pendant 35 jours 2,0
S. r. Sauv
1.2.2. Par la méthode de la dilution isotopique [méthode 15N)
La quantification de l'azote fixé a été également effectuée par la méthode de la dilution isotopique (méthode '5N) qui permet d'avoir une estimation quantitative de la contribution de l'azote fixé. Elle repose essentiellement sur le choix de la plante de con tôle. En effet le pourcentage de l'excès isotopique de la plante de référence doit être le reflet de celui de l'azote disponible dans le sol. Plusieurs types de plantes de référence sont proposés dans la littérature (Witty, 1985 ; Ndoye, 1990), mais nous avons choisi la plante non inoculée. Les témoins non inoculés ont l'avantage de présenter le même profil racinaire que la plante fixatrice et par conséquent la même utilisation de l'azote du sol, mais l'inconvénient est qu'il y a presque toujours des contaminations, ce qui conduit à des erreurs d'appréciation ; et nos plantes témoins n'ont pas étéàl'abri.
Les résultats obtenus par la méthode isotopique (tableau 4) montrent que l'excès isotopique des plantes témoins non inoculées n'est pas significativement différent de celui des plantes nodulées. La répartition au sein de la plante montre, qu'ausi bien chez le mutant que chez le sauvage, les feuilles présentent l'excès isotopique le plus faible.
Concernant le pourcentage d'azote fixé, on note qu'il n'y a pas de différences significatives (34 à 44%) entre les plantes sauvages et mutantes cultivées sur sol inondé. Il est intéressant de noter que le mutant présente la même teneur en azote fixé (environ 43%) quelque soit le régime hydrique. En conditions drainées, on constate que le pourcentage d'azote fixé par les nodules racinaires sauvages ne différe pas significativement de celui des nodules de tiges, tandis que la somme des nodules de racines plus tiges du sauvage présentent la valeur la plus faible (23,95%). Le pourcentage d'azote fixé des nodules de racines du mutant (43,86%) ne différe pas significativement de celui des nodules de racines sauvages (33,26%) sur sol drainé.
Les quantités d'azote fixé mesurées pour ces plantes (tableau 4) montrent que sur sol drainé, les nodules racinaires du mutant fixent plus que les nodules de racines et des tiges sauvages. Ceci a été rapporté par les résultats d'ARA et la méthode par différence, qui ont montré une meilleure fixation du mutant.
En conditions inondées le sauvage avec double nodulation présente la meilleure fixation tandis que les racines et les tiges sauvages fixent la même quantité d'azote. Par ailleurs la plus grande partie de l'azote fixé se retrouve au niveau des feuilles. Cette fixation serait maximale si les plantes avaient été cultivées en période chaude (Juin-Septembre), période durant laquelle les conditions climatiques sont beaucoup plus favorables àla croissance et à la fixation de Sesbania rostrata que celles de la période froide (Novembre-Décembre). Il faut également noter que la fixation des nodules de tiges a été sous-estimée par rapport à celle des nodules de racines du sauvage; en effet, les sites de nodulation et par conséquent les nodules caulinaires apparaissent tardivement par rapport aux nodules racinaires qui commencent plus tôt leur fixation.
Il est intéressant de noter que les résultats d'azote fixé obtenus par les deux méthodes (différence et isotopique) sont similaires (tableau 5).
Par ailleurs l'azote du sol et de l'engrais (fig.5) sont absorbés presque de la même manière par toutes les plantes du même phénotype (sauvage ou mutant). Mais les plantes sauvages
Fig.5 : Contribution de l'azote du sol, de l'azote de l'air et de l'azote de l'engrais à la nutrition des plantes cultivées sur sol inondé et drainé
méthode de dilution isotopique.
0,50 0,45 0,40
,-.., 0,35
....
~c~ 0,30
Ô. 0,25
0lJc~ 0,20
' - "
~ 0,15
....
0N~ 0,10
0,05 0,00
SNI SIR
SIT
SIRT MNI MIRFie Sa : Conditions inondées Légende
Il Azote fixé (AF) e2l Azote de l'engrais (E)
[ZJ Azote du sol (S)
....
~o~N
0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00
1
SNI SIR SIT SIRT MNI MIR
Fie Sb Conditions drainées
Tableau 3:Influence des différents traitements sur la teneur en azote et le poids sec de tiges, racines, feuilles et nodules chez deux phénorypes sauvage (sauv.) et mutant (Mut.) deSesbania rostrata (S.r.) cultivés pendant 50 jours sur sols inondés (W) ou drainés (D) .
Traitements Poids secs
(g/p1ante)Teneur en azote
(9c)N total
(g/p1ante)
Phénotype Inoculation Régime Feuilles Tiges Racines Total Nodules Feuilles Tiges Racines
hydrique
S.r. Sauv. 0 W 3,4ybe 4,38ed 1,68a 9 51 b, 0 4,18abe 1,11 abcJ 1.75" O,nabe
S.r. Sauv. R+ W 5,08abe 7abe 2,87a 14,9yb 0,45abe 4,29abe 1,12abcd 2,08" 0,36ab
S.r. Sauv. T+ W 3,59abe 5,19bed 2,26a 11,04ab 0,1ge 4,86"b 1,19bc 1.88a 0,28abe
S.r. Sauv. RT+ W 4,8ybe 5,79bed 2,59a 13 23ab, 0,41 abc 4,99ab 1, 14abcd 2,13a 0,36ab
S.r. Sauv.
°
D 4,52abe 5,80abed 2,33a 12,65"b°
4,82ab 1,35" 1,62a 0,33abS.r. Sauv. R+ D 5,88a 7,83a 2,69a 16,39a 0,50ab 4,52ab 1,14JbCd 1,82a 0,40a W
S.r. Sauv. T+ D 5,53ab 7,48ab 2,71 a 15,71a 0,2ee 5,33a 1,22"oe 1,59a 0,42a W
S.r. Sauv. RT+ D 5,45ab 6,86abe 2,67a 14,nab 0,5yb 5,12ab 1,26Jb 1.93a 0,41 a
S.r. Mut. 0 W 3,01 e 366d 1,83a 8,51 b
°
2,79d 0,83d 1,20a 0,14e,
S.r. Mut. R+ W 4 40abe, 6,12ab 3,01 a 13,53ab 0,58a 4,31 abc 1.21a~c 1.70a 0,31 abe
S.r. Mut. 0 D 2,92e 4,56ed 2,15" 9,63b 0 3,44bed 0,91'J 1.23" 0,17 bc
S.r. Mut. R+ D 5,74ab 6,64abe 3,67a 16,OY 0,34"be 3.7eed 1,12"ocj 2.21 a 0,37ab
CV(%) 21,92 23,08 29,52 22,50 60,12 12,33 12.61 12,01 25,3
NB. Chaque valeur est la moyenne de 4 répétitions. Pour chaque expérience, les nombres de la même colonne suivis de la m~me lettre ne différent pas significativement au seuil de 5% (Newman& Keu1s, 1957).
CV :coefficient de variation
0= témoins non inoculés; R+ = plantes avec racines inoculées: T+ = plantes avec tiges inoculées; RT+ = plantes avec racines et tiges inoculées
1
1 34
1
1
Tableau 5: Fixation d'azote par les plantes de dcux phénotypcs sauvagc (Sauv.) ct mutant (Mut.) sans sitcs dc nodulation dcSesbania rosfrata (S.r.) cultivées en conditions inondées (W) ou drainées (D) pendant 50 jours ct soumiscsà différents types d'inoculation. Fixation mesurée1
scion deux méthodes: isotopiquc ct différence.l'rai temen L<; Méthode Fixation d'azote
de
1
Phénotype In oculation Régime Mesure %Ndfa Azote fixéHydrique
(g/plantc) (kg/hectare)
1
S.r. Sauv. 0 W IsotopiqueDifférence 0() 00 0()1
S.r. Sauv. R+ W DifférenceIsotopique :n,2~c3X,S"~ 0,0,14~ctl12~cd 43,250,if1
S.r. Sauv. T+ W IsotopiqueDifférence 42,sa~21,4cd 0,O,ll12~cdbcd 43,239,61
S.r. Sauv. RT+ W IsotopiqueDifférence 40,3"~38,sab O,14U,lybbcd 5450,41
S.r. Sauv. 0 D IsotopiqueDifférencc U0 U0 001
S.r. Sauv. R+ D IsotopiqucDilTérence 33,317,yIbc 0,100,07dbcd 25,2361
S.r. Sauv. T+ D 1sotopiquc 25,3cd U,11bcd 39,6
Diflcrence 2l,4cd O,09~ctl 32,4
S.r. Sauv. RT+ D Isotopique 23,9cd (),08~cd 2X,S
1
Différence 19,yd 0,08bcd 28,S1
S.r. Mut. 0 W IsotopiqueDifférence U0 00 ()01
S.r. Mut. R+ W Isotopique 41,93a~ 0,14bcd 5U,4
Différence 54,sa U,17ab 61,2
S.r. Mut. 0 D Isotopiquc 0 0 U
l
0 DifJcrencc 0 U ()S.r. Mut. R+ D Isotopiquc 43,9"b 0, 17"~ 61,2
~
DifférenceCV(%) 54"23,12 0,20"25,24 72i
NB. Chaque valcur cst la moycnne dc 4 répétitions. Pour chaque expérience, les nombres de la mêmc colonnc suivis de la même lettre ne différent pas sigllilïcativemcnt au scuil de 5%(Newman & Kculs, 1957).
l
CV : coefficicnt dc variation0= témoins non inoculés; R+= plantes avec racines inoculées;'1'+ = plantcs avec tiges
, inoClilées ;RT+
=
plantcs avec racines et tiges inoculées~
3S
utilisent un peu plus l'azote du sol que les plantes du mutant.
Pour extrapoler sur le rendement d'azote par hectare, en considérant une densité normale de plantation de 360 000 plantes à l'hectare (Ndoye, communication personnelle) et une période de culture de 50 jours, la fixation d'azote par le mutant serait équivalent à 57,6 à 72 kg de N2 sur sol drainé et 43,2 à 61,2 kg sur sol inondé contre 43,2 à 50,4 kg/ha pour le sauvage et sur sol inondé et 25,2 à 46,8 kg/ha sur sol drainé. Cette extrapolation doit être consid6rée avec prudence car il existerait une volatilisation de l'azote du sol et une hydrolyse par les uréases secrétées par les cellules microbiennes (Xiaoyan etal., 1992).
1.2.3. Comparaison des poids secs
Les poids secs sont obtenus après séchage des échantillons à l'étuve (70°e) pendant 48h ; les valeurs mesurées sont analysées par le test de Newman et Keuls (Snedecor et Cochran,
1957).
Le tableau 3 montre que le poids sec des plantes témoins (non inoculées) du sauvage cultivées sur sol drainé ne présentent pas de différences significatives avec celui des plantes témoins du mutant quelque soit le régime hydrique. Les plantes nodulées du mutant et du sauvage présentent le même poids sec aussi bien sur sol drainé que sur sol inondé.
Les poids secs des nodules obtenus montrent que les racines du mutant et du sauvage présentent la même quantité de nodules avec les plantes sauvages à double nodulation. La faible quantité de nodules caulinaires observée chez les plantes sauvages ayant subi la seule inoculation des tiges pourrait être attribuée au retard dans l'apparition des sites de nodulation par rapport aux nodules racinaires.
La comparaison des résultats de poids secs obtenus par les trois expériences effectuées montre qu'ils sont presque totalement différents, ceci traduit une imprécision de cette méthode pour l'évaluation de la fixation d'azote.
2. ANALYSE COMPAREE DES PROTEINES TOTALES DE TROIS
PHENOTYPES DE SESBANIA ROSTRATA
L'étude génétique du mutant sans sites de nodulation sur la tige a montré que la mutation était monogénique et dominante (Leblanc, résultats non publiés). Pour connaitre les bases moléculaires de cette mutation, nous avons entrepris une comparaison des protéines totales du mutant et du sauvage. En effet une différence au niveau génotypique pourrait se traduire au niveau des produits des gènes (protéines) impliqués dans cette mutation.
Notre analyse a porté sur des plantes de 3 phénotypes deSesbania rostrata issus de la même descendance: une plante sauvage avec beaucoup de sites de nodulation sur la tige, une plante mutante sans sites, une plante avec quelques sites dont les protéines sont extraites et séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.
Des microbouturages répétés in vitro ont été effectués sur ces plantes dans le but de cloner le matériel végétal afin d'avoir du matériel homogène. Mais nous nous sommes heurtés à un
1
2 3
/F====~~~F'====~~PM,r=-=====\,Photo 2: Profils électrophorétiques (SDS-PAGE) des protéines totales de trois phénotypes de Sesbania rostrata :(1) plantes mutantes sans sites, (2) plantes avec peu de sites, (3) plantes
sauvages avec beaucoup de sites. MPM
=
marqueur de poids moléculaire.1
l L
", , i
IL
1
&
1 1 ,
1 1 1 1 1 1
1
36
problème d'enracinement aux derniers repiquages. La technique de bouturage a été alors abandonnée et nous avons recouru à une série d'autofécondations afin d'obtenir des plantes des trois phénotypes de la même descendance et à une génération la plus avancée possible, ayant donc une certaine stabilité génétique. En fait nous avons obtenus des plantes de la 4e descendance dont le génôme est fixé à 95%.
Les électrophorégrammes obtenus par électrophorèse en une dimension, qui permet de séparer les protéines selon leur poids moléculaire, sont très reproductibles (photo 2). La comparaison visuelle des différents profils électrophorétiques montre que les trois phénotypes de Sesbania rostrata présentent les mêmes profils, la seule différence observée se trouvant au niveau de l'intensité des bandes, confirmant ainsi les résultats de P. De Lajudie etal. (1992).
Mais cela ne signifie pas que les différentes plantes analysées aient exactement les mêmes protéines totales. En effet, une des limites de cette méthode est qu'elle ne révéle que les protéines majeures. Ainsi, si la protéine recherchée est une protéine mineure, elle ne sera pas révélée.
Afin d'accéder à un niveau supérieur de résolution et de révéler un plus grand nombre de protéines, nous avons effectué l'électrophorèse en deux dimensions qui permet une séparation des protéines selon leur point isoélectrique d'abord et ensuite selon leur poids moléculaire. Les profils électrophorétiques obtenus ne sont pas comparables, car les bandes ne sont pas nettes.
3. COMPARAISON DE LA CROISSANCE RACINAIRE DE