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Influence de plusieurs facteurs sur l’autolyse de Lactobacillus helveticus CNRZ 414.
Sylvie Lortal, Patrick Boyaval, J. van Heijenoort
To cite this version:
Sylvie Lortal, Patrick Boyaval, J. van Heijenoort. Influence de plusieurs facteurs sur l’autolyse de Lactobacillus helveticus CNRZ 414.. Lait, Elsevier, 1989, 69 (3), pp.223-231. �hal-02725868�
Article de recherche
Influence de plusieurs facteurs sur l'autolyse de Lacto- bacillus helveticus eN RZ 414
s. Lortal i, P. Boyaval 1et J.Van Heijenoort 2
1INRA, Laboratoire de recherches de technologie laitière, 65,rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex;
2CNRS, Laboratoire de biochimie moléculaire et cellulaire, Université Paris-Sud, 91405 Orsay Cedex, France
(reçu le 31 août 1988, accepté le 28 novembre 1988)
Résumé - L'autolyse des bactéries lactiques libère au cours de l'affinage des enzymes intracellu- laires qui vont activement participer à la maturation des fromages. Lactobacillus helveticus en parti- culier intervient ainsi largement dans la flaveur finale des fromages à pâte pressée cuite. L'influence de la température, du pH, du magnésium, et du stade de croissance sur l'autolyse induite par choc osmotique de L. helveticus CNRZ 414 est envisagée dans ce travail. L'autolyse procède par une cinétique biphasique. Un relargage concomitant de matériel absorbant, à 260 nm et à 280 nrn, est observé. La présence d'inhibiteurs de protéases dans le milieu favorise l'autolyse. La température optimale pour l'autolyse de cette souche se situe entre 40 et 45 oC.Au-delà de 45 oC,le système est inhibé. Les cellules récoltées en début de phase exponentielle s'autolysent de manière plus mar- quée que pour les autres stades de croissance. Enfin, l'effet du magnésium sur l'autolyse dépend de sa concentration.
autolyse - Laetobaeillus helvetieus - paroi
Summary - Autolysis of Laetobaeillus helvet/eus CNRZ 414 : influence of sorne factors.
Lactic acid bacteria autolysis plays an important role in cheese ripening. As amatter of fact, proteo- Iytic enzymes are released in the curd when cell envelopes have been broken by their own autoly- sins. Lactobacillus helveticus is implicated in hard cooked cheese ripening. The effect of temperatu- re, pH, magnesium, and growth phase on L.helveticus CNRZ 414 autolysis are presented in this paper. If the effect of pH was rather complicated to explain without extensive complementary expe- rimentations, temperature dependency looked like an enzymatic degradation. Accompanying relea- se of material absorbing at 260 and 280 nm was observed. Protease inhibitors were favorable to autolysin expression. Early harvested cells at the beginning of the exponential phase of growth autolysed much more rapidly than at later growth phases. The effect of magnesium depends on its concentration.
autolysis - Lactobacillus helveticus - eell wall
224 S. Lortalet al.
Introduction
Spontanée ou induite, l'autolyse se carac- térise par une rupture de l'enveloppe bac- térienne (membrane et paroi) avec libéra- - tion du contenu cytoplasmique. Ce phénomène, observé chez de nom- breuses espèces bactériennes, a été prin- cipalement étudié chez E. coli (Leduc et Van Heijenoort, 1980; Leducet al., 1982), Bacillus subtilis (Youngetsl.,1974; Taka- hara et al., 1964) et Streptococcus fae- calis (Shockmanet al., 1967). Il est main- tenant établi que les bactéries possèdent des enzymes capables de rompre des liaisons de leur propre paroi, entraînant ainsi la lyse. Ces enzymes sont appelées de par cette particularité «autolysines» et certaines ont déjà été isolées et purifiées (Rogerset al., 1984). Leur rôle, toutefois, ne se limite pas à l'autolyse; elles inter- viendraient de façon essentielle dans la croissance cellulaire (en réalisant les cou- pures permettant l'insertion de nouveau matériel pariétal), dans la division cellulai- re, les phénomènes de transformation et de sporulation (Rogerset al., 1980).
Leur étude chez les bactéries lactiques présente à terme au moins deux applica- tions intéressantes:
- la première concerne l'affinage des fro- mages. Protéases et peptidases bacté- . riennes y jouent, on le sait, un rôle essen- tiel (Desmazeaud et Gripon, 1977). Or ces enzymes ne sont en général mises au contact de leur substrat qu'au moment de l'autolyse. Connaître les facteurs qui contrôlent ou influencent celle-ci permet- trait de libérer à un stade choisi ce conte- nu cytoplasmique à haut potentiel protéolytique et, en conséquence, d'accé- lérer l'affinage;
- la deuxième concerne les nom- breuses fermentations où les bactéries lactiques interviennent et où l'autolyse, par destruction de l'agent fermenteur, peut devenir préjudiciable. Mieux
connaître ses déterminants permettrait de l'éviter ou de la contrôler.
Les recherches réalisées à ce jour sur l'autolyse des bactéries lactiques relèvent de deux approches différentes et complé- mentaires : d'une part des études biochi- miques approfondies sur la localisation, la spécificité, le relargage et l'isolement de ces autolysines (Coyette et Ghuysen, 1970; Coyette et Shockman, 1973; Hig- ginsetai., 1973; Mouetai., 1976); d'autre part des études plus technologiques sur l'autolyse dans des conditions proches de celles de l'affinage des fromages (Ohmiya et Sato, 1969a et b; Bie et Sjostrom, 1975a et b).
L'espèceLactobacillus helveticus inter- vient dans la fabrication de nombreux fro- mages à pâte pressée cuite. Son pouvoir acidifiant est remarquable Ousqu'à 2,8%
plv d'acide lactique, Veisseyre, 1975) et ses propriétés protéolytiques affirmées (El Soda et Desmazeaud, 1982). Malgré la très grande importance. de cette espèce en transformation fromagère, son systè- me autolytique n'a été que peu étudié (Ohmiya et Sato, 1969a et b; Bie et Sjos- tram, 1975a ~t b). Nous présentons dans ce travail l'influence de plusieurs facteurs (température, pH, stade de croissance, présence d'inhibiteurs de protéases ou de magnésium) sur l'autolyse deLactobacil- lus helveticus CNRZ 414.
Matériel et Méthodes
Cultures bactériennes
La soucheutiliséeprovenaitde l'INRA(Centre de recherchede Jouy-en-Josas,France) et portele n°CNRZ414.
Sonappartenanceàl'espèceLactobacillus helveticus a été confirmée par galerie API (France). Elle était conservée congelée (-30oC) dans du MRS (DIFCO)(De Manet al., 1960) additionnéde15% de glycérol.La
souche avant utilisation était repiquée deux fois en bouillon MRS (ensemencement 1% vlv) et incubée à 45 oC durant 15 h. Les cultures étaient effectuées dans du MRS, à45 oC, sans régulation de pH.
Induction de l'autolyse
Principe
L'autolyse a été induite parchoc osmotique sur des cellules récoltées. Le culot cellulaire obte- nu par centrifugation est resuspendu dans un tampon de pH et concentration connus, et ayant une pression osmotique toujours inférieu- re àla pression osmotique intracellulaire (com- prise chez les bactéries àGram positif entre 10 et 20 atm).
Sauf exception indiquée dans le texte, les cellules étaient séparées dans le premier tiers de la phase exponentielle (poids sec cellulaire de 0,8 mg/ml) par centrifugation (24 000 g x 10 min, 4 OC), le surnageant étant éliminé le plus complètement possible en essuyant soigneuse- ment les parois du tube. Le culot était rapide- ment resuspendu dans un volume de tampon tel que le poids sec cellulaire soit de 0,33 mg/ml environ. Cette suspension était ensuite placée àla température àlaquelle on souhaitait observer l'autolyse.
Tampons utilisés
La totalité des tampons utilisés ont été prépa- résàpartir de produits Merck et d'eau distillée.
Nature des tampons en fonction du pH (avant stérilisation) :
pH =5,00 à pH =S,50 ... Tampon acétate de sodium 0,2 M
pH = 6,00 àpH = 8,00 ... Tampon phosphate de sodium 0,1 ou 0,2 M
pH =8,50 à pH =9,50 ... Tampon Tris ajusté avec HCI 0,2 M
Suivi de l'autolyse
Décroissance de la densité optique (à 65Dnm)
L'évolution de l'absorbance à650 nm au cours de la lyse était suivie par spectrophotométrie (spectrophotomètre Beckman acta M IV).
Relargage d'acides nucléiques et de pro- téines
Au cours de l'autolyse, une partie du contenu cytoplasmique est relarguée dans le tampon de lyse. Pour suivre ce phénomène, des échan- tillons (3 ml) étaient prélevés à différents temps, filtrés (filtres HAWP Millipore 0,45 pm) et les variations de la densité optique à260 nm (acides nucléiques) et 280 nm (protéines) étaient mesurées.
Chute de la viabilité
Des échantillons étaient prélevés à différents temps d'autolyse, ensemencés dans un milieu MRS gélosé (en double) et les colonies étaient dénombrées après 48 hà45 oC, en conditions anaérobies.
Autolyse en présence d'inhibiteurs de protéases
L'EDTA (litriplex Il)(Merck), l'inhibiteur detryp- sine (provenant du soja) (Sigma), la pepstatine A (inhibiteur de pepsine) (Sigma) étaient ajou- tés au tampon de lyse à des concentrations finales de 0,1 mM pour l'EDTA et 0,01 mM pour les autres inhibiteurs.
Observations microscopiques
Elles étaient réalisées en contraste de phase avec un microscope Nikon Optiphot (objectif à immersion, G = 1 000).
Autolyse en présence de magnésium Du chlorure de magnésium (Merck) était ajouté dans le tampon de lyse (tampon phosphate de sodium, 0,1 M, pH = 7,00), de telle sorte que les concentrations finales en magnésium soient de10--2Met10--3M.
Résultats
Eléments concernant la souche utilisée
A l'observation microscopique, les cellules de L. helveticus CNRZ 414 se présen- taient sous forme de bâtonnets seuls ou
226 S. Lortal et al.
assemblés en courtes chaînes. A 45 oC,
le taux de croissance de L. helveticus CNRZ 414 était de 0,8 h-1. Le poids sec bactérien était de 0,37 mg/ml de milieu de DO égale à 1.
Mise en évidence de l'autolyse de L. hel-
veticus CNRZ 414
Pour cette phase de mise en évidence du phénomène, les cellules étaient resus- pendues dans un tampon phosphate de sodium, de concentration 0,2 M, et de pH égal à 8 (avant stérilisation).
Suivi de la DO à650 nm,260 nm et 280 nm
Les densités optiques en visible et en ultra-violet évoluaient différemment au
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cours de l'autolyse. La rupture de l'enve- loppe bactérienne entraîne une diminution de la DO à 650 nm et une augmentation à 260 et 280 nm, par libération du contenu cytoplasmique (acides nucléiques et pro- téines) (Fig. 1).
La chute de la DO (650 nm) était sur- tout importante dans les 8 premières heures (diminution de 50% par rapport à la DO initiale). Au-delà, on observe un seuil en dessous duquel la DO ne des- cend plus. même après plusieurs jours (résultats non présentés).
Evolution de la viabilité
Après un temps de latence (30-40 min).
la viabilité chute exponentiellement. Après 5 h en tampon d'autolyse on ne dénombre plus aucune bactérie vivante (Fig. 2).
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25
Fig. 1. Autolyse{Â}des cellules deL.helveticus placées en tampon phosphate de sodium{O,2M, pH=8}, avec libération de protéines (e) et d'acides nucléiques(O).
5
Observation microscopique
Au cours de l'autolyse, les bâtonnets de Lactobacillus helveticus CNRZ 414 deve- naient plus clairs et granuleux (aspect probablement dû à une recondensation intracytoplasmique d'ADN). Des «fan- tômes» (parois seules ayant gardé la forme de la cellule) apparaissaient. Des déformations et une tendance à l'aggluti- nation étaient fréquemment observées.
Ces symptômes affectaient une fraction de la population cellulaire, certains bâtonnets avaient un aspect absolument normal même après un séjour de 10 h dans le tampon d'autolyse.
Recherche des conditions optimales d'au- tolyse
Influence de la température
Les essais étaient réalisés dans du tam- pon phosphate de sodium 0,2 M, à pH
8,0; la température d'autolyse variant de 30 à60 -c, de 5° C en 5-c, La Figure 3 montre la diminution de la DO (en %) en 24 h, selon la température. La températu- re optimale de lyse semble se situer entre 40 et 45 oC. On observe une inactivation
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HEURES
Fig. 2. Evolution de la viabilité lors de l'autoly- se deL.helveticus. Conditions identiquesàla Fig. 1. N est le nombre de cellules viables mesuré par étalement en double sur gélose MRS.
du système autolytique après 30 min à 60-c.
Influence du pH
Dans la zone optimale de température précédemment définie (soit 42 OC), plu- sieurs tampons de concentration 0,2 M et de pH différents étaient utilisés. Le pour- centage de diminution de DO (650 nm) par rapport à la DO initiale était mesuré pour chaque pH après 1 h 30, 3 h 30, et 8 h d'autolyse (Fig. 4).
Bien que la courbe apparaisse difficile- ment interprétable, une zone de pH favo- rable à l'autolyse apparaît entre pH 6,50 et pH 8,00. Cette expérience est toutefois peu répétable. A pH acides notamment (pH = 4,50 et pH = 5,00), on obtenait, contrairement à la Fig. 1, des pourcen- tages de diminution de DO très bas.
La courbe à8 h n'est pas représentée car on observe alors un aplanissement des différences entre les pH.
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TEMPERATURE (OC)
Fig. 3. Influence de la température sur l'autoly- se de L. helveticus. Conditions identiquesà la Fig. 1. Les diminutions de DO représentées étaient obtenues après 24 h d'autolyse. Les sigles. et 0 représentent deux expérimenta- tions différentes.
pH
Fig. 4.Diminution de la densité optique dans le tampon de lyse en fonction du pH, en 1h30 (-) et 3h30 (---).
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5 6
S. Lortal et al.
Influence du stade de croissance
Pour étudier l'influence du stade de crois- sance sur l'autolyse, les cellules étaient récoltées en début (DO=0,90), au milieu (DO=3,40) et en fin de phase exponen- tielle (DO=4,90). Les résultats montrent que plus la culture est récoltée tôt après le début de la phase exponentielle, plus son autolyse est importante (Fig. 5). En pourcentage de diminution de DO, on obtenait respectivement pour ces trois stades de croissance différents : 50,3%, 44,2% et 30,7% en 24 h.
Présence d'EDTA et d'inhibiteurs de pro- téases dans le milieu d'autolyse
L'autolyse obtenue en présence d'EOTA, d'inhibiteur de trypsine et d'inhibiteur de pepsine était de manière significative supérieureà celle obtenue dans du tam- pon seul (cf. Fig. 6). (Dans la Figure 6, l'autolyse obtenue en présence de peps- tatine A n'est pas représentée, car elle est en tout point semblable à celle obtenue avec l'inhibiteur de trypsine).
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1h30
7 8 9 10
Présence de magnésium dans le milieu d'autolyse
Un net ralentissement de l'autolyse est observé en présence de MgCI2 10-2 M.
En revanche, à 10-3 M, le magnésium semble améliorer légèrement le phéno-
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HEURES
Fig. 5. Influence du stade de croissance sur l'autolyse deL.helveticus en tampon phospha- te de sodium (0,2 M, pH = 8,00). Récohe des cellules à DO = 0,90 (_), DO = 3,40 (0) et DO=4,90 (e).
mène autolytique (cf. Fig. 7). Un résultat comparable a été obtenu chez une autre souche,L.helveticus ATCC 12046.
Discussion
L'induction par choc osmotique de l'auto- lyse deLactobacillus helveticus a été réa- lisée pour la première fois. La cinétique de lyse, suivie par l'évolution de la DO à 650 nm, est rapide dans les cinq pre- mières heures, puis beaucoup plus lente.
L'absence de phase de latence avant la diminution de la densité optique à 650 nm est semblable à ce qu'on observe chezL.
fermenti (Neujahr et Logardt, 1973) et S.
cremoris (Mou et el., 1976), mais diffère des résultats obtenus chezL.acidophilus (Coyette et Shockman, 1973). L'existence d'un seuil, après quelques heures d'auto- lyse, au-delà duquel la densité optique résiduelle encore élevée ne chute plus que très lentement, a déjà été observée chez S. cremoris (Mouet el., 1976). Ces derniers auteurs n'émettent pas d'hypo-
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Fig. 6. Autolyse de L.helveticus en présence d'inhibiteurs de protéases : témoin =tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH = 6,50 (Â);
témoin + EDTA 0,1 mM (e); témoin + inhibiteur de trypsine 0,01 mM(t1).
thèses particulières pour expliquer ce ralentissement.
L'amélioration nette de l'autolyse obte- nue en présence d'inhibiteurs de pro- téases suggère que des protéases deL.
helveticus ont la possibilité de dégrader les enzymes autolytiques et ainsi de ralentir l'autolyse. L'EDTA peut, outre son action d'inhibiteur des protéases, agir en séquestrant des cations éventuellement inhibiteurs des autolysines, d'où une lyse plus importante.
L'augmentation de la densité optique à 260 nm et zèo nm dans le surnageant d'autolyse fémoigne d'un relargage pro- gressif de matériel cytoplasmique. Elle ne constitue toutefois qu'une approche quali- tative, et l'utilisation d'un marqueur de lyse (qui pourrait être pour cette espèce la lac- tate deshydrogénase, enzyme intracellu- laire) est indispensable à la quantification de ce relargage.
A l'observation microscopique, certains bâtonnets apparaissent absolument nor- maux même après plusieurs heures en tampon d'autolyse. Or la viabilité est alors
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Fig. 7. Autolyse de L. helveticus en présence de MgCI2 : témoin = tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH=7,00 (_); témoin + MgCI2
10-2M(e);témoin + MgCI21o-3 M (O)~
230 S. Lortal et al.
nulle. Ce phénomène concorde avec des observations faites chez des strepto- coques du groupe N (Krishna et Dutta, 1976; Langsrud et al.,1978; Langsrud et al.,1987).
Dans le même sens, si l'on compare l'évolution de la viabilité et celle de la densité optique (650 nm), on observe qu'après un séjour de 5 h en tampons, plus de 50% de la densité optique initiale subsiste alors qu'on ne dénombre plus aucune bactérie viable; la mort des cel- lules survient donc sans lyse totale de leurs structures.
Plusieurs paramètres d'environnement influent largement sur l'autolyse. Lors- qu'on augmente la température, la vitesse initiale du phénomène augmente, mais l'inhibition intervient de plus en plus tôt, ce qui est conforme à l'action de la tem- pérature sur tout système enzymatique.
L'optimum de température se situe entre 42 et 45 oC, c'est-à-dire semblable à l'op- timum de croissance. (Ce résultat diffère légèrement de ceux obtenus chez L. fer- menti par Neujahr et Logardt (1973), où l'optimum de température pour l'autolyse était supérieur à l'optimum de creissan- ce.)
La zone favorable de pH obtenue, trop imprécise (entre pH =6,50 et pH =8,00), ne permet pas d'émettre d'hypothèses concernant la spécificité de ou des autoly- sines présentes. De plus, le manque de répétabilité concernant l'influence du pH suggère que le critère utilisé (diminution de la densité optique à 650 nm) n'est pas totalement adapté pour appréhender l'ef- fet de ce paramètre.
L'effet inhibiteur du magnésium a déjà été observé chez d'autres espèces bacté- riennes (Leduc et el., 1982; Neujahr et Logardt, 1973). En revanche, son action éventuellement activatrice à d'autres concentrations constitue un résultat nou- veau.
Le choix du stade de croissanceau moment de la récolte des cellules a une grande influence sur l'autolyse. Les cel- lules récoltées en fin de phase exponen- tielle ont une activité auto lytique moins importante. Cette observation, déjà faite chez L. fermenti (Neujahr et Logardt, 1973), soutient l'hypothèse de l'implication des autolysines dans la croissance cellu- laire et les phénomènes de division (Rogers et al., 1980). Il apparaît en effet logique que l'activité auto lytique soit plus forte quand la fréquence de division est plus importante, c'est-à-dire pendant la phase exponentielle. Toutefois, des mutants autolytiques déficients ont été isolés chez d'autres espèces (Fein et Rogers, 1976) et présentent une croissan- ce et une division normales. D'autres, en revanche, voient ces phénomènes pertur- bés si l'activité autolytique est déficiente (Shungu et al., 1979). L'isolement de mutants auto lytiques déficients de Lacto- bacillus helveticusCN RZ 414 apporterait d'intéressants compléments à l'influence du stade de croissance que nous avons observée.
Le caractère complexe de l'influence du pH comme le manque d'informations sur la nature des composés cytoplas- miques et pariétaux relargués pendant la lyse cellulaire ne permettent pas actuelle- ment de prédire l'autolyse dans un froma- ge ou dans un fermenteur. Pour cela, une approche plus biochimique du phénomè- ne devient nécessaire. L'isolement d'auto- lysines (après relargage à partir de parois actives), l'étude de leur spécificité (par la nature des groupements pariétaux qu'elles libèrent), et l'éventuelle localisa- tion de leur action (par microscopie élec- tronique) constituent entre autres des élé- ments de connaissance indispensables à la compréhension du phénomène autoly- tique chez cette espèce bactérienne.
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