélangée avec du tampon d'extraction à raison de 2ml/g de poids frais. Le mélange est ensuite centrifugé
à
22.530 rpm et 4 oC pendant 20 min. dans des tubes Eppendorf, le surnageant est conservé à -80°e.Composition du tampon d'extraction
Trizma-base 0, lM
Cystéine DL , '" 0,05 M
DIT lümM
Le pH est ajustéà6,8 et le tampon est gardéà4°C.
6.2.1. Préparation de la gamme étalon
en fonction de la quantité de BSA est ensuite tracé.
y =(D0620nm / D0465nm )échantillon - ( D0620nm / D0465nm )témoin(Ol!g de BSA)
La technique utilisée est celle de Sedmak et Grossberg (1977). Son principe est de déduire la concentration en protéines des extraits végétaux d'une courbe étalon tracée préalablement à l'aide de concentrations connues de protéines.
17
6.2. Dosal:e des protéines
Pour la gamme étalon, la référence choisie est l'albumine de sérum de bœuf (BSA). Les échantillons à doser sont les suivants:
- solution saline: 1,Smlde NaCI (9g/l)
- solution témoin: 1,S ml de solution saline +1,S ml de solution de bleu de Coomassie G2S0 (solution à 0,06% avec 3% d'acide percWorique)
- solution témoin additionné de 0, 10, 20, 30 ou SO~gde BSA.
Les mélanges sont homogénéisés immédiatement et la densité optique(DO)est mesurée à 46Snm et 620 nm par rapport à la solution saline.Legraphe:
, ---.---,
1
(
1 f
f
r
f
1
[
1
6.2.2. Dosage des extraits de protéines
Pour doser la quantité de protéines contenue dans chaque extrait, les échantillons suivants sont préparés:
- témoin: 1,Smlde solution saline additionnée à 1,Smlde solution de bleu de Coomassie - solution témoin additionnée à 10 ou 20 ~l de chaque extrait (SSl, SS2, SS3, PSI, PS2, PS3, AS1, AS2, AS3).
Le mélange est agité immédiatement et la densité optique(DO)est prise à 46Snm et à 620nm par rapport à la solution saline NaCI (9gll). Ensuite le rapport Y est calculé comme précédemment (Cf. paragraphe 6.2.1.). La concentration en protéines de chaque extrait est déduite par projection orthogonale sur la courbe d'étalonnage.
6.3. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
6.3.1. Principe de l'électrophorèse
1
Les protéines sont des polymères d'acides aminés. Elles possédent une charge nette positive ou négative due aux groupements positifs ou négatifs des acides aminés de leur surface. Si on applique un champ électrique à une solution contenant une molécule protéique, la protéine migrera à une vitesse qui dépend de sa charge nette, de sa taille et de sa forme. Il existe~ ,1
,1
il Il Il Il Il
ri
,1 1 q
~
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1 1
S
1 1
1
18
une relation linéaire entre le logm1thme du poids moléculaire et la mobilité d'une protéine. La migration de protéines témoins de masses moléculaires connues permet de dételminer celui des protéines étudiées.
6.3.2. Electrophorèsc en une dimension ; SOS-PAGE
L'électrophorèse selon Laemmli (1970) se fait sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (présence de SOS). Les protéines dénaturées migrent alors en fonction dc leur poids moléculaire.
6.3.2.1. Préparation des Cels de polyacrylamide
Solutions d'électrophorèse
- Solution monomère: acrylamide 29,2g; bis acrylamide 0,8g ; compléter à 100 ml avec de l'eau distillée et filtrer sur millipore. La solution est stable si elle est conservée dans un bouteille bruneà4°C.
-Tampon du gel résolutif: TIizma-base (l,5M) 18,2g ; SOS 10% 3 ml ; compléterà 100 ml avec de l'eau distillée; ajuster le pH à 8,8, filtrer sur millipore et conserver à 4°C.
-Tampon du gel de concentration: Trizma-base (500mM) 3,03g ; SOS 10% 2 ml ; compléterà50 ml avec de l'eau; ajuster le pH à 6,8, filtrer sur millipore et conserverà4°C.
- Solution de SOS 10%
lOg SOS dans 100 ml d'eau, filtrer au millipore et conserver à la température ambiante.
-Tampon d'électrophorèse (réservoirs inférieur et supérieur) : Trizma-base (Sigma) 12g ; Glycine (Sigma) 57,6g ; compléter à un litre avec de l'eau distillée; ajuster le pH à 8,6 et conserver à 4°C.
-Tampon d'échantillon: 3 ml deTris-HCI lM (pH =6,8) ; 5ml de Glycérol bidistillé ; 0,77g OTT ; 19 de SOS; 0,3ml de bleu de bromophénol ; compléter à 25ml avec de l'eau distillée; conserver à la température ambiante.
L'appareil utilisé est de marque Hoefer (SE 600). Les plaques en verre sont immergées dans du péroxyde d'hydrogène concentré (30%) pendant au moins 3 jours. Les plaq ues sont ensuite rincées abondamment à l'eau distillée et séchées à l'air libre. Des lattes en plastiques ou
"spacers" d'une épaisseur de 1,5 mm placées de part et d'autre des plaques, déterminent l'épaisseur du gel. L'ensemble, réuni par des vis de sen'age, est monté verticalement sur un support de polymérisation. Il est alors appelé "cassette".
Le gel résolutif est constitué d'un mélange de DJ mg de persulfate d'ammonium, de 13,3
19
ml d'eau, de 26,7 Jll TEMEO, de 10 ml tampon du gel résolutif, de 16,7 ml de solution monomère. Le mélange est dégazé et coulé entre les deux plaques en évitant d'emprisonner des bulles d'air. 2 ml d'isobutanol saturé d'eau sont déposés àla surface du gel pour éviter son déssèchement et pour l'aplanir. Après au moins deux heures de polymérisation, l'isobutanol est éliminé et la surface du gel est bien rincée avec une petite quantité de solution de gel de concentration.
Le gel de concentration (5 mg de persulfate d'ammonium; 3 ml d'eau; 5 Jll de TEMEO ; 1,25 ml de tampon du gel de concentration; 0,75 ml de solution monomère) est coulé au dessus du gel résolutif. Un peigne (Téflon) de 12, 15 ou 20 dents est inséré dans le gel en évitant la formation de bulles d'air en-dessous des puits formés par ces dents.
Après au moins deux heures de polymérisation à température ambiante, le peigne est retiré et les puits formés sont rincés plusieurs fois avec du tampon d'électrophorèse avant d'être remplis du même tampon.
6.3.2.2. Préparation des échantillons
Le volume d'extrait à prélever est calculé en fonction des concentrations de protéines obtenues après dosage et selon la quantité de protéines nécessaire à l'analyse. Plusieurs concentrations ont été testées et nous avons retenu 30 Jlg de protéines pour une révélation au nitrate argent et 60 à 100 Jlg pour une révélation au bleu de Coomassie.
Les extraits prélevés dans des tubes Eppendorf sont mélangés avec du tampon d'échantillon (l/Y du volume à déposer dans le puit). Les protéines sont dénaturées au bain d'eau bouillante pendant 3 min. Les tubes sont ensuite rapidement centrifugés à 14.500 rpm pendant 2 min.
6.3.2.3. Migration
Les échantillons sont déposés dans les puits à l'aide d'une microseringue. Les cuves inférieure et supérieure sont remplies de tampon d'électrophorèse et branchées à un générateur de courant électrique.
Les échantillons migrent sous une intensité constante de 6 mA/gel toute la nuit ou 30 mA/gel pendant 5 à 6 heures. La température est maintenue constante (19°C) durant toute la migration.
6.3.3. Electrophorèse en deux dimensions
L'électrophorèse en 2 dimensions selon la technique de D'Farrell (1975) comporte: une première dimension en isoélectrofocalisation dans des gels en boudins pour séparer les protéines selon leur point isoélectrique et une deuxième dimension en conditions dénaturantes (SOS) sur des gels en plaques pour les séparer selon leur poids moléculaire.
1
20
6.3.3.1.Première dimension (isoélectrofocalisation)
Solutions utilisées:
- Solution A: urée (BioRad) 9,5 M ; Nonidet NP40 (Sigma) 2% (p/v) ; Ampholines pH 5-7 (LKB) 0,2% ; Ampholines pH 3-10 (LKB) 0,4% ; f3-Mercaptoéthanol (Sigma) 5%. Filtrer sur millipore, fractionner et conserverà-20°e.
- Solution K : urée (BioRad) 8M ; Ampholines pH 5-7 (LKB) 0,8% ; Ampholines pH 3-10 (LKB) 0,2%. filtrer, fractionner et conserver à -20°e.
- Solution G: Glycérol 10% (p/v) ; f3-mercaptoéthano15% (v/v) ; SOS (BioRad) 2,3%
(p/v) ; 6,25 mM Tris-HCl pH 6,8 ; agarose 1% (p/v). Frationner et conserver à 4°C, 15 jours au maxImum.
Les gels en boudins (13 cm) sont coulés dans des tubes en verre (16 cm x 3mm) soigneusement nettoyés (dans une solution de NaOH lM pendant 2h30 min. ; rinçage à l'eau distillée, puis immersion dans une solution d'acide acétique lM 1h30 min., rinçage à l'eau distillée, immersion dans de l'eau oxygénée pendant au moins une nuit, plusieurs rinçages à l'eau distillée, enfin séchage à l'étuve 50°C). Les tubes sont ensuite placés verticalement sur un support.
La composition du gel est la suivante: 11g d'urée; 2,66ml d'une solution 28,4%
acrylamide, 1,6% bis acrylamide ; 4ml Nonidet NP40 10% ; 3,94ml d'eau bidistillée ; 0,8ml Ampholines pH 5-7 ; 0,2mlAmpho1ines pH 3-10. L'urée est dissout au bain-Marie à 37°e. Le mélange est dégazé à la pompe à vide puis additionné de 20 ~lde persulfate d'ammonium à 10% et 14 ~l de TEMED et coulé dans les tubes obturés à leur base par du Parafilm. 0,5 ml d'eau bidistillée est déposé au dessus du gel afin de permettre la polymérisation. La cuve inférieure est remplie d'acide phosphorique 0,0 1 M dégazé. 20
III
de la solution A sont déposés sur chaque gel et le tube est complété avec du tampon de cuve supérieure NaOH 0,02 N dégazé.Après la préfocalisation (200V, 15 min. ; 300V, 30 min. ; 4ÜOV, 30 min.), le tampon de la cuve supérieure est éliminé et les échantillons déposés sur le gel sont recouverts de 10 ~l de solution K puis de tampon de cuve supérieure.
La migration se fait à une température constante de 18°C: pendant 16 heures à 400V, puis pendant 1heure à 800V. Les boudins sont ensuite conservés à -20°e.
6.3.3.2. Deuxième dimension
Les gels en boudins congélés sont déposés sur gel de polyacrylamide-SOS en plaque (Cf.
6.3.2.1.) pour une électrophorèse en deuxième dimension. La migration se fait d'abord pendant 20min. à raison de 20 mA/gel avec du tampon de cuve supérieure à 2% de SDS, ensuite pendant toute la nuit (10 mA/gel) en remplaçant le tampon à0,2% SOS par du tampon
1
21
d'électrophorèse à 0,1 % .
6.3.4. Révélation
Après la migration, la cassette est démontée et les gels sont plongés pendant une heure dans une solution de fixation: acide trichloroacétique (TCA) 7%.
Les polypeptides sont ensuite révélés par coloration soit au bleu de Coomassie R250 , soit au nitrate d'argent.
6.3.4.1. Coloration au bleu de Coomassie R250
Le gel est plongé dans une solution contenant: 0,2% bleu de Coomassie R250, 50%
méthanol, 10% acide acétique (AcOH). Après une nuit de coloration le gel est transféré dans une solution de : 50% méthanol, 10% AcOH pendant 2heures ; puis la solution est éliminée et remplacée par une solution de 25% méthanol, 7,5% AcOH, 67,5% d'eau pendant une heure en présence d'une éponge qui adsorbe les résidus de colorant; enfin le gel est plongé dans une solution contenant 1% Glycérol, 10% AcOH pendant une heure, avant le séchage.
6.3.4.2. Coloration au nitrate d'ar~ent
La technique utilisée est décrite par Ansorge (1983). Elle est sensible aux faibles concentrations de protéines (10 à40Ilg).
Le gel est plongé sucessivement dans des solutions contenant: (1) 50% méthanol, 20%
TCA, 2% CuCl2(20 min.) ; (2) dans une solution A: 10% éthanol, 5% AcOH (15 min.) ; (3) dans une solution de 0,01 % KMn04 (15 min.) ; (4) dans une solution A (15 min.) ; (5) dans une solution de 10% éthanol (15 min.) ; (6) dans H20 (15 min.) ; (7) dans une solution de 0,1% AgN03(15 min.) ; (8) dans une solution de 10% K2C03 (2 min.) ; (9) dans une solution de 0,01% formaldéhyde, (10) 2% K2C03 (3-10 min.); (11) dans une solution A (5 min.);
(12) enfin dans H20 (15 min.).
6.3.5. Sécha~e des ~els
Les gels colorés sont ensuite séchés entre 2 membranes de cellophane avec un sécheur de gels (BioRad) relié à une pompe à vide. Les gels séchés sont conservés dans un sac en plastique à l'abri de la lumière.
